Genscreen HIV-1 Ag Assay 192 Test 71120

Transkript

1 Genscreen HIV-1 Ag Assay 192 Test ENZYMIMMUNANALYSE (EIA) TIL KONSTATERING AF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS TYPE I (HIV-1) P24-ANTIGEN I HUMANT SERUM, PLASMA OG CELLEKULTUR SUPERNATANT IVD Producentens kvalitetskontrol Alle de af Bio-Rad producerede og markedsførte produkter gennemgår fra modtagelse af råmateriale til markedsføring af slutproduktet i et komplet kvalitetssikringssystem. Hvert batch af slutproduktet gennemgår kvalitetskontrol og markedsføres kun, hvis det opfylder de fastsatte kvalitetskriterier. Dokumentation vedrørende produktion og kontrol af hvert batch opbevares af producenten.

2 INDHOLD 1 - KLINISK VÆRDI 2 - PRINCIP FOR Genscreen HIV-1 ANTIGEN ASSAY 3 - INDHOLD AF Genscreen HIV-1 ANTIGEN ASSAY 4 - NØDVENDIGT, IKKE MEDFØLGENDE MATERIALE 5 - HELBREDS- OG SIKKERHEDSMÆSSIGE FORHOLDSREGLER 6 - FORHOLDSREGLER 7 - INDSAMLING OG HÅNDTERING AF PRØVEMATERIALE 8 - REKONSTITUERING AF REAGENSER 9 - OPBEVARINGSBETINGELSER - HOLDBARHED 10 - ANALYSEPROCEDURE 11 - BEREGNING OG FORTOLKNING AF RESULTATERNE 12 - SPEKTROFOTOMETRISK KONTROL AF PRØVE - OG REAGENSPIPETTERING 13 - YDEEVNE 14 - TESTENS BEGRÆNSNINGER 15 - REFERENCER 62

3 1 - KLINISK VÆRDI Det ætiologisk aktive organisme i Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) er en retrovirus, som kaldes Human Immunodeficiency Virus (HIV). HIV er isoleret fra patienter med AIDS og fra raske personer med stor risiko for at få AIDS 1,2. Man ved, at overførsel sker ved intim seksuel kontakt, ved brug af inficerede nåle, ved transfusioner af inficerede blodprodukter og perinatalt fra inficerede mødre til foster eller barn 1,8. Tegn på, at patienten har været udsat for HIV, ses normalt ved tilstedeværelsen af virusspecifikke antistoffer i vedkommendes serum eller plasma efter eksponering for virusen. Før de sporbare antistoffer viser sig, er der en tidlig periode i forløbet, hvor frie, virale antigener cirkulerer i blodet. Et af disse virale antigener er det virale kerneprotein p24. HIV-antigenanalyser kan anvendes til at konstatere tilstedeværelsen af virale antigener, og dermed en HIV-infektion, før serokonversion. Perioden med tilstedeværelse af antigener, som går forud for forekomsten af HIV-antistoffer, varierer og kan vare i dage eller uger hos smittede personer. Når serokonverteringen finder sted, danner virusspecifikke antistoffer komplekser med de cirkulerende antigener, således at niveauet af frie antigener i blodet falder eller forsvinder fuldstændigt 9,11. Senere i sygdomsforløbet kan der igen forekomme frie antigener 12. Genscreen HIV-1 Antigen Assay er beregnet til screening af doneret blod og plasma og som en hjælp i diagnosticering og prognosticering af HIV-1-infektion. 2 - PRINCIP FOR Genscreen HIV-1 ANTIGEN ASSAY Genscreen HIV-1 Antigen Assay er en enzymimmunteknik til påvisning af HIV-1 kerneantigenet (p24) i humane serum- og plasmaprøver. Genscreen HIV-1 Antigen Confirmatory Test (kode 71121) er en supplerende analyse til brug sammen med HIV-1 Antigen Assay for at bekræfte tilstedeværelsen af HIV p24 antigenet i gentagne reaktive prøver. Genscreen HIV-1 Antigen Assay er baseret på anvendelsen af en fast fase belægt med monoklonale antistoffer fra mus mod HIV-1 Antigen, et primært konjugat med biotinyleret anti-p24 antistof fra får og et sekundært konjugat med avidin bundet til peroxidase fra peberrod. Udførelsen af testen omfatter følgende trin i reaktionsforløbet: 1. Prøvefortynder tilsættes hver brønd. De prøver, der skal testes, og kontrolsera tilføres deres respektive brønde. Hvis der findes HIV-1 Ag i prøven, binder det sig til antistofferne i brønden. HIV-1 Ag bundet til brønden forbliver der under efterfølgende vask. Prøvefortynderens farve skifter fra grøn til blå for at bekræfte, at en prøve (eller kontrol) er tilsat brønden. 2. Konjugat 1 tilsættes herefter hver brønd, og disse inkuberes. Det biotinylerede fåre-anti-p24 antistof i konjugat 1 binder sig til HIV-1 Ag somer bundet til HIV-1 antistof i brønden. Antigen-antistofkomplekserne forbliver bundet under det efterfølgende vask. 3. Konjugat 2 tilsættes herefter hver brønd og inkuberes. Avidinen i konjugat 2 bindes specifikt til antistof-hiv-1 Agkomplekserne, som er bundet til brønden. Ubundet konjugat vaskes bort. 4. TMB-opløsning tilsættes herefter pladen og inkuberes. En blå eller grøn farve udvikles i forhold til den mængde HIV-1 Ag, der findes i prøven. Farveudviklingen standses ved tilsætning af syre, hvorved den blå-grønne farve skifter til gul. Den optiske absorption af prøverne og kontrollerne bestemmes spektrofotometrisk ved en bølgelængde på 450/ nm Bio-Rad 63

4 3 - INDHOLD AF Genscreen HIV-1 ANTIGEN ASSAY ETIKET REAGENSTYPE PRÆSENTATION R1 Microplate Mikrotiterplade 12 teststrimler med 8 brønde, belagt med murine, monoklonale antistoffer mod HIV-1 p24 Konserveringsmiddel : ProClin 300 Natriumazid (< 0,1%) 2 plader R2 Concentrated Washing Solution (20X) Koncentreret Skylleopløsning (20X) Tris NaCl-buffer ph 7,4 Konserveringsmiddel : ProClin 300 (0,04%) 235 ml R3 Specimen Diluent Prøvefortynder Konserveringsmiddel : ProClin 300 (0,5%) Prøvetilsætningsfarve (grøn) 20 ml C0 Negative Control Negativt Kontrol Normalt humant serum ikke reaktivt for HIV-antigen, HBs Ag og antistoffer mod HIV-1, HIV-2, HCV og HTLV-1 Gentamicinsulfat, 0,005% Konserveringsmiddel : ProClin 300 (0,5%) 10 ml C1 Positive Control Positivt Kontrol Oprenset, dissocieret HIV-1 antigen Konserveringsmiddel : ProClin 300 (0,5%) 7 ml R4 Concentrated Conjugate 1 (100X) Koncentreret Konjugat 1 (100X) Anti-p24 konjugat fra får, Gentamicinsulfat, 0,005% Gul farve - Konserveringsmiddel : ProClin 300 (0,5%) 1 ml R5 Concentrated Conjugate 2 (100X) Koncentreret Konjugat 2 (100X) Avidin-HRP-konjugat, Gentamicinsulfat, 0,005% Grøn farve - Konserveringsmiddel : ProClin 300 (0,5%) 1 ml R6 Conjugate Diluent Konjugatfortynder Buffer med proteinstabilisatorer Konserveringsmiddel : ProClin 300 (0,5%) 100 ml R8 Substrate Buffer Substratbuffer Citronsyre/Natriumacetatbuffer ph 4,0 Hydrogenperoxid 0,015% Dimethylsulphoxid (DMSO) 4% 60 ml R9 Chromogen Kromogen Tetramethylbenzidin (TMB) 5 ml R10 Stopping Solution Stopopløsning 1N H 2 SO 4 2 flasker 2 x 28 ml 4 - NØDVENDIGT, IKKE MEDFØLGENDE MATERIALE Destilleret vand Natriumhypoklorit fortyndes til en minimumkoncentration 0,5% natriumhypoklorit). Alternative desinficeringsmidler er: 70% ethanol eller 0,5% WescodyneTM (West Chemical Products, Inc.) Præcisionspipetter til levering af mængder fra 10 µl til 200 µl, 1 ml, 5 ml og 10 ml (nøjagtighed inden for ± 10%). En multikanal-pipetteringsenhed, som kan levere 100 µl eller 200 µl, kan også anvendes. Graduerede cylinderglas på 25 ml, 100 ml og 1000 ml. Affaldsbeholder til farligt affald. Vandbad eller varmeskab* med termostatindstilling til 37 C ± 1 C eller 40 C ± 1 C. Manuel, halvautomatisk eller automatisk mikrotiterpladevasker (*). Mikrotiterpladelæser med filtre på 450 nm og nm (*). Strimler med brønde uden antistof belægning (Bruges som pladsholder i automatisk mikrotiterpladelæser). EIA reagensbeholdere (valgfri). Engangshandsker. 64

5 Sugende papir. Rene plastikbeholdere (af enten polystyren eller polypropylen) til forberedelse af konjugatopløsninger og TMBopløsning. Cellekulturmedium, fx RPMI-1640 indeholdende 10% føtalt kalve serum, svarende til det, der anvendes til den inficerede cellekultur (til test af cellekulturprøver). (*) Kontakt os, hvis detaljerede oplysninger om det udstyr, der anbefales af vores tekniske afdeling ønskes. 5 - HELBREDS- OG SIKKERHEDSMÆSSIGE FORHOLDSREGLER Alle reagenser i kittet er beregnet til in vitro -diagnosticering. Benyt engangshandsker, når reagenserne og prøverne håndteres, og vask hænderne grundigt efter håndteringen. Undgå at pipettere med munden. Humant kildemateriale, der er brugt i fremstillingen af den negative kontrol, er testet og fundet ikke-reaktivt for HIV-1 antigen, anti-hiv1- og anti-hiv2-antistoffer, hepatitis B-antigen (HB Ag), anti-hcv-antistoffer, anti-htlv 1/ HTLV-2-antistoffer og anti-hiv1/hiv2. Den positive kontrol er varmeinaktiveret under tilstedeværelse af et dissocieringsstof. Da der ikke er kendskab til en testmetode, der med garanti kan sikre, at viraene HIV, Hepatitis B eller C eller andre smitstoffer ikke forekommer, skal disse reagenser samt patientprøverne betragtes som potentielt smitsomme og håndteres varsomt. Alt udstyr, der er i direkte kontakt med prøver og reagenser af humant kildemateriale samt bufferopløsninger, skal betragtes som kontaminerede og håndteres derefter. Undgå at spilde prøver eller opløsninger, der indeholder prøvemateriale. Kontaminerede overflader skal rengøres med natriumhypoklorit i en opløsning på 10%. Hvis den kontaminerende væske er en syre, skal de kontaminerede overflader først neutraliseres med natriumbikarbonat, derefter renses med natriumhypoklorit og tørres op med sugende papir. Det materiale, der anvendes til rengøringen, skal kasseres og placeres i en beholder til biologisk farligt affald. Prøver, reagenser af humant kildemateriale samt kontaminerede materialer og produkter skal kasseres efter desinficering: - enten ved nedsænkning i natriumhypoklorit med en slutkoncentration på 5% (1 del natriumhypoklorit til 10 dele kontamineret væske eller vand) i 30 minutter - eller ved autoklavering ved 121 C i mindst to timer. Autoklavering er den bedste metode til at deaktivere HIV og HBV. ADVARSEL! UNDGÅ AT PLACERE OPLØSNINGER, DER INDEHOLDER NATRIUMHYPOKLORIT, I AUTOKLAVEN. Sikkerhedsdataarket udleveres ved henvendelse. Undgå, at hud og slimhinder kommer i kontakt med substratbufferen, kromogenet og stopopløsningen (fare for forgiftning, irritation eller ætsning). Husk at neutralisere og/eller autoklavere affaldsopløsninger fra rengøringsprocessen eller enhver anden væske, der indeholder biologisk prøvemateriale, før de hældes i afløbet. Kemikalier skal håndteres og kasseres ifølge god laboratoriepraksis. Nogle reagenser indeholder natriumazid som konserveringsmiddel. Natriumazid kan danne kobber- og blyazider i laboratoriets rør. Disse azider er eksplosive. Undgå dannelse af azider ved at skylle rørene med store mængder vand, hvis opløsninger med azidindhold hældes i afløbet efter deaktivering. Nogle reagenser indeholder ProClin 300 (0,04%, 0,1% og/eller 0,5%). Xi Lokalirriterende R43 : Mulighed for irritation ved hudkontakt. S28-37 : Kommer stoffet på huden vaskes straks med store mængder vand. Brug egnede beskyttelseshandsker. 6 - FORHOLDSREGLER Resultaternes pålidelighed afhænger af en korrekt overholdelse af følgende regler for god laboratoriepraksis: Testnavnet samt et specifikt identifikationsnummer for testen er skrevet på rammen på hver mikrotiterplade. Dette specifikke identifikationsnummer er desuden angivet på hver teststrimmel. Genscreen HIV-1 Ag Assay : Specifikt ID-nummer = 49 Kontroller det specifikke identifikationsnummer før enhver brug. Hvis identifikationsnummeret mangler eller er forskelligt fra det angivne nummer ovenfor, må teststrimlen ikke bruges. Undgå at anvende forældede reagenser. Analyseproceduren må ikke ændres. Rekonstituer reagenserne forsigtigt for at undgå kontaminering. Bland ikke reagenser fra forskellige partier i samme testkørsel. Bemærk : Det gælder for vaskeopløsning (R2 identificeret 20X med grøn skrift på etiketten), peroxidasesubstratbuffer (R8, etiketidentifikation: TMB buf., farvet blå), kromogen (R9, etiketidentifikation: TMB 11X, farvet lilla) og stopopløsning (R10, etiketidentifikation: 1N farvet rød). Det er muligt at bruge andre partier end 2009 Bio-Rad 65

6 dem i dette sæt under forudsætning af, at det samme parti bruges inden for hele testforløbet. Disse reagenser kan anvendes sammen med en række andre produkter fra vores virksomhed. Desuden kan vaskeopløsningen (R2 identificeret 20X med grøn skrift på etiketten) blandes med en af de to andre vaskeopløsninger indeholdt i de forskellige Bio-Rad reagenskit (R2 identificeret 10X med blå skrift eller 10X med orange skrift på etiketten), når de rekonstitueres korrekt og på betingelse af at der kun bruges én blanding til et bestemt testforløb. Kontakt vores tekniske serviceafdeling for detaljerede oplysninger. Vent 30 minutter, før reagenserne tages i brug, så de kan stabilisere sig ved stuetemperatur (18-30 C). Undgå at udføre testen i nærheden af reaktive dampe (syre, alkaliske dampe og aldehyddampe) eller støv, der kan ændre konjugatets enzymaktivitet. Benyt engangsmateriale, eller hvis dette ikke er muligt, udstyr af glas, som er rengjort grundigt og skyllet med destilleret vand. Undgå, at mikrotiterpladen tørrer ud mellem fra vask og fordelingen af reagensstoffet. Brug en ny pipettespids til hver prøve. Kontroller, at pipetterne er præcise og nøjagtige, og at de instrumenter, der anvendes, fungerer korrekt. Vask: Følg de foreskrevne vaskeprocedurer nøje for at opnå de bedst mulige testresultater. Brug aldrig den samme beholder til at fordele konjugat og farveudviklingsopløsning. Enzymreaktionen er meget følsom over for metalioner. Undgå derfor, at metalelementer kommer i berøring med de forskellige konjugat- eller substratopløsninger. Udviklingsopløsningen (substratbuffer + kromogen) skal være pink. Ændres den pink farve inden for få minutters opløsning, kan reagensen ikke anvendes og skal udskiftes. Forberedelsen af udviklingsopløsningen kan foretages i en ny engangsplastikbakke eller en glasbeholder, der først er rengjort med 1N HCI og derefter skyllet grundigt med destilleret vand og tørret. Denne reagens skal opbevares i mørke. 7 - INDSAMLING OG HÅNDTERING AF PRØVEMATERIALE Tag en blodprøve i overensstemmelse med gældende praksis. Der kan anvendes serum, plasma eller cellekulturprøver. Følgende antikoagulanter er vurderet og fundet acceptable: EDTA, heparin, natriumcitrat, CPDA-1 og ACD. Prøver, som indsamles i antikoagulantrør, skal fylde røret helt op som noteret på etiketten for at undgå utilsigtet fortynding. Separer serummet eller plasmaet fra de koagulerede eller røde celler, så snart det er muligt, for at undgå eventuel hæmolyse. Udbredt hæmolyse kan påvirke testresultatet. Prøvemateriale med observerbare partikler skal renses ved centrifugering forud for testen. Opslæmmede fibrinaggregater eller -partikler kan give fejlagtigt positive resultater. Cellekulturprøver, som skal fortyndes før testen, skal fortyndes med et cellekulturmedium svarende til det, der er anvendt for at dyrke cellerne. ANVEND IKKE VARME-INAKTIVERET PRØVEMATERIALE. Prøverne skal opbevares ved 2-8 C, hvis screeningen udføres inden for 7 dage, eller dybfryses ved -20 C. Plasmaprøver skal tøs hurtigt op ved få minutters opvarmning i vandbad ved 40 C (for at undgå fibrinudfældning). På grund af HIV Ag sustabilitet kan temperaturer over 40 C ikke anvendes. Prøver, der har været nedfrosset og optøet mere end tre gange, kan ikke anvendes. Hvis prøvematerialet skal sendes, skal det pakkes ifølge de gældende regulativer angående transport af ætiologiske agenser. UNDGÅ AT ANVENDE KONTAMINERET, HYPERLIPÆMISK ELLER HYPERHÆMOLYSERET SERUM ELLER PLASMA. Bemærk : Prøver, der indeholder op til 80 mg/l bilirubin, 36 mg/l Immunoglobulin M eller G, lipæmiske prøver, der indeholder mængder op til det, der svarer til 5 g/l lipider og hæmolyserede prøver, der indeholder op til 5 g/l hæmoglobin, påvirker ikke resultaterne. 8 - REKOMSTITUERING AF REAGENSER BEMÆRK : Lad reagenserne stabilisere sig ved stuetemperatur (18-30 C), før de anvendes, med undtagelse af koncentreret konjugat 1 og 2 (R4 og R5). Brugsklare reagenser: Reagent R1 : Mikrotiterplade Hver støtteramme indeholder 12 teststrimler, der er pakket i en forseglet foliepose. Åbn posen med en saks eller skalpel 0,5-1 cm over forseglingen. Åbn posen, og tag rammen ud. Læg de ubrugte strimler tilbage i posen. Luk posen omhyggeligt, og opbevar den ved +2-8 C. Reagent R3 : Prøvefortynder Reagent C0 : Negativt Kontrol Reagent C1 : Positivt Kontrol Reagent R10 : Stopopløsning 66

7 Reagenser til rekonstituering: Koncentreret Skylleopløsning (20X) : R2 Opløs reagensen 1:20 i destilleret vand for at få en brugsklar vaskeopløsning. Forbered 800 ml til énplade med 12 teststrimler. BEMÆRK : Genscreen Assay Wash Solution Concentrate (30X), et komponent i andre genetiske systemtestkits, kan også anvendes i denne analyse. Fortynd 1 del koncentrat med 29 dele vand. Konjugatopløsning 1 (R4 + R6) og Konjugatopløsning 2 (R5 + R6) Konjugaterne 1 (R4) og 2 (R5) leveres som 100X koncentrater. Fremstil separat konjugatopløsning 1 og konjugatopløsning 2 ved at fortynde hver konjugat 1:101 i konjugatfortynder (R6). Forbered det i rene plastikbeholdere. Noter konjugatkoncentrationens lotnummer, dato og tidspunkt for tilberedelsen samt dato og tidspunkt for udløb (24 timer fra tilberedelsen) på beholderen. Bland arbejdsreagenserne forsigtigt før brug. Efter blanding er konjugatopløsning 1 gul og konjugatopløsning 2 grøn. Forberedelse af konjugatopløsning 1 eller 2 ved strimmel Antal strimler der skal bruges * 24** Mængde konjugat Koncentrat (µl) Mængde konjugat Fortynder (ml) * En fuld plade; **To fulde plader Farveudviklingsopløsning (R8 + R9) Opløs kromogenet (R9) 1:11 i buffersubstratet (R8). (Eksempel: 1 ml R9-reagens +10 ml R8-reagens). Der skal bruges 10 ml til mellem 1 og 12 teststrimler. Bland. 9 - OPBEVARINGSBETINGELSER - HOLDBARHED Kittet skal opbevares ved 2-8 C. Hver reagens i Genscreen HIV-1 Ag Assay-kittet kan efter åbning anvendes indtil den på pakken anførte udløbsdato, medmindre andet er angivet: R1 : Når du har åbnet den vakuum-forseglede pose, kan teststrimlerne med mikropladebrønde bruges i en måned, når de opbevares ved +2-8 C i den omhyggeligt forseglede pose. R2 : Den fortyndede vaskeopløsning kan opbevares ved stuetemperatur (2-30 C) i 2 uger. Den koncentrerede vaskeopløsning (R2) kan opbevares ved C. R8 - R9 : Efter rekonstitution kan reagenset, når det opbevares i mørke, bruges i 6 timer ved stuetemperatur (18-30 C). R4 - R5 : Efter rekonstitution kan reagenset bruges i 24 timer ved stuetemperatur (18-30 C) ANALYSEPROCEDURE To procedurer til påvisning af HIV-1 p24 Antigen i humant serum, plasma eller cellekulturprøver beskrives nedenfor : Fremgang småde Prøvemateriale inkubation 37 ± 1 C, varmeskab, 60 ± 5 min. 40 ± 1 C, varmeskab, 60 ± 5 min. Konjugat 1 inkubation 37 ± 1 C, varmeskab, 30 ± 5 min. 40 ± 1 C, varmeskab, 30 ± 5 min. Konjugat 2 inkubation 37 ± 1 C, varmeskab, 30 ± 5 min. 40 ± 1 C, varmeskab, 30 ± 5 min. Farve fremkaldning 18 till 30 C, i mørke, 30 ± 5 min. 18 till 30 C, i mørke, 30 ± 5 min. 37 C inkubation 40 C inkubation For prøver, som oprindelig er testet ved enten 37 C eller 40 C, skal der anvendes samme procedure til evt. gentagen testning eller bekræftelse. Den forventede kørselstid for denne procedure er ca. 3h30-4h00 fra det første inkubationstrin startes. Hver analyse skal køres færdig uden afbrydelse, når den først er påbegyndt. Der skal køres to positive og tre negative kontrolprøver på hver plade. Det er nødvendigt med tre cellekulturmediumkontroller i stedet for kittets negative kontrol (C0), når der testes cellekulturprøver. Cut-off for patientprøver bestemmes af kontrollerne på den enkelte plade. Undgå at udsætte pladerne for lys under det sidste inkubationstrin (efter tilsætning af TMB-opløsningen). Følg nøje den angivne procedure under iagttagelse af regler for god laboratoriepraksis : 2009 Bio-Rad 67

8 1. Fastlæg prøvefordelingen og identifikationsoversigten omhyggeligt. 2. Klargør den fortyndede vaskeopløsning. 3. Tag transportbakken og teststrimlerne (R1) ud af beskyttelsesposen. 4. Anvend direkte uden forudgående vask af pladen og i rækkefølge: µl fortynder i hver brønd µl negativt kontrolserum (C0) i brønd A1, B1 - C µl positivt kontrolserum (C1) i brønd D1-E µl prøvemateriale i brønd G1 osv Afhængig af det anvendte system er det muligt at ændre placering af kontrollerne ellerdistribueringsrækkefølgen. Det er nødvendigt med tre cellekulturmedium-kontrolprøver i stedet for kittets negative kontrol, når der testes cellekulturprøver. Sørg for, at prøvefortynderen er blandet godt med prøven (eller kontrollen). N.B : Fordelingen af prøvematerialet kan kontrolleres visuelt på dette stadium af processen: Efter tilsætning af prøven skifter fortynderen farve fra grøn til blå for at bekræfte, at en prøve (eller kontrol) er tilsat brønden. Når det er blandet ordentligt, har indholdet i hver brønd en ensartet farve. Nogle cellekulturprøver skifter ikke farve, afhængig af hvilket cellekulturmedium der er anvendt. (Se afsnit 12 om automatisk kontrol - SPEKTROFOTOMETRISK KONTROL AF PRØVEPIPETTERING). 5. Afdæk mikrotiterpladen med selvklæbende film, hvis dette er muligt. Pres filmen ned over hele pladen, så en tæt forsegling sikres. 6. Mikrotiterpladen inkuberes i 60 ± 5 minutter ved 37 ± 1 C eller 40 ± 1 C i et varmeskab. 7. Fjern den selvklæbende film. Sug indholdet af alle brønde op i en beholder til farligt biologisk affald (en beholder med natriumhypoklorit). Tilføj mindst 0,370 ml vaskeopløsning til hver brønd. Vent sekunder. Sug igen. Gentag denne procedure fire gange (dvs. alt i alt mindst 5 vask). Restmængden skal være mindre end 10 µl (hvis det er nødvendigt, kan pladen tørres ved at lægge den med bagsiden opad på sugende papir). Hvis der bruges en automatisk vasker, skal den samme procedure følges(se afsnit 10: Analyseprocedure). 8. Fordel hurtigt 100 µl af konjugat 1 opløsningen i alle brøndene. Konjugatet skal rystes forsigtigt før brug. NB : Fordelingen af konjugatopløsning 1, der er farvet gul, kan kontrolleres visuelt på dette stadium i processen. 9. Afdæk mikrotiterpladen med selvklæbende film, hvis dette er muligt. Mikrotiterpladen inkuberes i 30 ± 5 minutter ved 37 ± 1 C eller 40 ± 1 C i et varmeskab. 10. Fjern den selvklæbende film. Sug indholdet af alle brønde op i en beholder til farligt biologisk affald (en beholder med natriumhypoklorit). Tilføj mindst 0,370 ml vaskeopløsning i hver brønd. Vent sekunder. Sug igen. Gentag denne procedure fire gange (dvs. alt i alt mindst 5 vask). Restmængden skal være mindre end 10 µl (hvis det er nødvendigt, kan pladen tørres ved at lægge den med bagsiden opad på sugende papir). 11. Fordel hurtigt 100 µl af konjugat 2 opløsningen i alle brøndene. Konjugatet skal rystes forsigtigt før brug. NB : Fordelingen af konjugatopløsning 2, der er farvet grøn, kan kontrolleres visuelt på dette stadium i processen. 12. Afdæk mikrotiterpladen med selvklæbende film, hvis dette er muligt. Mikrotiterpladen inkuberes i 30 ± 5 minutter ved 37 ± 1 C eller 40 ± 1 C i et varmeskab. 13. Fjern den selvklæbende film, tøm alle brønde ved opsugning, og vask mindst fem gange som beskrevet ovenfor. Restmængden skal være mindre end 10 µl (hvis det er nødvendigt, kan teststrimlerne tørres ved at lægge dem omvendt på sugende papir). 14. Fordel hurtigt 100 µl nyforberedt udviklingsopløsning (R8 + R9) i hver brønd. Lad reaktionen foregå i mørke i 30 ± 5 minutter ved stuetemperatur (18-30 C). Undgå at bruge selvklæbende film under dyrkningen. N.B.: Fordelingen af udviklingsopløsningen, der er farvet pink, kan kontrolleres visuelt på dette stadie i manipulationen. Der er en tydelig farveforskel på en tom brønd og en brønd med den pink-farvede substratopløsning (se afsnit 12 om automatisk kontrol : SPEKTROFOTOMETRISK KONTROL AF PRØVE- OG REAGENSPIPETTERING). 15. Tilføj 100 µl stopopløsning (R10) i samme rækkefølge og med samme distributionsfrekvens som for substratopløsningen. Homogeniser reagensblandingen. N.B.: Fordelingen af stopopløsningen, der er ufarvet, kan kontrolleres visuelt på dette stadie i manipulationen. Efter tilsætningen af stopopløsningen forsvinder den pink farve i substratet (for de negative prøver) eller bliver blå til gul (for de positive prøver). 16. Tør undersiden af pladen forsigtigt af. Mindst fire minutter efter tilsætning af stopopløsningen og senest 30 minutter efter at reaktionen er stoppet aflæses den optiske densitet ved 450/ nm ved hjælp af en mikropladeaflæser. 17. Kontroller, at alle resultater stemmer overens, hvad angår aflæsning, plade, prøvefordeling og identifikationsoversigt BEREGNING OG FORTOLKNING AF RESULTATERNE 1 - Validering af resultater En kørsel er gyldig, hvis følgende kriterier er opfyldt : Absorptionsværdien for hver Negativ Kontrol (NC) (eller cellekulturkontrol, hvis det er relevant) er større end 0,000 68

9 AU og mindre end eller lig med 0,100 AU. En negativ kontrolværdi kan kasseres, og middelværdien af de negative kontroller kan udregnes på basis af de resterende to værdier. Middelværdien for de negative kontroller kan udregnes på basis af de resterende to absorptionsværdier. Hvis to eller flere negative kontroller ligger uden for grænseværdierne, er pladen ugyldig og må laves om. Middelabsorptionsværdien af de positive kontroller (PCX) skal være større end eller lig med 0,500 AU, og de individuelle absorptionsværdier skal ligge inden for en reproduktionsgrænse på 0,65 til 1,35 gange PCX'en. Positive kontrolværdier må ikke kasseres. 2 - Udregning af middelabsorptioner På basis af de validerede kontrolprøver bestemmes middelabsorptionerne for de negative kontroller og positive kontroller ved at dele summen af deres absorptionsværdier med antallet af acceptable kontroller. 3 - Cut-off-værdi Bestem cut-off-værdien ved at lægge 0,070 til NC middelværdien (NCX) som vist i eksemplet nedenfor. Cut-off = NCX Eksemplet : NCX = Cut-off = = Fortolkning af resultater Tilstedeværelsen af HIV-1 antigen, bestemmes ved at sammenholde prøvens absorptionsværdi med cut-offværdien. Prøvemateriale med absorptionsværdier på <0,000 skal tages om. De, der har værdier, som overskrider mikrotiteropladelæserens øvre lineære grænser, skal rapporteres som reaktive. Prøvemateriale med absorptionsværdier under cut-off-værdien betragtes som ikke-reaktive ved Genscreen HIV-1 Antigen Assay og kan betragtes som negativ for HIV-1 Antigen. Der kræves ingen yderligere test. Prøver med absorptionsværdier, der er lig med eller større end cut-off-værdien, betragtes som indledningsvis positive af Genscreen HIV-1 Antigen Assay. Prøver, som er indledningsvis reaktive, skal gentestes i to eksemplarer for at validere det første testresultat. Hvis absorptionsværdien af begge de to prøveeksemplarer ligger under cutoff-værdien efter den nye test, kan den oprindelige prøve betragtes som ikke-gentagen reaktiv og negativ for HIV- 1 antigen. Årsager til ikke-gentagne reaktive prøver kan være : utilstrækkelig vask af mikrotiterplader krydskontaminering af ikke-reaktive prøver med HIV-1 Ag fra højtiter prøvemateriale kontaminering af substratbufferen med iltningsmiddel (natriumhypoklorit, metalioner, osv.) kontaminering af stopopløsningen Hvis absorptionsværdien af en af de to prøveeksemplarer ligger over eller er lig med cut-off værdien efter den gentagne test, er det første resultat reproducerbart, og prøven skal betragtes som reaktiv med Genscreen HIV-1 Antigen Assay i overensstemmelse med grænserne beskrevet herfor. Prøver, som er blevet fundet gentaget reaktive ved Genscreen HIV-1 Antigen Assay, bør bekræftes med Genscreen HIV-1 Antigen Confirmatory Assay (Product No ). Prøven kan kun betragtes som positiv for HIV-1 antigen, hvis HIV-1 antigenet er positivt med den bekræftende procedure SPEKTROFOTOMETRISK KONTROL AF PRØVE PIPETTERING Kontrolpipettering af prøve Når prøvefortynderen (R3) og prøverne er fordelt, kan det kontrolleres, at de prøver, som skal testes, findes i brøndene ved hjælp af en spektrofotometrisk læsning ved 620 nm : Den optiske densitet for en brønd med prøvemateriale er større end 0,250 (mindre OD angiver manglende fordeling af prøvematerialet). BEMÆRK : Cellekulturprøver ændre eventuelt ikke farve afhængigt af cellekulturmedium. I så fald må den automatiske bekræftelse ikke anvendes. Kontrolpipettering af udviklingsopløsning Du kan kontrollere, at der er pink udviklingsopløsning i brøndene ved hjælp af en automatisk læsning ved 490 nm. En brønd med udviklingsopløsning skal have en optisk densitet større end 0,100 (lavere OD angiver dårlig fordeling af udviklingsopløsningen) YDEEVNE Sensitivitet 138 patienter smittet med HIV i forskellige stadier (AIDS, ARC, andre) er testet og fundet positive med testen Genscreen HIV-1 Antigen Assay. 20 veldokumenterede serokonverteringspaneler blev studeret. Resultaterne er sammenlignelige med dem, som er set ved andre HIV Ag-ananlyser. 55 cellekultur-supernatanter af HIV 1 (53 gruppe M og 2 gruppe O) og fortyndingspanelet Ag VIH SFTS 96 er blevet fundet positive med Genscreen HIV-1 Antigen Assay testen med undtagelse af to fortyndinger af gruppe O cellekultur-supernatanter Bio-Rad 69

10 - De 53 cellekultur supernatanter af HIV-gruppen M består af følgende genotyper: 10 genotyper A, 10 B, 9 C, 5 D, 11 E, 2 F, 2 G, 1 H, 2 J og 1 N. - Fortyndingspanelet Ag VIH SFTS 96 omfatter følgende genotyper: A, B, C, D, E, F, G, H genotyper fra gruppe M og 1 fra gruppe O. Analytisk sensitivitet Testens sensitivitetsgrænse er vurderet på en række fortyndinger, der er forberedt efter den franske standard (renset viralt lysat af genotype B i negativt citratplasma), og BBI-panelet (PRA 801). Sensitivitetsgrænsen er bedømt til 8 pg/ml Ag HIV uanset fremgangsmåde. Kalibreringskurven opnået med HIV-1 Ag Standard (kode 72217) kalibreret prøve er lineær mellem 0 og 100 pg/ml. Diagnostisk specificitet Den diagnostiske specificitet, der er evalueret på : 4038 bloddonorer, er bedømt til 99,95%. 209 kliniske patienter, er bedømt til 100%. Et panel på 105 patientprøver er testet. Det består af prøver: Som indeholder antistoffer mod HAV, HCV, HTLV, HSV, EBV, Rubelle, Toxoplasma Gondii, Treponema Pallidum, CMV. Som indholder auto-ab, IgG, IgM reumatoid faktor. Fra gravide kvinder, population med skrumpelever, population med mange transfusioner og patienter med SLE (Systemic Lupus Erythematosus). Der blev kun fundet en prøve, der kom fra en patient med SLE (Systemic Lupus Erythematosus), som var reaktiv med Genscreen HIV-1 Ag Assay testen, men ikke blev bekræftet med den bekræftende test. Nøjagtighed Reproducerbarheden i samme analysserie er vurderet ved at teste tre positive prøver og en negativ prøve 30 gange i samme kørsel. Reproducerbarheden mellem analyseserier er vurderet ved at teste tre positive prøver og en negativ prøve i fem dage med to forskellige teknikere. Variationskoefficienten for positive prøver var mindre end 10% TESTENS BEGRÆNSNINGER Genscreen HIV-1 Antigen Assay-procedure og fortolkning af resultater skal følges ved test af serum, plasma eller cellekulturprøver for tilstedeværelsen af HIV-1 antigen. Det anbefales brugeren af kittet at læse pakkens indlægsseddel grundigt, før testen udføres. Især skal testproceduren følges omhyggeligt hvad angår prøve- og reagenspipettering, vask af plader og tiderne for inkubationstrinnene. En bestegnelse som reaktiv over for HIV-1 antigen må ikke baseres på et enkelt reaktivt testresultat. Der skal udføres yderligere test, som bekræftende testkørsler, for at fastlægge specificiteten af prøvemateriale, som er reaktivt på screeningproceduren. Alle immunanalyser med høj sensitivitet har mulighed for at give ikke-specifikke reaktioner, som kan føre til falske positive resultater. Antallet af falske reaktiver afhænger af testkittets sensitivitet og specificitet. Der kan opstå negative resultater, hvis mængden af den tilstedeværende markør i prøven er for lav til analysens konstateringsgrænser, eller hvis markøren, som konstateres, ikke findes på det stadium af sygdommen, hvor prøven er taget. Med variationen af HIV-virus kan muligheden for falskt negative resultater ikke udelukkes. Ingen kendt testmetode kan give fuld sikkerhed for, at der ikke forefindes HIV-virus. Undlader man at tilføre prøvemateriale eller reagens efter instruktionerne i proceduren, kan det give falske negative resultater. Det bør overvejes at gentage testen, hvor der er mistanke om kontaminering eller en procedurefejl. En absorptionsværdi på under 0,000 AU antyder en procedure- eller instrumentfejl, og testen skal i så fald tages om. Faktorer, som kan påvirke resultaternes validitet, er bl.a. at undlade at tilsætte prøvemateriale i brønden, utilstrækkelig vask af mikrotiterpladebrønde, at undlade at følge de opgivne inkubationstider og -temperaturer, tilsætning af forkerte reagenser i brøndene, tilstedeværelse af metaller eller stænk af natriumhypoklorit i brøndene. Testens funktion er ikke vurderet på post mortem-prøver eller biologiske væsker ud over serum, plasma eller cellekulturprøver. Ved cellekulturprøver må prøvefortynderne ikke ændre farve efter cellekulturmediet. Selvom den analytiske sensitivitet er bedømt til 8 pg/ml under testens vurderinger, kan den variere efter funktionsbetingelserne og variationer i batchen. Derfor garanterer Bio-Rad kun en analytisk sensibilitet under 15 pg/ml. Den kolorimetriske metode til kontrol af prøve-, konjugat- og udviklingsopløsningsfordelingen kontrollerer ikke nøjagtigheden af de fordelte mængder. Denne metode viser kun forekomsten af prøvemateriale, konjugat og udviklingsopløsning i brønde. Fejlprocenten ved denne metode er tæt forbundet med nøjagtigheden af det anvendte system (en kumuleret variationskoefficient på mere end 10% for fordelingen og aflæsningen nedsætter kvaliteten af kontrollen markant). 70

11 I tilfælde af meget dårlig vaskeeffektivitet efter inkubationen af konjugatet kan den automatiske kontrol af pipettering af udviklingsopløsning (ved aflæsning af brøndenes OD ved 490 nm) give forkerte resultater med OD over 0,100 uden udviklingsopløsning. Dette fænomen er imidlertid aldrig observeret under bedømmelsen af 939 testede prøver REFERENCER 1. Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, et al: Isolation of T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome(aids). Science 220: , Gallo RC, Salahuddin SZ, Popovic M, et al: Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLVlll) from patients with AIDS and at risk for AIDS. Science 224: , Coffin J, Haase A, Levy JA, et al: What to call the AIDS virus? Nature 321:10, Van der Graff M, Diepersloot R: Transmission of human immunodeficiency virus (HIV/ HTLV-III/ LAV): a review, Infection 14: , Weis R: Retrovirus and human disease. J Clin Pathol 40: , Tovo P, Gabiano C, Riva C, et al: Specific antibody and virus antigen expression in congenital HIV infection, Lancet 1:1201, Tegtmeier G: Current tests for serologic detection of HlV-1 infection. J Clin lmmunoassay 11: , Schumacher R, Garrett P, Tegtmeier G, et al: Comparative detection of anti-hiv in early HIV seroconversion. J Clin lmmunoassay 11: , Casey JM, Kim Y, Andersen PR, et al: Human T-cell lymphotropic virus type III: immunologic characterization and primary structure analysis of the major internal protein, p24. J Virology 55: , Ritter J, Escaich S, Trepo C, et al: HIV antigen detection in antibody negative sera. Abstract 1627, IV International Conference on AIDS, Veronese FD, Sarngadharan MG, Rahman R, et al: Monoclonal antibodies specific for p24, the major core protein of human T-cell Leukemia virus type III. Natl Acad Sci USA, 82: , Schaeffler B, Flesher A, Shriver K, Tam MR: Monoclonal antibody detection of p25 HIV antigen in the serum and CSF of patients within the AIDS spectrum. Abstract 7759, IV International Conference on AIDS, Bos ES, van der Doelen AA, van Rooy N, Schurs AHWM: 3,3',5,5' - Tetramethylbenzidine as an Ames test negative chromogen for horseradish peroxidase in enzyme immunoassay. J lmmunoassay 2: , Garner RC, Walpole AL, Rose FL: Testing of some benzidine analogues for microsomal activation to bacterial mutagens. Cancer Letters 1:39-42, Resnick L, Veren K, Salahuddin SZ, et al: Stability and inactivation of HTLV-III/LAV under clinical laboratory environments. JAMA 255: , Sarngadharan MG, Markham PD: The role of human T-Lymphotropic retroviruses in leukemia and AIDS, in Wormser GP (ed.): AIDS and Other Manifestations of HlV Infection. New Jersey, Noyes Publications 1987, pp Bond WW, Favero MS, Petersen NJ, et al: Inactivation of Hepatitis B virus by intermediate-to-high level disinfectant chemicals. J Clin Micro 18: , Bio-Rad 71

12 IVD (GB) - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) (FR) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) (ES) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) (IT) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) (DE) - CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) (PT) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) (SE) - CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik) (DK) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) (GR) - CE ( 98/79/CE in vitro ) (PL) - CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro) (LT) - CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų) (HU) - CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről) (EE) - CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta) (SK) - CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy) (CZ) - CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro) (NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk) (RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro) (BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия) (GB) - For in vitro diagnostic use (GB) - Catalogue number (FR) - Pour diagnostic in vitro (FR) - Référence catalogue (ES) - Para diagnóstico in vitro (ES) - Número de catálogo (IT) - Per uso diagnostico in vitro (IT) - Numero di catalogo (DE) - In-vitro-Diagnostikum (DE) - Bestellnummer (PT) - Para uso em diagnóstico in vitro (PT) - Número de catálogo (SE) - In vitro-diagnostik (SE) - Katalognummer (DK) - In vitro diagnose (DK) - Katalognummer (GR) - in vitro (GR) - (PL) - Do stosowania in vitro (PL) - Numer katalogu (LT) - in vitro diagnostikai (LT) - Katalogo numeris (HU) - Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra (HU) - Cikkszám (EE) - In vitro diagnostiliseks kasutamiseks (EE) - Katalooginumber (SK) - Na diagnostiku in vitro (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Pro diagnostiku in vitro (CZ) - Katalogové číslo (NO) - Til in vitro-diagnostikk (NO) - Katalognummer (RO) - Pentru diagnostic in vitro (RO) - Număr de catalog (BG) - За ин витро диагностика (BG) - Каталожен номер (GB) - Manufacturer (GB) - Authorised Representative (FR) - Fabricant (FR) - Représentant agréé (ES) - Fabricante (ES) - Representante autorizado (IT) - Produttore (IT) - Distributore autorizzato (DE) - Hersteller (DE) - Bevollmächtigter (PT) - Fabricante (PT) - Representante Autorizado (SE) - Tillverkad av (SE) - Auktoriserad representant (DK) - Fremstillet af (DK) - Autoriseret repræsentant (GR) - (GR) - (PL) - Producent (PL) - Upoważniony Przedstawiciel (LT) - Gamintojas (LT) - Įgaliotasis atstovas (HU) - Gyártó (HU) - Meghatalmazott Képviselő (EE) - Tootja (EE) - Volitatud esindaja (SK) - Výrobca (SK) - Autorizovaný zástupca (CZ) - Výrobce (CZ) - Zplnomocněný zástupce (NO) - Produsent (NO) - Autorisert representant (RO) - Producător (RO) - Reprezentant autorizat (BG) - Производител (BG) - Упълномощен представител (GB) - Batch code (GB) - Expiry date YYYY/MM/DD (FR) - Code du lot (FR) - Date de peremption AAAA/MM/JJ (ES) - Código de lote (ES) - Estable hasta AAAA/MM/DD (IT) - Codice del lotto (IT) - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG (DE) - Chargen-Bezeichnung (DE) - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT (PT) - Código do lote (PT) - Data de expiração AAAA/MM/DD (SE) - Batchnr (SE) - Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD (DK) - Batchkoden (DK) - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD (GR) - (GR) - YYYY/MM/DD (PL) - Numer serii (PL) - Data ważności YYYY/MM/DD (LT) - Serijos numeris (LT) - Galioja iki YYYY/MM/DD (HU) - Gyártási szám (HU) - Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN (EE) - Partii kood (EE) - Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP (SK) - Číslo šarže (SK) - Použiteľné do RRRR/MM/DD (CZ) - Číslo šarže (CZ) - Datum exspirace RRRR/MM/DD (NO) - Partikode (NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD (RO) - Număr de lot (RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ (BG) - Партиден номер (BG) - Срок на годност година/месец/ден

13 (GB) - Storage temperature limitation (FR) - Limites de températures de stockage (ES) - Temperatura límite (IT) - Limiti di temperatura di conservazione (DE) - Lagertemperatur (PT) - Limites de temperatura de armazenamento (SE) - Temperaturbegränsning (DK) - Temperaturbegrænsning (GR) - (PL) - Temperatura przechowywania (LT) - Saugojimo temperatūriniai apribojimai (HU) - Tárolási hőmérsékleti határok (EE) - Piirangud säilitustemperatuurile (SK) - Skladovacia teplota od do (CZ) - Teplotní rozmezí od do (NO) - Oppbevaringstemperatur (RO) - Limitele de temperatură la stocare (BG) - Температурни граници на съхранение (GB) - Consult Instruction for use (FR) - Consulter le mode d'emploi (ES) - Consulte las instrucciones de uso (IT) - Consultare le istruzioni per uso (DE) - Siehe Gebrauchsanweisung (PT) - Consulte o folheto informativo (SE) - Se bruksanvisningen (DK) - Se instruktion før brug (GR) - (PL) - Sprawdź instrukcję (LT) - Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje (HU) - Olvassa el a használati utasítást (EE) - Kasutamisel vaata instruktsiooni (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Viz návod k použití (NO) - Se bruksanvisninger (RO) - Consultati prospectul de utilizare (BG) - Виж инструкцията за употреба

14 Bio-Rad 3, bd Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette - France Tél.: /2009 Fax.: Code: