Polyteknisk Midtvejs Projekt Forår 2004 Karakterisering af antagonistiske skimmelsvampe

Transkript

1 1 Indledning Teori Karakterisering af svampe Hæmning og antagonisme Kromatografi TLC Thin Layer Chromatogarphy HPLC High Performance Liquid Chromatography Bioautografi TLC-overlay Omvendt agar Forsøg med membraner Metoder og materialer Isolering, udvælgelse og identifikation Thin Layer Chromatography - Bioautografi High Performance Liquid Chromatography Menbranforsøg Materialer Screening Bioautografi HPLC Membraner Resultater Identifikation TLC og optimering af bioautografi Metabolitsammensætning ved hæmning Membranforsøg Diskussion Identifikation TLC-bioautografi Metabolitsammensætning ved hæmning Fejlkilder Menbranforsøg Fremtidige forsøg Bioautografi Metabolitsammensætning ved hæmning Membranforsøg Konklusion Perspektivering Referenceliste...46 Bilag Bilag BioCentrum-DTU 1

2 1 Indledning Adgang til fødevarer er essentiel i vores dagligdag. Ved nutidens distribuering af fødevarer er lagring en nødvendig del af markedet for fødevarer, da vejen fra producent til forbruger ofte er lang. Det er især ved denne lagring, at fordærvelse af fødevarerne kan finde sted. Da korn og andre landbrugsprodukter fortrinsvis bliver inficeret med skimmelsvamp, synes metoder til forebyggelse heraf vigtig. Mere viden om, hvordan infektioner opstår er nødvendig for forståelsen af deres forekomst. Ved analyser af bestemte fødevarer ses ofte kun vækst af få skimmelsvampe. Det ses, at nogle arter er i stand til at fortrænge andre. Det tænkes at de, ved hjælp af deres metabolisme, er i stand til bekæmpe andre arter. En undersøgelse af mekanismerne bag metabolitternes indvirkning synes derfor vigtig for videre arbejde med bekæmpelse af skimmelsvampe på fødevarer. BioCentrum-DTU 2

3 2 Teori 2.1 Karakterisering af svampe Da svamperiget omfatter et stort antal svampe, er det vigtigt at kunne skelne imellem de forskellige arter og slægter 1. På artsniveau ses der sammenlignelige træk mellem svampene, mens der på slægtsniveau findes mere markante forskelle mellem svampene 2. På baggrund af svampenes celler, der ligesom dyre- og planteceller er eukaryoter, kan der foretages en karakterisering 1. Dette sker både ved makroskopiske og mikroskopiske undersøgelser. Når forskellige svampe undersøges makroskopisk, betragtes typisk koloniers farver og vækst 2,3. Når svampene undersøges mikroskopisk, findes der flere måder at skelne mellem slægter og arter 2. Forskelle i hyfernes forgrening, struktur af mycelium, phialider og sporer gør svampene unikke 1,2,3. Særlig sporerne spiller en vigtig rolle ved identifikationen af svampe. Disse findes i mange forskellige former og størrelser, hvilket der er givet eksempler på i figur 1. Figur 1: Billeder af forskellige sporer. Gengivet efter 3 Desuden ses der ligeledes forskellige formationer af sporer, hvilket er illustreret i figur 2. BioCentrum-DTU 3

4 Figur 2: Billeder af konidiaformation. Gengivet efter 2 Sammen med de førnævnte faktorer er det muligt at inddele svampene i slægter og arter. På denne måde er der fremkommet viden om forskellige svampeslægters arter og udseender 2. Når svampene skal identificeres er det derfor vigtigt, at de vokser på et substrat, hvor deres vækst og sporulering kan genkendes Hæmning og antagonisme Når skimmelsvampe vokser på et givent materiale, findes de i en blanding af bakterier, gær og andre skimmelsvampe. Dog har kun få opnået synlige kolonier, som for eksempel ved vækst på korn 4,5. Grunden til det lille antal sete skimmelsvampe skyldes mikroorganismernes interne konkurrence om plads og substrat 4. De sete svampe er dem, der har de bedste vækstbetingelser i det observerede habitat 1. Faktorer som vandaktivitet, temperatur og luftsammensætning påvirker svampenes vækst, metabolitproduktion og dermed også deres evne til at bekæmpe andre mikroorganismer 4,5,6. Herved forstås, at omgivelserne er afgørende for svampens evne til at konkurrere. Dette giver sig primært til udtryk ved højere spiringshastighed, højere væksthastighed, enzymproduktion og sporulering 5. Sekundært skyldes det svampes interaktion og muligvis antagonisme 5. Begrebet antagonisme beskriver en konkurrerende tilstand mellem to parter 7. Biologisk set ses dette ved to konkurrerende mikroorganismer, hvor der på grund af dannelse af specifikke metabolitter ses hæmning af den ene organisme 8. BioCentrum-DTU 4

5 Blandt andet danner svampen Penicillium griseofulvum metabolitten griseofulvin, der er kendt som værende antifungalt. Stoffet anvendes som medikament mod hudinfektioner 1,9. Udover griseofulvin er stoffet compactin, der dannes af P. brevicompactum, ligeledes set have en antifungal effekt 10. I landbruget gøres der også brug af antifungale stoffer. Stofferne er dog ikke altid udvundet fra svampe. For eksempel anvendes stoffet iprodion mod svampesygdomme i forskellige afgrøder 11. Hvordan svampene interagerer med hinanden er dog forskelligt. Interaktioner kan forekomme som værende negative eller positive for de konkurrerende mikroorganismer. I andre situationer ses interaktionen som værende neutral 6,12. Interaktioner mellem svampe kan også påvirke mykotoksinproduktionen 6,12. Grundet de forskellige svampes produktion af metabolitter, der kan påvirke andre svampe både positivt og negativt, ses der forskellige typer af interaktioner 13. Blandt andet ses der eksempler på svampe, der vokser over en anden og nogle der vokser omkring en anden. Se figur 3a og 3b 13. Desuden kan der forekomme gensidig hæmning, hvor begge svampe blot vokser tæt op ad hinanden. Se figur 3c 13. Til sidst kan nævnes interaktionstypen, hvor svampe, på grund af dannelse af metabolitter, hæmmes ved afstand. Herved opnås et mellemrum mellem svampekolonierne på substratet. Se figur 3d 13. Kombination af forskellige interaktioner kan også forekomme 13. Figur 3: a) Vækst over koloni b) Hæmning ved vækst omkring koloni c) Gensidig hæmning d) Hæmning på afstand Som eksempler på forskellige interaktioner mellem skimmelsvampe kan nævnes, at Aspergillus candidus nedsætter vækst og produktion af ochratoksin hos A. ochraceus. Altså en negativ interaktion, der medfører, at A. ochraceus ikke er dominant i nogle tempererede egne med majsproduktion 6. Ud over A. ochraceus, bliver A. flavus og A. niger hæmmet ved tilstedeværelsen af Fusarium moniliforme og F. proliferatum på majskorn under visse vækstbetingelser 14. Under andre er det Fusarium spp., der hæmmes af Aspergillus spp. 14. Der ses også eksempler, hvor F. culmorum påvirkes af en positiv interaktion med Penicillium verrucosum, der medfører, at F. culmorum vokser hurtigere, end hvis den var alene 5. BioCentrum-DTU 5

6 En faktor, der også påvirker interaktioner mellem mikroorganismer, er flygtige stoffer, også kaldet Volatile Organic Compound (VOC) 12. Disse forbindelser er en del af svampenes metabolitter, der er effektive til at påvirke andre mikroorganismer, idet de spredes over større afstande via diffusion i atmosfæren 12. Ligesom med andre metabolitter, påvirkes produktionen af VOC er ved variation i vækstbetingelser 12. Kommunikationen via VOC er kan både være til fordel for begge parter, eller til gene for den ene 12. Fire VOC er, der dannes af Trichoderma spp., er blevet undersøgt med hensyn til påvirkning af andre svampe 12. Det blev fundet, at stofferne var mulige aktive interaktionsstoffer, idet væksten af alle svampene blev påvirket enten positivt eller negativt ved tilstedeværelsen af en eller flere af de testede VOC er 12. Ud over dannelse af VOC er, ses der ligeledes produktion af VOC er fra bakterier 12. Disse VOC er kan have en effekt på både svampes vækst og enzymaktivitet Kromatografi TLC Thin Layer Chromatogarphy At kunne separere komponenter fra hinanden er vigtigt ved videre undersøgelser af stoffers egenskaber. Separation af komponenter fra væsker indeholdende en blanding af solventer og urenheder, har derfor længe været et problem 15. Fra det 19. århundrede blev analyser af renhed udført på stof og papir. Udviklingen af separationsmetoder førte til anvendelsen af filterpapir 16. I 1950 erne blev silicapartikler introduceret. Silicapartiklerne blev limet fast til en glasplade ved hjælp af uorganiske bindingsmidler. Metoden kaldtes Thin Layer Chromatography (TLC), hvilket på dansk kaldes tyndtlagskromatografi 17,18. TLC blev brugt til at separere blandinger af antibiotiske stoffer og klassificere og identificere nye 19. TLC fungerer på grund af kapillærkræfter, der får solventen til at stige op gennem laget, hvorpå prøven er påført. Prøven opløses i solventen, og komponenterne i prøven adskilles på grund af forskel i binding til den mobile fase og den stationære fase 17,20. Den stationære fase kan bestå af forskellige kornstørrelser og materialer som silicagel og cellulosepulver 20,21. De adskilte komponenter i prøven kan visualiseres ved at betragte pladen i UV-lys. Det foregår ved at benytte plader med tilført fluorescensmateriale eller sprøjte pladen efterfølgende med fluorescensmateriale. Herved kan komponenter, der for eksempel indeholder aromatiske eller heterocykliske forbindelser, ses som fluorescerende regioner på pladen 18. TLC er en foretrukken teknik, når en prøve indeholder en stor mængde komponenter, der er lette at adskille, idet metoden er hurtig og let anvendelig 20. Dog kan metoden ikke automatiseres 18. BioCentrum-DTU 6

7 2.2.2 HPLC High Performance Liquid Chromatography Videnskab og teknologi i 1950 erne førte til udvikling af den analytiske kemi. Produktion og kontrol med industrielt fremstillede varer indenfor medicin og biologi krævede bedre muligheder for separationsmetoder og analyse 22. Udviklingen indenfor gaskromatografi førte til en omvæltning indenfor analytisk kemi, idet det blev muligt at udføre separation af komponenter hurtigt og effektivt 22. Udviklingen af kolonner ledte til separation ved højt tryk og muliggjorde hurtig separation, hvilket blev kaldt High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 22. Ved HPLC gøres der brug af en stationær og en mobil fase. Materialet af den stationære fase i kolonnen kan bestå af forskellige materialer, blandt andet silica, aminer eller nitril 20. Separationen foregår ved, at prøveopløsningen placeres for enden af kolonnen, hvorefter solventet trækker prøvens komponenter gennem kolonnen 23. Se figur 4. Figur 4: Skitse over HPLC. Gengivet efter 20 Prøven kan passere kolonnen ved normal og omvendt faseseparation 20. Ved normal faseseparation er kolonnen mere polær end solventet, mens kolonnen er mindre polær end solventet ved omvendt faseseperation. Solventet består af en gradient af stoffer med forskellig polaritet 20. Gradienten ændres fra upolær til polær ved normal faseseparation, mens der ved omvendt faseseparation ændres fra polær til upolær. Forskellen i polaritetsgradienten ved de to faseseparationer er skitseret i figur 5. Ved ændring af polariteten i solventet separeres de forskellige komponenter 15. Figur 5: Polaritetsgradient ved normal og omvendt faseseparation Til identifikation af komponenterne kan flere detektorer benyttes 20. Ved analyse af prøverne ved HPLC blev der i dette projekt anvendt en diodearraydetektor. Komponenterne, der forlader kolonnen, belyses med UV-lys indenfor området nm 23. Ved belysning med UV-lys springer elektroner fra én orbital til en anden, og molekylet opnår en eksciteret tilstand. Når den absorberede energi afgives, udløses lys, der måles af diodearray-detektoren. Herved fremkommer kromoforer og komponenterne kan identificeres 23. Ved analyse af skimmelsvampe kan metabolitter genkendes udfra deres kromofor og retentionsindeks 23. BioCentrum-DTU 7

8 De metabolitter, der kommer fra samme syntesevej i svampens stofskifte, har ofte sammenlignelige kromoforer og kan derfor inddeles i familier for at lette identifikationen 23. Kromoforer kan derfor benyttes til identifikation af svampe på baggrund af deres specifikke metabolitter Bioautografi TLC-overlay Et antibiotikum er en kemisk forbindelse, der kan produceres af levende organismer, og besidder egenskaber til at nedkæmpe sygdomsfremkaldende mikroorganismer 16. Derfor er der stor interesse i at finde nye antifungale stoffer, blandt andet til behandling af følgesygdomme som svampeinfektioner i forbindelse med AIDS 24. I tilknytning til bestemmelse af antifungale og antivirale stoffer, og synlighed heraf, blev en ny metode udviklet, kaldet bioautografi 16,19,24,25,26,27,28,29,30. Omkring 1966 blev denne metode udviklet til bestemmelse af det antibakterielle stof monensin 25. Metoden kan anvendes efter separering af biologisk aktive stoffer på TLC-plader, hvor flydende agar med inokuleret mikroorganismer hældes på pladen i et tyndt lag 24,25,29. Koncentrationen af mikroorganismerne ses optimal ved cirka 10 5 til 10 6 celler pr. ml 24,29. Efter tilsætningen af agaren med mikroorganismerne opbevares pladerne i sterile bokse i varmeskab 24,29. Alt efter testorganismernes væksthastighed kan hæmningszoner ses efter mindre end én uges inkubering 29. Metoden bygger herved på den biologiske effekt af det aktive stof 19. Fordelene ved brugen af bioautografi er sensitiviteten overfor koncentrationen af det aktive stof, og at prisen for en sådan test er lav 25,27,31. Desuden er metoden anvendelig til screening for tilstedeværelsen af aktive stoffer 25. Det ses dog som en ulempe, at metoden ikke kan automatiseres. Desuden er udførelsen og sensitiviteten påvirkelig af inkubationstemperatur, ph, substratsammensætning og koncentration af mikroorganismer 25. Inkubationstemperaturen og ph påvirker diffusionen af stofferne og sensitiviteten af mikroorganismerne 25. Substratets sammensætning kan ligeledes påvirke testen, idet mikroorganismer reagerer forskelligt på forskellige substrater 25. Desuden har tykkelsen af agarlaget også en betydning, da tykkelsen medfører ændret diffusionsafstand 25. Ved at varme pladerne op inden påhældning af agar kan der opnås et tyndt lag størknet agar på under 1 mm 24. Urenheder påvirker også resultatet. Dette sker ved, at urenheder kan påvirke diffusionen af antibiotikummet, samt forstyrre væksten af mikroorganismen og dermed forstyrre hæmningszonen 25. For at gøre testen lettere, anbefales det at anvende TLC-plader med glasryg. Disse plader medfører bedre spredning af substrat, samt bedre temperaturkontrol 24,25. Hvis TLC-plader med aluminiumryg anvendes kan der opstå problemer med bobler i gelen og udflydende silica-gel 25. BioCentrum-DTU 8

9 Eksempelvis er TLC-bioautografi anvendt til at finde antifungale stoffer fra afgrøder og blade mod Cladosporium spaerospermum og C. cladosporiides 32. Under tidligere forsøg på instituttet er der desuden set hæmningszone på bioautografi med Rhizopus spp Omvendt agar Mikroorganismer kan kun overleve i et vist temperaturinterval. Hvis mikroorganismer anvendes uden for dette temperaturinterval kan organismerne efter kortere eller længere tid dø 1. For eksempel ses problemer, hvis organismerne blandes med varm, flydende agar 33. For at løse problemet kan en copolymer bestående af polypropylenoxid og ethtylenoxid anvendes. Copolymeren betegnes LTLpolyol (low temperature liquefying) 33 her kaldt omvendt agar. Dette stof kan anvendes til varmesensitive mikroorganismer, hvor der ønskes isolering og vækst 33. Geleringstemperaturen kan justeres ved ændring af den tilsatte mængde polyol, hvor der ved 18 w:v geleres ved ca. 32 C, 30 w:v ved ca. 18 C og 50 w:v gelerer agaren ved ca. 10 C 33. Se figur 6 for skitse over geleringstemperatur. Figur 6: Graf over geleringstemperaturen 2.4 Forsøg med membraner Optagelsen af glukose og fosfor gennem en cellofanmembran er undersøgt med Fusarium oxysporum 34. Gennem cellofanen kunne svampen optage næring uden at vokse på selve substratet. Porestørrelsen i cellofanen medførte, at svampens sporer og mycelium ikke kunne passere gennem membranen 34, mens metabolitter tænkes afgivet til substratet. Samtidig er der på instituttet udført ikke-publicerede forsøg med celluloseacetat-filtre med en porestørrelse på 0,2 pm. Ved brug af disse filtre er det ligesom ved brug af cellofan fundet, at svampen ikke er i stand til at vokse gennem membranen. BioCentrum-DTU 9

10 3 Metoder og materialer I de følgende underafsnit anskueliggøres udførelsen af forsøgene. Grundet den begrænsede tid blev flere forsøg udført på samme tid. Forløbet af processen er skitseret herunder på figur 7. Figur 7: Tidslinie for arbejdsprocessen 3.1 Isolering, udvælgelse og identifikation De anvendte svampe i projektet blev fundet ved screening udfra forskellige levnedsmidler og naturprodukter, såsom jord og bark. Samtlige prøver er nævnt i afsnit 3.5. Screening blev foretaget på DRYES-substrat. Desuden blev der modtaget enkelte luftprøver på V8. Ved tegn på interaktion blev svampe herfra isoleret på V8. Undervejs i forløbet blev enkelte svampe podet på PDA for at fremme deres sporulering. Ved et tilfælde resulterede det i et sæt, hvor der fremkom en interaktion mellem en renpodning og en kontaminering. Ved tidligere arbejde på instituttet med skimmelsvampe er der set interaktion mellem F. avenaceum og Alternaria infectoria på V8. Sættet blev derfor podet op igen og anvendt. I projektforløbet foretages screening for interaktioner, hvor der forekommer hæmningszone mellem kolonierne. Ved tegn på afstand mellem kolonier, gensidig hæmning, eller en blanding heraf, jævnfør afsnit 4.1.1, isoleres de interagerende svampe. De interagerende svampe blev renpodet som sæt bestående af en hæmmende og en hæmmet svamp. I alt blev 21 sæt isoleret. De anvendte svampe blev identificeret ved at betragte dem makroskopisk og mikroskopisk. Til identifikation blev Penicillium spp. podet på substraterne CYA, MEA, CREA og YES, mens resten af svampene blev podet på DRYES, V8 og PDA. Ved hjælp af mikroskopi blev sporerne, hyferne og phialiderne betragtet. Som yderligere hjælp til identifikationen blev der udført HPLC af alle svampe. Til identifikation af Penicillium spp. blev der her brugt substraterne CYA og YES, mens der for de øvrige blev brugt det pågældende substrat, som interaktionen blev fundet på. 3.2 Thin Layer Chromatography - Bioautografi I dette afsnit vil fremgangsmåden for fremstilling af en TLC-plade 2 til bioautografi blive beskrevet. BioCentrum-DTU 10

11 2 propper med diameter på 0,5 cm udtages fra den ønskede test-svamp. Propperne bruges enkeltvis. På myceliesiden af proppen blev tilført en til to dråber kloroform/metanol blandet i forholdet 2:1. Herefter blev proppen påsat TLC-pladen, cirka halvanden centimeter fra bunden af pladen med myceliesiden nedad. Efter cirka et halvt til et helt minut blev proppen fjernet, og en ny prop fra samme prøve påsat med substratsiden nedad. En variation, hvor svampen erstattes med ekstrakt blev udført. Der blev anvendt cirka 10 μl ekstrakt. TLC-pladen blev nedsænket i et TLC-kar med en eluent i. Eluenten bestod af toluen/acetone/metanol (TEF) blandet i forholdet 5:3:2. Når fronten af eluenten var cirka 2 cm fra toppen af TLC-pladen blev denne taget op. Efter elueringen blev pladen tørret cirka 30 minutter i stinkskab. Når pladen var tør, blev det testet om elueringen var fuldført. Dette blev gjort ved at betragte TLC-pladen i UV-lys ved 254 nm og 366 nm. Ovennævnte TLC-plade blev brugt til fremstilling af en bioautografi-plade. Dimension af den valgte TLC-plade var 5x20 cm. Den svamp, som blev elueret, var den hæmmende svamp. Først blev der fremstilles det ønskede substrat, jævnfør bilag 2. Efter fremstillingen af substratet blev dette autoklaveret ved 121 C i 15 minutter. Dernæst blev substratet afkølet i et vandbad, til temperaturen var 47 C. Mens substratet blev afkølet, blev en sporesuspension fremstillet af den hæmmede svamp. Da substratet havde opnået den ønskede temperatur blev ml substrat afmålt, hvortil der var tilsat cirka 1 ml sporesuspension med den hæmmede svamp. Substrat tilsat sporesuspension hældes over TLC-pladen og fordeles således, at agarlaget havde samme tykkelse over hele pladen. Derefter blev pladen tørret til substratet var størknet. Bioautografi-pladerne blev opbevaret i beholdere, hvorefter de blev inkuberet ved 25 C til en eventuel hæmningszone fremkom. To metoder blev benyttet til at forhindre agaren i at løbe ud over siderne af TLC-pladen. Tape blev sat på alle siderne af TLC-pladen, således at dette kunne holde på agaren. Desuden blev en støbeform benyttet, som TLC-pladen passede ned i. Ved brug af normal agar blev det erfaret, at silicagelen blev ødelagt. Bioautografi med omvendt agar blev derfor forsøgt, se afsnit Substratet blev autoklaveret ved 121 C i 15 minutter. Efter autoklavering blev opløsningen opbevaret i køleskab natten over. En sporesuspension af den hæmmede svamp blev fremstillet ml agar tilsat sporesuspension blev hældt over pladen. TLCpladerne blev inkuberet ved 25 C, til en eventuel hæmningszone fremkom. BioCentrum-DTU 11

12 3.3 High Performance Liquid Chromatography Der blev analyseret metabolitproduktion for svampene ved hjælp af HPLC 23 i både hæmningszonen og ved renpodning. Renpodningen blev podet op på samme substrat som sættets interaktion. Efter en uges inkubering blev 6-9 propper udtaget fra den udvalgte svamp eller hæmningszone, se figur 6a og b. Propperne blev anbragt i et HPLC-glas. Dernæst blev 1 ml ethylacetat med 1% myresyre tilsat. Prøverne blev anbragt i et ultralydsbad i 45 minutter. Ekstraktet blev overført med en pipette til et nyt HPLC-glas, og inddampet i en Rotational Vacuum Concentrator (RVC). Efter inddampningen blev 0,5 ml 99,9 % methanol tilsat, og prøverne blev anbragt i et ultralydsbad i 20 minutter. Ekstraktet blev filtreret med et 0,45μm HPLC-filter. Prøverne kunne herefter benyttes til HPLC. Betingelser for HPLC er beskrevet i afsnit 3.5. Figur 8: a) Propper udtaget fra renpodning. b) Propper udtaget fra hæmningszone. 3.4 Menbranforsøg Som beskrevet i afsnit 2.4 kan forsøg med svampe podes på cellofan eller filter anvendes at analysere ekstracellulære metabolitter. I det følgende vil begge metoder blive beskrevet. Figur 9: Forløb med cellofan. Det overordnede forløb af forsøg med cellofan er vist på figur 9. For at opnå sterile materialer blev cellofanen autoklaveret i glaspetriskåle med vand, hvor cellofanstykkerne var lagt ned enkeltvis, så der var vand mellem hvert enkelt stykke. Cellofanen blev autoklaveret ved 121 C i 15 minutter. Efter autoklavering blev cellofanen pålagt det udvalgte substrat, se figur 10a. Substrater med cellofan blev inkuberet ved 25 C i to dage, for at observere om der var fremkommet kontaminering. Dernæst podes den hæmmende svamp i midten af cellofanen. Svampen blev inkuberet ved 25 C i en uge, se figur 10b. Efter svampen havde vokset i en uge, blev kolonien optegnet med en tusch under petriskålen, og cellofanen med svampen blev fjernet fra substratet med en pincet. Der blev forberedt to plader for hver prøve. Fra den ene blev der udtaget propper til videre analyse ved HPLC, mens den anden blev podet med den hæmmede svamp. Den hæmmede svamp blev podet både i og udenfor det optegnede område, og podestederne blev markeret med en tusch, se figur 10c. BioCentrum-DTU 12

13 Figur 10: a) Plade pålagt med cellofan. b) Koloni vokset op på cellofan. c) Koloni og podninger optegnet med tusch. Forsøg med filtre adskiller sig fra forsøg med cellofan. Forløbet er derfor vist på figur 11. Figur 11: Forløb med filter. Ved brug af filtre, blev tre filtre per plade benyttet. Disse blev pålagt substratet således, at de dækkede det størst mulige areal, se figur 12a. Pladerne blev inkuberet i to dage, for at se om der var fremkommet kontaminering. Dernæst blev den hæmmende svamp podet i midten og inkuberet i en uge, se figur 12b. Efter en uge blev kolonien optegnet med tusch, og filtrene fjernet med en pincet. Den hæmmede svamp blev podet på substratet både inden og uden for det optegnede område. Podestederne blev markeret med en tusch, se figur 12c. Efter en uges inkubering blev en eventuel hæmning observeret. Figur 12: a) Plade pålagt med filtre. b) Koloni vokset på filtre. c) Koloni og podninger optegnet med tusch. 3.5 Materialer De i rapporten nævnte materialer er herunder beskrevet. Opskrifter på substrater er beskrevet i bilag Screening Som tidligere nævnt blev der foretaget screening på forskellige levnedsmidler og naturprodukter. Ved screening blev der anvendt oregano, basilikum, æble, mandarin, tandori massala krydderi, sultan krydderi, rugbrød, chokoladebolle, agurk, bouillon som terning og pulver, sukker, bagepulver, vaniljesukker, jord, bark, fuglefjer, lasagneplader, træ fra udendørs gelænder, karry, mandler, valnødder, peber, hel tørret chili, te og havreprøver udleveret af instituttet. Sporesuspensioner, fremstillet på instituttet, indeholdt 0,5 g/l Tween 80 og 0,5 g/l agar Bioautografi Til TLC-bioautografi blev anvendt TLC-plader produceret af Merck i størrelsen 5x20 cm, 10x10 cm, 20x20 cm med silicagel 60. BioCentrum-DTU 13

14 Omvendt agar er produceret af Sigma med betegnelsen P2443-1KG, pluronic f-127, batchnummer 093K0023. Anvendt iprodion er 99% rent og produceret af Chem Service, Lot:273-36B HPLC Til ekstraktion af HPLC-prøver blev følgende apparatur brugt: Ultralydsbad: Branson 3210 og Rotational vacuum concentrator: Christ alpha (RVC) fra Struers KEBO LAB. Kemikalier: Ethylacetat indeholdende 1% myresyre. Ethylacetat: Labscan, batch nummer 3492/3. Myresyre: Fluka, batch nummer /1. 99,9% methanol, super gradient, fra LabsCan, batchnummer 4476/3. HPLC prøverne blev filtreret med 0,45µm HPLC-filter, ved navn 4-MF-45(T) 326 Ved HPLC blev anvendt en HPLC Agelent 100 series fra Hewlett packard. Der blev brugt en luna 2 C18 kolonne og injektionsvolumen på 3 μl. Eluenterne var millipore vand og acetonitril. Acetonitrilen var fra Riedel-de-Haën. Begge eluenter blev tilsat 50 ppm trifluoreddikesyre fra Bie og Berntsen. Ved HPLC blev anvendt omvendt faseseparation Membraner Cellofanen er fremstillet af firmaet Eric S. Ekman AB, Sverige, mens filtrene er fra Pall life sciences, supor-450, membranfilter, 47mm, 0,45μm, P/N BioCentrum-DTU 14

15 4 Resultater Arbejdet med de fundne interaktioner gav anledning til flere uforudsete problemer. Som det vil fremgå af den følgende tekst, skabte isoleringen af de i alt 21 sæt store problemer, idet mange sæt bestod af en eller to Penicillium spp. eller Aspergillus spp. Disse var gode til at sporulere og sprede sig. Renpodningerne af disse sæt tog derfor forholdsvis lang tid på grund af konstant kontaminering af egen svamp. Et andet problem var, at den ene svamp i sættet var bedre til at sporulere i forhold til den anden svamp, således at renpodning var umulig. Den ene svamp fik herved overtaget, så snart sættet blev renpodet på et nyt substrat. Sættets interagerende svampe var derfor umulige at skille ad. Undervejs blev flere sæt renpodet, men renpodning var ikke ensbetydende med, at det videre arbejde kunne lykkes. Flere sæt gik derfor tabt på grund af forskellige årsager, der er beskrevet i punktform herunder: 1. Under arbejdet med renpodning og videre undersøgelser blev svampene opbevaret i cryorør. Det forekom en enkelt gang, at sporer fra sættets ene svamp kontaminerede den anden svamp. Det var derefter umuligt at renpode denne svamp, da den kontaminerende svamp spolerede bedre end den oprindelige. 2. Et enkelt sæt gik tabt på grund af en kontaminering i sættes ene svamp. Den kontaminerende svamp voksede tilsyneladende godt ved køleskabstemperatur, hvor sættene blev opbevaret. Derfor var det den kontaminerende svamp, der fremkom ved podning. 3. Mens flere sæt af svampe tog lang tid at oprense, var andre hurtig klaret. Disse blev ligesom alle andre opbevaret i cryorør, men da de videre undersøgelser skulle udføres, var sættets ene svamp udtørret. Sættet måtte derfor opgives. Dette skete med to sæt. 4. Ved de videre undersøgelser blev det fundet, at to sæt i samlingen var ens. Det ene sæt blev derfor opgivet. Dette skete to gange, hvor sæt 4 var det samme som sæt 5, og sæt 19 var det samme som sæt Ved et enkelt sæt fremkom der ingen interaktion, da sættet var blevet renpodet, på trods af, at en interaktion oprindeligt var observeret. Det kunne skyldes tilstedeværelsen af en helt tredje svamp. BioCentrum-DTU 15

16 Af de 21 sæt, der blev startet ud med, gik syv sæt derfor tabt. For overblikkets skyld er alle sæt, der er gået tabt, noteret i skemaform i tabel 1. Første kolonne viser sættets nummer. Anden kolonne henviser til ovenstående liste med nummererede årsager til, at sættet gik tabt. Tabel 1: Årsag til tab af sæt med henvisning til ovenstående liste. Sætnr. Årsag til tab Under arbejdet med sættene blev de hæmmende svampe for nemheds skyld betegnes A-svampe, mens de hæmmede svampe betegnes som B-svampe. Denne nomenklatur bliver anvendt i rapportens resultat- og diskussionsafsnit. Ved forsøg hvor der er anvendt HPLC kan rådata findes på bilag 1. For at overskueliggøre brugen af tabeller i resultat.- og diskussionsafsnittene er metabolitterne benævnt ved retentionsindeks i stedet for metabolittens kromofor eller navn. I de tilfælde hvor flere metabolitter har samme retentionsindeks, er metabolitterne foruden deres retentionsindeks benævnt a, b og c. 4.1 Identifikation Identifikation af de anvendte svampe er foretaget makroskopisk og mikroskopisk. De makroskopiske observeringer er brugt til at understøtte de mikroskopiske. Mikroskopiske observeringer indebærer målinger af metabolitproduktion, foruden udseende af sporer, phialider og hyfer. Makroskopiske observeringer omfatter kolonidiameter og farven på svampens over- og underside. Med henblik på identifikation af Penicillium spp og Aspergillus spp. blev professor Jens-Christian Frisvad ved BioCentrum konsulteret. I starten blev svampene identificeret til slægtsniveau. Ved podning på rette substrater og mikroskopi kunne en videre identifikation til artsniveau finde sted. Nedenstående tabel 2 viser karakteristika og det valgte substrat til identifikation af den enkelte slægt. BioCentrum-DTU 16

17 Tabel 2: Karakteristika og valgt substrat til identifikation Karakteristika Slægt Substrat Ofte grønne kolonier, Penicillium spp. CYA, MEA og CREA pensellignende forgrening, runde sporer Blomsterlignende vesikler, Aspergillus spp. runde sporer Bananformede sporer Fusarium spp. V8 Dråbeformede, flercellede Altanaria spp. V8 eventuelt YES DRYES sporer Bælgformede sporer Bipolaris spp. GAK, V8 Pyknidier Coelomyceter V8 Til makroskopiske observeringer af Penicillium spp. blev svampene, som vist i tabel 2, podet op på de tre substrater CYA, MEA og CREA. Enkelte svampe krævede også podning på YES for identifikation. Billeder af samtlige svampe kan betragtes på bilag 1. I tre tilfælde fremkom der ikke sporer ved podning på DRYES. Dette gav problemer ved identifikationen. Disse blev derfor podning på GAK og V8 for at opnå sporedannelse til videre identifikation. I starten mindede tre svampe om Bipolaris spp. Senere blev det klart, at to af svampene var coelomyceter, da de havde dannet pyknidier på V8. En yderligere identifikation var ikke mulig. Den tredje tilhørte Bipolaris spp., men en yderligere identifikation var heller ikke mulig her. For at identificere svampene til artsniveau blev der foruden mikroskopiundersøgelser foretaget HPLC af alle svampe. I tabel 3 er de kendte, specifikke metabolitter vist for hver enkelt svamp. Tabel 3: Oversigt over kendte metabolitter # Hæmmer Kendte metabolitter Hæmmet Kendte metabolitter 1 P. cyclopium Viridicatol, puberulin, xanthomegnin P. bialowiezense Raistrick phenoler, mycophenol syre, brevione, met O, met A 2, asperphenamat, 2 P. griseofulvum Dechloro-griseofulvin, griseofulvin, cyclopiazon syre, patulin 3 P. freii Aurantiamin, viridicatol, dehydrocyclopeptin, 3- mycophenol syre P. polonicum Anacin, cyclopenol, cyclopenin, cyclopeptin, viridicatol, puberulin, verrucosidin, dehydrocyclopeptin. P. brevicompactum Raistrick phenoler, Brevianamid A, BioCentrum-DTU 17

18 methoxyviridicatin, xanthomegnin, viomellein 5 P. polonicum Anacin, cyclopenol, cyclopenin cyclopeptin, viridicatol, puberulin, verrucosidin, dehydrocyclopeptin. 7 P. bialowiezense Raistrick phenoler, mycophenol syre, brevione, met O, met A 2, asperphenamat 8 P. janczewskii Griseofulvin, compactin derivat, peniprequinolon, penigequinolon mycophenol syre, met O, asperphenamat A. tubingensis Aurasperon, asperazin. Coelomycet Ingen kendte P. brevicompactum Raistrick phenoler, Brevianamid A, mycophenol syre, met O, asperphenamat P. solitum Viridicatin, compactin. 9 A. versicolor Viridicatol, versicolin, versicolorin B, 10 A. versicolor Viridicatol, aspergamid. P.cf. glabrum Ingen kendte 11 P. freii Aurantiamin, viridicatol, dehydrocyclopeptin, 3- methoxyviridicatin. 12 P. hirsutum Meleagrin, cyclopenol, compactin, terresterinsyre, daldinin C. 15 P. freii Aurantiamin, viridicatol, dehydrocyclopeptin, 3- methoxyviridicatin. 16 P. brevicompactum Raistrick phenoler, Brevianamid A, mycophenol syre, met O, asperphenamat 17 F. avenaceum Rubrofusarin, P. brevicompactum Raistrick phenoler, Brevianamid A, mycophenol syre, met O, asperphenamat P.cf. glabrum Ingen kendte P. brevicompactum Raistrick phenoler, Brevianamid A, mycophenol syre, met O, asperphenamat Coelomycet Ingen kendte A. infectoria Ingen kendte Aurofusarin. 20 Bipolaris sp. Ingen kendte P. bialowiezense Raistrick phenoler, mycophenol syre, met O, met A 2, asperphenamat To svampe, der lignede P. glabrum producerede ikke P. glabrum metabolitter. I stedet producerede de ukendte metabolitter. Ved konsultation med Jens-Christian Frisvad blev det pointeret, at de tilhørte P.cf. glabrum, der endnu ikke er beskrevet i litteraturen. BioCentrum-DTU 18

19 Tabel 4 viser de kendte metabolitter, der blev fundet. Den første kolonne viser navnet på metabolitten, den anden kolonne viser retentionsindekset, mens den tredje angiver hvilke svampe metabolitten er produceret af. Tabel 4: Oversigt over de fundne, kendte metabolitter Navn Retentionsindeks Svamp 3-meyhoxyviridicatin A, 15A Anacin 778 2B, 5A Asperazin 754 5B Asperphenamat B, 3B, 8B, 11B, 15B, 16A, 20B Auranthiamin A, 15A Aurasperoner 865 5B Aurofusarin A Breviamid A 804 3B, 11B, 15B, 16A Brevion 993 7A Compactin A, 9B, 12A Cyclopenin 819 2B, 5A Cyclopenol 724 2B, 5A, 9B, Cyclopeptin 819 2B, 5B, 9B Cyclopiazon syre A Daldinin C A Dechlorogriseofulvin 869a 2A Dehydrocyclopeptin 858 2B, 5B, 15A Griseofulvin 917 2A, 8A Met A B, 7A, 20B Met O B, 3B, 7A, 8B, 11B, 15B, 16A, 20B Mycochromen syre B, 7A, 20B Mycophenol syre 916 1B, 3B, 7A, 11B, 12B, 15B, 16A, 20B Patulin 579 2A Peniprequinolon A Penigequinolon A Puberulin B, 5A Raistrick fenoler 577, 600, 621c, 1B, 3B, 7A, 11B, 15B, 16A, 20B 663, 669, 696a Rubrofasarin A Quinolactacin 733 1B, 7A, 20B, Terresterinsyre A Verrucosidin B, 5A Viridicatin 918 2B, 5A Viridicatol 812 2B, 5A, 9A, 11A, 15A I nedenstående tabel 5 er svampene inddelt sætvis. Der er også vist hvilket substrat, interaktionen er observeret på. Derudover er der i kolonne 3 og 5 vist, hvilket oprindeligt substrat svampen er isoleret BioCentrum-DTU 19

20 fra. Da enkelte interaktioner skyldes en kontaminering, er der angivet kontaminering som oprindelig substrat. Tabel 5: Oversigt over de forskellige sæt # Hæmmer Oprindeligt Hæmmet Oprindeligt Substrat substrat substrat 1 P. cyclopium Pizzamel P. bialowiezense Pizzamel DRYES 2 P. griseofulvum Pizzamel P. polonicum Pizzamel DRYES 3 P. freii Pizzamel P. brevicompactum Bolle DRYES 5 P. polonicum Pizzamel A. tubingensis Tørret chili DRYES 7 P. bialowiezense Fuglefjer Coelomycet Fuglefjer DRYES 8 P. janczewskii Jord P. brevicompactum Bolle DRYES 9 A. versicolor Luftprøve P. solitum Luftprøve V8 10 A. versicolor Luftprøve P.cf. glabrum Luftprøve V8 11 P. freii Pizzamel P. brevicompactum Kontaminering DRYES 12 P. hirsutum Kontaminering P.cf. glabrum Kontaminering DRYES 15 P. freii Mel P. brevicompactum Ukendt DRYES 16 P. brevicompactum Kontaminering Coelomycet Korn PDA 17 F. avenaceum Korn A. infectoria Korn V8 20 Bipolaris sp. Korn P. bialowiezense Korn DRYES 4.2 TLC og optimering af bioautografi Under forsøgene med bioautografi blev der ændret på forskellige faktorer for at opnå en optimal proces. Heriblandt substrat og koncentration heraf, temperatur af agaren og podningsmetoden. Forløbet af optimeringsforsøgene kan ses på figur 13 og opskrifter på anvendte substrater er beskrevet på bilag 2. Figur 13: Optimeringsforløb af bioautografi Ved starten på forsøgene med bioautografi var opgaven at undgå, at TLC-pladernes gel ikke blev ødelagt af agarens temperatur. Ved en langsom sænkning af temperaturen blev der forsøgt udpladning af agar på små TLC-plader. Det blev fundet, at når temperaturen var sænket til under 47 C, blev gelen ikke opløst og ødelagt i så stor grad. Dog kunne temperaturen ikke sænkes yderligere, da dette ville medføre, at agaren størknede for hurtigt. Desuden blev der også eksperimenteret med mængden af flydende agar, der blev pladet ud på TLC-pladerne. Herved blev det fundet, at til TLC-plader af BioCentrum-DTU 20

21 størrelsen 10x10 cm og 5x20 cm skal der bruges cirka 15 ml (se Figur 14), hvilket højst giver et 2 mm tykt lag agar. Figur 14: Billede af agar lagt på TLC-plade Efterfølgende blev det forsøgt med forskellige podningsmetoder. Først blev det forsøgt at inokulere svampesporerne i den flydende agar, dernæst at stryge sporerne ud oven på den størknede agar. Ved forsøg med Rhizopus spp. fremkom der ringe vækst, når sporerne blev inokuleret i agaren. Hvis sporerne derimod blev strøget ud, efter agaren var størknet, gav det bedre vækst. Væksten ved udstrygning var dog så kraftig, at der ikke kunne ses hæmning. Under forsøgene med Rhizopus spp. fremkom én hæmningszone (se figur 15). Hæmningszonen fremkom ved forsøg med Rhizopus microsporus på en TLC-plade, hvor svampe fra samlingen af antagonistiske sæt var påført som vist på figur 16. Figur 15: Hæmningszone med Rhizopus sp. Figur 16: Skitse for bioautografiforsøg Der blev ved dette forsøg anvendt vandagar med stor koncentration af sporer inokuleret i agaren. Det blev derfor efterfølgende forsøgt at eluere metabolitter fra den hæmmende svamp og dernæst udføre bioautografi med den hæmmede Rhizopus sp. Dette gav til gengæld ikke noget positivt resultat, idet der ikke fremkom hæmningszoner. Der blev også forsøgt bioautografi med de fundne antagonistiske sæt på vandagar, men grundet manglende næring i substratet fandtes der kun vækst på tapen rundt om TLC-pladerne. Derfor blev vandagaren herefter skiftet ud med CYA. Forsøg med de forskellige hæmmede og hæmmende svampe blev herefter udført, samt enkelte forsøg med Rhizopus spp. Herved fik svampene mere substrat, hvilket også gav bedre vækst og kunne ses ved overbevoksning på TLC-pladerne som på figur 17. Tilsyneladende blev væksten for omfattende, hvorfor der blev forsøgt bioautografi med lavere koncentration af CYA. Ved en 10% CYA-opløsning blev væksten af svampene mindsket, hvorved synliggørelsen af hæmningszonerne burde forbedres. Dog fremkom der ikke tydelige hæmningszoner ved denne ændring. Figur 17: Billede af overbevoksning af TLC-plade BioCentrum-DTU 21

22 Efter forsøg med almindelig og 10% CYA blev der anvendt omvendt agar til bioautografi. Her blev der eksperimenteret med masseprocenten af omvendt agar, der har betydning for, hvilken temperatur agaren størkner ved. Det blev set, at masseprocenten har en effekt på TLC-pladernes gel. For at undersøge sammenhængen mellem masseprocent og effekt på TLC-pladen, er der udført forsøg med forskellige opløsninger af omvendt agar. Der er her anvendt opløsninger med 30w/V, 40w/V og 50w/V omvendt agar. På figur 18 er de to TLC-plader til venstre forsøg med 30w/V, og de to til højre er forsøg med 40w/V. For pladerne markeret OA30+ og OA40+ gælder der, at agaren er tilført 1 ml sporesuspension inden udpladning. På figur 19 er der forsøgt samme opstilling som med omvendt agar. Her er der dog brugt en almindelig agar. På pladen til højre er agaren tilført 1 ml sporesuspension. Resultaterne af forsøgene med omvendt agar ses i tabel 6. Figur 18: Forskelle mellem OA30 og OA40 m/u ss Figur 19: Forskel i CYA og CYA+ss Tabel 6: Opstilling af resultater fra forsøg med omvendt agar Opløsning Produktion Størknepunkt Reaktion med gel 30w/V Opløses let i Er flydende i op til fem River meget op i substratblandingen minutter i laboratoriet gelen. 40w/V Er opløst efter to Størkner efter ét minut i dage i køleskab laboratoriet River lidt op i gelen 50w/V Har svært ved at Størkner efter meget opløses fuldstændigt kort tid i laboratoriet - Ved disse forsøg blev det fundet, at det ved produktion af 40w/v og 50w/V blev sværere at opløse agarpulveret. Hvor 30w/V blev opløst efter én nat i køleskab, skulle 50w/V stå i op til fem dage for fuldstændig opløsning. Desuden ses, at ved lavere masseprocenter trækkes gelen med substratblandingen og krølles derved sammen. Der blev ved videre forsøg anvendt omvendt agar med masseprocenten 40. Denne var helt opløst og klar til brug på to dage og størkner i et tyndt lag ved stuetemperatur og ødelægger kun TLC-pladerne, hvis der i forvejen er revner i gelen. Efter optimeringen af omvendt agar blev der udført forsøg med alle sæt. Desuden blev der lavet ekstrakter af propper fra hæmningszonen mellem svampene. Det blev ligeledes anvendt ved bioautografi. Dog fremkom der ved forsøgene med omvendt agar ikke tydelige hæmningszoner, trods inokulering og substrat. BioCentrum-DTU 22

23 Der blev som sidste test udført et forsøg med bioautografi, hvor der i toppen af TLC-pladen blev påført iprodion. Ved denne bioautografi fremkom en tydelig hæmningszone, hvilket er vist på figur 20. Figur 20: Hæmningszone ved hjælp af iprodion 4.3 Metabolitsammensætning ved hæmning Metabolitproduktionen er, som beskrevet i afsnit 3.3, blevet undersøgt ved at udføre HPLC på samtlige svampe. Alle svampe er undersøgt på det substrat som interaktionen er fundet på. Samtidig er sammensætningen af metabolitter fra sættets hæmningszone analyseret. Rådata fra HPLC resultater kan findes på bilag 1. Ved analysen blev metabolitsammensætningen i hæmningszonen undersøgt med hensyn til hvilke metabolitter, der stammede fra sættets to interagerende svampe. En sammenligning af metabolitterne fra hæmningszonen og renpodningerne blev derfor foretaget. For at anskueliggøre data er resultaterne indført i tabel 7. Første kolonne angiver sættets nummer. Anden og fjerde kolonne angiver antallet af metabolitter ved henholdsvis A- og B-svampenes renpodninger, vist ved figur 21a. Tredje og femte beskriver de metabolitter fra hæmningszonen, der stammer fra enten A eller B, vist ved figur 21b. Figur 21: a) Propper fra renpodning, hvis antal metabolitter bruges til kolonne 2 og 4. b) Propper fra hæmningszone, hvis metabolitter sammenlignes med metabolitter fra renpodning og bruges til kolonne 3 og 5. Skemaets sidste kolonne angiver hvilket substrat, interaktionen har fundet sted på. I tabellens nederste række er antallet af metabolitter adderet kolonnevis. Dette gælder for kolonne 2 til 5. Tabel 7: Undersøgelse af metabolitsammensætningen i hæmningszonen mellem de interagerende kolonier. Sæt nr. Antal metabolitter i A (figur 21a) Metabolitter fra A- svampe (figur 21b) Antal metabolitter i B (figur 21a) Metabolitter fra B- svampe (figur 21b) a, 567, 689a, 779a , 600, 621a, 708, 733, 746, 810, 916 Substrat DRYES BioCentrum-DTU 23

24 , 569, 579, 621b, 845, 869a, 875, 917, , 779b, 794, 812, 819, 891, 963, 1010, 1081, , , 593, 600, 621c, 643, 669, 688a, 696a, 738, 804, 830, 837, 841, 854, 877, , 602, 613, 689, 724, 778, 812, 891, , 600, 643, 663, 669, 708, 733, 748, 777, 810, 828, 854, 874, 883, 894a, 916, 963, 1025, 1077, 1141, 1221, 1614a, 1694 DRYES DRYES , 627, 704 DRYES b, 669, 800, 817, 929, 947 DRYES , 938, , 600, 643, 669, DRYES 688b, b, 724, 812, 856, , 724, 804, 819, V , 812, 856, a V , 600, 669, 712, 804, 811, 829, 840, 854, 916 DRYES , , 610 DRYES , 600, 621c, 643, 669, 696b, 738, 748, 804, 830, 854, 877, 916 DRYES Ingen b, 568, 800, 929, PDA Ingen 4 Ingen V b, 1614b , 600, 663, 669, 686, 717, 733, 743, 782, 795b, 810, 829, 836, 854, 869b, 916, 963, 1089, 1183 DRYES I alt Ud fra tabel 7 ses det, at samlet set produceres der lige mange metabolitter ved renpodning for A- og B-svampe. Samlet set er der altså ikke forskel på mængden af producerede metabolitter ved renpodninger. Det kan derfor overraske, at sandsynligheden for at finde metabolitter i hæmningszonen er større for B-svampe end A-svampe. Betegnelsen ingen i tabel 7 henviser til, at ingen metabolitter blev genkendt i hæmningszonen i forhold til renpodningen. BioCentrum-DTU 24

25 For at anskueliggøre data bedre udføres der en beregning over hvor ofte der er set metabolitter fra A- henholdsvis B-svampen i hæmningszonen. For hvert sæt divideres tallet i kolonne 3 med antallet af metabolitter i kolonne 2 og omskrives til procent. Samme procedure udføres for kolonne 5 med kolonne 4. Beregningerne er vist i kolonne 2 og 3 i tabel 8. Dette beskriver antallet af metabolitter i hæmningszonen, som er genkendt fra renpodning, i forhold til antallet af producerede metabolitter fundet ved renpodning. Sidste kolonne i tabel 8 angiver hvilket af sættets svampe, der har størst procent. Tabel 8: Metabolitter i hæmningszonen i forhold til antallet af producerede metabolitter fundet ved renpodning angivet i procent. Sæt nr. A-metabolitter i B-metabolitter i Største værdi hæmningszonen hæmningszonen 1 15,4 % 13,1 % A 2 20,0 % 31,3 % B 3 16,7 % 36,4 % B 5 23,7 % 8,6 % A 7 46,9 % 20,0 % A 8 5,5 % 13,0 % B 9 4,9 % 15,4 % B 10 23,5 % 11,1 % A 11 5,3 % 21,7 % B 12 4,8 % 8,7 % B 15 3,8 % 27,1 % B 16 0,0 % 38,5 % B 17 0,0 % 0,0 % ,7 % 38,0 % B Idet B optræder 9 ud af 14 gange i sidste kolonne, mens A optræder 4 gange, ses det af tabel 8, at sandsynligheden for at finde flest metabolitter fra B-svampe i hæmningszonen er cirka dobbelt så stor som for metabolitter fra A-svampe. Da flere svampe findes i mere end et sæt, er det interessant at undersøge sammensætningen af metabolitter hos disse. Til dette bruges nedenstående tabel 9 til 15, der viser metabolitproduktionen hos hver enkel svamp, såfremt svampen optræder mere end en gang i det samlede antal sæt. Data fra tabel 7 benyttes, idet felter fra tabellen bruges til at finde ud af, hvilke metabolitter hver enkelt svamp producerer når denne fungerer som A- eller B-svamp. Data fra tabel 7 benyttes derfor direkte i tabel 9 til 15. Tabel 9 til 15 er hver inddelt i to skemaer. Skemaet til venstre indeholder oplysninger taget direkte fra tabel 7. Her sammenlignes metabolitproduktionen ved renpodningen af den undersøgte svamp med BioCentrum-DTU 25

26 metabolitsammensætningen i hæmningszonen fra samme sæt. Kolonne 1 i skemaet beskriver hvilken sammenligning der foretages. Når der for eksempel står: Ren over for zone, sæt 3, i tabel 9 ved undersøgelse af P. freii, henvises der til de metabolitter, der optræder både i renpodningen af P. freii og i hæmningszonen af sæt 3. I kolonne 2 er metabolitterne nævnt ved retentionsindeks. I kolonne 3 henvises til om den undersøgte svamp indgår som A- eller B-svamp i det undersøgte sæt. I det nævnte tilfælde henvises der til, at P. freii virker som A-svamp i sæt 3. Skemaet til højre i tabel 9 til 15 indeholder nye oplysninger, som ikke er præsenteret i tabel 7. Her er metabolitproduktionen i hæmningszonerne sammenlignet med de andre hæmingszoner som den undersøgte svamp indgår i. Når der for eksempel i kolonne 1 i tabel 9, står: Zone over for zone, 3-11 henvises der altså til de metabolitter, der indgår i både hæmningszonen fra sæt 3 og fra sæt 11. I kolonne 2 beskrives metabolitterne ved retentionsindeks. Kolonne 3 beskriver om de undersøgte svampe indgår som A- eller som B-svampe i de to undersøgte hæmningszoner. Når der for eksempel i sammenligningen mellem sæt 2 og sæt 5 står B/A i kolonne 3 i tabel 10, betyder det altså, at P. polonicum indgår som B-svamp i sæt 2 og som A svamp i sæt 5. Hvis en metabolit forekommer mere end en gang i samme skema i tabel 9 til 15 markeres retentionsindekset med fed skrift. Tabel 9: P. freii på DRYES i sæt 3, 11 og 15. Sammenligning Retentionsindeks A/B Ren over for 551, 567 A zone, sæt 3 Ren over for zone, sæt 11 Ren over for zone, sæt A 567 A Sammenligning Retentionsindeks A/B Zone over for 551, 567, 577, 600, A/A zone, , 669, 804, 854, 916 Zone over for 551, 567, 577, 600, A/A zone, Zone over for zone, , 804, 854, , 567, 577, 593, 600, 621c, 643, 669, 688a, 804, 830, 841, 854, 877, 916 A/A Det ses i skemaet til venstre af tabel 9, at en enkelt metabolit findes i alle tre tilfælde, mens otte metabolitter findes i skemaet til højre. Metabolitsammensætningen i hæmningszoner indeholdende P. freii minder derfor mere om hinanden end hæmningszonerne minder om renpodningerne af P. freii. Det skal dog tages med i overvejelserne, at B-svampen i alle tre sæt er en P. brevicompactum og mange af metabolitterne derfor stammer fra P. brevicompactum og ikke fra P. freii. BioCentrum-DTU 26

27 Tabel 10: Metabolitter fra P. polonicum på DRYES i sæt 2 og 5. Sammenligning Retentionsindeks A/B Ren over for 724, 779b, 794, 812, B zone, sæt 2 819, 891, 963, 1010, Ren over for zone, sæt , , 602, 613, 689, 724, 778, 812, 891, 1010 A Sammenligning Retentionsindeks A/B Zone over for zone, , 724, 812, 891, 1010 B/A Det ses ud fra tabel 10, at mængden af producerede metabolitter fra P. polonicums renpodninger og sættenes hæmningszoner bedre kan sammenlignes end hæmningszonerne af sæt 2 og 5 kan. Det ses, at fire metabolitter er ens i skemaet til venstre, mens fem metabolitter optræder i skemaet til højre. Sammenlignin g Ren over for zone, sæt 1 Ren over for zone, sæt 7 Ren over for zone, sæt 20 Retentionsindeks 577, 600, 621a, 708, 733, 746, 810, , 600, 643, 663, 669, 708, 733, 748, 777, 810, 828, 854, 874, 883, 894b, 916, 963, 1025, 1077, 1141, 1221, 1614a, , 600, 663, 669, 686, 717, 733, 743, 782, 795b, 810, 829, 836, 854, 869b, 916, 963, 1089, 1183 A/B Tabel 11: P. bialowiezense på DRYES i sæt 1, 7 og 20. Sammenligning Retentionsindeks A/B Zone over for 577, 600, 663, 733, B/A zone, , 916, 989 Zone over for 577, 600, 621a, 663, B/B zone, , 782, 810, 916 Zone over for zone, , 600, 643, 669, 733, 810, 916, 963, 1614 A/B Af tabel 11 ses, at fem af P. bialowiezense s metabolitter produceres både i hæmningszonen og ved renpodning for alle tre sæt. Det ses ligeledes af venstre skema, at renpodningen i sæt 7 og sættets hæmningszone minder meget om hinanden. Renpodningen i sæt 20 og sættets hæmningszone minder lidt mindre om hinanden, mens renpodningen i sæt 1 og sættets hæmningszone minder mindst om hinanden. B A B Ved sammenligning af billeder på bilag 1 ses det, at P. bialowiezense agerer som B-svamp i sæt 1, som A-svamp i sæt 7, mens sæt 20 er et tilfælde med gensidig hæmning. Når P. bialowiezense agerer BioCentrum-DTU 27