En sammenligning af farvekvalitet og økonomi

Transkript

1 Evaluering af monoklonale murine og kaninantistofkloner til Desmin, TTF-1 og CD1a En sammenligning af farvekvalitet og økonomi Udarbejdet af bioanalytikerstuderende fra VIA University College, December 2015 Ditte Beck Pedersen og Jeanette Bojsen Klinisk vejleder: Gitte Woldum Institutionsvejleder: Helen Nordahl Madsen Antal anslag79.271

2 Forord Dette projekt er udført på Patologisk Anatomisk Institut, Sygehus Vendsyssel, Hjørring, hvorfor vi gerne vil rette en tak til afdelingen. En særlig tak skal lyde til Jytte Tved, som har hjulpet os i immunhistokemisk laboratorie. Dernæst en tak til de behjælpelige patologer på afdelingen, som har hjulpet os i forbindelse med tumordiagnostik. Slutteligt en stor tak til I-vejleder Helen Nordahl Madsen og K-vejleder Gitte Woldum, for deres konstruktive kritik, samt vejledning igennem hele projektets forløb. D Ditte Beck Pedersen & Jeanette Bojsen Side 1 af 106

3 Indhold Forord... 1 Resumé... 5 Introduktion... 6 Baggrund og formål... 6 Problemformulering... 7 Målformulering... 7 Teori... 9 Immunhistokemi... 9 Analyseprincip og anvendt detektionssystem... 9 EnVision Kvalitetssikring...10 Intern kvalitetssikring...10 Ekstern kvalitetssikring...11 Antistoffer...12 Desmin...12 TTF CD1a...15 Materialer...17 Udvælgelse af væv...17 Konstruering af multiblokke...19 Reagenser...19 Apparatur...20 Metode...21 Forsøgsdesign...21 Undersøgelse af farveresultat...21 Undersøgelse af økonomiske konsekvenser...24 Side 2 af 106

4 Scoringssystemer...24 Desmin...25 TTF CD1a...29 Analysemetode...30 Resultater...31 Undersøgelse af farveresultat...31 Optimering af analyseprotokollerne for de tre nye antistofkloner...31 Sammenligning af farveresultaterne fra de nye antistofkloner med farveresultaterne fra referencerne...42 Undersøgelse af økonomiske konsekvenser...45 Desmin...45 TTF CD1a...45 Diskussion...46 Undersøgelse af farveresultatet...46 Optimering af analyseprotokollerne for de tre nye antistofkloner Sammenligning...51 Økonomiske konsekvenser...56 Desmin...56 TTF CD1a...56 Metode...57 Konklusion...58 Perspektivering...59 Referenceliste...60 Bilag Side 3 af 106

5 Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag 15 rådata...99 Side 4 af 106

6 Resumé Formål: For antistofferne Desmin, TTF-1 og CD1a evaluerer dette projekt, tre monoklonale kaninantistofkloner fra producenten CELL MARQUE og tre monoklonale murine antistofkloner fra producenterne DAKO og NOVOCASTRA. Formålet var at undersøge, hvilken betydning det har for resultatet ved immunhistokemisk farvning, og hvilke økonomiske konsekvenser det vil have for Patologisk Anatomisk Institut Sygehus Vendsyssel (PAI), at anvende antistofklonerne fra CELL MARQUE, fremfor de nuværende leverandører DAKO og NOVOCASTRA. Projektet udarbejdes for at bidrage med ny og relevant viden for PAI i forhold til, om det omkostningsmæssigt vil være en fordel, at udskifte de anvendte antistofkloner fra leverandørerne DAKO og NOVOCASTRA med de nye kloner fra CELL MARQUE. Materialer og metode: Den mest optimale fortynding for de tre nye antistofkloner fra producenten CELL MARQUE scores ud fra et scoringssystem specifikt for det enkelte antistof med udgangspunkt i teori fra NordiQC, samt observeret farvemønster fra afdelingens nuværende antistofkloner. Ud fra beregninger af prisen pr. analyse for afdelingens nuværende antistofkloner vurderes det, om der er en økonomisk gevinst, ved at erstatte disse, med de nye antistofkloner fra CELL MARQUE. Resultater: For Desmin (EP15) vurderedes den mest optimale fortynding at være Grundet moderat baggrund i vævscoren Placenta, blev denne scoret Borderline, sammenlignet med afdelingens antistofklon D33, fortynding 1+50, som blev scoret Optimal. EP15 er 16,56 kr. billigere pr. analyse sammenlignet med D33. For TTF-1 opnåedes et lige resultat med scoren Good, mellem afdelingens nuværende antistofklon SPT24 (fortynding 1+100) og antistofklon EP229 (fortynding 1+125) fra CELL MARQUE. Det var ikke muligt, med det anvendte scoringssystem, at give en højere score end Good, grundet manglende positiv farvereaktion i alle cylinderepithelceller i Lungevæv. Prisen pr. analyse for antistofklon EP229 er 5,17 kr. dyrere end afdelingens nuværende antistofklon SPT24. Begge antistofkloner for CD1a fik scoren Optimal, og prisen pr. analyse var identisk klonerne imellem. Den bedste fortynding blev vurderet til at være for EP3622 og er derfor fortyndet +50 mere antistofklon 010. Konklusion: Ved at erstatte Desmin (D33) fra DAKO med Desmin (EP15) fra CELL MARQUE, fås et farveresultat, med en højere grad af baggrund. EP15 leverer et utilstrækkeligt farveresultat i forhold til D33, men den synes mere sensitiv i forhold til farvning af neoplastiske celler i Rhabdomyosarkomet, hvorfor det giver anledning til yderligere undersøgelse. Økonomisk vil der være en besparelse på 16,56 kr. pr. analyse, ved at anvende Desmin (EP15). For TTF-1 og CD1a er der opnået identiske scoringer sammenlignet med afdelingens nuværende antistofkloner samtidig med, at der økonomisk er en merudgift på 5,17 kr. pr. analyse ved brug af TTF-1 (EP229) i forhold til TTF-1 (SPT24) mens der ingen økonomisk forskel er mellem CD1a (010) og CD1a (EP3622) fra CELL MARQUE. Side 5 af 106

7 Antal immunhistokemiske analyser Jeanette Bojsen VIA University College Introduktion Baggrund og formål Sundhedssektoren har igennem de seneste år skullet spare en stor sum penge grundet stigende priser og forbrug indenfor blandt andet medicin (1). I Region Nordjylland skal der ifølge budgetforliget for 2016 spares 205 mio. kr. på sygehusområdet (1). For Sygehus Vendsyssel betyder det, at der skal spares 32 mio. kr. (2). Patologisk Anatomisk Institut(PAI) Sygehus Vendsyssel er i den forbindelse pålagt, at spare omkring kr. Afdelingen er derfor interesseret i, at undersøge hvilke muligheder, der er for besparelse på de forskellige områder. Der er en øget anvendelse af immunhistokemiske analyser til diagnostisk udredning (3). På figur 1 ses antallet af immunhistokemiske analyser på årsbasis for PAI Sygehus Vendsyssel i perioden 2000 til Antal immunhistokemiske analyser på årsbasis Periode/år Figur 1. På grafen ses antallet af immunhistokemiske analyser som Patologisk Anatomisk institut Sygehus Vendsyssel har farvet i perioden år 2000 til Dette vil øge interessen for udviklingen af det immunhistokemiske område. Sammen med udvikling stiger omkostningerne, hvorfor det vil være relevant at undersøge, om det er muligt at spare penge. Afdelingen får løbende tilbud fra forskellige antistofproducenter. Antistofproducenten CELL MARQUE har gjort opmærksom på deres nye monoklonale kaninantistoffer og reklamerer med, at disse er endnu mere Side 6 af 106

8 robuste end tidligere, samt at den høje fortyndingsratio giver mere antistof for pengene (bilag 1). Blandt de nye antistoffer fra CELL MARQUE er Desmin, TTF-1 og CD1a. Disse antistoffer anvendes i forvejen til immunhistokemisk analyse på afdelingen, dog er de anvendte monoklonale antistoffer fra producenterne DAKO (Desmin, CD1a) og NOVOCASTRA (TTF-1) produceret i mus. Diagnostisk indgår antistofferne i paneler som er en sammensætning af udvalgte antistoffer, der anvendes til identifikation og klassifikation ved diagnosticering. Desmin anvendes til udredning af blødvævsneoplasmer, herunder skelnes blandt andet mellem diagnoserne Leimyomer, Leimyosarkomer og Rhabdomyosarkomer (bilag 2). TTF-1 er positiv i Thyroidea follikelceller og parafollikulære celler, samt type II pneumocytter og basale epithelceller fra lunge, og anvendes til at identificere om metastaser har oprindelse i disse organer (bilag 3). CD1a anvendes ved diagnosticering af Histiocytose i Langerhanske celler og Interdigiterende dendritiske celler fra blandt andet hud og lymfatisk væv (bilag 4). Formålet med projektet er at undersøge, om de nye antistofkloner fra CELL MARQUE, kan levere et lige eller bedre resultat til en billigere pris, sammenlignet med de antistofkloner, der allerede anvendes på afdelingen. Dette vil bidrage med ny og relevant viden for afdelingen i forhold til, om det omkostningsmæssigt ville være en fordel, at udskifte de anvendte antistoffer med de nye kloner fra CELL MARQUE. Udover det omkostningsmæssige aspekt, vil vi undersøge hvilken indflydelse det har på farveresultatet at anvende disse kloner. Problemformulering Hvilken betydning har det for resultatet ved immunhistokemisk farvning, og hvilke økonomiske konsekvenser vil det have for Patologisk Anatomisk Institut Sygehus Vendsyssel, at anvende antistofferne Desmin, TTF-1 og CD1a fra antistofproducenten CELL MARQUE, fremfor de nuværende leverandører DAKO og NOVOCASTRA? Målformulering Vi vil undersøge farveresultatet ved at: Optimere analyseprotokollerne for de 3 nye antistofkloner, herunder: o Konstruerer multiblokke med udvalgt væv o Udarbejde et scoringssystem med udgangspunkt i referencen, defineret som afdelingens anvendte antistoffer med tilhørende protokol, og med inspiration til opbygning af systemet fra NordiQC, til vurdering af farveresultaterne (4) o Undersøge og fastlægge den optimale antistoffortynding Side 7 af 106

9 Sammenligne farveresultaterne fra de nye antistoffer med farveresultaterne fra referencerne Vi vil undersøge de økonomiske konsekvenser for Patologisk Anatomisk Institut Sygehus Vendsyssel ved at: Udregne prisen pr. analyse for de nye kloner ud fra den fundne optimale antistoffortynding Udregne prisen pr. analyse for afdelingens anvendte antistofkloner (referencer) Sammenligne de udregnede priser for analyserne med henblik på at finde den billigste Side 8 af 106

10 Teori Immunhistokemi Forud for en immunhistokemisk analyse blokeres for endogen peroxidaseaktivitet. Endogen peroxidaseaktivitet forekommer i celler i det omkringliggende væv (Bilag 5)(3). Visualiseringssystemet EnVision+ anvender et peroxidase enzym, hvilket giver anledning til uspecifik farvning af vævet, hvis ikke der blokeres for den endogene enzymaktivitet. NBF minimerer dette problem, men erytrocytter indeholder pseudoperoxidase, som ikke hæmmes af NBF (3). Vævet forbehandles med varmeinduceret epitopdemaskering (HIER), hvor det opvarmes i en buffer, med formålet at genfinde epitoper, som under fiksering i NBF er blevet skjult af methenbindinger som skal denatureres (Bilag 5). Analyseprincip og anvendt detektionssystem EnVision+ Dette detektionssystem er en indirekte polymerforstærkningsteknik, som bygger på en forstærkning af detektionen af det primære antistof bundet til det specifikke antigen (3). Her anvendes en polymer (dextran-kæde) konjugeret med enzymet Horse Radish Peroxidase (HRP) samt et sekundært antistof i form af ged anti-mus og/eller ged anti-kanin (3). Figur 2: EnVision+ - indirekte polymerforstærkningsteknik opdelt i trin. Trin 1: primært antistof (orange) binder til antigen (blå). Trin 2: Polymer (grøn) konjugeret med HRP (grå) og sekundært antistof (gul), binder det primære antistof på dennes Fc-del. Trin 3: Substratkromogen tilsættes og enzymet peroxidase omsætter H 2 O 2 til et enzymprodukt (DAB+) som udfælder Det primære antistof produceret i mus eller kanin binder til antigenets epitop (Figur 2, trin 1)(3). Side 9 af 106

11 Detektionen af det primære antistof sker ved binding til det sekundære antistof konjugeret til polymeren (Figur 2, trin 2)(3). Visualisering af bindingskomplekset sker ved tilsætning af hydrogen peroxid substrat (H 2 O 2 ) samt kromogenet 3,3 diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB). H 2 O 2 omsættes af HRP til et produkt i form af et brunt præcipitat, som udfælder (Figur 2, trin 3). Ved tilsætning af kobbersulfat, forstærkes farveintensiteten af enzymproduktet, ved at kobberet udfælder ovenpå, og dette kan ses i lysmikroskop (3). Kvalitetssikring Intern kvalitetssikring Multiblokke Den primære anvendelse af multiblokke, som er paraffinblokke indeholdende multiple cylinderformede vævscores udstanset fra et udvalgt område i en vævsbiopsi eller andet patientprøvemateriale, er i forbindelse med screening, kvalitetssikring, diagnostik og til læringsformål. Indenfor det immunhistokemiske felt anvendes multiblokke specielt til testning og karakterisering af nye antistoffer og reagenser med den fordel, at alt vævsmateriale som testes, befinder sig i samme paraffinblok, og undergår den præcis samme behandling ved den immunhistokemiske farvning. Mange analytiske variationer elimineres, og muligheden for sammenligningsstudier øges, ved at bruge en lille mængde reagens, til at analysere en hel række af forskellige væv samtidig (5). Størrelsen og antal af vævscores, samt hvilke væv multiblokken indeholder, varierer og afhænger af analysen og tilgængeligheden af vævsmateriale. Udvælgelsen af inkluderede vævscores i en multiblok gøres på baggrund af overvejelser omkring, hvad farveresultatet skal bringe af viden. Ved testning og optimering af et nyt reagens fx en ny antistofklon, til en i forvejen valideret analyse, kan en lille multiblok indeholdende fem til ti vævscores med tumor- og normalvæv anvendes (4,6). De udvalgte væv til multiblokken, anvendt i undersøgelsen af en ny klon, bør inkludere væv med forskellige grader af antigensekspression. Således tages højde for, at mange tumorer varierer i indholdet af antigen, afhængigt af differentieringsgraden (4). Fremhævet som vigtigt at medtænke, er den lave ekspressionsgrad, som har til formål at sikre, at den optimerede analyse er i stand til, at påvise lav antigensekspression og undgå falsk negative analyseresultater (4). Indholdet af vævscores fra normalvæv giver muligheden for en kendt stabil ekspression af antigenet og et fastlagt reaktionsmønster. Inkludering af tumorvæv med en allerede kendt diagnose, kan anvendes på samme måde som normalvævet, men med det forbehold, at reaktionsmønsteret og graden af antigensekspression ikke er ens i hele tumorvævet (4). Side 10 af 106

12 Vævskontroller Positiv vævskontrol En positiv vævskontrol har til formål at bekræfte, at en immunhistokemisk farvning med indledende demaskering, er udført korrekt efter protokollen, og at resultatet giver det forventede niveau af sensitivitet og specificitet, som fastlagt under den tekniske optimering og validering af analysen (7). For at kunne bekræfte dette, skal kontrolvævet indeholde det søgte antigen med en på forhånd kendt og stabil ekspressionsgrad (7). Hvis en positiv vævskontrol befinder sig på samme objektglas som det testede væv, kan det udover at sikre den overordnede analyseproces, også sikre specifikt for det pågældende objektglas, at udførelsen af alle analysetrin er forløbet optimalt, eksempelvis korrekt additiv af reagenser, der kan vise sig som falsk positive eller falsk negative resultater i kontrolvævet (7,8). Negativ vævskontrol En negativ vævskontrol mangler det søgte antigen. Vævet kan udvælges som et separat væv med nonekspression af antigen, sidestillet med den positive vævskontrol på et objektglas, eller inkorporeret i den positive kontrol, som et område i vævet af strukturer eller celler, der forventes at være negative, på baggrund af en kendt mangel på det relevante antigen. Det tjener til formålet at sikre, at antistoffet har den korrekte specificitet fastlagt til den immunhistokemiske farvning, samt detekterer eventuelle falsk positive reaktioner på grund af uventet krydsreaktivitet af det primære antistof til det negative kontrolvæv (7,8). Ekstern kvalitetssikring NordiQC (4) Nordic Immunohistochemical Quality Control (NordiQC) er en selvstændig non-profit videnskabelig organisation etableret med formålet, at fremme ekstern kvalitetssikring af immunhistokemiske analyser. NordiQC arrangerer tre årlige eksterne kvalitetsvurderinger af immunhistokemiske farvninger, med fem forskellige antigenmarkører jævnligt anvendt til diagnostiske formål, indenfor patologi. Hvert farveresultat bliver ved konsensus vurderet at tilhøre en af kategorierne: Optimal, Good, Borderline eller Poor. Vurderinger gøres på baggrund af; farveintensiteten og lokaliseringen af farvereaktionen i cellen der forventes farvet, baggrundsfarvning, tegn på krydsreaktion og vurdering af kontrastfarvning. For kvalitetsvurdering af en given antistofmarkør udgiver NordiQC en uddybende beskrivelse af optimale vurderingskriterier. Beskrivelsen omfatter, hvad der for alle inkluderede væv forventes at se ved et optimalt farveresultat. Ud fra disse beskrivelser tages stilling til om et laboratories farveresultat er fyldestgørende, hvis ikke, nedgraderes der til de lavere kategorier. I forbindelse med diagnostik, anbefaler NordiQC ikke at Side 11 af 106

13 analyser givet scoren Borderline eller Poor anvendes til dette formål, før en optimering af analysen har fundet sted. Antistoffer Desmin Desmin er et intermediært filament, som er en del af cytoskelettet og ses blandt andet i hjerte, skelet og glatte muskelceller (Bilag 6). Desmin detekteres som en cytoplasmatisk farvereaktion og kan udvise et fibrillært mønster (Bilag 6). Der er udvalgt 6 testvæv med henblik på testning og optimering af antistoffet (tabel 1). Desmin multiblok Vævscore: 1. Chorion 2. Placenta 3. Appendix 4. Rhabdomyosarkom 5. Leimyom 6. Leimyosarkom kar Ekspression af antigen: svag non moderat svag kraftig kraftig Tabel 1: Vævscores på multiblok til Desmin, angivet med corenr., navn på væv samt ekspression af antigen I placenta forventes syncytio- og cytotrophoblaster, at være negative (tabel 1). Cellerne ser ud som på figur 3, der ses ingen farvereaktion i dem. Figur 3: (x13,5) IHC-farvning med Desmin, klon D33, fortynding Placenta med negative syncytiotrophoblaster og cytotrophoblaster. Side 12 af 106

14 Større kar i placentavæv, Chorionkar, indeholder et glat muskellag rundt om karvæggen. Muskelcellerne forventes farvet som i figur 4: Figur 4: (x10) IHC-farvning med Desmin, klon D33, fortynding Placentavæv hvor glatte muskelceller i Chorionkar er farvet. I et Rhabdomyosarkom farver Desmin cytoplasma i runde tumorceller, og spindelcellerne, se figur 5. Figur 5: (x10) IHC-farvning med Desmin, klon EP15, fortynding Rhabdomyosarkom hvor tumorceller er farvet i cytoplasma. En farvning ses af muskelfibre i bindevæv. Side 13 af 106

15 Afbilledet figur 6, visuel fremstilling af godkendt kontrolvæv til Desmin. Figur 6: (x5) IHC-farvning med Desmin, klon D33, fortynding A: Appendix, farvede muskelceller i Lamina muskularis mucosa og muskularis propria, ingen farvereaktion i epithelceller. B: Lever, negative hepatocytter, med sporadiske udfældninger. C: Tonsil, farvet muskelvæv TTF-1 En transkriptionsfaktor er et kerneprotein som bestemmer hvilke gener, der bliver udtrykt i en celle. Thyroid Transkriptions Faktor-1 (TTF-1) bestemmer således hvilke gener der skal aktiveres, og dermed udtrykkes, i blandt andet Thyroidea og Lunge (4). Påvisning af TTF-1 ses som en kernefarvning i celler. For TTF-1 er der udvalgt 3 vævscores til testning og optimering af antistoffet, se tabel 2. TTF-1 multiblok Vævscore: Lever Lunge Nodøs Kolloid Stroma (Thyroidea) Ekspression non svag, moderat, kraftig moderat, kraftig af antigen: Tabel 2: Vævscores på multiblok til TTF-1, angivet med corenr., navn på væv samt ekspression af antigen Side 14 af 106

16 Figur 7: (x20) IHC-farvning med TTF-1, klon SPT24, fortynding A: Lunge, svag kernefarvning af cylinderepithelceller samt moderat kernefarvning af basale epithelceller. B: Thyroidea (Nodøs Kolloid Stroma), Kraftig kernefarvning af follikelceller samt moderat kernefarvning af parafollikulære celler Med TTF-1 ses ingen farvereaktion i leveren (4). I lungevæv forventes mindst en svag kernefarvning i cylinderepithelceller, en som minimum moderat kernefarvning af alle basale epithelceller (Figur 7) og en kraftig kernefarvning af type II pneumocytter i alveolevæggen (4). I Thyroidea forventes en kraftig kernefarvning af follikelcellerne samt en moderat kernefarvning af de parafollikulære celler (figur 7) (4). CD1a CD1a er et MHC I-relateret celleoverfladeglykoprotein (Bilag 7). CD1a påvises i Langerhanske celler og Interdigiterende dendritiske celler (Bilag 7). For CD1a er der udvalgt 4 vævscores til undersøgelsen, se tabel 3. Side 15 af 106

17 CD1a multiblok Vævscore: Ekspression af antigen: Lever Hud Tonsil Lymfe non moderat, kraftig moderat, kraftig moderat, kraftig Tabel 3: Vævscores på multiblok til CD1a, angivet med corenr., navn på væv samt ekspression af antigen Med udgangspunkt i referencen, er følgende farvereaktioner forventelige: Ingen farvereaktion i levervævet. For vævscores Hud og Tonsil, forventes en som minimum moderat membranøs farvning af Langerhanske celler i henholdsvis epidermis i Hud, og det uforhornet flerlaget pladeepithel i Tonsil (Figur 8). Der forventes en kraftig membranøs farvning af Interdigiterende dendritiske celler i dermis i Hud, i underliggende stroma i Tonsil, samt i germinalcentre i Lymfeknude, se figur 8. Som kontrolvæv er anvendt Hud. Figur 8: (x10) IHC-farvning med CD1a, klon EP3622, fortynding A: Epidermis i hud; Langerhanske celler moderat farvning, dermis i hud; Interdigiterende dendritiske celler kraftig farvning. B: Uforhornet flerlaget pladeepithel; Langerhanske celler moderat farvning, underliggende stroma; Interdigiterende dendritiske celler kraftig farvning. C: Lymfe, Interdigiterende dendritiske celler kraftig farvning Side 16 af 106

18 Materialer Udvælgelse af væv Til kontrolvæv anvendes afdelingens standard kontrolblokke for antistofferne, som var forud-produceret af afdelingen selv og påsat de elektrostatisk behandlede objektglas (Tabel 4). Kontrollerne vurderes som godkendt/afvist, ud fra afdelingens beskrivelse af farvereaktion, men har ikke indflydelse på scoringen af vævscores. Anvendt kontrolmateriale Antistof: Desmin TTF-1 CD1a Kontrolblok: K1 TTF HUD Væv: Appendix Positiv farvereaktion i muskelvæv Lever Ingen farvereaktion i leverceller (Svag cytoplasmatisk udfældning kan forekomme) Tonsil Positiv farvereaktion i muskelvæv Thyroidea Kraftig farvereaktion i øjensynligt mere end 50 % af follikelceller, samt de parafollikulære celler Hud Langerhanske celler farves moderat, Interdigiterende dendritiske celler farves kraftig Tabel 4: Kontrolblokke for antistofferne Desmin, TTF-1 og CD1a med angivelse af forventet farvereaktion i de forskellige kontrolvæv Udvælgelsen af væv tog udgangspunkt i teori om de tre antistoffers anvendelse diagnostisk, samt forekomst i normalt væv. NordiQCs assesments og anbefalinger blev brugt som inspiration til Desmin og TTF-1 (4). Efterfølgende lavedes søgninger i Patobank efter SNOMED-koder (Tabel 5). De fundne SNOMED-koder blev anvendt til søgning i blokarkivet i afdelingens interne patologisystem Logica (Tabel 5). Ved anvendelse af SNOMED-koden m, som er en søgning på morfologi, udføres søgning på diagnoser. T står for topografi og ved anvendelse af denne, søges på væv. Koderne kan anvendes i kombination med hinanden hvis man eksempelvis leder efter en diagnose (m-kode) lokaliseret i et bestemt væv (t-kode). Side 17 af 106

19 Desmin Ønsket væv eller diagnose: Anvendte SNOMED-koder: Fundet væv: Leimyom m88900 Uterus Leimyosarkom m88903 Uterus Rhabdomyosarkom m89003 Testis CD1a Ønsket væv eller diagnose: Anvendte SNOMED-koder: Fundet væv: Normal hud t01000 Normal hud Tonsil t61100 Ganetonsil Lymfeknude t08000 Lymfeknude Tabel 5: SNOMED-koder anvendt til søgning af væv med angivet diagnose for antistofferne Desmin og CD1a I afdelingens vævsarkiv blev der foretaget tilfældig udvælgelse af væv fra patientvævsprøver. En tilfældig udvælgelse kunne lade sig gøre for de væv, hvor der er ekspression af antigen i normalvæv. Det undersøgtes om udvalgte patientvævsprøver var besvaret, og dermed afsluttet for undersøgelse. Dette var en forudsætning for, at vævet kunne anvendes, da undersøgende patolog eventuelt kunne have brug for mere af det udtaget patientvæv. Lunge- og Thyroideavæv blev fremskaffet på Patologisk Institut i Aalborg (Tabel 6). Desmin Placenta Appendix Lever Thyroidea Lunge Lever Væv: Væv: Væv: Hjørring Hjørring TTF-1 Hjørring Aalborg Aalborg CD1a Hjørring Sygehus: Sygehus: Sygehus: Tabel 6: Vævene udvalgt fra sygehusenes vævsarkiv til antistofferne Desmin, TTF-1 og CD1a Side 18 af 106

20 Konstruering af multiblokke Blokkene mikrotomeredes (4 µm) og vævssnittene blev analyseret ved oversigtsfarvningen Hæmatoxylin- Eosin Y (HE), se bilag 8, med formålet, at udvælge et bestemt område i vævet til udstansning (4 mm cirkulær udstanser). Der anvendtes fire udvælgelseskriterier pr. antistof. Væv indeholdende: nonekspression af antigen, lav ekspression af antigen, moderat ekspression af antigen, høj ekspression af antigen. Vævsudstansningerne (vævscores) til et antistof samles som en multiblok på et objektglas (Figur 9). Anvendelsen af multiblokke valgtes med henblik på mindst mulig analytisk variation. Figur 9: Optegning af multiblokke angivet med placering af vævscores og navn på væv, samt tilhørende antistof (Fra venstre: Desmin, TTF-1, CD1a) Reagenser Antistof Klon Producent Produktnr./kode Desmin EP15 CELL MARQUE 243R TTF-1 EP229 CELL MARQUE 343R CD1a EP3622 CELL MARQUE 101R Desmin D33 DAKO IS606 TTF-1 SPT24 Novocastra PA0364 CD1a 010 DAKO M3571 Tabel 7: Anvendte antistofkloner til Desmin, TTF-1 og CD1a, referenceklon (Gul, bilag 9 for fremstilling), ny klon (Rød), angivet med producent og produktnr./kode. Side 19 af 106

21 Reagens Producent Produktnr./kode Anvendelse Ethanol Brenntag Nordic A/S Hydrering/Dehydrering Hydrogen peroxid (H 2 O 2 ) Fremstilles på afdelingen Se bilag 13 for fremstilling Blokering af endogen peroxidaseaktivitet TBS+Tween Fremstilles på afdelingen Se bilag 13 for Vaskebuffer fremstilling TE-buffer, ph 9 Fremstilles på afdelingen Se bilag 13 for Demaskeringsbuffer fremstilling EnVision+ System HRP Labelled Polymer Antimouse DAKO K4001 LabVision - detektionssystem EnVision+ System HRP Labelled Polymer Antirabbit DAKO K4003 LabVision - detektionssystem DAB + Substrate Chromogen System DAKO K3468 LabVision - visualisering CuSO 4 Emsure - Amplifikation Mayers hæmatoxylin Ampliqon AN01 Kernefarvning Xylen VWR Chemicals Filmmontering Tabel 8: Analysereagenser angivet med producent, produktnr./kode samt anvendelse Apparatur Apparatur Serienr. Lysmikroskop, Olympus BX50 4M00452 Mikrotom, Micron, HM355 HJS 5920 HE-farvemaskine, Tissue tek prisma 6133 Varmeskab, Memmert PT Link, DAKO PT10126 / HJS14102 Autostainer 360, Lab Vision corp. LVMi-LV Film-maskine, Tissue-tek SCA / HJS09019 NDP Nanozoomer Digital Pathology, HAMAMATSU / AAS48766 Tabel 9: Anvendte apparaturer angivet med serienr. Side 20 af 106

22 Metode Forsøgsdesign De to første delforsøg udføres med henblik på at optimere analyseprotokollerne for de tre nye antistofkloner ved at finde de mest optimale fortyndinger. Delforsøg 3 er et sammenligningsforsøg, hvor de tre nye antistofkloner sammenlignes med afdelingens tre referencer. De økonomiske konsekvenser undersøges ved at udregne og sammenligne prisen pr. analyse for de to antistofkloner for samme antistof. Den økonomiske sammenligning sættes i kontekst til undersøgelsen af farveresultatet og vurderes. Undersøgelse af farveresultat Optimering af analyseprotokollerne for de tre nye antistofkloner Delforsøg 1 Der testes for hvert antistof et fortyndingsområde, som udvælges på baggrund af producentens anbefalede fortyndingsområde (Tabel 10). De anbefalede fortyndinger i nedenstående tabel 10 er angivet identisk med producentens angivelser (Bilag 2-4), men vil i efterfølgende beskrivelser angives med 1+, da alle antistoffer i immunhistokemisk laboratorie på Patologisk Anatomisk institut Sygehus Vendsyssel, fortyndes 1+ fortyndingsfaktoren (Bilag 9). Dette projekt har til formål at undersøge om de anvendte referenceantistofkloner med fordel kan erstattes af de nye antistofkloner, hvortil det vil være mest hensigtsmæssigt at tilpasse fortyndingsmetoden af de nye antistofkloner til metoden, som anvendes i laboratoriet. CELL MARQUE Antistoffer: Desmin (EP15) TTF-1 (EP229) CD1a (EP3622) Anbefalede fortyndingsområde: 1:100 1:500 1:50 1:200 1:25 1:100 Tabel 10: Det anbefalede fortyndingsområde for antistofferne Desmin, TTF-1 og CD1a Forsøget udføres med dobbeltbestemmelser, da der fortyndes udover producentens anbefalede fortyndingsområde (Tabel 10) uden kendskab til farveresultatet. Ved en dobbeltbestemmelse kan den ekstra farvning bekræfte resultatet, som en større sikkerhed end et enkeltstående tilfælde. Ulempen ved dobbeltbestemmelser er, at en del af vævet skæres væk, så der ved Delforsøg 2 er væv fra et dybere niveau, med ændring i celler og væv. Side 21 af 106

23 Vævssnittene er mikrotomeret i serier. En serie på fire vævssnit indeholder hver fortynding, se figur 10. Fortyndingsmetoden er en fordobling ved hvert interval. Serierne mærkes med hver sin farve, sådan at der for et antistof er en blå serie med de forskellige fortyndinger og en rød serie med tilsvarende fortyndinger (Figur 10). Dette giver et større sammenligningsgrundlag ved scoring af farveresultaterne indenfor en serie, ved at vævet har ændret sig mindst muligt i niveau. På baggrund af scoringsresultaterne udvælges den mest optimale fortynding til Delforsøg 2, se figur 10. Figur 10: Flowdiagram over delforsøg 1 for antistofferne Desmin, TTF-1 og CD1a, dobbeltbestemmelserne er mikrotomeret i to fortyndingsserier (Blå og Rød markering), med formålet at finde den bedste fortynding (Grøn markering) ved at teste fortyndingsområdet Der blev udført et udvidet Delforsøg 1 for Desmin, da både kontrol- og vævscores viste uspecifikke farvereaktioner, samt overfarvning i alle væv. Fortyndingsområdet blev ændret til et højere niveau, se figur 11. Forsøget blev udført under samme forudsætninger som de andre fortyndinger. Figur 11: Flowdiagram over udvidet delforsøg 1 for Desmin angivet med ændret fortyndingsområde Delforsøg 2 Delforsøg 2 udføres med det formål at optimere, og eventuelt justere, den udvalgte fortynding fra Delforsøg 1. Forsøget udføres uden dobbeltbestemmelser. Der blev i Delforsøg 1 verificeret en farvereaktion for den udvalgte fortynding og der testes nu i et kendt fortyndingsområde. Side 22 af 106

24 Figur 12: Udvidet flowdiagram over delforsøg 2 for antistofferne Desmin, TTF-1 og CD1a, angivet med testet fortyndingsområde (bedste fortynding markeret med grøn, referencefortynding markeret med gul) Referencerne farves sammen med de nye fortyndinger, med henblik på at give det bedst mulige sammenligningsgrundlag til Delforsøg 3, se figur 12. Sammenligning af farveresultaterne fra de nye antistofkloner med farveresultaterne fra referencerne Delforsøg 3 Ved sammenligningsforsøget scores referencen og farveresultatet sammenlignes med farveresultatet for de nye antistofkloner fra Delforsøg 2. Scoringen af de to antistofkloner for hvert af de tre antistoffer sammenlignes i kvalitet affarveresultatet, se figur 13. Side 23 af 106

25 Figur 13: Flowdiagram over de tre delforsøg, bedste fortynding for de tre nye antistofkloner (grøn) sammenlignes i delforsøg 3 med referencen (gul) på farvekvalitet Undersøgelse af økonomiske konsekvenser Til undersøgelsen af de økonomiske konsekvenser udregnes prisen pr. analyse for alle antistofkloner. De udregnede priser sammenlignes for to kloner indenfor samme antistof, og vurderes i forhold til mulighed for økonomisk besparelse, sat i kontekst til kvalitetsniveauet af farveresultatet. Scoringssystemer Kvaliteten af farveresultaterne for de 3 delforsøg vurderes ud fra et scoringssystem lavet på baggrund af kategorier og kriterier opstillet af NordiQC (4) og med udgangspunkt i referenceantistofferne, samt tilhørende datasheets (Bilag 2-4,6-7). Referencen scores ikke i Delforsøg 1 og 2. Alle resultaterne for Delforsøg 1 og 2 blindes af klinisk vejleder og scores først individuelt af alle i gruppen. På den måde opnås bedst objektivitet. Ulempen ved denne metode er manglen på kalibrering af et fælles vurderingsgrundlag. Ved udarbejdelse af scoringssystemet, er der ved mikroskopi taget udgangspunkt i referencen med henblik på at kende til celle- og vævsstrukturer i de valgte vævscores for hvert antistof, for på den måde at danne et fælles grundlag for, at anvende scoringssystemet individuelt. Efterfølgende sammenlignes de individuelle scores og der gives en konsensus score til de resultater, der ikke er enighed om. Systemerne anvendes ved at tage udgangspunkt i kriterierne for en optimal scoring, hvor en nedgradering til lavere kategorier vil være, at en eller flere af de inkluderede væv på et glas, tilstrækkeligt opfylder en eller flere kriterier inden for den lavere scoringskategori. Side 24 af 106

26 Desmin Optimal Et farveresultat som bedømmes perfekt eller næsten perfekt Vævscore Beskrivelse 1. Chorionkar 2. Placenta 3. Appendix 4. Rhabdomyosarkom En som minimum svag cytoplasmatisk farvereaktion i størstedelen af de glatte muskelceller i begge Chorionarterier Ingen baggrundsfarvning Ingen farvereaktion i cytotrophoblaster og syncytiotrophoblaster Ingen baggrundsfarvning Moderat cytoplasmatisk farvereaktion i glatte muskelceller i Lamina muscularis mucosa og muscularis propria Ingen baggrundsfarvning En som minimum svag til moderat cytoplasmatisk farvereaktion i øjensynligt 20 % af tumorcellerne i det myoxide væv ved forstørrelse X100 Ingen baggrundsfarvning 5. Kraftig cytoplasmatisk farvereaktion i de neoplastiske celler Leimyom Ingen baggrundsfarvning 6. Kraftig cytoplasmatisk farvereaktion i de neoplastiske celler Leimyosarkom Ingen baggrundsfarvning Tabel 11: Til Desmin; Kriterier for en Optimal scoring angivet for hver vævscore Good Et farveresultat der bedømmes acceptabel Baggrund Årsag Begrundelse Svag baggrundsfarvning i et af de inkluderede væv Farvereaktion Farvereaktion i øjensynligt minimum 70 % af de forventede celler i et af de inkluderede væv Farveintensitet Svagere farveintensitet i øjensynligt under halvdelen af de farvede celler i et af de inkluderede væv Tabel 12: Til Desmin; Årsag med tilhørende begrundelse for at score et farveresultat Good Side 25 af 106

27 Borderline Et farveresultat som bedømmes utilstrækkelig Baggrund Årsag Begrundelse Moderat baggrundsfarvning i et af de inkluderede væv Farvereaktion Farvereaktion i minimum 50 % af de forventede celler i et af de inkluderede væv Ikke forventet farvereaktion Positiv farvereaktion i andre vævskomponenter end de forventede i et af de inkluderede væv Farveintensitet Svagere farveintensitet i øjensynligt over halvdelen af de farvede celler i et af de inkluderede væv Tabel 13: Til Desmin; Årsag med tilhørende begrundelse for at score et farveresultat Borderline Poor Et farveresultat der bedømmes stærkt utilstrækkeligt Baggrund Årsag Begrundelse Kraftig baggrundsfarvning i et af de inkluderede væv Farvereaktion Meget svag eller ingen farvereaktion i øjensynligt under 50 % af de forventede celler i et af de inkluderede væv Ikke forventet farvereaktion Positiv farvereaktion i andre vævskomponenter end de forventede i mere end et af de inkluderede væv Tabel 14: Til Desmin; Årsag med tilhørende begrundelse for at score et farveresultat Poor Side 26 af 106

28 TTF-1 Optimal Et farveresultat som bedømmes perfekt eller næsten perfekt Vævscore Beskrivelse 1. Ingen farvereaktion i hepatocytterne Lever Ingen eller minimal baggrundsfarvning 2. Lunge 3. Nodøs Kolloid Stroma (Thyroidea) Svag kernefarvning i alle cylinderepitelceller i de terminale bronkioler Moderat til kraftig kernefarvning i alle basale epitelceller i de terminale bronkioler Kraftig kernefarvning i type II pneumocytter i alveolevæggen Ingen eller minimal baggrundsfarvning Kraftig kernefarvning i alle follikelceller, samt moderat kernefarvning i alle normale og neoplastiske parafollikulære celler Ingen eller minimal baggrundsfarvning Tabel 15: Til TTF-1; Kriterier for en Optimal scoring angivet for hver vævscore Good Et farveresultat der bedømmes acceptabel Farvereaktion Årsag Begrundelse Farvereaktion i øjensynligt minimum 70 % af de forventede celler i et af de inkluderede væv Farveintensitet Svagere farveintensitet i øjensynligt under halvdelen af de farvede celler i et af de inkluderede væv Tabel 16: Til TTF-1; Årsag med tilhørende begrundelse for at score et farveresultat Good Side 27 af 106

29 Borderline Et farveresultat som bedømmes utilstrækkelig Baggrund Årsag Begrundelse Moderat baggrundsfarvning i et af de inkluderede væv Farvereaktion Farvereaktion i minimum 50 % af de forventede celler i et af de inkluderede væv Ikke forventet farvereaktion Positiv farvereaktion i andre vævskomponenter end de forventede i et af de inkluderede væv Farveintensitet Svagere farveintensitet i øjensynligt over halvdelen af de farvede celler i et af de inkluderede væv Tabel 17: Til TTF-1; Årsag med tilhørende begrundelse for at score et farveresultat Borderline Poor Et farveresultat der bedømmes stærkt utilstrækkeligt Baggrund Årsag Begrundelse Kraftig baggrundsfarvning i et af de inkluderede væv Farvereaktion Meget svag eller ingen farvereaktion i øjensynligt under 50 % af de forventede celler i et af de inkluderede væv Ikke forventet farvereaktion Positiv farvereaktion i andre vævskomponenter end de forventede i mere end et af de inkluderede væv Tabel 18: Til TTF-1; Årsag med tilhørende begrundelse for at score et farveresultat Poor Side 28 af 106

30 CD1a Optimal Et farveresultat som bedømmes perfekt eller næsten perfekt Vævscore Beskrivelse 1. Ingen farvning af hepatocytter Lever Ingen til minimal baggrundsfarvning 2. Hud Minimum moderat membranfarvning af alle Langerhanske celler i epidermis Kraftig membranfarvning af alle Interdigiterende dendritiske celler i dermis Ingen til minimal baggrundsfarvning Minimum moderat membranfarvning af alle Langerhanske celler i det uforhornet flerlaget pladeepitel 3. Tonsil Kraftig membranfarvning af alle Interdigiterende dendritiske celler i det underliggende stroma Ingen til minimal baggrundsfarvning 4. Kraftig membranfarvning af alle Interdigiterende dendritiske celler Lymfe Ingen til minimal baggrundsfarvning Tabel 19: Til CD1a; Kriterier for en Optimal scoring angivet for hver vævscore Good Et farveresultat der bedømmes acceptabel Farvereaktion Årsag Begrundelse Farvereaktion i øjensynligt minimum 70 % af de forventede celler i et af de inkluderede væv Farveintensitet Svagere farveintensitet i øjensynligt under halvdelen af de farvede celler i et af de inkluderede væv Tabel 20: Til CD1a; Årsag med tilhørende begrundelse for at score et farveresultat Good Side 29 af 106

31 Borderline Et farveresultat som bedømmes utilstrækkelig Årsag Begrundelse Baggrund Moderat baggrundsfarvning i et af de inkluderede væv Farvereaktion Farvereaktion i minimum 50 % af de forventede celler i et af de inkluderede væv Ikke forventet farvereaktion Positiv farvereaktion i andre vævskomponenter end de forventede i et af de inkluderede væv Farveintensitet Svagere farveintensitet i øjensynligt over halvdelen af de farvede celler i et af de inkluderede væv Tabel 21: Til CD1a; Årsag med tilhørende begrundelse for at score et farveresultat Borderline Poor Et farveresultat der bedømmes stærkt utilstrækkeligt Årsag Begrundelse Baggrund Kraftig baggrundsfarvning i et af de inkluderede væv Farvereaktion Meget svag eller ingen farvereaktion i øjensynligt under 50 % af de forventede celler i et af de inkluderede væv Ikke forventet farvereaktion Positiv farvereaktion i andre vævskomponenter end de forventede i mere end et af de inkluderede væv Tabel 22: Til CD1a; Årsag med tilhørende begrundelse for at score et farveresultat Poor Analysemetode Alle vævssnit for de to første delforsøg er blevet behandlet efter følgende protokoller: 60 min. i varmeskab ved 65 C. Immunhistokemisk påvisning af antigener med EnVision+ (Bilag 5). Demaskering i TE-buffer på PT-modul 1-3 (Bilag 10). Side 30 af 106

32 Analysering på LabVision Autostainer (Bilag 11). Filmmontering på Tissue-Tek filmmaskine (Bilag 12). Resultater Undersøgelse af farveresultat Optimering af analyseprotokollerne for de tre nye antistofkloner Delforsøg 1 Desmin Den mest optimale Desminfortynding (1+800) med scoren Borderline, blev fundet i det først anvendte fortyndingsområde, se tabel 23. Desmin Fortynding Score Optimal Good Borderline Poor Årsag X X X X X X X X Baggrund (Kraftig) (Tabel 14) Kontrol (Tabel 4) Baggrund (Kraftig) (Tabel 14) Kontrol (Tabel 4) Baggrund (Kraftig) (Tabel 14) Kontrol (Tabel 4) Baggrund (Moderat) (Tabel 13) Kontrol (Tabel 4) Baggrund (Kraftig) (Tabel 14) Kontrol (Tabel 4) Baggrund (Kraftig) (Tabel 14) Kontrol (Tabel 4) Baggrund (Moderat) (Tabel 13) Kontrol (Tabel 4) Baggrund (Moderat) (Tabel 13) Kontrol (Tabel 4) Side 31 af 106

33 Tabel 23: Scoringsresultater for første fortyndingsområde til Desmin udført med dobbeltbestemmelser. Dobbeltbestemmelserne er scoret indenfor samme fortyndingsserie (Blå og rød markering). Mest optimale fortynding for Desmin er fremhævet med grøn. Det fremgår af resultaterne for dette fortyndingsområde, at denne fortynding er det eneste resultat med højest overensstemmende scoring af dobbeltbestemmelserne (Tabel 23). Som angivet i tabel 23 under årsag, blev ingen af kontrollerne godkendt. Scoren Borderline, ses at være den højeste score af Desmin (Tabel 23). En gennemgående årsag til scoren borderline, er observationen af en moderat baggrundsfarvning i mindst en vævscore hos alle fortyndingsresultater. Den moderate baggrundsfarvning observeres generelt for alle resultater i placentavævet, se figur 14. Figur 14: (x13,5). IHC-farvning af Placenta med Desmin. A: Ny klon (EP15, fortynding 1+800, blå serie), der ses moderat baggrund, scoret Borderline. B: Ny klon (EP15, fortynding 1+100, blå serie), der ses kraftig baggrund, scoret Poor. C: Referenceklon (D33, fortynding 1+50), der ses ingen baggrund, scoret Optimal Side 32 af 106

34 For Desmins ændrede fortyndingsområde ses der, i resultat-tabel 24 under årsag, ingen godkendte kontroller. Ændret fortyndingsområde for Desmin Fortynding Score Optimal Good Borderline Poor Årsag X X X X X X X X Baggrund (Tabel 13) Kontrol (Tabel 4) Baggrund (Tabel 14) Kontrol (Tabel 4) Baggrund (Tabel 14) Kontrol (Tabel 4) Baggrund (Tabel 13) Ikke forventet farvereaktion (Tabel 13) Farvereaktion (%)(Tabel 13) Farveintensitet (Tabel 13) Kontrol (Tabel 4) Baggrund (Tabel 13) Kontrol (Tabel 4) Baggrund (Tabel 13) Kontrol (Tabel 4) Baggrund (Tabel 13) Farvereaktion (%)(Tabel 13) Farveintensitet (Tabel 13) Kontrol (Tabel 4) Baggrund (Tabel 13) Ikke forventet farvereaktion (Tabel 13) Farvereaktion (%)(Tabel 13) Farveintensitet (Tabel 13) Kontrol (Tabel 4) Tabel 24: Scoringsresultater for ændret fortyndingsområde til Desmin udført med dobbeltbestemmelser. Dobbeltbestemmelserne er scoret indenfor samme fortyndingsserie (Blå og rød markering). Kontrollerne blev afvist på grund af utilstrækkelig positiv farvereaktion i kontrolvævet tonsil for alle farveresultater, se figur 15. Side 33 af 106

35 Figur 15: (x20) IHC-farvning af tonsil (kontrolvæv, core 3) med Desmin klon D33 (reference) og EP15 (ny). A: fortynding 1+50, D33, tilstrækkelig kraftig cytoplasmatisk farvning af de glatte muskelceller, godkendt kontrol. B: fortynding 1+850, EP15, ikke tilstrækkelig cytoplasmatisk farvning af de glatte muskelceller, afvist kontrol. Da begge fortyndingsområder for Desmin ikke indeholder nogen godkendte kontroller, forkastes farveresultaterne for det ændrede fortyndingsområde, fordi en tilstrækkelig positiv farvereaktion vægtes højere end observationen af baggrundsfarvning. Side 34 af 106

36 TTF-1 Den mest optimale TTF-1-fortynding (1+100) med scoren Good, er den ene af to dobbeltbestemmelser med højeste overensstemmende scoring, se tabel 25. TTF-1 Fortynding Score Optimal Good Borderline Poor Årsag 1+50 X X Farvereaktion (%) (Tabel 16) Farvereaktion (%) (Tabel 16) Farvereaktion (%)(Tabel 18) X X 1+50 X X Farveintensitet (Tabel 18) Kontrol (Tabel 4) Farvereaktion (%) (Tabel 18) Kontrol (Tabel 4) Farvereaktion (%)(Tabel 16) Baggrund (Tabel 16) Farvereaktion (%) (Tabel 16) Farvereaktion (%) (Tabel 18) X X Farveintensitet (Tabel 18) Kontrol (Tabel 4) Farvereaktion (%) (Tabel 18) Kontrol (Tabel 4) Tabel 25: Scoringsresultater for fortyndingsområde til TTF-1 udført med dobbeltbestemmelser. Dobbeltbestemmelserne er scoret indenfor samme fortyndingsserie (Blå og rød markering). Mest optimale fortynding for TTF-1 er fremhævet med grøn. Med et lige scoringsresultat mellem fortyndingerne 1+50 og (Tabel 25), er valget truffet, på baggrund af mindst indhold af antistofkoncentrat. Resultaterne med scoren Good, er under Årsag i tabel 25, begrundet med angivelsen Farvereaktion (%). Denne angivelse betyder, at der ikke ses en positiv farvereaktion i alle cylinderepitelceller i lungevævet. For alle farveresultaterne scoret Poor observeredes der en positiv farvereaktion i under 50 % af cylinderepitelcellerne i lungevævet, hvilket var afgørende for placeringen i denne kategori, se figur 16. Side 35 af 106

37 Derudover observeredes en svagere farveintensitet i under halvdelen af de follikulære og parafollikulære Figur 16: (x20) IHC-farvning af Lungevæv med TTF-1 klon EP229. A: fortynding 1+100, scoret Good. B: fortynding 1+400, scoret Poor celler i Nodøs Kolloid Stroma i Thyroidea-vævet. Dette er angivet som Farveintensitet under Årsag i tabel 25. Fælles for de ikke godkendte kontroller, angivet som kontrol under Årsag i tabel 25, var manglende farvereaktion i over halvdelen af de forventede positive celler i kontrolvævet Thyroidea, se figur 17. Side 36 af 106

38 Figur 17: (x10) IHC-farvning af Thyroidea (kontrolvæv) med TTF-1 klon EP229. A: fortynding (blå serie), kraftig kernefarvning i øjensynligt mere end 50 % af alle follikelceller samt parafollikulære celler, godkendt kontrol. B: fortynding (blå serie), kraftig kernefarvning i øjensynligt mindre end 50 % af alle follikelceller samt parafollikulære celler, afvist kontrol CD1a Den mest optimale CD1a-fortynding med scoren Optimal, er den højest overensstemmende scoring af dobbeltbestemmelserne, samt den eneste dobbeltbestemmelse med godkendt kontrolvæv, se tabel 26. Side 37 af 106

39 CD1a Fortynding Score Optimal Good Borderline Poor Årsag Baggrund (Tabel 21) 1+25 X 1+50 X X Ikke forventet farvereaktion (Tabel 21) Kontrol (Tabel 4) Baggrund (Tabel 21) Ikke forventet farvereaktion (Tabel 21) Kontrol (Tabel 4) Kontrol (Tabel 4) X Baggrund (Tabel 21) 1+25 X 1+50 X X Ikke forventet farvereaktion (Tabel 21) Kontrol (Tabel 4) Kontrol (Tabel 4) Kontrol (Tabel 4) X Tabel 26: Scoringsresultater for fortyndingsområde til CD1a udført med dobbeltbestemmelser. Dobbeltbestemmelserne er scoret indenfor samme fortyndingsserie (Blå og rød markering). Mest optimale fortynding for CD1a er fremhævet med grøn. Gældende for alle de ikke godkendte kontroller i tabel 26 under Årsag, var observationen af farvereaktion i andre vævskomponenter end de langerhanske- og Interdigiterende dendritiske celler, i hvilke den positive farvereaktion kun skal være til stede, se figur 18. Side 38 af 106

40 Figur 18: (x20) IHC-farvning af normal hud (vævscore 2) med CD1a klon EP3622. A: fortynding (blå serie), moderat membranfarvning af Langerhanske celler i epidermis, samt overvejende negativ baggrund (keratin), scoret Optimal. B: fortynding 1+25 (blå serie), moderat til kraftig membranfarvning af Langerhanske celler i epidermis, kraftig membranfarvning af Interdigiterende dendritiske celler i dermis, samt moderat baggrund (keratin), scoret Borderline Delforsøg 2 Desmin Det fremgår af resultaterne i tabel 27, at alle fortyndingsresultater for Desmin, er scoret Borderline med angivelsen Baggrund under Årsag, da der blev observeret moderat baggrundsfarvning i placenta-vævet. Desmin Fortynding Score Optimal Good Borderline Poor Årsag X X X Baggrund (Tabel 13) Kontrol (Tabel 4) Baggrund (Tabel 13) Kontrol (Tabel 4) Baggrund (Tabel 13) Kontrol (Tabel 4) Tabel 27: Scoringsresultater for Delforsøg 2 for Desmin. Den mest optimale fortynding er fremhævet med grøn. Side 39 af 106

41 Det ses også i tabel 27 under Årsag, at ingen kontroller er godkendt for farveresultaterne med Desmin, da der gældende for alle Tonsilvæv i kontrollerne observeredes områder af muskelvæv med manglende positiv farvereaktion. Den mest optimale fortynding 1+850, udvælges ud fra mindst indhold af antistofkoncentrat (tabel 27). Figur 19 viser et eksempel på forskellige grader af baggrundsfarvning (svag og moderat) i vævscoren chorionkar. Figur 19A viser moderat baggrundsfarvning mellem de negative syncytiotrophoblaster og cytotrophoblaster, mens 19B viser samme område i placenta, hvor der i dette tilfælde er observeret svag baggrundsfarvning. Begge væv i figur 19, A og B, er farvet med Desmin klon EP15, fortynding (Figur 19A) og fortynding (Figur 19B). Figur 19: (x10) IHC-farvning af Placenta (Chorionkar, vævscore 1) med Desmin klon EP15. A: fortynding 1+750, kraftig cytoplasmafarvning af de glatte muskelceller omkring chorionkar, moderat baggrundsfarvning, scoret Borderline. B: fortynding 1+850, kraftig cytoplasmafarvning af de glatte muskelceller omkring chorionkar, svag baggrundsfarvning, scoret Borderline. Side 40 af 106

42 TTF-1 Af resultaterne i tabel 28 ses det, at den mest optimale TTF-1-fortynding, scoret Good, er TTF-1 Fortynding Score Optimal Good Borderline Poor Årsag 1+75 X X X Farvereaktion (Tabel 16) Farveintensitet (Tabel 16) Farvereaktion (Tabel 17) Baggrund (Tabel 17) Farvereaktion (Tabel 16) Tabel 28: Scoringsresultater for Delforsøg 2 for TTF-1. Den mest optimale fortynding for er fremhævet med grøn. Gældende for alle fortyndingsresultater i tabel 28 er der angivet Farvereaktion som en begrundelse under Årsag. Denne årsag er baseret på den procentvise andel af positiv farvereaktion i cylinderepithelceller i Lunge-vævet. Ydermere er der for fortynding 1+75 angivet Farveintensitet som en Årsag, da der blev observeret svagere farveintensitet i øjensynligt under halvdelen af follikel- samt parafollikulære celler i Nodøs Kolloid Stroma i Thyroideavævet. Resultatet af fortynding viste moderat baggrundsfarvning i Nodøs Kolloid Stroma i Thyroideavævet. CD1a Den mest optimale CD1a-fortynding, scoret Optimal, er 1+250, se tabel 29. CD1a Fortynding Score Optimal Good Borderline Poor Årsag X X X Tabel 29: Scoringsresultater for Delforsøg 2 for CD1a. Den mest optimale fortynding er fremhævet med grøn. Denne er valgt ud fra mindst indhold af antistofkoncentrat, fremfor de resterende fortyndinger, som også er scoret Optimal, da der ikke ses en forskel i farvekvaliteten mellem disse (figur 20). I nedenstående figur 20 er afbilledet farveresultatet af Lymfe-væv med CD1a, klon EP3622, med de tre fortyndinger fra tabel 29. Side 41 af 106

43 Figur 20: (x20) Kraftig positiv IHC-membranfarvning af Interdigiterende dendritiske celler i Lymfevæv (vævscore 4) med CD1a klon EP3622, alle scoret Optimal. A: fortynding B: fortynding C: fortynding Sammenligning af farveresultaterne fra de nye antistofkloner med farveresultaterne fra referencerne Delforsøg 3 Desmin Ved sammenligning af farveresultatet for de to Desmin antistofkloner blev det bedste resultat, med scoren Optimal, opnået med referencen, se tabel 30. Desmin Score Klon Fortynding Optimal Good Borderline Poor Årsag Kontrol (Tabel 4) D33 (Ref.) 1+50 X EP15 (Ny) X Baggrund (Tabel 13) Kontrol (Tabel 4) Tabel 30: Sammenligning af de to Desmin antistofkloner, angivet for hver er; klon, fortynding, score og årsag. Bedste farveresultat opnåedes med referenceklon D33 (Grøn markering). Side 42 af 106

44 For begge antistofkloner gjorde det sig gældende at kontrollerne ikke blev godkendt, da der observeredes manglende farvereaktion i nogle områder i muskelvævet i Tonsil. Den nye antistofklon blev scoret borderline grundet årsagen moderat Baggrund i placenta-vævet (Tabel 30). TTF-1 For TTF-1 ses der ingen forskel på farveresultatet mellem antistofklonerne, se tabel 31. TTF-1 Score Klon Fortynding Optimal Good Borderline Poor Årsag X Farvereaktion (Tabel 16) SPT24(Ref.) EP229 (Ny) X Farvereaktion (Tabel 16) Tabel 31: Sammenligning af de to TTF-1 antistofkloner, angivet for hver er; klon, fortynding, score og årsag. Der ses en lige scoring (Good) af farveresultatet mellem klonerne. Udvælgelsen er gjort på baggrund af højeste antistoffortynding (Grøn markering). Begge fortyndinger blev scoret Good, hvortil årsagerne til placeringerne i denne scoringskategori, fælles for begge fortyndinger, er under Årsag i tabel 31 begrundet med Farvereaktion (%), da der ikke ses en positiv farvereaktion i alle cylinderepitelceller i lungevævet og i follikelceller i Nodøs Kolloid Stroma i Thyroidea, figur 21. Udvælgelsen af bedste antistofklon blev derfor udelukkende foretaget på baggrund af, hvilken analyse der blev anvendt mindst antistofkoncentrat til (tabel 31). Side 43 af 106

45 Figur 21: (x20) Svag positiv IHC-kernefarvning i øjensynligt mere end 70 % af alle cylinderepitelcellerne, og moderat til kraftig kernefarvning af basale epitelceller i Lungevæv, samt kraftig kernefarvning af follikelceller og moderat kernefarvning af parafollikulære celler i Thyroidea-væv, opnået med begge antistofkloner til TTF-1, alle scoret Good. A: Lungevæv, referenceklon SPT24, fortynding B: Thyroidea-væv, referenceklon SPT24, fortynding C: Lungevæv, ny klon EP229, fortynding D: Thyroidea-væv, ny klon EP229, fortynding CD1a Ved sammenligningen af antistofklonerne for CD1a ses der ingen forskel på farveresultatet. Begge blev scoret Optimal, se tabel 32. CD1a Score Klon Fortynding Optimal Good Borderline Poor Årsag 010 (Ref.) X EP3622 (Ny) X Tabel 32: Sammenligning af de to CD1a antistofkloner, angivet for hver er; klon, fortynding, score og årsag. Der ses en lige scoring (Optimal) af farveresultatet mellem klonerne. Udvælgelsen er gjort på baggrund af højeste antistoffortynding (Grøn markering) Udvælgelsen af bedste antistofklon blev derfor udelukkende foretaget på baggrund af, hvilken analyse der Figur 22: (x20) Kraftig positiv IHC-membranfarvning af Interdigiterende dendritiske celler i Lymfevæv og dermis i hud samt moderat til kraftig membranfarvning af Langerhanske celler i epidermis i hud, opnået med begge antistofkloner til CD1a, alle scoret Optimal. A: Lymfevæv, referenceklon 010, fortynding Side af B: 106 Hud, referenceklon 010, fortynding C: Lymfevæv, ny klon EP3622, fortynding D: Hud, ny klon EP3622, fortynding 1+250

46 blev anvendt mindst antistofkoncentrat til (Tabel 32). I figur 22 er afbilledet optimale farveresultater opnået i lymfe-væv og hud med begge antistofkloner. Undersøgelse af økonomiske konsekvenser Desmin I tabel 33 ses pris pr. analyse og pris for alle IHC-analyser udført med Desmin i år 2014, udregnet for begge Desminkloner samt pris-differencen. Desmin Klon Pris pr. analyse (kr.) Pris for alle IHC-analyser i år 2014 (kr.) D33 (Ref.) 18, ,24 EP15 (Ny) 1,66 318,72 Difference -16, ,52 Tabel 33: Pris pr. analyse samt pris for alle IHC-analyser med Desmin, i år 2014 (kr.) for klonerne D33 (reference) og EP15 (ny) TTF-1 I tabel 34 ses pris pr. analyse og pris for alle IHC-analyser udført med TTF-1 i år 2014, udregnet for begge TTF-1kloner samt pris-differencen. TTF-1 Klon Pris pr. analyse (kr.) Pris for alle IHC-analyser i år 2014 (kr.) SPT24 (Ref.) 6,85 760,35 EP229 (Ny) 12, ,22 Difference 5, ,84 Tabel 34: Pris pr. analyse samt pris for alle IHC-analyser med TTF-1, i år 2014 (kr.) for klonerne SPT24 (reference) og EP229 (ny) CD1a I tabel 35 ses pris pr. analyse og pris for alle IHC-analyser udført med CD1a i år 2014, udregnet for begge CD1akloner samt pris-differencen. CD1a Klon Pris pr. analyse (kr.) Pris for alle IHC-analyser i år 2014 (kr.) 010 (Ref.) 7,29 364,5 EP3622 (Ny) 7,29 364,5 Difference 0 0 Tabel 35: Pris pr. analyse samt pris for alle IHC-analyser med CD1a, i år 2014 (kr.) for klonerne 010 (reference) og EP3622 (ny) Side 45 af 106

47 Diskussion Undersøgelse af farveresultatet Optimering af analyseprotokollerne for de tre nye antistofkloner. Delforsøg 1 Desmin Resultater Den mest optimale fortynding af antistofklon Desmin(EP15) viste at være 1+800, se tabel 23. Dette resultat blev udvalgt som det bedste, på trods af en ikke godkendt vævskontrol, samt observation af moderat baggrundsfarvning i flere vævscores, der resulterede i scoren Borderline. Der fandtes overensstemmelse mellem farveresultatet og den teoretiske beskrivelse af ekspressionsgrad (tabel 1), i forhold til de forventede og observerede positive farvereaktioner i alle vævscores, se tabel 14. Sensitiviteten for en IHC analyse er ifølge Torlakovic et al (9), som regel beskrevet ved evaluering af intensiteten i en farvereaktion (svag kraftig), som den observeres i kendt og veldefineret væv (11). En høj sensitivitet er af NordiQC (4) beskrevet som særlig vigtig, da dette mindsker risikoen for falsk negative analyseresultater, jf. teoriafsnit om Multiblokke. Ingen af kontrollerne under Delforsøg 1 for Desmin godkendtes, se tabel 23,24. Det bedste farveresultat opnået i det ændrede fortyndingsområde til Desmin, var (tabel 24). Farveresultatet i vævscorerne med var identisk med farveresultatet for fortynding Ved identisk opnåede farveresultater, blev valget af bedste fortynding truffet ud fra, hvilken af de to resultater der var anvendt mindst antistofkoncentrat til. Dette ville som udgangspunkt have resulteret i valget af 1+900, som mest optimale fortynding, men da de tilhørende kontrolvæv til begge fortyndinger var afvist på forskelligt grundlag, var der enighed om at konsultere en patolog. Desmins første fortyndingsområde blev kontrollerne afvist på grund af baggrundsfarvning, men med alle forventede positive farvereaktioner i orden (tabel 1). Vævskontrollerne for Desmins ændrede fortyndingsområde afvistes på grund af manglende positiv farvereaktion i kontrolvævet Tonsil. Patologen vurderede med en diagnostisk tilgang at manglende positiv farvereaktion i kontrolvæv, som var gældende for 1+900, ikke ville være diagnostisk acceptabelt, da usikkerheden omkring antistoffets evne til at farve det søgte antigen i patientprøven, kunne drages i tvivl. Den mest optimale fortynding blev Det bedste farveresultat med Desmin opnået i Delforsøg 1 ses at være utilstrækkeligt ud fra scoren Borderline, fordi antistoffet ikke er i stand til, ved anvendelse af det undersøgte fortyndingsområde, at farve tilstrækkeligt specifikt. I forhold til anbefalingerne fra CELL Side 46 af 106

48 MARQUE om anvendt fortyndingsområde (tabel 10) til Desmin, opnåedes det bedste farveresultat i Delforsøg 1 med en fortynding +300 tillagt den øvre anbefalet grænse. Metode Set retrospektivt i forhold til metodebeskrivelsen for aflæsning af Desmins vævskontroller var afvisningsgrundlaget ikke fuldstændig validt til at starte med, da beskrivelsen af godkendte kontroller ikke direkte indeholdt klare retningslinjer for, at kunne forkaste en kontrol på baggrund af observerede baggrundsfarvning, samt farvereaktioner i andre vævs- og cellekomponenter end de forventede positive (tabel 4). Alle observatører havde, i forbindelse med scoringen, alligevel taget stilling til observationen af uspecifik farvereaktion og tydelig baggrundsfarvning i samtlige fortyndingers kontrolvæv Tonsil, da dette stod i stor kontrast, sammenlignet med referencekontrollens udseende. At disse vurderinger blev gjort, var ikke en hensigtsmæssig fremgangsmåde, da dette ikke indgår som en del af metoden i forbindelse med bedømmelse af kontrolvæv. Det blev besluttet fremadrettet, at vurdere alle kontrolvæv til de tre antistoffer uden yderlig direkte beskrivelse af forventede henholdsvis positive og negative farvereaktioner, med underforståelsen af, at ikke beskrevet celler i vævet i en positiv kontrol, forventes negative. Ifølge Lin F. og Chen Z. (6) har IHC-laboratoriet Geisinger, lavet et online bibliotek, hvor billeder af farvereaktioner for specifikke antistoffer og dertilhørende specifikke ekstern-positive TMA-kontrolblokke opbevares. Ved optimering af en IHC-analyseprotokol, kan dette bibliotek anvendes som gylden standard. Fortolkningsvanskeligheder kunne undgås med et online bibliotek af billeder, der viser farvereaktioner i kontrolvævene for det specifikke antistof, som anvendes i IHC-laboratoriet Geisinger (6). For et forsøg som dette er det vigtigt at medtænke og udarbejde konkrete beskrivelser i metoden forud for vurdering af forsøgsresultater, for at eliminere problematikker, som denne. TTF-1 Resultater Fortyndingen med scoren Good og et godkendt kontrolvæv, fandtes at være den mest optimale til TTF-1, se tabel 25. Som det fremgår af tabellen, var Good den højeste score givet til TTF-1, da ingen af fortyndingerne, var i stand til at levere et farveresultat med positiv farvereaktion i øjensynligt alle cylinderepitelceller lokaliseret i de terminale bronkioler i lungevævet. Overordnet betyder Delforsøg 1 resultatet for TTF-1, at det er muligt at opnå et acceptabelt farveresultat med antistoffortynding til anvendelse ved immunhistokemisk farvning. Fortynding befinder sig indenfor det anbefalede fortyndingsområde, angivet af producenten CELL MARQUE ( ), se tabel 10. Side 47 af 106

49 Metode Metodebeskrivelsens formulering om forventet positivt farveresultat i alle cylinderepitelceller i lungevæv, som forudsætningen for at opnå scoren Optimal med TTF-1 viste sig i dette delforsøg, som en tæt på umulig opgave, da selve formuleringen hindrede for scoring med Optimal, hvis der observeredes ét tilfælde af en cellekerne i cylinderepitelcellerne uden svag positiv farvereaktion. Den overordnede beskrivelse for scoren Optimal ses i scoringssystemet at være; farveresultatet vurderes perfekt eller næsten perfekt, hvortil det kan diskuteres, om en manglende positiv farvereaktion i kun én cellekerne ikke overvejende kunne kategoriseres, som en næsten perfekt farvereaktion. NordiQCs angivelse af et analyseresultat scoret Good, beskriver en acceptabel farvning i alle inkluderede vævscores og at analysen med fordel kan optimeres, for at sikre den bedste farveintensitet og signal-støj-ratio (4). Sidstnævnte parameter er i dette projekt sammenlignelig med graden af baggrundsfarvning, hvor der ikke fandtes utilstrækkelige resultater hos den optimale fortynding Analysen ville, i forhold til NordiQCs beskrivelse, ikke egne sig til en optimering, hvilket peger på, at kravene for en Good scoring af TTF-1, kunne give anledning til, at passe til beskrivelsen for en næsten perfekt farvning, ifølge NordiQC (4). CD1a Resultater Det bedste farveresultat med CD1a i Delforsøg 1, blev opnået med antistoffortyndingen og blev vurderet til scoren Optimal, se tabel 26. Farveresultatet er i overensstemmelse med den beskrevet teori jf. teoriafsnit om CD1a. Positive farvereaktioner ses i alle celler og vævskomponenter som angivet i litteraturen. Af resultaterne i tabellen ses det at to dobbeltbestemmelser, og 1+200, opnåede scoren Optimal, men at farveresultaterne i dobbeltbestemmelsen med var det eneste tilfælde med en godkendt kontrol. For Delforsøg 1 er der opnået en perfekt eller næsten perfekt immunhistokemisk farvning med CD1a ved fortynding 1+200, som er en fordoblet fortynding af antistoffet i forhold til angivelsen af antistoffets højeste grænse i fortyndingsområdet, , anbefalet af producenten CELL MARQUE (tabel 10). Metode En metodeegenskab i det valgte forsøgsdesign kom særligt til udtryk i forbindelse med vurdering af samlede scoringsresultater for dobbeltbestemmelserne fra CD1a. Ved scoring af fortynding 1+50 har dobbeltbestemmelsen ikke fået samme score. Det ses i tabel 26, at det ene resultat har fået scoren Optimal, hvor den anden har fået scoren Borderline, hvilket understøtter beslutningen om at udføre Side 48 af 106

50 dobbeltbestemmelser som en styrke i metoden. Beslutningen om at blinde farveresultaternes fortynding inden scoring, giver en høj objektivitet under scoringen, ved ikke at kunne relatere farveresultaterne for en dobbeltbestemmelse til hinanden. Denne forskel i scoring af dobbeltbestemmelsen 1+50 bekræfter ikke farveresultatet ved denne fortynding af antistoffet, med lige så stor sikkerhed, som for dobbeltbestemmelserne hvor scoren var identisk, for hvert af de to tilhørende farveresultater. Delforsøg 2 Desmin Resultater Det bedste farveresultat for Desmin opnåedes med fortynding Som det ses i tabel 27 over resultaterne til Desmin i dette delforsøg, var det ikke muligt for antistofklonen, at opnå en højere score end Borderline, hvilket ikke er en forbedring fra Delforsøg 1. Årsagen angivet som Baggrund i tabellen går igen i dette delforsøg, hvor det ikke har været muligt, ved justering i fortynding, at opnå en tilstrækkelig specifik immunhistokemisk farvning med anvendte Desminklon. Lin F., Chen Z. (6) beskriver justeringer i analysens demaskeringsmetode, inkubationstid af primært og sekundært antistof, som mulige løsninger med forbedrende effekt for en analyse, hvor et farveresultat med stærk positiv farvereaktion og stærk baggrund er fundet, som var tilfældet for det bedst mulige farveresultat opnået med Desmin. Ved justeringer i disse parametre er det sandsynligt, at der kan opnås en reduceret baggrundsfarvning og dermed et bedre farveresultat. CELL MARQUE beskriver i medfølgende datasheet til Desmin(EP15), at en forholdsregel ved anvendelse af antistoffet er validering af inkubationstid og temperatur, og udføres af brugeren (Bilag 2). Det endelige resultat af mest optimale fortynding fandtes at være fortyndet yderligere med +350 sammenlignet med CELL MARQUES anbefalinger jf. tabel 10. I tabel 27 ses det under Årsag, at kontrolvævene til Desmins farveresultater i Delforsøg 2 ikke godkendtes, da der af alle observatører fandtes muskelvæv i nogle områder af Tonsilvævet, med manglende positiv farvereaktion. Dette fund stemmer ikke overens med farveresultaterne til dobbeltbestemmelsen af fortynding i Delforsøg 1 som viste, at det var muligt at opnå en kontrol med godkendte positive farvereaktioner i muskelvævet i Tonsil. Ved sammenligning af kontrolvævene Tonsil for de tre fortyndingsresultater i Delforsøg 2, bemærkedes der af observatørerne et uniformt farvemønster for, hvilket område i kontrollerne muskelvævet ikke var farvet, hvilket grundlagde mistanke om, at årsagen til den manglende positive farvereaktion, var en defekt i vævet. Under antagelsen af at dette er tilfældet, ville det ikke have en indflydelse på godkendelse/afvisning af kontrollerne, da dette ikke ville betyde noget for observationen af baggrundsfarvning i samtlige kontrolvæv. Side 49 af 106

51 Metode Nævnte analysevariabler af Lin F., Chen Z. (6), udover fortynding af antistof, er ikke forsøgt tilpasset i dette projekt. Grundlaget er forsøgets rammer, som er fastlagt med udgangspunkt i at tilpasse de nye antistofkloner til den eksisterende analyseprotokol til referenceklonerne anvendt på PAI, Sygehus Vendsyssel til antistofferne Desmin, TTF-1 og CD1a (Bilag 5,8-12). Der er i projektet et omkostnings-aspekt i forhold til mulighed for besparelse. Dette aspekt er ikke i overensstemmelse med, at tilføre de nye antistofkloner en analyseprotokol, som afviger fra afdelingens, hvilket ville være et muligt udfald ved ændring i andre analysevariabler end fortyndingen TTF-1 Resultater Den mest optimale fortynding af TTF-1 fandtes at være jf. tabel 28 med scoren Good og fortyndingen befinder sig indenfor grænserne i angivet fortyndingsområde anbefalet af CELL MARQUE (tabel 10). I henhold til resultaterne i Delforsøg 1, hvor den optimale fortynding udvalgtes som med scoren Good, kan det ses i tabellen, at fortyndingen ikke har kunnet opnå samme score i dette delforsøg, hvor den blev scoret Borderline. Årsagen er den tillagte moderate baggrundsfarvning observeret i vævscoren Nodøs Kolloid Stroma i Thyroidea. Det er vist i dette delforsøg, at det er muligt at opnå samme resultat, ved yderligere at fortynde den mest optimale fortynding med +25. Optimeringen af TTF-1 i dette projekt har vist, at der kan opnås et acceptabelt farveresultat, ved anvendelsen af den nye antistofklon til immunhistokemisk analyse ved fortynding Farveresultatet har vist sig at være i god overensstemmelse med den teori, som et acceptabelt resultat i dette projekt, bygger på. I NordiQC assessment run 39, 2013 (Bilag 14), har det været muligt af opnå et farveresultat med TTF-1 antistoffer, hvor der ses en moderat kernefarvning i cylinderepitelet i de terminale bronkioler i lungevæv. Metode Tilstedeværelsen og graden af baggrundsfarvning ses at være forskellig for hvert farveresultat, selvom samme fortynding er anvendt, hvilket tyder på, at forekomsten af baggrundsfarvning kan være svær at forudse og fastlægge ud fra resultaterne for TTF-1 for de to første delforsøg. En mere stabil faktor har været angivelsen af den øjensynligt procentvise andel af farvede cylinderepitelceller i lungevævet. Side 50 af 106

52 CD1a Resultater fandtes at være den mest optimale fortynding af CD1a jf. tabel 29. I tabel 29 ses det, at alle de testede CD1a fortyndinger i Delforsøg 2, har opnået Optimal score og vurderes ifølge tabel 19, som angiver kriterierne for en optimal farvning, at være perfekte eller næsten perfekte farveresultater. I forhold til den anbefalede øvre grænse for fortynding af CD1a, angivet af producenten CELL MARQUE som jf. tabel 10, er der i dette projekt opnået et optimalt farveresultat med yderligere +150 tillagt den anbefalede øvre grænse. Metode Under scoring af CD1a i dette delforsøg, kunne alle resultater placeres under kategorien Optimal (Tabel 19). På trods af lige scoringsresultater, observeredes en forskel på farveresultaterne i vævscoren Lymfe. Der var en klar forskel i antal af positive celler i vævet, men ud fra vurderingskriterierne i tabel 19, kan dette ikke tages stilling til. Under konstrueringen af scoringssystemet var det ikke muligt at finde en kvalitetsvurdering af immunhistokemisk farvning med CD1a lavet af NordiQC. Der kunne derfor ikke hentes inspiration til hverken kriterier eller øjensynlige procentsatser af farvede celler, som hos de andre to antistoffer, hvorfor det var vanskeligt, at angive mere konkrete beskrivelser af kriterierne til CD1a. Dette blev synligt i forbindelse med observationerne i lymfevævet, hvor det var klart, at der var en forskel, som virkede logisk at tage stilling til, men dette var ikke en mulighed ud fra scoringssystemet. Angivelsen af en procentsats for celler i et givet væv kan, set i forhold til TTF-1 scoringssystemet, være en fordel ikke at medtage, da der har været fin mulighed for at score et farveresultat fra CD1a med scoren Optimal, som med TTF-1 ikke har været muligt at opnå. Sammenligning Delforsøg 3 Desmin Resultater Sammenligningen af farveresultatet fra den nye antistofklon Desmin(EP15) med farveresultatet fra referenceklonen Desmin(D33), resulterede i forhold til scoringskategorierne i en Borderline score til Desmin(EP15) og scoren Optimal til Desmin(D33), se tabel 30. Begge antistofkloner farvede tilstrækkeligt i forhold til forventede positive farvereaktion i alle vævscores angivet i scoringssystemet til Desmin, tabel 11. Side 51 af 106

53 I sammenligning af antistofklonernes evne til at detektere og påvise det søgte antigen, som ifølge NordiQC og Torlakovic et al. beskriver analysens sensitivitet (4,8), har begge antistofkloner en god sensitivitet. Beskrivelsen Baggrund er angivet som Årsag til scoren Borderline i tabel 30, da der er moderat baggrundsfarvning tilstede i farveresultatet fra den nye antistofklon, hvor der ikke observeredes baggrundsfarvning hos referencen. Torlakovic et al. nævner, at for at teste en analyses specificitet, er det en nødvendighed, at anvende negative kontroller (8). I dette forsøg er medtaget negative væv i multiblokkene, som for Desmin er placentavæv i vævscore 2, med non-ekspression af antigenet. Analysens specificitet for Desmin(EP15), er vurderet utilstrækkelig (Borderline) grundet baggrundsfarvning i blandt andet vævscoren Placenta, og dermed er muligheden for falsk positive resultater opstået. Det skal dog nævnes, at de forventede negative celler, syncytiotrophoblaster og cytotrophoblaster, forblev negative. Der er ikke fundet en falsk positiv farvereaktion i en negativ celles cytoplasma, men baggrundsfarvning og uspecifikke udfældninger er set i vævet omkring cellerne, hvilket hører ind i de parametre en analyses specificitet måles ud fra, ifølge NordiQC (4). I sammenligning af antistofklonerne fås en bedre kvalitet med referenceklon Desmin(D33) i forhold til analysernes evne til at farve specifikt. For farveresultaterne ses i tabel 30, at kontrolvævene er afvist. Årsagen i begge tilfælde er Tonsilvævet med manglende positiv farvereaktion i muskelvævet, hvilket understøtter teorien om en mulig defekt i selve vævet Metode Ud fra scoringssystemet findes graden af baggrundsfarvning, at være afgørende for kvalitetsforskellen mellem de to farveresultater, hvorimod antistofklonernes evne til at påvise Desmin antigenet er lige. I sammenligning med referencen, har Desmin(EP15) en højere sensitivitet, ifølge NordiQCs beskrivelse af evnen til at detektere et højere antal tumorceller (4). Dette kommer til udtryk i vævscore 4, Rhabdomyosarkom, hvor øjensynligt alt tumorvæv af runde- og spindelceller er farvet, hvor referencen kun farvede runde tumorceller i det mere myoxide vævsområde af Rhabdomyosarkomet, og dermed ikke er i stand til at påvise spindelcellerne i tumorvævet, som det ses afbilledet i figur 23 nedenfor. Side 52 af 106

54 Figur 23: IHC-farvning af Rhabdomyosarkom (vævscore 4) med Desmin klon D33 (reference) og EP15, forstørrelse x10. A: fortynding 1+50, D33, scoret Optimal. Omkring 20 % af tumorcellerne i det myoxide væv er farvet kraftigt, spindelceller er ikke farvet (nederst højre side). B: fortynding 1+850, EP15, scoret Borderline. >20 % af tumorcellerne i det myoxide væv er farvet kraftigt, spindelceller er farvet kraftigt (nederst højre side) Denne kvalitetsforskel bliver ikke gjort synlig af scoringssystemet og vurderingskriterierne. Spindelcellerne indgår ikke som en del i scoringssystemet. Spindelcellerne er beskrevet i teoriafsnittet under Demin, og blev ikke inkluderet i metoden, da der ikke blev observeret nogen positive spindelceller under mikroskopien af Rhabdomyosarkomet, ved konstruering af scoringssystemet. Referencen er som tidligere nævnt en valideret analyse og ingen af de fire observatører havde erfaring i at kende positive spindelceller. Derfor fokuseredes der som udgangspunkt på det myoxide område i Rhabdomyosarkomet, hvor forekomsten af runde tumorceller kunne påvises med referencen i det indledende arbejde. Denne beslutning blev taget i samråd med en patolog. Det kunne ikke undgås ved udstansningen af Rhabdomyosarkomet, at få noget tumorvæv med fra området indeholdende spindelcellerne. Ved at spindelcellerne er en del af vævscore 4, men ikke nævnes i vurderingskriterierne i tabel 11, betyder det for vurdering af farveresultat fra de to antistofkloner, at der er opnået et klart bedre positivt farveresultat med Desmin(EP15), men som ikke indgår og får betydning i sammenligningen af de to antistofkloners farvekvalitet. Side 53 af 106

55 TTF-1 Resultater I sammenligningen af den nye antistofklon TTF-1(EP229) og referenceklonen TTF-1(SPT24) fandtes der ikke en forskel i farvekvaliteten jf. tabel 31. Begge antistofkloner opnåede et farveresultat med scoren Good, samt en godkendt kontrol. Under Årsag i tabel 31 kan det ses, at beskrivelsen Farvereaktion(%) er angivet for begge resultater. Som afbilledet i figur 21, mangler der positive farvereaktioner i en lille procentdel cylinderepitelceller, samt i follikelceller i henholdsvis vævscore 2. Lunge og 3. Nodøs Kolloid Stroma i Thyroidea. I sammenligning af hvorvidt antistofklonerne kan fortyndes fremhæves det, at TTF-1(EP229) kan fortyndes +25 mere end TTF-1(SPT24). Det ses i sammenligningsforsøgets resultater ud fra tabel 31, at det end ikke var muligt for referencen at opnå en Optimal score, hvilket også har gjort sig gældende for alle farveresultater med den nye antistofklon under optimeringsdelen jf. tabel 25 og 28. Angivelsen af, i tabel 15, at alle cylinderepitelceller skal farves, for at kunne vurdere et farveresultat Optimal, har haft den betydning, at antistoffet TTF-1, uanset hvilken antistofklon der anvendes, højest kan opnå scoren Good, der beskriver farveresultatet som acceptabelt i denne undersøgelse. I en kvalitetsvurdering af TTF-1, run 39, udført af NordiQC (Bilag 14), er der opnået optimale farveresultater med referenceklon TTF-1(SPT24) fra producenten Novocastra. NordiQC angiver protokolindstillinger for demaskeringstid og inkubationstid af primært antistof, som er sammenlignelige med indstillingerne for protokollen anvendt i dette projekt (Bilag 5,10), men et optimalt farveresultat er oftest set ved anvendelse af analysereagenser fra samme producent som antistofklonen er fra, hvor der i dette forsøg hovedsageligt er anvendt reagenser fra producenten DAKO. Om anvendelsen af reagenser fra forskellige producenter kan have en afgørende indflydelse på farveresultatet, kan ikke vurderes i dette projekt. Det kunne være interessant at undersøge, om anvendelsen af samme reagens fra forskellige producenter, har en betydelig effekt på farveresultatet, med den indgangsvinkel, at optimere antistofprotokollerne via valg af bedste analysereagens i de protokoltrin, hvor det er muligt at variere disse. Metode I Run 39 fra NordiQC (Bilag 14) ses der anvendt normalt Lungevæv der af NordiQC anses som det bedst anvendelige kontrolvæv til TTF-1. Normalt lungevæv er i dette projekt anvendt i vævscore 2 jf. tabel 2. Farveresultaterne, som fastslås af NordiQC kan opnås med TTF-1(SPT24), stemmer ikke overens med, hvad der er set i denne undersøgelse ud fra farveintensiteten i cylinderepitelcellerne i de terminale bronkioler. NordiQC afbilleder i run 39 en moderat til kraftig farveintensitet i cellekernen af disse celler, ved anvendelse af referenceklonen (Bilag 14). En moderat til kraftig kernefarvning i cylinderepitelcellerne er Side 54 af 106

56 også et vurderingskriterie for en optimal score i NordiQCs scoringssystem (Bilag 14). Dette projekts farveresultater med klon(spt24) har højest vist, en svag farveintensitet af cylinderepitelcellernes kerne. En svag farveintensitet i cellekernen er, i det anvendte scoringssystem, minimumskravet for en optimal farvning jf. tabel 15. I overført betydning ville de opnåede farveresultater i dette projekt sandsynligvis ikke få en score, som vurderer farvningen tilstrækkelig i denne vævscore, ud fra NordiQCs beskrivelse med det forbehold, at der imellem NordiQC og dette projekt ikke er afstemt for, hvornår en farveintensitet vurderes henholdsvis svagt og moderat positiv. CD1a Resultater Jf. tabel 32 i sammenligningen af farvekvaliteten mellem den nye antistofklon CD1a(EP3622) og referenceklonen CD1a(010) ses der scoringslighed ved en Optimal score til begge antistofkloner. Det var muligt i dette projekt at opnå et perfekt eller næsten perfekt farveresultat, uanset hvilken antistofklon der anvendtes i analysen. I forhold til antistoffortynding, fortyndes CD1a(EP3622) med +50 mere end referencen. Vurderingskriterierne for et Optimalt farveresultat i tabel 19 er opfyldt af begge CD1a antistofkloner, hvilket viser god overensstemmelse mellem farveresultaterne i dette projekt og den teoretiske beskrivelse af cellernes morfologi ved en positiv farvereaktion, samt farvemønster i de anvendte væv i tabel 3. Til en relevant sammenligning af farveresultaternes kvalitet i dette forsøg, med lignende kvalitetsvurderinger af farveresultater ved påvisning af CD1a i andre studier, samt eventuelle kvalitetsvurderinger foretaget af NordiQC, har det ikke været muligt at finde litterært belæg. Udgangspunktet i samtlige publicerede videnskabelige artikler fandtes at være diagnostisk, hvor dette projekt har et analytisk fokus. Medfølgende datasheet i bilag 4 til den nye antistofklon CD1a(EP3622) beskriver hud, som positiv kontrolvæv, der kvalificerer sig bedst til kvalitetsvurdering af opnået farveresultater. I et videnskabeligt studie af Hussein M. anvendes forskellige typer af hudlæsioner til påvisning af CD1a-antigen i Langerhanske celler med CD1a(010) antistofklon. Vyberg M. udpeger ligeledes hud som væv, hvor der observeres en kraftig farvereaktion i Langerhanske celler (3). Nævnte publiceringer er sammenlignelige med resultaterne opnået med begge CD1a antistofkloner i dette projekt. Metode Det var ikke muligt at finde et væv eller celler med lav ekspression af CD1a antigen. Ud fra mikroskopi af referencen observeredes en moderat membranfarvning i Langerhanske celler i hud, som den laveste farveintensitet. Der observeredes svage farvninger i form af cellernes dendritter i alle de positive vævscores, hvor Langerhanske- og Interdigiterende dendritiske celler forventedes påvist, men dette Side 55 af 106

57 vurderes at være for ustabil at vurdere farveintensitet ud fra, da det ikke er muligt at bedømme, hvornår en svag farvning er forårsaget af en celleoverflade i det synlige vævsniveau og selve cellelegemet befinder sig i et dybere vævsniveau. Observatørerne har under konstruering af scoringssystemet kalibreret for vurderingen af CD1a positive celler, ved ikke at tage stilling til observerede sfæriske farvereaktioner, hvor der forventes at se en positiv farvereaktion med CD1a, men kun at vurdere ud fra observationer af faste membranstrukturer, som cellelegemets membran. Økonomiske konsekvenser Diskussionen i følgende afsnit, afviger fra den hidtil sete opbygning, da metoden til at belyse de økonomiske konsekvenser er identisk for de tre antistoffer og findes derfor separat nederst i dette afsnit. Desmin Resultater Der ses en tydelig økonomisk besparelsesfordel i at anvende den nye antistofklon Desmin(EP15) fremfor referenceklonen, se tabel 33. En erstatning af referenceklon Desmin(D33) med den nye Desmin(EP15) vil ifølge resultaterne i dette projekt betyde, at kvaliteten af farveresultatet nedsættes, se tabel 30. Analysens specificitet, som evnen til at farve specifikt i væv, vurderet ud fra graden af baggrundsfarvning, er ved anvendelse af Desmin(EP15), utilstrækkelig i forhold til referencen, som lever op til disse krav med en Optimal score. Begge antistofkloner opfyldte dette projekts krav for forventede positive farveresultater, se tabel 1. Med den fundne økonomiske fordel ved anvendelse af den nye antistofklon Desmin(EP15), jf. tabel 33, kunne det være interessant, på baggrund af projektets resultater og analytiske tilgang, at undersøge den diagnostiske betydning, forskellen i farvekvalitet har. TTF-1 Resultater Der ses ikke en økonomisk fordel i, at erstatte referenceklonen med den nye antistofklon fra CELL MARQUE for TTF-1, se tabel 34. I sammenligningen af kvaliteten mellem de to antistofkloners farveresultat (tabel 31), er der ikke fundet en forskel. Begge antistofkloner har opnået scoren Good, som vurderer farveresultaternes kvalitet acceptabel til anvendelse ved IHC-analyse, se tabel 31. At udskifte referenceklon SPT24 med den nye klon EP229 fra CELL MARQUE findes dermed heller ikke fordelagtigt, i kontekst til analysekvaliteten. CD1a Resultater Side 56 af 106

58 Der ses en lige kvalitet af antistofklonernes farveresultater og der findes tillige ingen økonomisk gevinst eller merudgift forbundet med valg af antistofklon, ud fra resultaterne opnået i dette projekt (tabel 32,35). Da der ikke er en prisdifference mellem de to kloner, og der heller ikke ses forskel i kvaliteten af farveresultatet (tabel 32), ville det være interessant yderligere at undersøge, om der er en forskel på antistofklonernes præstationsevne i forbindelse med diagnostisk påvisning af antigener i sygdomsvæv. Metode Ud fra statistiske data fra afdelingens EDB-system Logica, har det været muligt at se på, hvor mange IHCanalyser der er blevet udført på årsbasis, for hvert af de tre antistoffer. Dermed kunne prisen for alle analyser, udført med hvert af de tre antistoffers referenceklon i et givet år, udregnes og sammenlignes med omkostningerne der ville ses, hvis den nye antistofklon var anvendt i samme år i stedet for referencen. Denne sammenligningsmetode har vist sig nyttig til, at give et mere håndgribeligt overblik over de økonomiske konsekvenser. Side 57 af 106

59 Konklusion Betydningen for resultatet ved en immunhistokemisk farvning, ved anvendelse af Desmin (EP15) fra antistofproducenten CELL MARQUE, fremfor Desmin D33 fra den nuværende leverandør DAKO, vil være at der ses en højere grad af baggrundsfarvning. Dette projekts resultater har påvist at antistofklonerne er lige sensitive til at detektere det søgte antigen i vævet, dog med det forbehold, at metoden i dette projekt er begrænset til at vurdere om Desmin (EP15) kan levere et ligeså godt positivt farveresultat som Desmin (D33), men ikke om Desmin (EP15) muligvis kan levere et bedre analyseresultat. En erstatning af den nuværende anvendte antistofklon fra DAKO med antistofklonen fra CELL MARQUE, vil betyde for Patologisk Anatomisk Institut, Sygehus Vendsyssel, at det nuværende analyseresultat med Desmin (D33) fra DAKO som vurderes perfekt eller næsten perfekt i denne undersøgelse, vil blive nedgraderet til et utilstrækkeligt farveresultat ved immunhistokemisk analyse med Desmin (EP15) fra CELL MARQUE. Hvis PAI anvender Desmin fra CELL MARQUE, fremfor den nuværende leverandør DAKO, vil den økonomiske konsekvens være en besparelse på 16,56 kr. i pris pr. analyse. Det vil ikke have nogen betydning for resultatet ved en immunhistokemisk farvning med TTF-1 at anvende TTF-1 (EP229) fra CELL MARQUE fremfor TTF-1 (SPT24) fra den nuværende leverandør NOVOCASTRA. Kvaliteten af farveresultatet er for begge antistofkloner vurderet acceptabel, men der vil være en økonomisk konsekvens i form af en merudgift på 5,17 kr. pr. analyse for Patologisk Anatomisk Institut, Sygehus Vendsyssel, ved at anvende TTF-1 (EP229) fra CELL MARQUE fremfor TTF-1 (SPT24) fra NOVOCASTRA. Valg af antistofklon fra henholdsvis CELL MARQUE og DAKO har ingen betydning for resultatet ved immunhistokemisk farvning med CD1a. Kvaliteten af farveresultatet er vurderet at være lige imellem de to antistofkloner, samt på et analytisk højt niveau, hvor farveresultatet vurderes perfekt eller næsten perfekt. Der er ingen økonomiske konsekvenser forbundet med at vælge CD1a (EP3622) fra CELL MARQUE fremfor CD1a (010) fra den nuværende leverandør DAKO da prisen pr. analyse for begge antistofkloner er 7,29 kr. Side 58 af 106

60 Perspektivering Dette projekt bidrager med relevant viden omkring mulighed for anvendelse af tre nye antistofkloner der lige er kommet på markedet, med påstanden om en lige sensitivitet og højere fortyndingsratio, til en billigere pris. Ud fra projektets resultater påvistes en økonomisk gevinst i at anvende antistofklonen Desmin(EP15) fra producenten CELL MARQUE, fremfor den nuværende antistofklon fra DAKO. Disse resultater kan give anledning til yderligere undersøgelser af antistofklonens potentiale til diagnostisk immunhistokemi, og samtidig udføre en grundigere udredning af, hvad resultaterne i dette projekt betyder i diagnostisk sammenhæng med det formål, at samle og evaluere alle aspekter, for at kunne træffe en kvalificeret beslutning herom. Side 59 af 106

61 Referenceliste 1) Region Nordjylland Budget, Budgetforlig 2016 Budgetaftale 2016: Fokus og fornyelse Journalnummer: (Set 2015 Okt.). Tilgængelig fra: URL: Nordjylland/Budget-og-regnskab/Budget 2) Riise K. Referat af: Orientering omkring budgetforlig på temadag September, Region Nordjylland, Sygehus Vendsyssel, Hjørring 3) Vyberg M. Anvendt immunhistokemi 2008 forfatteren. Bioanalytikeruddannelsen og Odontologisk Boghandel og Forlag. Academic Books: september udgave. 8. oplag 4) NordiQC. (Set 2015 Okt.). Tilgængelig fra: URL: 5) C. Eguiluz et al. Multitissue array review: A chronological description of tissue array techniques, applications and procedures. ELSEVIER. April 2006; Pathology Research and Practice 202 (2006) ) Lin F., Chen Z., Standardization of Immunohistochemistry. Arch Pathol lab med. December 2015; vol-138: ) Hudson J. Antibody Optimization for Immunohistochemistry. Dako North America. Connection ) Torlakovic et al. Standardization of Negative Controls in Diagnostic Immunohistochemistry: Recommendations From the International Ad Hoc Expert Panel. Appl Immunohistochem Mol Morphol. April 2014; 22(4): doi: /pai 9) Kelly et al. Embryonal rhabdomyosarcoma of the testis. Can Urol Assoc J 2011;5(1):e7-e10; DOI: /cuaj ) Wang Y., Zhao S. Vascular Biology of the Placenta. Morgan & Claypool Life Sciences; Bookshelf ID: NBK (Set 2015 December). Tilgængelig fra: URL: 11) Torlakovic et al. Standardization of Positive Controls in Diagnostic Immunohistochemistry: Recommendations From the International Ad Hoc Expert Committee. Appl Immunohistochem Mol Morphol. Januar 2015, Volume 23, Nr. 1; 2015;23: ) Ma et al. The expression of TTF-1 and Napsin A in early-stage lung adenocarcinoma correlates with the results of surgical treatment. International Society of Oncology and Biomarkers. Tumor Biol. (2015) 36: DOI: /s z Side 60 af 106

62 13) Hussein, M., Skin-Limited Langerhans Cell Histiocytosis in Children. Informa Healthcare USA, Cancer Investigation, 27: , 2009 DOI: / Side 61 af 106

63 Bilag 1 Side 62 af 106

64 Bilag 2 Side 63 af 106

65 Side 64 af 106

66 Side 65 af 106

67 Side 66 af 106

68 Side 67 af 106

69 Bilag 3 Side 68 af 106

70 Side 69 af 106

71 Side 70 af 106

72 Side 71 af 106

73 Side 72 af 106

74 Bilag 4 Side 73 af 106

75 Side 74 af 106

76 Side 75 af 106

77 Side 76 af 106

78 Bilag 5 Side 77 af 106

79 Side 78 af 106

80 Bilag 6 Side 79 af 106

81 Side 80 af 106

82 Bilag 7 Side 81 af 106

83 Side 82 af 106

84 Bilag 8 Side 83 af 106

85 Side 84 af 106

86 Bilag 9 Side 85 af 106

87 Side 86 af 106

88 Bilag 10 Side 87 af 106

89 Bilag 11 Side 88 af 106

90 Side 89 af 106

91 Bilag 12 Side 90 af 106

92 Side 91 af 106

93 Bilag 13 Side 92 af 106

94 Side 93 af 106

95 Bilag 14 Side 94 af 106

96 Side 95 af 106

97 Side 96 af 106

98 Side 97 af 106

99 Side 98 af 106