Histology FISH Accessory Kit Kode K5799

Transkript

1 Histology FISH Accessory Kit Kode K udgave Til fluorescens in situ hybridisering (FISH) på formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. Sættet indeholder reagenser til 20 analyser. ( ) P04094DK_02_K / s. 1/27

2 Indholdsfortegnelse Tilsigtet anvendelse... 3 Indledning... 3 Reagenser... 3 Medfølgende materialer... 3 Nødvendige materialer, der ikke medfølger... 4 Forholdsregler... 5 Opbevaring... 8 Klargøring af præparater... 8 Paraffinindstøbte snit... 8 BRUGSVEJLEDNING... 9 A. Klargøring af reagens... 9 A.1 Pre-Treatment Solution... 9 A.2 Stringent Wash Buffer... 9 A.3 Wash Buffer... 9 A.4 Serie af alkoholer... 9 A.5 Pepsinopløsning... 9 B. Farvningsprocedure B.1 Bemærkninger til proceduren B.2 Behandling af vævsprøver før farvning B.3 Farvningsprotokol B.3.a. Farvningsprotokol for FISH-prober, der er fortyndet i ethylencarbonatbaseret hybridiseringsbuffer B.3.b. Farvningsprotokol for FISH-prober, der er fortyndet i formamidbaseret hybridiseringsbuffer Kvalitetskontrol Fortolkning af resultater Fejlfinding Appendiks Appendiks Referencer Symbolforklaring ( ) P04094DK_02_K / s. 2/27

3 DANSK Tilsigtet anvendelse Til in vitro-diagnostisk brug. Histology FISH Accessory Kit er beregnet til brug til fluorescens in situ hybridiseringsteknik (FISH) på formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnitspræparater. Reagenserne i dette Histology FISH Accessory Kit kan også anvendes sammen med HER2/CEN- 17 IQISH Probe Mix (kode K5731, flaske 3). Hvis reagenserne fra Dako Histology FISH Accessory Kit, kode K5799 bruges sammen med reagenser fra kode K5731, skal den procedure, der er beskrevet i indlægssedlen til kode K5731, følges. Indledning Histology FISH Accessory Kit indeholder alle nødvendige reagenser med undtagelse af proben, til udførelse af en FISH-procedure på prøver af formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. Efter afparaffinering og rehydrering opvarmes prøverne i Pre-Treatment Solution efterfulgt at proteolytisk fordøjelse med pepsin. Efter opvarmningen og det proteolytiske forbehandlingstrin anvendes FISH-prober, som brugeren skaffer, og prøverne forsegles med Coverslip Sealant inden denaturering og hybridisering. Efter hybridisering udføres der en stringensvask, som sikrer fjernelse af ubundne og uspecifikt bundne FISH-prober inden dehydrering med alkohol. Til sidst monteres prøverne med Fluorescence Mounting Medium, der indeholder en blå fluorescenskontrastfarve. Resultaterne fortolkes ved hjælp af et fluorescensmikroskop udstyret med egnede filtre (se bilag 1). Reagenser Medfølgende materialer De anførte materialer rækker til 20 analyser (en analyse defineres som ét målområde på 22 mm x 22 mm). Sættet indeholder materialer til op til 10 individuelle FISH-kørsler (fire separate kørsler, når pepsinnedsænkningsmetoden anvendes). Histology FISH Accessory Kit fremsendes på tøris. Som en kontrol af at sættets komponenter ikke har været udsat for høje temperaturer under transporten, skal der stadig være tøris tilbage ved modtagelsen. Bemærk, at nogle af sættets komponenter kan være ufrosne. Dette vil ikke påvirke ydelsen af Histology FISH Accessory Kit. Flaske 1 Flaske 2A Flaske 2B Flaske 4 Pre-Treatment Solution (20x) 150 ml, 20x koncentreret MES-buffer (2-[N-morpholin]ethansulfonsyre). Pepsin 4 x 6,0 ml, brugsklar Pepsinopløsning, ph 2,0; indeholder stabilisator og et antimikrobielt stof. Pepsin Diluent (10x) 24 ml, koncentreret 10x Fortyndingsbuffer, ph 2,0, med et antimikrobielt stof. Stringent Wash Buffer (20x) 150 ml, 20x koncentreret SSC-buffer (natrium-citrat-saltvandsopløsning) med Tween-20. ( ) P04094DK_02_K / s. 3/27

4 Flaske 5 Flaske 6 Del 7 Fluorescence Mounting Medium 0,4 ml Brugsklart fluorescensmonteringsmedium med 500 µg/l DAPI (4,6-diamidin-2-phenylindol). Wash Buffer (20x) 500 ml, 20x koncentreret Tris/HCl-buffer. Coverslip Sealant 1 tube Brugsklar opløsning til aftagelig forsegling af dækglas. BEMÆRK: Samtlige reagenser kan frit ombyttes med de tilsvarende reagenser i Dako HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731). Hvis reagenserne fra Dako Histology FISH Accessory Kit, kode K5799 bruges sammen med reagenser fra kode K5731, skal den procedure, der er beskrevet i indlægssedlen til kode K5731, følges. Nødvendige materialer, der ikke medfølger Laboratoriereagenser Destilleret eller deioniseret vand Alkohol, 96% Xylen eller xylenerstatninger Laboratorieudstyr Absorberende servietter Justerbare pipetter Kalibreret termometer til delvis nedsænkning (område C) Dækglas (18 mm x 18 mm eller 22 mm x 22 mm og 24 mm x 50 mm eller 24 mm x 60 mm) Pincet Stinkskab Dako Hybridizer (kode S2450/S2451)* Varmeblok eller hybridiseringsovn* Fugtkammer til hybridisering* Mikrocentrifuge Objektglas, Dako Silanized Slides, kode S3003, poly-l-lysin-coatede objektglas eller Superfrost Plus-objektglas Farvningsskåle eller bade Metal- eller plastholdere Stopur (der kan måle intervaller på 0 60 minutter) Vandbad med låg (der kan holde en temperatur på 37 (±2) C, 63 (±2) C, 65 (±2) C og fra 95 C til 99 C Mikrobølgeovn med mulighed for registrering, hvis der udføres forbehandling ved hjælp af en mikrobølgeovn** (se trin 1 i afsnit B.3a eller B.3.b. Farvningsprotokol, Metode B). Beholderen, der er egnet til mikrobølgeovn, låget skal have huller med en diameter på f.eks. én cm * Varmeblok til fordøjelse (37 (±2) C), varmeblok eller hybridiseringsovn til denaturering (66 (±2) C (B.3.a.) eller 82 (±2) C) (B.3.b.) og fugtkammer til hybridisering (45 (±2) C) kan anvendes, men vi anbefaler Dako Hybridizer, kode S2450/S2451. ** Vandbad med låg (der kan holde en temperatur på C) eller et mikroprocessorstyret trykkammer som f.eks. Dako Pascal, kode S2800 kan anvendes i stedet for en mikrobølgeovn. ( ) P04094DK_02_K / s. 4/27

5 Mikroskopudstyr og -tilbehør Filtre til fluorescensmikroskop: DAPI-filter og egnede filtre til det anvendte fluorokrom, f.eks. FITC/Texas Red dobbelt filter, FITC og Texas Red enkeltfiltre til Dako FISH-prober se appendiks 1 for detaljerede oplysninger. Der skal anvendes et fluorescensmikroskop med en 100 watt kviksølvpære som lyskilde til Dako FISH-prober. Andre lyskilder anbefales ikke med disse filtre. Mappe til objektglas (papbakke til 20 objektglas med hængslet låg eller tilsvarende). Forholdsregler 1. Anvendes til in vitro diagnostik. 2. Må kun anvendes af uddannet personale. 3. Flaske 1, Pre-Treatment Solution (20x), kræver ingen faremærkning. Sikkerhedsdatablad (SDS) kan rekvireres af uddannet personale. 4. Flaske 2A, Pepsin, indeholder 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepsin A og <0.1% 5- chlor-2-methyl-4-isothiazol-3-one og 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. Flaske 2a er mærket: Farlig H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Forårsager svære forbrændinger af huden og øjenskader. Kan forårsage allergisk hudreaktion. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Brug særligt arbejdstøj. VED INDÅNDING: Flyt personen til et sted med frisk luft og sørg for, at vejrtrækningen lettes. Ring omgående til en GIFTINFORMATIONS-CENTRAL eller en læge. I TILFÆLDE AF INDTAGELSE: Ring omgående til en GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller en læge. Fremkald IKKE opkastning. VED KONTAKT MED HUDEN (eller håret): Alt tilsmudset tøj tages straks af. Skyl eller brus huden med vand. Ring omgående til en GIFT-INFORMATIONSCENTRAL eller en læge VED KONTAKT MED ØJNENE: Ring omgående til en GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller en læge. Opbevares under lås. Indholdet/beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regulativer. 5. Flaske 2B, Pepsin Diluent (10x), indeholder 50-<75% propan-2-ol og 5-<10% 2-amino-2- (hydroxymethyl) propan-1,3-diolhydrochlorid. Flaske 2B er mærket: Farlig H225 H319 H336 P280 P210 P241 P304 + P340 Meget brandfarlig væske og damp. Forårsager alvorlig øjenirritation. Kan forårsage sløvhed eller svimmelhed. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Holdes væk fra varme, varme overflader, gnister, åben ild og andre antændelseskilder. Rygning forbudt. Anvend eksplosionssikkert elektrisk, ventilations- og lysudstyr samt til al håndtering af materialet. VED INDÅNDING: Flyt personen til et sted med frisk luft og sørg ( ) P04094DK_02_K / s. 5/27

6 P303 + P361 + P353 P235 P501 for, at vejrtrækningen lettes. KONTAKT MED HUDEN (eller håret): Alt tilsmudset tøj tages straks af. Skyl eller brus huden med vand. Opbevares køligt. Indholdet/beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regulativer. 6. Flaske 4, Stringent Wash Buffer (20x), indeholder 10-<25% natriumchlorid og 10-<20% 2- amino-2-(hydroxymethyl) propan-1,3-diolhydrochlorid. Flaske 4 er mærket: H319 H315 P280 Advarsel P264 P305 + P351 + P338 Forårsager alvorlig øjenirritation. Forårsager hudirritation. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Vask hænderne grundigt efter brug. VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. 7. Flaske 6, Wash Buffer (20x), indeholder 10-<25% natriumchlorid og 10-<20% trometamol. Flaske 6 er mærket: H319 H315 P280 Advarsel P264 P305 + P351 + P338 Forårsager alvorlig øjenirritation. Forårsager hudirritation. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Vask hænderne grundigt efter brug. VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. 8. Del 7, Coverslip Sealant, indeholder 100% naphtha (råolie), hydrogenbehandlet let, og er mærket: Farlig H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 Meget brandfarlig væske og damp. Kan være livsfarligt, hvis det indtages og kommer i luftvejene. Giftig for vandlevende organismer, med langvarige virkninger. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Holdes væk fra varme, varme overflader, gnister, åben ild og andre antændelseskilder. Rygning forbudt. Anvend eksplosionssikkert elektrisk, ventilations- og lysudstyr samt til al håndtering af materialet. Undgå udledning til miljøet. I TILFÆLDE AF INDTAGELSE: Ring omgående til en GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller en læge. Fremkald IKKE opkastning. VED KONTAKT MED HUDEN (eller håret): Alt tilsmudset tøj tages straks af. Skyl eller brus huden med vand. ( ) P04094DK_02_K / s. 6/27

7 P235 P501 Opbevares køligt. Indholdet/beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regulativer. 9. Der henvises til sikkerhedsdatabladet (SDS) for yderligere oplysninger. 10. Andre vævsfikseringsmetoder og tykkelser på prøverne end de angivne kan påvirke vævsmorfologien og/eller signalintensiteten. 11. Andre inkubationstider og -temperaturer eller -metoder end de angivne kan give dårlige resultater. 12. Reagenserne er optimalt fortyndet. Yderligere fortynding kan medføre en dårlig præstation. 13. Der må kun anvendes rene farvningsskåle til pepsinneddypningsmetoden (trin 2. Metode C). ( ) P04094DK_02_K / s. 7/27

8 Opbevaring Opbevares mørkt ved 2-8 C. Alle reagenser kan også opbevares i frossen stand. Pepsin (flaske 2A) kan blive påvirket negativt, hvis det udsættes for varme. Denne komponent må ikke opbevares i stuetemperatur. Fluorescense Mounting Medium (flaske 5) kan blive påvirket negativt, hvis det udsættes for stærke lyskilder. Denne komponent må ikke opbevares i lys. Sættet må ikke anvendes efter udløbsdatoen, der er stemplet på æsken. Hvis reagenserne opbevares under andre betingelser end de angivne, skal brugeren validere reagensernes ydeevne (1). Der er ingen synlige tegn på, at produktet kan være ustabilt. Derfor er det vigtigt at evaluere normalt væv, som tidligere har udvist god FISH som en kontrol af analysekørslen. Kontakt Dakos tekniske service, hvis der observeres et uventet fluorescensmønster, som ikke kan forklares med variationer i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et problem med Histology FISH Accessory Kit. Klargøring af præparater Prøver fra biopsier, excisioner eller resektioner skal behandles med henblik på at konservere vævet til FISH-analyse. Følg den anbefalede metode til vævsbehandling til immuncytokemisk farvning, som er beskrevet herunder. Der henvises til reference (2) for yderligere oplysninger. Brugen af væv, der har været udsat for sur afkalkning til FISH anbefales ikke (3-6). EDTA som afkalker er rapporteret til at bevare DNA bedre (6) med henblik på (F)ISH-teknikker (3, 4, 7). BEMÆRK: Ydelsen for Dako Histology FISH Accessory Kit performance er ikke blevet valideret på afkalket væv. Paraffinindstøbte snit Kun væv, der er konserveret i neutral, bufferjusteret formalin og indstøbt i paraffin, er egnet til brug. Præparaterne kan f.eks. skæres i blokke med en tykkelse på 3 eller 4 mm og fikseres i timer i neutral, bufferjusteret formalin. Derefter dehydreres vævene gradvist i alkohol og xylen, efterfulgt af infiltrering med smeltet paraffin, hvor temperaturen bevares på maks. 60 C. Korrekt fikserede og indstøbte væv kan holde sig uendeligt inden opskæring og montering på objektglas, hvis de opbevares korrekt (15-25 C) (2, 8). Andre fiksativer er ikke egnede. Længere fikseringstider kan øge den nødvendige inkubationstid i trinnet med Pepsin-fordøjelse. Vævspræparater skal skæres i snit på 2 6 µm, anbringes på objektglas fra et vandbad og derefter lufttørres. Den optimale tykkelse af vævssnittene er 2-3 µm til Dako Split Signal FISH-prober. Snit på 4 6 µm kan anvendes til andre FISH-applikationer. Paraffinen skal smeltes ved 60 C i minutter. Snittene skal derefter afkøles til stuetemperatur (20 25 C) og opbevares ved 2 8 C. Det anbefales, at vævssnittene monteres på Dako Silanized Slides, kode S3003, eller poly L lysin coatede objektglas eller Superfrost Plus-objektglas. Generelt skal præparaterne analyseres inden for 6 måneder fra udskæringen, hvis de opbevares ved 2-8 C. Hvis vævssnittene opbevares under andre betingelser end de angivne, skal brugeren verificere betingelserne. ( ) P04094DK_02_K / s. 8/27

9 BRUGSVEJLEDNING A. Klargøring af reagens Det anbefales at forberede nedenstående reagenser inden farvningen: A.1 Pre-Treatment Solution Der kan forekomme krystaller i Flaske 1, men de vil gå i opløsning ved stuetemperatur. Sørg for, at krystallerne er forsvundet, inden reagenset klargøres. Fortynd en tilstrækkelig mængde fra Flaske 1 (Pre-Treatment Solution 20x) ved fortynding af koncentratet 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet opløsning kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kasser fortyndet opløsning, hvis den er uklar. A.2 Stringent Wash Buffer Fortynd en tilstrækkelig mængde af flaske 4 (Stringent Wash Buffer 20x) ved at fortynde koncentratet 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kasser fortyndet buffer, hvis de n er uklar. A.3 Wash Buffer Fortynd en tilstrækkelig mængde fra flaske 6 (Wash Buffer 20x) ved fortynding af koncentratet 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kasser fortyndet buffer, hvis den er uklar. A.4 Serie af alkoholer Klargør 3 skåle med 70%, 85% og 96% alkohol ud fra en 96% alkoholopløsning. Opbevar de tildækkede skåle ved stuetemperatur eller ved 2 8 C, og brug dem til maks. 200 objektglas. Kasser opløsningerne, hvis de er uklare. A.5 Pepsinopløsning Der er kun brug for en pepsinopløsning ved anvendelse af pepsinneddypningsmetoden (B.3.a. og B.3.b. trin 2, metode C). Klargør pepsinopløsningen som følger: Klargør 60 ml pepsinopløsning til en beholder med kapacitet til seks objektglas: Tilsæt 48 ml destilleret eller deioniseret vand ved stuetemperatur (20 25 C) til beholderen. Tilsæt 6 ml kold (2-8 C) Pepsin Diluent (10x) (flaske 2B) til beholderen. Tilsæt 6 ml kold (2 8 C) pepsin (flaske 2A) til beholderen. Sæt låg på beholderen og lad pepsinopløsningen få en temperatur på 37 (±2) C i et vandbad. Klargør 240 ml pepsinopløsning til en beholder med kapacitet til 24 objektglas: Tilsæt 192 ml destilleret eller deioniseret vand ved stuetemperatur (20 25 C) til beholderen. Tilsæt 24 ml kold (2-8 C) Pepsin Diluent (10x) (flaske 2B) til beholderen. Tilsæt 24 ml kold (2 8 C) Pepsin (flaske 2A) til beholderen. Sæt låg på beholderen og lad pepsinopløsningen få en temperatur på 37 (±2) C i et vandbad. Når pepsinopløsningen har nået den fastsatte temperatur, skal den bruges inden for 5 timer. ( ) P04094DK_02_K / s. 9/27

10 B. Farvningsprocedure B.1 Bemærkninger til proceduren Brugeren skal læse denne vejledning grundigt igennem og gøre sig fortrolig med alle komponenter inden brug (se Forholdsregler). Hvis komponenterne i sættet opbevares frosne, anbefales det at overføre reagenserne til 2 8 C, dagen inden analysen skal udføres, for at sikre en korrekt temperatur. Alle reagenser skal have den relevante temperatur inden brug. Flaske 1: Den fortyndede Pre-Treatment Solution skal ækvilibreres til C, hvis der anvendes vandbad (afsnit B.3.a. eller B.3.b. Farvningsprotokol, Trin 1: Forbehandling, metode A). Hvis der anvendes en mikrobølgeovn med mulighed for registrering til forbehandling (afsnit B.3.a. eller B.3.b. Farvningsprotokol, Trin 1: Forbehandling, metode B), skal den fortyndede Pre-Treatent Solution ækvilibreres til stuetemperatur, C. Flaske 2A: Pepsin skal anvendes ved 2-8 C (afsnit B.3.a. eller B.3.b. Farvningsprotokol, Trin 2: Metode A og B) og holdes koldt konstant. Flaske 2B: Pepsin Diliuent (10x) skal anvendes ved 2-8 C (afsnit B.3.a. eller B.3.b. Farvningsprotokol, Trin 2: Metode C) Flaske 4: En skål med fortyndet Stringent Wash Buffer skal ækvilibreres til stuetemperatur, og en anden skål skal ækvilibreres til 63 (±2) C (afsnit B.3.a.) eller 65 (±2) C (afsnit B.3.b) inden brug. Flaske 5: Fluorescence Mounting Medium kan anvendes ved en hvilken som helst temperatur fra 2-25 C. Flaske 6: Del 7: Fortyndet Wash Buffer skal ækvilibreres til stuetemperatur (20-25 C). Coverslip Sealant kan anvendes ved stuetemperatur (20 25 C). Alle trin skal udføres ved den angivne temperatur. Forfarvningsproceduren omfatter dehydreringer efterfulgt af tørring af prøverne. Sørg for, at prøverne er helt tørre, inden der fortsættes til næste trin. Prøverne må ikke tørre under de andre proceduretrin. Hvis det er nødvendigt at afbryde farvningsproceduren, kan objektglassene opbevares i Wash Buffer efter afparaffineringstrinnet i maks. 1 time ved stuetemperatur (20-25 C). B.2 Behandling af vævsprøver før farvning Afparaffinering og rehydrering: Forud for proceduren skal objektglassene med væv afparaffineres for at fjerne paraffinet, og derefter rehydreres. Ufuldstændig fjernelse af paraffinen skal undgås. Paraffinrester vil medføre en øget uspecifik farvning. Dette trin skal udføres ved stuetemperatur (20 25 C). 1. Placer objektglassene i et xylenbad, og inkuber i 5 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 2. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i 96% alkohol i 2 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 3. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i 70% alkohol i 2 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 4. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i fortyndet Wash Buffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.2) i mindst 2 minutter. Påbegynd farvningsproceduren som beskrevet i afsnit B.3.a. eller B.3.b., Trin 1, Forbehandling. Friske xylen- og alkoholopløsninger skal klargøres, hver gang 200 objektglas er blevet bearbejdet. ( ) P04094DK_02_K / s. 10/27

11 Der kan anvendes xylenerstatninger. BEMÆRK: Reagenserne og vejledningen i dette sæt er udviklet med henblik på at opnå en optimal ydelse. Yderligere fortynding af reagenser eller ændring af inkubationstemperaturen kan give fejlagtige eller uoverensstemmende resultater. Forskelle i vævsbehandling og tekniske procedurer på brugerens laboratorium kan gøre analyseresultaterne ugyldige. Valgfri modning af prøver: Inden afparaffineringen og rehydreringen inkuberes objektglassene ved 60 C i f.eks. 1 time på en varmeblok, en blok i en hybridiseringsovn eller i Dako Hybridizer. Som alternativ kan objektglassene inkuberes ved 37 C i 1-2 dage efterfulgt af 1 time ved 60 C. Fortsæt med afparaffineringen og rehydreringen. BEMÆRK: Dette trin er valgfrit. Modnede prøver kan reducere en eventuel baggrundsstøj. B.3 Farvningsprotokol Følg en af de to varianter af farvningsprotokollen, B.3.a eller B3.b. Bland ikke trinene i de to fremgangsmåder: Farvningsprotokol B.3.a beskriver den halvdøgnsprocedure, der skal anvendes til FISH-prober, der er fortyndet i en ethylencarbonatbaseret hybridiseringsbuffer. Farvningsprotokol B.3.b beskriver den todøgnsprocedure, der skal anvendes til FISH-prober, der er fortyndet i en formamidbaseret hybridiseringsbuffer. B.3.a. Farvningsprotokol for FISH-prober, der er fortyndet i ethylencarbonatbaseret hybridiseringsbuffer Trin 1: Forbehandling (mikrobølgeovn, vandbad, Pascal) Forbehandlingen kan enten udføres ved hjælp af et vandbad som beskrevet under metode A), ved hjælp af en mikrobølgeovn med mulighed for registrering, som beskrevet under metode B) eller ved hjælp af en Pascal-trykkoger som beskrevet under metode C). Metode A: Forbehandling med vandbad Fyld farvningsskåle (f.eks. Coplin-skåle) med den fortyndede Pre-Treatment Solution (se BRUGSANVISNING, afsnit A.1). Anbring farvningsskålene med den fortyndede Pre-Treatment Solution i et vandbad. Opvarm vandbadet og Pre-Treatment Solution til C. Mål temperaturen i skålen med et kalibreret termometer for at sikre en korrekt temperatur. Sæt låg på skålene for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Sænk de afparaffinerede snit, der har stuetemperatur, ned i den forvarmede Pre-Treatment Solution i farvningsskålene. Kontroller temperaturen igen, og inkuber i 10 (±1) minutter ved C. Tag hele skålen med objektglassene op af vandbadet. Tag låget af, og lad objektglassene køle af i Pre-Treatment Solution i 15 minutter ved stuetemperatur. Overfør objektglassene til en skål med fortyndet Wash Buffer (se BRUGSANVISNING, afsnit A.3) i 3 minutter ved stuetemperatur (20-25 C). Udskift Wash Buffer, og lad snittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. BEMÆRK: Pre-Treatment Solution er kun beregnet til én anvendelse. Må ikke genbruges. Metode B: Forbehandling ved hjælp af mikrobølgeovn med mulighed for registrering (anbefales) Fyld en plastskål med fortyndet Pre-Treatment Solution med stuetemperatur (20-25 C). Nedsænk de afparaffinerede snit i Pre-Treatment Solution, dæk skålen med et låg med ventilationshuller, og placer den i mikrobølgeovnen. Aktiver kogepunktssensoren, og vælg et program, der kører i 10 minutter efter at temperaturen er nået op på kogepunktet*. Efter de 10 minutters inkubation tages skålen med objektglas ud af ovnen, låget fjernes, og skålen lades henstå til afkøling i 15 minutter ved stuetemperatur. Overfør objektglassene til en skål med fortyndet Wash Buffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20-25 C). Udskift Wash Buffer, og lad snittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. ( ) P04094DK_02_K / s. 11/27

12 * Kravet om brug af en mikrobølgeovn med mulighed for registrering betyder, at ovnen skal have en sensor og programmer, som indledningsvis opvarmer Pre-Treatment Solution til kogepunktet og derefter opretholder den krævede forbehandlingstemperatur (over 95 C), mens den forudindstillede tid tæller ned (10 (±1) minutter). På visse mikrobølgeovne med mulighed for registrering er det ikke muligt at indstille en valgfri nedtællingstid. Hvis ovnen kun har forudindstillede programmer, skal der vælges et program, som opretholder den krævede forbehandlingstemperatur (over 95 C) i mindst 10 (±1) minutter, og programm et skal stoppes manuelt efter 10 (±1) minutter. BEMÆRK: Pre-Treatment Solution er kun beregnet til én anvendelse. Må ikke genbruges. Metode C: Forbehandling ved hjælp af Pascal-trykkammer Anbring 500 ml deioniseret vand i Pascal-karret. Fyld en plastikskål med 250 ml Pre-Treatment Solution. Nedsæk de afparrafinerede snit i Pre-Treatment Solution, og anbring skålen i Pascalkarret. Inkuber ved 121 C i 1 minut. Udløs trykket efter nedkøling til 90 C. Læs brugervejledningen til Pascal omhyggeligt for at få oplysninger om korrekt håndtering af Pascaltrykkammeret. Fjern beholderen, når trykket er udløst. Tag lågene af, og lad objektglassene køle af i Pre-Treatment Solution i 15 minutter ved stuetemperatur. Overfør objektglassene til en skål med fortyndet Wash Buffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.2). Lad snittene ligge i blød i 3 minutter ved stuetemperatur. Udskift Wash Buffer, og lad snittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. Fortsæt til trin 2. BEMÆRK: Pre-Treatment Solution er kun beregnet til én anvendelse. Må ikke genbruges. Anvend ikke en lukket, lufttæt beholder ved forbehandling i en mikrobølgeovn, da trykket i beholderen stiger og kan medføre, at beholderen eksploderer eller er årsag til personskade ved åbning. Der må anvendes en metalholder til objektglas i mikroovnen, hvis metalholderen er helt dækket af forbehandlingsopløsning under hele behandlingen i mikrobølgeovnen. Anvend ikke metal i en mikrobølgeovn på nogen anden måde. Følg instruktionerne fra producenten af mikrobølgeovnen. Undgå, at Pre-Treatment Solution koger vedvarende i de 10 minutters inkubationstid. Kontroller temperaturen hyppigt med et kalibreret termometer for at verificere temperaturforholdene. Trin 2: Pepsin, brugsklar (RTU) eller pepsinopløsning Pepsininkubation kan udføres ved direkte anvendelse af RTU-pepsindråber på objektglassene enten ved stuetemperatur (20-25 C) (metode A) eller ved 37 C (metode B). Alternativt kan objektglassene nedsænkes i en pepsinopløsning og inkuberes ved 37 (±2) C (Metode C). Metode A og metode B: Bank overskydende buffer af. Brug en fnugfri klud (såsom en absorberende serviet eller et stykke gaze) til omhyggeligt at tørre af rundt om prøven for at fjerne overskydende væske og holde reagenserne inden for det foreskrevne område. Tilsæt 5-8 dråber (250 µl) kold (2-8 C) Pepsin (flaske 2A), så præparatet er dækket. Opbevar altid Pepsin ved 2-8 C. Metode A: Pepsin, RTU - Inkubation ved C Inkuber i 5-15 minutter ved stuetemperatur (20-25 C). En inkubationstid på 5-15 minutter vil være passende for de fleste prøver, men den optimale inkubationstid kan afhænge af vævsfikseringen og/eller tykkelsen af prøven og skal bestemmes af brugeren. Bank overskydende Pepsin af, og læg snittene i blød i fortyndet Wash Buffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.3) i 3 minutter ved stuetemperatur (20-25 C). Udskift den fortyndede Wash Buffer og lad snittene ligge i bufferen i endnu 3 minutter. Fortsæt med dehydrering. Metode B: Pepsin, RTU - Inkubation ved 37 C Sæt præparatet med Pepsin på en varmeblok ved 37 C f.eks. Dako Hybridizer og inkuber i 3-5 minutter. En inkubationstid på 3-5 minutter vil være passende for de fleste prøver, men den optimale inkubationstid kan afhænge af vævsfikseringen og/eller tykkelsen af prøven og skal bestemmes af brugeren. Bank overskydende Pepsin af, og læg vævssnittene i blød i fortyndet Wash Buffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). ( ) P04094DK_02_K / s. 12/27

13 Udskift Wash Buffer, og lad snittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. Fortsæt med dehydrering. Dehydrer vævssnittene gradvist med alkohol: 2 minutter i 70% alkohol, 2 minutter i 85% alkohol, og 2 minutter i 96% alkohol. Lad vævssnittene lufttørre helt. Metode C: Pepsin-opløsning - Nedsænkning af objektglas i 37 C varm pepsinopløsning Sættet indeholder tilstrækkeligt reagens til fire separate kørsler (60 ml pepsinopløsning, lille beholder til seks objektglas) eller en enkelt kørsel (240 ml pepsinopløsning, stor beholder til 24 objektglas). Klargør pepsinopløsningen som beskrevet i afsnit A.5. Sæt låg på beholderen og lad pepsinopløsningen få en temperatur på 37 (±2) C i et vandbad. Sørg for, at temperaturen har stabiliseret sig. Mål temperaturen i beholderen med et kalibreret termometer for at sikre en korrekt temperatur. Bank overskydende Wash Buffer af. Nedsænk objektglassene i den 37 (±2) C grader varme pepsinopløsning, og inkuber i minutter. En inkubationstid på minutter vil være passende for de fleste prøver, men den optimale inkubationstid kan afhænge af vævsfikseringen og/eller tykkelsen af prøven og skal bestemmes af brugeren. Bank overskydende pepsinopløsning af, og læg vævssnittene i blød i fortyndet Wash Buffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20-25 C). Udskift Wash Buffer, og lad snittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. Fortsæt med dehydrering. Dehydrer vævssnittene gradvist med alkohol: 2 minutter i 70% alkohol, 2 minutter i 85% alkohol, og 2 minutter i 96% alkohol. Lad vævssnittene lufttørre helt. Trin 3: FISH-probe fortyndet i ethylencarbonatbaseret hybridiseringsbuffer (leveres af brugeren) BEMÆRK: FISH-probeblandinger fortyndet i ethylencarbonatbaseret hybridiseringsbuffer skal opbevares ved -18 C mellem hver brug. Opbevaring v ed -18 C medfører, at bufferen skiller sig i to faser. Inden anvendelse skal det kontrolleres, at der kun er én fase til stede, ved at lade probeblandingen få stuetemperatur (20-25 C) efterfulgt af blanding. Optø FISH-probeblandingen ved stuetemperatur (20-25 C) i højst 30 minutter ( beskyttet mod kraftigt lys), og hvirvl derefter flasken rundt i 15 sekunder ved 2500 o/min ved hjælp af en vortex-mikser. Tilsæt en passende mængde probeblanding, f.eks. 10 µl, i midten af vævssnittet. Anbring straks et 22 mm x 22 mm dækglas over probeblandingen, og lad det sprede sig jævnt under dækglasset. Undgå luftbobler. Hvis der observeres luftbobler, fjernes de ved at slå forsigtigt på dækglasset med en pincet. Forsegl dækglasset med Coverslip Sealant ved at presse dette ud i en fuge langs kanten af dækglasset. Lad Coverslip Sealant overlappe dækglasset og objektglasset, så der dannes en forsegling rundt om dækglasset. Sørg for, at Coverslip Sealant dækker hele dækglassets kant. Klargør Dako Hybridizer* (kode S2450 eller S2451) til en hybridiseringskørsel. Sørg for, at Humidity Control Strips (kode S2452) er mættede og optimale for brug. Start Hybridizer'en, og vælg et program, som vil: Denaturere ved 66 C i 10 minutter efterfulgt af hybridisering ved 45 C i minutter. Placer objektglassene i Hybridizer en, sørg for, at låget er korrekt lukket, og start programmet. Se instruktionsbogen til Dako Hybridizer for at få detaljerede oplysninger. * Instrumentering, der giver mulighed for betingelser, der svarer præcis til de ovenfor beskrevne, kan anvendes til denaturering og hybridisering: Anbring objektglasset på en flad metal- eller stenoverflade (varmeblok eller en blok i en hybridiseringsovn), der er forvarmet til 66 (±1) C. Denaturer i præcis 10 minutter. Anbring objektglassene i et forvarmet hybridiseringsfugtkammer. Tildæk kammeret med et låg, og inkuber ved 45 (±2) C i minutter. ( ) P04094DK_02_K / s. 13/27

14 Trin 4: Stringensvask Fyld to farvningsskåle (f.eks. Coplin-skåle) med den fortyndede Stringent Wash Buffer (se BRUGSANVISNING, afsnit A.2). Det anbefales at bruge mindst 100 ml eller 15 ml pr. objektglas i hver skål. Anbring den ene af farvningsskålene med fortyndet Stringent Wash Buffer ved stuetemperatur i et stinkskab og det andet i et vandbad. Opvarm vandbadet og den fortyndede Stringent Wash Buffer til 63 (±2) C. Sørg for, at temperaturen har stabiliseret sig. Sæt låg på skålen for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Mål temperaturen inde i skålen i vandbadet med et kalibreret termometer for at sikre den korrekte temperatur. Stringent Wash Buffer indeholder detergent og kan blive turbid ved 63 C. Dette vil ikke påvirke resultatet. Tag objektglassene ud af hybridiseringskammeret ved hjælp af en pincet eller handsker, fjern forsigtigt Coverslip Sealant og dækglassene, og placer objektglassene i forvaskeskålen, der har stuetemperatur, et ad gangen. Så snart dækglassene er fjernet, skal objektglassene overføres fra for-vaskeskålen med stuetemperatur til den 63 (±2) C grader varme skål i vandbadet. Umiddelbart efter at objektglassene er overført til den 63 (±2) C varme fortyndede Stringent Wash Buffer i vandbadet skal timeren startes. Udfør en stringensvask i præcis 10 minutter. Fjern objektglassene fra den fortyndede Stringent Wash Buffer, og læg vævssnittene i blød i fortyndet Wash Buffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20-25 C). Udskift den fortyndede Wash Buffer og lad snittene ligge i bufferen i endnu 3 minutter. Dehydrer vævssnittene gradvist med alkohol: 2 minutter i 70% alkohol, 2 minutter i 85% alkohol, og 2 minutter i 96% alkohol. Lad vævssnittene tørre fuldstændigt. Trin 5: Montering Tilsæt 15 µl Fluorescence Mounting Medium indeholdende DAPI (Flaske 5) til målområdet på objektglassene og læg et dækglas over. BEMÆRK: Objektglassene kan aflæses efter 15 minutter eller inden for 7 dage efter monteringen. Imidlertid kan der forekomme falmning, hvis objektglassene udsættes for lys eller høje temperaturer. For at minimere falmning skal objektglassene opbevares mørkt ved C. B.3.b. Farvningsprotokol for FISH-prober, der er fortyndet i formamidbaseret hybridiseringsbuffer DAG 1 Trin 1: Forbehandling (mikrobølgeovn, vandbad, Pascal) Forbehandlingen kan enten udføres ved hjælp af et vandbad som beskrevet under metode A), ved hjælp af en mikrobølgeovn med mulighed for registrering, som beskrevet under metode B) eller ved hjælp af et Pascal-trykkammer som beskrevet under metode C). Metode A: Forbehandling med vandbad Fyld farvningsskålene med fortyndet Pre-Treatment Solution (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.1). Anbring farvningsskålene med den fortyndede Pre-Treatment Solution i et vandbad. Opvarm vandbadet og Pre-Treatment Solution til C. Mål temperaturen i skålen med et kalibreret termometer for at sikre en korrekt temperatur. Sæt låg på skålene (uden huller) for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Nedsænk de afparaffinerede snit i den foropvarmede Pre-Treatment Solution. Kontroller temperaturen igen, luk låget over vandbadet, og inkuber i 10 (±1) minutter ved C. ( ) P04094DK_02_K / s. 14/27

15 Tag hele skålen med objektglassene op af vandbadet. Tag låget af (tag ikke objektglassene op). Lad objektglassene køle af i Pre-Treatment Solution i 15 minutter ved stuetemperatur. Overfør objektglassene til en skål med fortyndet Wash Buffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.2) i 3 minutter ved stuetemperatur. Udskift Wash Buffer, og lad snittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. Fortsæt til trin 2. Metode B: Forbehandling ved hjælp af mikrobølgeovn med mulighed for registrering (anbefales) Fyld en beholder med fortyndet Pre-Treatment Solution ved stuetemperatur (20-25 C). Sænk de afparaffinerede snit ned i opløsningen og luk låget. Låget skal have huller, der gør det muligt for trykket at slippe ud. Placer beholderen med objektglassene i mikrobølgeovnen og varm. Før der varmes, skal det sikres, at ydersiden af beholderen og rummet i mikrobølgeovnen er tør. Inkuber lige under kogepunktet (ikke mindre end 95 C) i 10 minutter. Tag låget af efter inkubation (tag ikke objektglassene op). Lad objektglassene køle af i Pre-Treatment Solution i 15 minutter ved stuetemperatur (20-25 C). Objektglassene skal være dækket med buffer under hele forbehandlingsproceduren. Overfør objektglassene til en skål med fortyndet Wash Buffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.2) i 3 minutter ved stuetemperatur. Udskift Wash Buffer, og lad snittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. Fortsæt til trin 2. Metode C: Forbehandling ved hjælp af Pascal-trykkammer Anbring 500 ml deioniseret vand i Pascal-karret. Fyld en plastikskål med 250 ml Pre-Treatment Solution. Nedsæk de afparrafinerede snit i Pre-Treatment Solution, og anbring skålen i Pascalkarret. Inkuber ved 121 C i 1 minut. Udløs trykket efter nedkøling til 90 C. Læs brugervejledningen til Pascal omhyggeligt for at få oplysninger om korrekt håndtering af Pascaltrykkammeret. Fjern beholderen, når trykket er udløst. Tag lågene af, og lad objektglassene køle af i Pre-Treatment Solution i 15 minutter ved stuetemperatur. Overfør objektglassene til en skål med fortyndet Wash Buffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.2). Lad snittene ligge i blød i 3 minutter ved stuetemperatur. Udskift Wash Buffer, og lad snittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. Fortsæt til trin 2. BEMÆRK: Pre-Treatment Solution er kun beregnet til én anvendelse. Må ikke genbruges. Anvend ikke en lukket, lufttæt beholder ved forbehandling i en mikrobølgeovn, da trykket i beholderen stiger og kan medføre, at beholderen eksploderer eller er årsag til personskade ved åbning. Der må anvendes en metalholder til objektglas i mikroovnen, hvis metalholderen er helt dækket af forbehandlingsopløsning under hele behandlingen i mikrobølgeovnen. Anvend ikke metal i en mikrobølgeovn på nogen anden måde. Følg instruktionerne fra producenten af mikrobølgeovnen. Undgå, at Pre-Treatment Solution koger vedvarende i de 10 minutters inkubationstid. Kontroller temperaturen hyppigt med et kalibreret termometer for at verificere temperaturforholdene. Trin 2: Pepsin, brugsklar (RTU) eller pepsinopløsning Pepsininkubation kan udføres ved direkte anvendelse af RTU-pepsindråber på objektglassene enten ved stuetemperatur (20-25 C) (metode A) eller ved 37 C (metode B). Alternativt kan objektglassene nedsænkes i en pepsinopløsning og inkuberes ved 37 (±2) C (metode C) Metode A og metode B: Bank overskydende buffer af. Brug en fnugfri klud (f.eks. en absorberende serviet eller gaze), og tør forsigtigt rundt om prøven for at fjerne eventuel overskydende væske og holde reagenset inden for det foreskrevne område. Tilsæt 5 8 dråber (250 µl) kold (2 8 C) Pepsin (flaske 2A), idet det sikres, at præparatet dækkes. Opbevar altid Pepsin ved 2-8 C. ( ) P04094DK_02_K / s. 15/27

16 Metode A: Pepsin, RTU Inkubation ved C Inkuber i 5-50 minutter ved stuetemperatur (20-25 C). En inkubationstid på minutter ved stuetemperatur vil være passende for de fleste præparater, men brugeren skal fastlægge den optimale inkubationstid. Bank overskydende Pepsin af, og læg snittene i blød i fortyndet Wash Buffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.3) i 3 minutter ved stuetemperatur (20-25 C). Udskift den fortyndede Wash Buffer og lad snittene ligge i bufferen i endnu 3 minutter. Fortsæt til trin 3, FISH-probe, eller se appendiks 2 vedrørende optimering af fordøjelsestid (valgfri). Metode B: Pepsin, RTU Inkubation ved 37 C Placer præparaterne med pepsin ved 37 C på Dako Hybridizer eller på en forvarmet varmeblok. Inkuber i 2 6 minutter ved 37 C. Dette vil være passende for de fleste præparater, som er klargjort som beskrevet i afsnittet Klargøring af præparater. Den optimale inkubationstid afhænger af vævstype, vævsfiksering samt præparatets tykkelse og modning og skal fastslås af brugeren. Disse faktorer kan forlænge den krævede fordøjelsestid til 7 15 minutter eller længere. Førstegangsbrugere skal identificere den optimale fordøjelsestid ved at teste et repræsentativt væv i 1, 3, 6, 12 og 18 minutter. Bank Pepsin af, og læg snittene i blød i fortyndet Wash Buffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.3) i 3 minutter ved stuetemperatur (20-25 C). Udskift den fortyndede Wash Buffer og lad snittene ligge i bufferen i endnu 3 minutter. Fortsæt til trin 3, FISH probe, eller se appendiks 2 vedrørende optimering af fordøjelsestid (valgfri). Metode C: Pepsin-opløsning - Nedsænkning af objektglas i 37 C varm pepsinopløsning Sættet indeholder reagenser til fire separate kørsler (60 ml pepsinopløsning, lille beholder til seks objektglas) eller en enkelt kørsel (240 ml pepsinopløsning, stor beholder til 24 objektglas). Klargør pepsinopløsningen som beskrevet i afsnit A.5. Sæt låg på beholderen og lad pepsinopløsningen få en temperatur på 37 (±2) C i et vandbad. Sørg for, at temperaturen har stabiliseret sig. Mål temperaturen i beholderen med et kalibreret termometer for at sikre en korrekt temperatur. Bank overskydende Wash Buffer af. Nedsænk objektglassene i den 37 (±2) C grader varme pepsinopløsning, og inkuber i minutter. En inkubationstid på minutter vil være passende for de fleste prøver, men den optimale inkubationstid kan afhænge af vævsfikseringen og/eller tykkelsen af prøven og skal bestemmes af brugeren. Bank overskydende pepsinopløsning af, og læg vævssnittene i blød i fortyndet Wash Buffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20-25 C). Udskift Wash Buffer, og lad snittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. Fortsæt til trin 3, FISH probe, eller se appendiks 2 vedrørende optimering af fordøjelsestid (valgfri). BEMÆRK: Det anbefales at følge proceduren i afsnittet Klargøring af præparater. Underfordøjede væv kan resultere i manglende eller svage signaler ofte med et højt niveau af grøn cytosolisk baggrund. Trin 3: FISH-probe (leveres af brugeren) BEMÆRK: Hvis reagenserne fra Dako Histology FISH Accessory Kit, kode K5799 bruges sammen med reagenser fra kode K5731, skal den procedure, der er beskrevet i indlægssedlen til kode K5731, følges. Følgende trin skal udføres i stinkskab. Fluorokrom-mærkede prober kan blive påvirket negativt, hvis de udsættes for stærke lyskilder. Resten af denne procedure må ikke udføres i stærkt lys, som f.eks. direkte sollys. Dehydrer vævssnittene gradvist med alkohol: 2 minutter i 70% alkohol, 2 minutter i 85% alkohol og 2 minutter i 96% alkohol (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.4). Lad vævssnittene lufttørre helt. ( ) P04094DK_02_K / s. 16/27

17 Påfør en passende mængde fluorokrom-mærket probe, f.eks. 10 µl af en Dako FISH-probe, på midten af vævssnittet. Anbring straks et 18 mm x 18 mm (eller 22 mm x 22 mm) dækglas over proben og lad den sprede sig jævnt ud under dækglasset. Undgå luftbobler. Hvis der observeres luftbobler, bankes disse forsigtigt væk med en pincet. Forsegl dækglasset ved at påføre Coverslip Sealant rundt om dækglassets periferi. Lad Coverslip Sealant overlappe dækglasset og objektglasset, så der dannes en forsegling rundt om dækglasset. Sørg for, at Coverslip Sealant forsegler dækglassets kant hele vejen rundt. Placer objektglassene i Dako Hybridizer (kode S2450/S2451) og indstil denatureringen til 82 C i 5 min. og hybridiseringen til 45 C natten over (14-20 t), når der anvendes Dako FISH-prober. Fortsæt til dag 2, trin 4, stringent vask. Se brugervejledningen til Hybridizer for at få yderligere anvisninger. BEMÆRK: Alternativt kan der anvendes en varmeblok, en hybridiseringsovn og et hybridiseringskammer, se nedenfor. Anbring objektglasset på en flad metal- eller stenoverflade (en varmeblok eller en blok i en hybridiseringsovn), der er forvarmet til 82 (±2) C. Denaturer i 5 minutter, mens det sikres, at temperaturen ikke falder under 80 C. Anbring objektglassene i et forvarmet hybridiseringsfugtkammer. Dæk kammeret med et låg, og inkuber natten over (14 20 timer) ved 45 (±2) C, når der anvendes Dako FISH-prober. DAG 2 Trin 4: Stringensvask Fyld to farvningsskåle med fortyndet Stringent Wash Buffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.2). Der kræves en mængde på mindst 100 ml fortyndet Stringent Wash Buffer til 1-6 objektglas i en skål. Hvis der er mere end 6 objektglas, skal der anvendes mindst 15 ml buffer pr. objektglas. Anbring den ene af farvningsskålene med fortyndet Stringent Wash Buffer ved stuetemperatur i et stinkskab og det andet i et vandbad. Opvarm vandbadet og den fortyndede Stringent Wash Buffer til 65 (±2) C. Sørg for, at temperaturen har stabiliseret sig. Sæt låg på skålen for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Mål temperaturen i skålen med et kalibreret termometer for at sikre en korrekt temperatur. Tag objektglassene ud af hybridiseringskammeret. Brug en pincet til forsigtigt at fjerne Coverslip Sealant og dækglasset, og overfør objektglasset til forvaskeskålen med stuetemperatur. Så snart alle dækglas er fjernet, overføres objektglassene fra forvaskeskålen, der har stuetemperatur, til skålen i vandbadet med 65 (±2) C. Luk låget på skålen og derefter låget på vandbadet. Udfør stringent vask i nøjagtig 10 minutter ved 65 (±2) C. Fjern objektglassene fra den fortyndede Stringent Wash Buffer, og læg snittene i blød i fortyndet Wash Buffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift den fortyndede Wash Buffer og lad snittene ligge i bufferen i endnu 3 minutter. Dehydrer vævssnittene gradvist med alkohol: 2 minutter i 70% alkohol, 2 minutter i 85% alkohol og 2 minutter i 96% alkohol (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.4). Lad objektglassene lufttørre helt. Trin 5: Montering Påfør 15 µl Fluorescense Mounting Medium (flaske 5), der indeholder blå fluorescerende kontrastfarve, på objektglassets målområde og sæt et dækglas på (f.eks. 24 mm x 50 mm eller 24 mm x 60 mm). Lad mediet sprede sig jævnt over prøven. BEMÆRK: Objektglassene kan aflæses efter 15 minutter eller inden for 7 dage efter monteringen. Farven kan falme, hvis objektglassene udsættes for lys eller høje temperaturer. Derfor skal objektglassene opbevares mørkt ved C. ( ) P04094DK_02_K / s. 17/27

18 Kvalitetskontrol 1. Signalerne skal være klare, tydelige og nemme at evaluere. 2. Normalt væv, der tidligere har udvist god FISH, skal anvendes som kontrol af analysekørslen. 3. Normale vævsceller skal udvise tydelige fluorescenssignaler, hvilket indikerer, at FISHproberne er hybridiseret til målregionerne. 4. Hvis der ikke kan påvises signaler i normale vævsceller, indikerer dette en fejlagtig analyse, og resultaterne skal betragtes som ugyldige. 5. Nogle normale celler vil have mindre end det forventede antal signaler på grund af vævsudskæringen. 6. Den nukleære morfologi skal være intakt og homogent farvet under evaluering med et DAPIfilter. Talrige spøgelsesagtige celler, donut-celler og en generelt dårlig nukleær morfologi indikerer overfordøjelse eller overdenaturering af prøven, hvilket kan medføre tab eller fragmentering af signaler. Perifer farvning, huller i celler (DAPI-filter) og/eller kraftig grøn cytosolisk baggrundsfarvning ved observation med et Texas Red/FITC dobbeltfilter kan være tegn på underfordøjelse, hvilket kan resultere i tab af signal. Sådanne prøver skal betragtes som ugyldige. 7. Forskelle i vævsfiksering, -behandling og -indstøbning på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt, hvilket gør det nødvendigt at gennemføre regelmæssige kontroller på laboratoriet. Fortolkning af resultater Scan flere områder af celler for at tage højde for eventuel heterogenitet. Vælg et område, der har en god kernefordeling. Begynd analysen i øverste venstre kvadrant af det valgte område, idet der scannes fra venstre mod højre. Tæl antallet af signaler inden for kerneafgrænsningen af hver af de evaluerede kerner i henhold til retningslinjerne nedenfor. Fokuser op og ned for at finde alle signalerne i de individuelle kerner. Tæl ikke kerner uden signaler. Medtag ikke kerner, der kræver en subjektiv vurdering. Spring kerner med svag signalintensitet og uspecifik eller høj baggrund over. Brugeren skal fastslå antallet af kerner, som kan tælles for hver probe. Undgå områder, hvor de nukleære grænser er tvetydige. Begrænsninger 1. Den optimale inkubationstid for pepsinfordøjelse kan afhænge af vævsfikseringen og/eller tykkelsen af prøven og skal bestemmes og verificeres af brugeren. 2. For den tilsigtede anvendelse af FISH-proben henvises til indlægssedlen for den enkelte FISH-probe og dennes tilhørende produktinformation. 3. FISH er en diagnostisk proces omfattende mange trin, der kræver specialiseret uddannelse vedrørende valg af passende reagenser såvel som vævsselektion, -fiksering, -behandling og fremstilling af FISH-objektglas og fortolkning af farvningsresultaterne. 4. Resultater af FISH er afhængige af håndteringen og behandlingen af vævet inden farvning. Forkert fiksering, vask, tørring, opvarmning, sektionering eller kontaminering med andre væv eller væsker kan påvirke probehybridisering. Uoverensstemmende resultater kan skyldes forskelle i fikserings- og indstøbningsmetoder eller uregelmæssigheder i selve vævet. 5. For optimale og reproducerbare resultater skal objektglassene med vævsprøverne afparaffineres fuldstændigt. Fjernelsen af paraffin skal være fuldført ved begyndelsen af farvningsprocessen. (Se BRUGSANVISNING, afsnit B.2). ( ) P04094DK_02_K / s. 18/27

19 6. Der bør kun benyttes temperaturkalibreret vandbad, varmeblok og hybridiseringsovn. Anvendelse af andre typer udstyr kan resultere i fordampning af Probe Mix under hybridisering og skal valideres af brugeren. ( ) P04094DK_02_K / s. 19/27

20 Fejlfinding Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 1. Ingen signaler eller svage signaler 1a. Ukorrekt fordøjelsestid. 1a. Sørg for, at der anvendes formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. En længere fordøjelsestid på f.eks minutter eller endnu længere ved 37 C kan muligvis hjælpe. Se afsnit B.3.a eller B.3.b, Trin 2, Fejlfinding, punkt 4d, 4e og Appendiks 2. 1b. Sættet har været udsat for høje temperaturer under transport eller opbevaring. 1c. Ukorrekte forbehandlingsbetingelser. 1d. Ukorrekte denatureringsbetingelser. 1e. Ukorrekt hybridiseringstemperatur. 1f. Fordampning af probebuffer under hybridisering. 1b. Kontroller opbevaringsbetingelserne. Kontroller, om der stadig var tøris i pakken ved modtagelsen. Kontroller, at flaske 2A og 5 har været opbevaret ved 2 8 C, og at flaske 5 har været opbevaret mørkt. 1c. Sørg for at anvende den anbefalede forbehandlingstemperatur og -tid. Sørg også for, at fordøjelsesinkubationstiden om nødvendigt er blevet optimeret. Se afsnit B.3.a eller B.3.b, trin 2. Jo tættere forbehandlingstemperaturen er på kogepunktet, desto stærkere er signalerne. Sørg for at håndtere Pepsin ved den korrekte temperatur. Se afsnit B.1. 1d. Sørg for at anvende den anbefalede denatureringstemperatur og -tid. 1e. Hybridiser ved 45 (±2) C, når der anvendes Dako FISH-prober. 1f. Sørg for tilstrækkelig fugtighed i hybridiseringskammeret. Brug Dako Hybridizer (kode S2450/S2451) og Hybridizer Humidity Control Strips (kode S2452). Brug Coverslip Sealant. Se Fejlfinding, punkt 5a og 5b. ( ) P04094DK_02_K / s. 20/27

21 1g. Ukorrekte betingelser for stringent vask. 1h. Mikroskopet virker ikke rigtigt - Ukorrekt filtersæt - Uegnet pære - Kviksølvpæren er for gammel - Udbrændte filtre - Snavsede og/eller revnede kollektorlinser - Uegnet immersionsolie 1g. Sørg for at anvende den anbefalede volumen, temperatur og tid for den stringente vask og at fjerne dækglassene, inden udførelse af den stringente vask. 1h. Kontroller mikroskopet og sørg for, at de anvendte filtre er egnede til brug sammen med fluorokromerne, at de ikke er slidte, og at kviksølvpæren er egnet og ikke har været brugt ud over den forventede levetid (se Appendiks 1). Brug egnet immersionsolie til fluorescens. I tilfælde af tvivl kontaktes leverandøren af mikroskopet. 1i. Falmede signaler. 1i. Undgå langvarig undersøgelse under mikroskopet, og minimer eksponeringen for kraftigt lys. 2. Områder uden signal 2a. Probevolumen er for lille. 2a. Sørg for, at probevolumen er stort nok til at dække området under dækglasset. 2b. Luftbobler er blevet fanget under probetilsætning eller montering. 2b. Undgå luftbobler. Hvis der observeres luftbobler, bankes disse forsigtigt væk med en pincet. 2c. Dårlig afparaffinering. 2c. Sørg for, at paraffinen er fuldstændigt fjernet fra snittene. Se afsnit B Overdreven baggrundsfarvning 3a. Ukorrekt fordøjelsestid. Kraftig, grøn cytosolisk baggrund kan tryde på underfordøjelse. 3a. Sørg for, at der anvendes formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. En længere digestionstid på f.eks minutter ved 37 C kan muligivs hjælpe. Se afsnit B.3.a eller B.3.b. Trin 2, Fejlfinding, punkt 4e og Appendiks 2. 3b. Snittene er tørret i B.3. 3b. Følg anvisningerne og undgå, at objektglassene tørrer ud, medmindre det angives. ( ) P04094DK_02_K / s. 21/27

22 4. Dårlig nukleær morfologi eller svag kernefarvning 3c. Paraffinen er ikke helt fjernet. 3c. Følg proceduren for afparaffinering og rehydrering beskrevet i afsnit B.2 3d. Temperaturen på den stringente vask er for lav. 3e. Langvarig eksponering af det hybridiserede snit for kraftigt lys. 3f. Udløbne eller uegnede objektglas kan forårsage en overdreven rød farvning som en stjernehimmel. 3g. Ikke-fluorescerende immersionsolie blandet med fluorescerende monteringsmedium. 4a. Ukorrekte forbehandlingsbetingelser kan medføre et uklart eller tåget udseende. 4b. Kogning under forbehandling kan resultere i morfologisk skade og manglende signaler. 3d. Kontroller, at den anbefalede temperatur for den stringente vask anvendes. 3e. Undgå langvarig undersøgelse under mikroskopet og minimer udsættelsen for stærkt lys. 3f. Anvend de anbefalede objektglastyper og sørg for, at de ikke er for gamle. Se afsnittet "Paraffinindstøbte snit". 3g. Brug store dækglas ved montering, som anbefalet. Se afsnit B.3.a eller B.3.b., trin 5. Dette forhindrer, at immersionsolien blander sig med monteringsmediet, hvilket forhindrer autofluorescens og utilsigtet fjernelse af dækglas med mikroskopobjektivet. 4a. Sørg for at anvende den anbefalede forbehandlingstemperatur og -tid. Se også Fejlfinding, punkt 4b-e. 4b. Undgå kogning. Se afsnit B.3, trin 1. Se også Fejlfinding, punkt 4d. 4c. Ukorrekt Pepsin-behandling. 4c. Overhold de anbefalede pepsininkubationstider. Se afsnit B.3, Trin 2 og Appendiks 2. Se også Fejlfinding, punkt 1a, 1c, 3a, 4d og 4e. 4d. Pepsin-behandling i for lang tid vil opløse vævet og medføre manglende signaler. Overfordøjelse kan medføre, at der forekommer spøgelsesceller eller donutkerner med en generelt dårlig morfologi. 4d. Forkort Pepsininkubationstiden. Se afsnit B.3.a eller B.3.b, trin 2 og Appendiks 2. Sørg for, at snittykkelsen er 2 6 µm. Se også Fejlfinding, punkt 1a, 1c, 4b og 4e. ( ) P04094DK_02_K / s. 22/27

23 5. Dækglasset klæber kraftigt til objektglasset efter hybridisering og er derfor vanskeligt at fjerne. 6. Kraftig grøn autofluorescens på objektglasset herunder i områder uden FFPE-væv 4e. Pepsin-behandling i for kort tid kan resultere i manglende signaler. Underfordøjet væv kan forårsage perifer kernefarvning og huller i kernerne (DAPI-filter); kraftig grøn baggrund i cytosolen (Texas Red/FITC dobbeltfilter). Bemærk, at kernerne i underfordøjet væv har god morfologi i modsætning til overfordøjet væv. 4f. Denatureringstemperaturen er for høj. 4g. Ukorrekte hybridiseringsbetingelser. 5a. Dækglasset er ukorrekt forseglet til objektglasset. 5b. Ukorrekte hybridiseringsbetingelser. Kan forårsage reducerede eller manglende signaler, vævsskade og baggrundsfarvning. 6. Brug af udløbne eller ikkeanbefalede glasobjektglas 4e. Forlæng pepsininkubationstiden til f.eks. 2-3 gange den anvendte fordøjelsestid. Se også Fejlfinding, punkt 1a, 1c, 3a, 4a og 4d. 4f. Kontroller, at den anbefalede temperatur for denaturering anvendes. 4g. Se Fejlfinding, punkt 1f og 5b. 5a. Tving ikke dækglasset af, hvis det klæber kraftigt til objektglas. Dyp objektglasset i skålen med fortyndet Stringent Wash Buffer ved stuetemperatur i fem minutter og tag så dækglasset af. Følg anbefalingerne for forsegling med dækglas i afsnit B.3.a eller B.3.b, trin 3. Se også Fejlfinding, punkt 1f og 5b. 5b. Sørg for tilstrækkelig fugtighed i hybridiseringskammeret. Brug Dako Hybridizer (kode S2450/S2451) og Hybridizer Humidity Control Strips (kode S2452). Følg anvisningerne på indlægssedlen til Hybridizer Humidity Control Strips. Se de anbefalede hybridiseringsbetingelser i afsnit B.3.a eller B.3.b, trin 3. Se også Fejlfinding, punkt 1f og 5a. 6. Kontroller, at det belagte glasobjektglas (Dako Silanized Slides, kode S3003 eller poly-l-lysinbelagte objektglas) ikke har overskredet udløbsdatoen. BEMÆRK: Hvis problemet ikke kan henføres til en eller flere af ovenstående årsager, eller hvis forslagene til afhjælpning ikke løser problemet, kontaktes Dakos tekniske serviceafdeling for yderligere hjælp. ( ) P04094DK_02_K / s. 23/27

24 Appendiks 1 Histology FISH Accessory Kit, kode K5799 Specifikationer for fluorescensmikroskop Dako anbefaler følgende udstyr til brug sammen med Histology FISH Accessory Kit, når der anvendes Dako FISH-prober: 1. Mikroskoptype Epifluorescensmikroskop. 2. Pære 100 watt kviksølvpære (skal generelt skiftes ud efter 200 timer). 3. Objektiver Til screening af vævene kan der anvendes fluorescens tør 10x eller fluorescens olieimmersion 16x objektiver. Til kraftig forstørrelse og bedømmelse af signaler kan der kun anbefales olieimmersionsfluorescensobjektiver, f.eks. 63x eller 100x. 4. Filtre Filtrene udformes individuelt til specifikke fluorokromer og skal vælges derefter. Dako anbefaler brug af et særligt DAPI-filter kombineret med et Texas Red/FITC dobbelt filter af høj kvalitet, når Dako FISH-prober anvendes. DAPI-filter, f.eks. Omega Optical-filter nr. XF06 eller Chroma-filter nr Texas Red/FITC dobbelt filter, f.eks. Omega optisk filter # XF53 eller Chroma filter # Texas Red og FITC enkeltfiltre kan anvendes til bekræftelse, f.eks. Omega Optical-filter henholdsvis nr. XF102-2 og XF202. Fluorokrom Excitationsbølgelængde Emissionsbølgelængde FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filtre er specifikke for hver mikroskoptype, og anvendelsen af de korrekte filtre er altafgørende for fortolkningen. Der kan fås yderligere oplysninger hos producenten af mikroskopet, den lokale Dakorepræsentant eller på Dakos hjemmeside. 5. Olie Ikke-fluorescerende immersionsolie. Forholdsregler Specifikke fluorokromer kræver forskelligt udstyr. Det frarådes at anvende en 50 watt kviksølvpære til Dako FISH-prober, Rhodaminfiltre kan ikke anvendes, og tredobbelte filtre kan generelt ikke anbefales. Et mikroskop, der ikke er optimeret, kan medføre problemer, når de fluorescerende signaler aflæses. Det er vigtigt, at lyskilden ikke er udløbet, og at den er korrekt rettet ind og fokuseret. Kunderne skal overvåge og følge producentens anbefalinger for kviksølvpæren, og mikroskopet skal vedligeholdes. Du skal bestræbe dig på at udsætte prøven for så lidt af excitationslyset som muligt for at minimere fluorescensens falmen. Vi anbefaler, at du diskuterer opsætningen af dit mikroskop med producenten, inden du påbegynder fluorescens in situ hybridiseringen, eller undersøger den relevante dokumentation. ( ) P04094DK_02_K / s. 24/27

25 Appendiks 2 Valgfrit trin til optimering af pepsinfordøjelsestiden Dette valgfri trin kan anvendes til evaluering af pepsinfordøjelsens effekt og hjælpe med til at optimere den fordøjelsestid, der anvendes i trin 2, Pepsin. For at kontrollere, om den anvendte pepsinfordøjelsestid er tilstrækkelig, farves det vaskede, pepsinfordøjede vævssnit med 10 µl propidium-iodid (400 ng/ml), som brugeren selv leverer. Anbring et 22 mm x 22 mm dækglas over propidium-iodiden og lad det sprede sig under dækglasset. Inkuber i 1 minut. Brug et fluorescensmikroskop med Texas Red/FITC dobbelt filter (se Appendiks 1) til at evaluere den røde kernefarvning med propidium-iodid. For at vævsdigestionen er acceptabel, skal der være røde kerner med godt definerede omkredse. Fjern propidium-iodiden ved at lægge snittene i blød i fortyndet Wash Buffer to gange 3 minutter ved stuetemperatur (20-25 C), og fortsæt til afsnit B3, Farvningsprotokol, trin 3, FISH-probe. Hvis kernerne stadig er grønne af autofluorescens og ikke farvet røde af propidium-iodid, er det nødvendigt at gentage digestionscyklussen: Lad snittene ligge i blød i fortyndet Wash Buffer to gange 3 minutter ved stuetemperatur (20-25 C) for at fjerne propidium-iodid. Tilsæt 5 8 dråber (250 µl) kold (2-8 C) Pepsin (flaske 2), så præparatet er dækket. Opbevar altid flasken med Pepsin ved 2 8 C. Placer objektglassene ved 37 C på en forvarmet varmeblok eller på Dako Hybridizer. Inkuber i 10 minutter i tilfælde af ingen eller kun svag fordøjelse. De 10 minutter er kun vejledende; brugeren skal fastsætte den optimale tid. Læg igen snittene i blød i fortyndet Wash Buffer to gange 3 minutter ved stuetemperatur (20-25 C) for at fjerne Pepsin. Tilsæt igen 10 µl propidium-iodid (400 ng/ml) i 1 minut. Evaluer farvningen, og lad snittene ligge i blød i fortyndet Wash Buffer to gange 3 minutter ved stuetemperatur (20-25 C). Gentag om nødvendigt cyklussen, eller fortsæt til afsnit B.3.a or B.3.b, Farvningsprotokol, Trin 3, FISH-probe. BEMÆRK: Sættet indeholder reagenser til 20 analyser. Anvendelse af Wash Buffer og Pepsin i dette valgfri trin vil reducere det samlede antal analyser, der ellers kan udføres med dette sæt. ( ) P04094DK_02_K / s. 25/27

26 Referencer 1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 CFR 7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company; Brown RSD, Edwards J, Bartlet JW, Jones C, Dogan A. Routine acid decalcification of bone marrow samples can preserve DNA for FISH and CGH studies in metastatic prostate cancer. J Histochem Cytochem : Alers JC, Krijtenberg P-J, Visser KJ, van Dekken H. Effect of bone decalcification procedures on DNA in situ hybridization and comparative genomic hybridization: EDTA is highly preferable to a routinely used acid decalcifier. J Histochem Cytochem : Provan AB, Hodges E, Smith AG, Smith JL. Use of paraffin wax embedded bone marrow trepine biopsy specimens as a source of archival DNA. J Clin Pathol : Sarsfield P, Wickham CL, Joyner MV, Ellard S, Jones DB, Wilkins BS. Formic acid decalcification of bone marrow trephines degrades DNA: alternative use of EDTA allows the amplification and sequencing of relatively long PCR products. Mol Pathol : Reineke T, Jenni B, Abdou MT, Frigerio S, Zubler P, Moch H, Tinguely M. Ultrasonic decalcification offers new perspectives for rapid FISH, DNA, and RT-PCR analysis in bone marrow trephines. Am J Surg Pathol : Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; Symbolforklaring Katalognummer Temperaturbegrænsning Lotnummer Medicinsk produkt til in vitro diagnostik Må ikke udsættes for sollys (se afsnittet om opbevaring) Anvendes senest Se brugsanvisningen Indeholder tilstrækkeligt materiale til <n> tests Producent GHS-farepiktogram (se afsnittet om forholdsregler) GHS-farepiktogram (se afsnittet om forholdsregler) GHS-farepiktogram (se afsnittet om forholdsregler) GHS-farepiktogram (se afsnittet om forholdsregler) GHS-farepiktogram (se afsnittet om forholdsregler) ( ) P04094DK_02_K / s. 26/27