Forarbejdningsmetoder til optimering af DNA-oprensning fra luftvejssekreter uden påvirkning af DNA-indhold

Transkript

1 Forarbejdningsmetoder til optimering af DNA-oprensning fra luftvejssekreter uden påvirkning af DNA-indhold Af Katrine Qvist (99940) Dato: 23. maj 2012 Antal tegn: I-vejleder: Lektor Karen Louise Møller K-vejleder: Bioanalytikerunderviser Dorte Paulmann

2 Resumé Baggrund: Ved analyse af indholdet i luftvejssekreter er den største barriere for succesfuld analyse den viskøse konsistens nogle af disse prøvematerialer kan have. Viskositeten af prøvematerialet kan bl.a. komplicere DNA-oprensning, som er essentiel for en senere PCR-analyse. Dette forsøg afprøver forskellige forarbejdningsmetoder med det formål at optimere homogenisering og opløsning af svært viskøse luftvejssekreter forud for DNA-oprensning og senere real-time PCR-analyse. Metode: Viskøse sekreter spiket med CMV i forskellige koncentrationer er blevet bearbejdet med fire forskellige forarbejdningsmetoder ved opblanding med 1 og 3 ml af det valgte opblandingsmiddel. Der er anvendt en kemisk metode (dithiothreitol (DTT)), en mekanisk metode (sonikering) og en videreudvikling af referencemetoden (vatpind) som sammenlignes med den nuværende referencemetode, der består af oprystning af sekretet i 5-prime vand. Prøverne udsat for de forskellige forarbejdningsmetoder vurderes i forhold til antallet af succesfulde DNA-oprensninger på MagNa Pure Compact og størrelse og mængde af Ct-værdier fra real-time TaqMan PCR-analyse på ABI 7900HT. Resultat: Forarbejdningsmetoderne med vatpind og DTT klarede sig bedst med hensyn til opløsning og homogenisering af sekretet med hhv. 30 og 29 succesfulde DNAoprensninger ud af 30 mulige. Herefter fulgte sonikering med 23 og referencemetoden 5- prime vand med 22 succesfulde DNA-oprensninger. For udbytte af detekterbart CMV- DNA i sekret er favoritten igen vatpindmetoden med detekterbare Ct-værdier for alle tre CMV-koncentration og for begge opblandingsforhold. Herefter følger igen DTT som har fået detekterbare Ct-værdier ved begge opblandingsforhold og ved de to højeste CMVkoncentrationer. Sonikering og 5-prime vand har fået detekterbare Ct-værdier ved begge opbalndingsforhold ved højeste CMV-koncentration og ved opblanding med 3 ml ved næsthøjeste CMV-koncentration. Konklussion: Det konkluderes at forarbejdningsmetoden med brug af vatpind er den aktuelle forarbejdningsmetode overlegen, både med henblik på homogenisering og opløsning af sekret og i forhold til bevarelsen af detekterbart CMV-DNA heri. 1

3 Forord Jeg vil gerne sige tak til alle på klinisk mikrobiologisk afdeling (KMA) på Århus Universitetshospital, Skejby for muligheden for at udføre mit professionsbachelorprojekt på afdelingen. Der skal lyde en speciel tak til afdelingens molekylærbiologer Lone Pødenphant og Kurt Handberg for hjælp og vejledning gennem hele projektet, samt bioanalytikerne i virusafsnittet for at give os den fornødne tid ved og vejledning i de forskellige apparaturer. Også en stor tak til bioanalytikerunderviser Dorte Paulmann og lektor Karen Louise Møller fra bioanalytikeruddannelsen i Århus for vejledning i forbindelse med projektet og udarbejdelse af den skriftlige opgave. Til sidst en stor tak til min medstuderende og meget gode veninde Charlotte Damsgaard Mikkelsen for samarbejdet om dette projekt. 2

4 Indholdsfortegnelse Resumé... 1 Forord... 2 Introduktion... 6 Baggrund... 6 Formål... 7 Problemformulering... 7 Målformulering... 7 Teori... 8 Cytomegalovirus (CMV) prime vand... 8 Sonikering ,4-dithiothreitol (DTT)... 9 DNA-oprensning på MagNa Pure Compact... 9 Real-time TaqMan PCR på ABI 7900HT Databehandling på ABI 7900HT vha. SDS Kvalitetssikring af Real-time TaqMan PCR på ABI 7900HT Metoder og materialer Metoder Litteratursøgning Indsamling af prøvemateriale Standardopløsning af dithiothreitol (DTT) Spiking af prøver med CMV Fremstilling af standardrække Fremgangsmåde (præ-analyse) Fremgangsmåde (analyse)

5 Resultatbehandling Materialer Mekanisk forarbejdning Kemisk forarbejdning Standard forarbejdning DNA-oprensning og PCR-analyse Resultater DNA-oprensning på MagNa Pure Compact Real time TaqMan PCR-analyse på ABI 7900HT Cytomegalovirus (CMV) Intern kontrol (INTC) Standardkurver Diskussion Forarbejdningsmetodernes evne til at opløse og homogenisere sekret Fejlkilder angående DNA-oprensning på MPC Forarbejdningsmetodernes evne til at bevare detekterbart CMV-DNA i sekret Fejlkilder angående real-time PCR-analysen: Delkonklusion Kvalitetssikring Standardkurver Intern kontrol (INTC) Projektets opbygning og udførelse Fejlkilder Konklusion Perspektivering Overførbarhed

6 Videre forskning i relation til projektet Referenceliste

7 Introduktion Baggrund Sekreter fra luftvejene er en stor del af de rutinemæssige prøver på en mikrobiologisk afdeling. I takt med stigende erkendelse af sekretindholdets betydning for kritisk syge patienter er undersøgelsesmetoderne til påvisning af virus blevet stadig flere. Nogle af disse metoder er begrænsede af konsistensen af sekreterne. Problemet består i at luftvejssekreter fra patienter med lungesygdomme, som fx astma, cystisk fibrose m.fl. ofte er meget viskøse og seje og derfor svære at håndtere (1) (2). På mikrobiologiske afdelinger anvendes i dag både traditionel dyrkning og molekylærbiologiske metoder som Polymerase Chain Reaction (PCR) til identifikation af diverse mikroorganismer i disse sekreter (3). Ved anvendelse af PCR analysen må prøvematerialet først gennemgå en oprensning af DNA på en DNA-oprensningsmaskine som fx MagNa Pure Compact (MPC). Her er det vigtigt at prøvematerialet er helt homogent og tyndtflydende, da klumper i prøvematerialet vil kunne forårsage fejl i DNA-oprensningen. I forsøg på at løse dette problem har producenten Roche Applied Science udviklet et slimopløsende middel ved navn dithiothreitol (DTT). DTT anvendes i dag på Rigshospitalet. (Bilag 1) På Klinisk Mikrobiologisk Afdeling (KMA) i Skejby er der nogle gange problemer med at kunne oprense DNA fra de ekstra viskøse sekreter. Proceduren er i øjeblikket at opløse sekreterne i 5-prime vand forud for oprensning på MPC (4). MPC er dog, som ovenfor nævnt, ekstremt følsom overfor prøvernes viskositet og homogenitet, som ikke altid er optimal ved opløsning i vand (4). Derfor vil det være interessant at undersøge forskellige muligheder for opløsning af ekstra viskøse sekreter. Optimalt set ønskes en opløsningsmetode, som kan give et homogent og tyndtflydende sekret, der stadig indeholder DNA repræsentativt for patientens indleverede prøvemateriale. Artiklen af Caroline G. Baxter et al. (1) omhandler et forsøg, der afprøver forskellige metoder til homogenisering af sekreter, både mekaniske og kemiske i form af sonikering, dithiothreitol (DTT) og vand. Resultaterne fra homogeniseringen er vurderet ifht. traditionel dyrkning og PCR med henblik på et homogent prøvemateriale, hvor indholdet af mikroorganismer ikke bliver påvirket. 6

8 Formål Formålet med dette projekt er at afprøve forskellige forarbejdningsmetoder, både mekaniske og kemiske, til homogenisering af de mest viskøse sekreter fra den almindelige rutine på KMA Skejby forud for DNA-oprensning på MagNa Pure Compact (MPC) og detektion af CMV-DNA vha. Polymerase Chain Reaction (PCR). Problemformulering Hvordan er det muligt at opnå en viskositet og homogenitet, som gør det muligt at oprense ekstra viskøse sekreter på MagNa Pure Compact (MPC), med det formål at detektere virus- DNA vha. PCR, og hvordan påvirker denne forarbejdningsmetode indholdet af DNA? Målformulering - Vi vil undersøge, om det er muligt at optimere DNA oprensning af ekstra viskøse sekreter med cytomegalovirus (CMV) på MPC ifht. KMA Skejbys nuværende procedure ved at afprøve sonikering og opblanding med DTT og 5-prime vand for at opnå et homogent og flydende prøvemateriale. - Vi vil herunder undersøge, om disse forarbejdningsmetoder medfører en forringelse eller forbedring af indholdet af DNA i forhold til en højere eller lavere nedre detektionsgrænse ved at udføre real-time PCR for CMV på eluaterne fra oprensningen på MPC. - Vi vil sammenligne de øvrige forarbejdningsmetoder med den aktuelle metode på KMA Skejby, ved at vurdere antallet af prøver, der gennemgår korrekt DNA oprensning på MPC, derudover vil vi sammenligne de forskellige forarbejdningsmetoders PCR resultater i form af Cycle threshold (Ct) -værdier, både for CMV og interne kontroller. - Desuden vil vi medtage en standardkurve bestående af oprenset CMV-DNA i 10-folds fortyndinger på hver PCR-kørsel, for at kunne validere PCR-analysen og sammenligne Ctværdier fra de forskellige PCR-kørsler indbyrdes. 7

9 Teori Cytomegalovirus (CMV) Cytomegalovirus (fra græsk ''Cyto-'', "celle" og ''-Megalo-'', "stor") er en del af herpesvirusfamilien tilhørende underfamilien Beta-herpesvirinae. Det officielle navn for virusset er herpes hominis-virus 5. Herpesvira er membranklædte vira med et genom bestående af dobbeltstrenget DNA. Mellem kerne-capsidet og virusmembranen findes et Figur 1: Opbygning af cytomegalovirus (20) proteinfyldt matrix som hedder tegument (se Figur 1). Det er proteiner herfra, som forbliver latent i organismen efter primærinfektion. Man ved ikke i detaljer hvordan virusset evt. senere reaktiveres, men det kan skyldes cytokiner som f.eks. interleukin-8 og TNF-α, som kan inducere virusreplikation. CMV overføres som kontaktsmitte ved spyt, modermælk, urin, sæd og cervixsekret og som blodsmitte. Mange bliver smittet med CMV allerede i sit første leveår og hos voksne antager man at alt fra %, afhængig af alder og adfærd, vil være smittet med CMV. Oftest forløber en CMV-infektion asymptomatisk mens enkelte oplever milde influenzalignende symptomer, dog kan en CMV-infektion have alvorlige og nogle gange fatale konsekvenser for immunsupprimerede personer. Der findes endnu ingen vaccine som kan forhindre CMV-infektion og antiviral-behandling anvendes næsten udelukkende på immunsupprimerede patienter og ved organtransplantationer. (5) 5-prime vand 5-prime vand er nuklease- og proteasefrit sterilt vand. Dvs. at det indeholder hverken DNaser, RNaser eller Proteaser. Det er de-ioniseret og fremstillet uden brug af kemiske hjælpemidler som Diethylpyrocarbonat (DEPC). (6) 8

10 Sonikering Sonikering er brugen af ultralyd til at agitere partikler i et prøvemateriale. Ultralydsbølgerne kan manipulere prøvematerialet ved at nedbryde nogle intermolekylære bindinger, og på den måde være med til at opløse og homogenisere prøvematerialet. I dette forsøg er rør med prøvemateriale blevet nedsunket i et sonikeringsbad i 10 min, hvor ultralydsbølger altså bevæger sig gennem vand. (7) (1) 1,4-dithiothreitol (DTT) Dithiothreitol (DTT) er den almindelige betegnelse for en redox reagent også kendt som Cleland s reagens. DTT s molekylære struktur i den hhv. reducerede og oxiderede form er vist i Figur 2. Figur 2: Molekylær struktur for dithiothreitol (8) DTT er et usædvanlig stærkt reduktionsmiddel på grund af sin store tilbøjelighed til at danne en seks-leddet ring med en indre disulfidbinding. Dette anvendes til at reducere disulfidbindinger af proteiner og mere generelt til at forhindre dannelsen af intermolekylære disulfidbindinger mellem proteiner. På denne måde kan DTT hjælpe til at skabe et mere løst sammenhængende materiale og kan derfor anvendes til at opløse stærkt viskøse prøvematerialer. (8) (Bilag 2) DNA-oprensning på MagNa Pure Compact Oprensning af DNA fra forskelligt biologisk materiale, foregår ved hjælp af proteinnedbrydende stoffer og gentagne vask mens DNA tilbageholdes. Processen forløber over 7 trin, som er skitseret i Figur 3 nedenfor. Først kommes prøvematerialet i et prøverør [1] og dette monteres på MagNa Pure Compact (MPC) sammen med et eluatrør til det færdige eluat. På MPC udføres nu selve oprensningen, der starter med tilførelsen af lysisbuffer og proteinase K, som nedbryder celler og proteiner [2]. Herefter tilføres magnetiske glaspartikler, som vha. deres magnetiske tiltrækning binder det nu frie DNA i prøverøret [3]. Med en magnet fjernes så 9

11 de magnetiske glaspartikler med det påhæftede DNA [4]. Herefter gennemføres en række vaskeprocedurer for at fjerne alle celle- og proteinrester [5]. Glaspartiklerne og det påhæftede DNA løsnes fra magneten [6] og vha. høje temperaturer adskilles DNA et fra glaspartiklerne, så det endelige eluat kun indeholder DNA [7]. (4) Figur 3: Oprensning af DNA fra biologisk materiale på MagNa Pure Compact (4) Real-time TaqMan PCR på ABI 7900HT PCR er en teknik til amplifikation af et bestemt stykke dobbeltstrenget DNA (Template), som f.eks. er blevet oprenset fra et prøvemateriale vha. MPC. Det er en in vitro efterligning af kroppens egne cellers replikation in vivo, og indeholder en række standard-komponenter som template, primere, nukleotider (dntp er), polymerase og buffere. PCR består af tre steps; Denaturering, annealing og elongering som foregår ved forskellige temperaturer. Efter en cyklus med denaturering, annealing og elongering er template fordoblet. Dvs. at efter 40 cyklusser kan et enkelt stykke template, som f.eks. et stykke CMV-DNA, blive til millioner af kopier (amplicons). Dette er særdeles brugbart, når man skal undersøge sit template yderligere vha. andre analyser eller vha. real-time PCR, da det giver en meget større sensitivitet end et enkelt stykke template alene. (9) (10) 10

12 Ved real-time PCR anvender man, foruden de tidligere nævnte standard-komponenter, en eller flere prober, som bindes specifikt til det template, de er designet efter. På denne måde kan man, samtidig med at amplifikationen foregår, identificere, hvor meget der er tilstede af de forskellige templates. I denne analyse anvendes TaqMan prober. En TaqMan probe er et stykke syntetisk fremstillet enkeltstrenget DNA på omkring 20 basepar, som er blevet mærket med en reporter (R) i 5 enden og en quencher(q) i 3 enden (Figur 4). Når reporter og quencher sidder i umiddelbar nærhed af hinanden, vil Figur 4: Illustration af TaqMan real-time PCR (19) quencheren opsluge den fluorescens som reporteren udsender. Det vil de gøre under annealingstrinnet, hvor primere og prober syntetiserer til template, men når proben skubbes væk fra template (Strand displacement) og klippes i stykker af DNA-polymerasen (cleavege) under elongeringstrinnet, vil proben blive nedbrudt og derved vil quncher og reporter adskilles og reporterens fluorescens kan således måles af en laser på ABI 7900HT. (9) (10) Databehandling på ABI 7900HT vha. SDS 2.4 Den målte fluorescens bearbejdes af en computer og vha. databehandlingsprogrammet Sequence Detection System (SDS) 2.4 dannes et amplifikationsplot hvor mængden af udsendt fluorescens (målt i relative lysenheder) er ligefrem proportional med mængden af DNA (10). Som man kan se på Figur 5 indeholder et amplifikationsplot et koordinatsystem med en x-akse med antallet af cyklusser og en logaritmisk y-akse med mængden af detekteret lys, givet i relative lysenheder (ΔRn). Desuden ses en cycle threshold (Ct), som er den grønne streg set på Figur 5Fejl! Henvisningskilde ikke fundet.. Ct angiver en tærskelværdi, som lysudviklingen må overstige før et resultat kan kaldes positivt. 11

13 Figur 5: Eksempel på et amplifikationsplot. CMV målt for vatpind opblandet med 3 ml. CMVkoncentration på 10-2 er grøn, 10-3 er blå og 10-4 er rød. Jo tidligere i forløbet af gentagne PCR-cyklusser den pågældende prøves detekterede lysmængde overskrider Ct, jo større mængder af CMV har der været tilstede i prøven. I dette projekt køres 40 PCR-cyklusser og hermed er 40 den maksimalt opnåelige Ct-værdi. Denne Ct-værdis tilsvarende CMV-koncentration afspejler således analysens nedre detektionsgrænse. Findes der koncentrationer af CMV i prøven, som er under det muligt detektérbare, eller detekteres der af andre grunde ikke tilstrækkelige mængder lys til at overstige Ct, kaldes prøven Undertermined. (10) Kvalitetssikring af Real-time TaqMan PCR på ABI 7900HT For alle valide analyser findes kontrolkomponenter, som skal sikre at proceduren forløber korrekt. Ved real-time PCR-analyse sikres analysens korrekthed bl.a. ved at tilføre en intern kontrol til mastermixet, som sikrer differentiering mellem falske negative resultater og mislykkede PCR-kørsler. Denne kaldes også en amplifikationskontrol, da den netop kan 12

14 verificere, at der er sket en amplifikation og at PCR-kørslen dermed er forløbet korrekt. En intern kontrol må naturligvis designes, så den ikke konkurrerer med target-dna, for at forhindre falsk negative resultater. Derfor er balancen mellem den interne kontrols primer, prober samt dntp er og CMVs pimer, -probe samt dntp er meget vigtig. Ud over diverse kontroller har man valgt at tilføre en ekstra sikkerhedsmekanisme for at forhindre kontaminering med amplicons fra tidligere PCR-kørsler på maskinen. For at kunne skelne mellem allerede amplificerede amplicons fra tidligere kørsler og det nye template, som er til stede i form af elutat fra prøvematerialet, tilføres dutp er i stedet for dttp er i mastermixet. Dette bevirker at amplicons som bliver bygget ud fra template under elongeringstrinnet indeholder basen uracil i stedet for thymin. Ved også at tilføre et UNG-enzym (Uracil-DNA Glukosylase), som kan nedbryde disse dutp er, sikrer man at amplicons fra tidligere kørsler nedbrydes inden næste kørsels amplifikationer påbegyndes. UNG-enzymet aktiveres og eventuelle amplicons med dutp er nedbrydes under Stage 1 som ses på Figur 6. Aktiveringen sker ved 50 C og enzymet deaktiveres igen efter 2 min Figur 6: Temperaturprofil for TaqMan real-time PCR-analyse af CMV (billede fra databehandlingsprogrammet SDS 2.4) ved 95 C i 10 min (Stage 2). Herefter følger 40 cykler med denaturering (95 C) og annealing samt elongering (60 C) set i Stage 3. Her bemærkes desuden at den aktuelle real-time PCR anvendt på KMA, Skejby i realiteten kun er en to-steps analyse, da annealing og elongering kan foregå ved samme temperatur (stage 3). Da det ønskes at sammenligne flere forskellige PCR-kørsler i dette projekt, anvendes desuden en standardkurve, som medtages på hver kørsel. Standardkurven består af CMV opblandet i 0,9 % NaCl i fortyndingerne 10-1 til 10-6 M. Den afdækker både høje og lave koncentrationer af virus og kan derfor afspejle apparaturets måleområde og med koncentrationer på 10-5 M og 10-6 M ses tydeligt analysens nedre detektionsgrænse inden for de forudindstillede 40 cykler. 13

15 En standardrække eller en positiv kontrol med en kendt koncentration kan anvendes som en reference mellem forskellige kørsler. I dette projekt blev værdien for 10-2 M brugt som rettesnor for indstilling af Cycle Threshold (Ct). Ved at indstille Ct så standarden med koncentrationen 10-2 M lå på 20,1, var det muligt at sammenligne resultater af Ct-værdier for de forskellige kørsler. (9) (10) Metoder og materialer Metoder Litteratursøgning I perioden februar til maj 2012 er der blevet søgt litteratur til inspiration for og i forbindelse med projektet. Der er anvendt søgedatabaser som Wikipedia, Google, Google scholar og Pubmed. Søgningen er blevet begrænset til danske og engelske tekster. Der blev søgt både på MeSH-terms; Sputum, dithiothreitol, sonication, cytomegalovirus, Polymerase Chain Reaction, DNA, cystic fibrosis, asthma mm. Samt fritekstsøgning på bl.a.; Respiratory specimens, homogenization, pretreatment mm. Til brug ved inspirationssøgning og til opgavens baggrunds- og teoriafsnit har der været anvendt studierelevant litteratur i form af lærebøger og litteratur fundet vha. søgedatabaser som Wikipedia, Google, Google scholar og PubMed. For information ang. afdelingens apparaturer og nuværende arbejdsprocedure benyttedes regionens elektroniske forskriftssamling e-dok.rm.dk, og for information om indhold og anvendelse af diverse laboratorieudstyr og -materialer er der søgt information i indlægssedler og på fabrikanters websteder. Til at søge videnskabelig relevant litteratur og perspektiverende artikler er udelukkende søgedatabasen PubMed blevet anvendt, til at finde peer-reviewed litteratur, som er udgivet i anerkendte tidsskrifter. 14

16 Da der findes meget lidt litteratur om emnet, og specielt om brugen af PCR til analyse af sekretindhold, har vi måttet nedprioritere begrænsninger for det anvendte litteraturs udgivelsesdato, og vi har således måtte medtage litteratur tilbage fra Generelt set omhandler størstedelen af dette projekt uafprøvede sammensætninger af utensiler, apparaturer og analysemetoder, og det har derfor ikke været muligt at inddrage relevant perspektiverende litteratur. Indsamling af prøvemateriale Den første uge i modul 14 udvælges og indsamles ekstra viskøse sekreter fra KMA s rutineprøver. Disse sekreter samles i pools på ca. 5 ml, som alle testes for CMV vha. KMA s aktuelle DNA-oprensningsmetode og TaqMan real-time PCR på ABI 7900 SDS. Alle negative pools samles og rystes sammen for at opnå et homogent men stadig repræsentativt prøvemateriale mht. viskositet og sammensætning i forhold til de udvalgte sekreter. Dette bliver delt ud i seks portioner af 20 ml sekret, der nedfryses indtil anvendelsestidspunktet (i denne mængde er der taget hensyn til evt. spild). Standardopløsning af dithiothreitol (DTT) Der anvendes en DTT koncentration på 4,2 %. Dvs mg DTT til 70 ml vand. Spiking af prøver med CMV Der laves 10-folds fortyndinger med 0,9 % NaCl ud fra 3 ml af en ampul med CMVstammen AD169. Til projektet anvendes fortyndinger af sekret spiket med CMV i koncentrationer på 10-2, 10-3 og 10-4 M, som alle blev frosset i portioner svarende til antallet af afprøvede forarbejdningsmetoder i projektet, dvs. 30 prøver pr. metoder og dermed 120 prøver i alt. Fremstilling af standardrække Ud fra 3 ml af en ampul med CMV-stammen AD169 oprenses 300 µl eluat, som fortyndes med 0,9 % NaCl i 10-folds fortyndinger. Til standardrækken anvendes koncentrationer på 15

17 0, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 og 10-6 M. Da standardrækken fremstilles ud fra oprenset DNA fra CMV-stammen opbevares denne på køl (ca. 8 C), da oprenset DNA ikke tåler nedfrysning på samme måde som CMV (hele vira). Fremgangsmåde (præ-analyse) I Tabel 1 nedenfor ses en oversigt over de forskellige trin, der udføres ved de udvalgte forarbejdningsmetoder. Indenfor hver metode udføres fem bestemmelser for hver koncentration af CMV ved tilsætning af hhv. 1 og 3 ml af det valgte opblandingsmiddel. Til alle metoder på nær vatpinden anvendes 0,5 ml sekret. Ved vatpind-metoden roteres i stedet en vatpind rundt i sekretet og overføres til et rør med hhv. 1 og 3 ml 5-prime vand. Resultatet er 30 prøver pr. metode og dermed indeholder projektet i alt 120 prøver. DNA koncentrationer og blandingsforhold er valgt på baggrund af diverse pilotforsøg udført i perioden op til PBP (Bilag 3). Tabel 1 viser en oversigt over forskellige trin ved de udvalgte forarbejdningsmetoder DNAkoncentration (M) Forarbejdningsmetode Blandingsforhold (prøvemateriale : opblandingsmiddel) Vortex Inkubation Vortex Antal Prøver Sonikering DTT PRIME-5 H 2 O : : :3 1:7 1:3 1:7 10 sek. 10 min. (sonikering) 10 sek sek sek Vatpind Vatpind i 1 og 3 ml 5-PRIME H 2 O 10 sek Tabel 1: Oversigt over forskellige trin ved de udvalgte forarbejdningsmetoder og antal af prøver. Der er fire metoder som hver testes med tre forskellige koncentrationer af CMV og disse testes ved opblanding med hhv. 1 og 3 ml. For hver test er der analyseret 5 prøver. Dette giver 120 prøver i alt. Alle metoder ud over sonikering er blevet oprenset og analyseret umiddelbart efter tilsætning af opblandingsmiddel. 16

18 Fremgangsmåde (analyse) I Figur 7 viser et flowdiagram over fremgangsmåden for projektets udførelse Figur 7 på næste side ses en illustration af fremgangsmåden for projektet. De 120 prøverør med prøve-materiale spiket med CMV i tre forskellige koncentrationer behandles med de 4 valgte forarbejdningsmetoder og oprenses herefter på MPC. De prøver, som succesfuldt gennemgår DNA-oprensning, sættes op til real-time PCR. Succesfulde DNA-oprensninger vil altså være de prøver, hvor maskinen ikke har meldt fejl i oprensningen pga. f.eks. sample clot. Til TaqMan real-time PCR analysen laves hver dag et nyt mastermix bestående af dntp er, buffer, forward- og reverseprimer, TaqMan prober og intern kontrol. I hver sin brønd på en MicroAmp Optical 96-well reaction plate afpipetteres nu 40 µl mastermix og 10 µl eluat fra prøverne. Desuden afpipetteres 40 µl mastermix i en ekstra brønd, som, pga. den manglende tilsætning af prøvemateriale fungerer som negativ kontrol. Normalt anvendes også en positiv kontrol ved hver PCR-kørsel, men i dette tilfælde anvendes standardrækkens fortynding på 10-4 M i stedet. Den indeholder en kendt koncentration af virus, som er tilsvarende afdelingens normalt anvendte positive CMV-kontrol, og standardrækken medtages som ovenfor nævnt på alle PCR-kørsler. Resultatbehandling Det noteres for hver metode hvor mange og hvilke prøver der bliver korrekt oprenset på MPC. Desuden noteres et gennemsnit af Ct-værdier af de fem bestemmelser for hver koncentration og for hvert blandingsforhold under hver metode. Resultaterne for DNAoprensning og real-time PCR for hver metode sammenholdes, og det vurderes hvilke(n) metode(r) der er bedst, dvs. hvilken metode der får flest succesfulde DNA-oprensning igennem MPC, og som samtidig ikke forringer prøvematerialets indhold af DNA. 17

19 Figur 7 viser et flowdiagram over fremgangsmåden for projektets udførelse Figur 7: Flowdiagram over fremgangsmåden for PBP 18

20 Materialer Mekanisk forarbejdning Sonikering VWR International ApS Ultrasonic Cleaning Devices (serie TH) Cleaning agent 5-prime vand 10 ml prøverør (Sarstedt LOT ) Engangs transferpipette (3,2 ml) Kemisk forarbejdning DTT Standardopløsning: - 1,4-Dithiothreitol fra Roche 10 g LOT ) - 5-prime vand - Vægt (Sartorius BL210S) - Plastik vejeskål - Finnpipette fra Thermo Labsystems 1-5 ml 19

21 - Finntip fra Thermo Labsystems (5 ml) - Veje spatel (Bochem 3540) - 50 ml Polypropylene Conical Tube 10 ml prøverør (Sarstedt LOT ) MS2 minishaker IKA Engangs transferpipette (3,2 ml) Standard forarbejdning 5-prime vand 5-prime vand Engangs transferpipette (3,2 ml) 5-prime vand med vatpind 5-prime vand Vatpinde fra Selefa Trade 10 ml prøverør (Sarstedt LOT ) Engangs transferpipette (3,2 ml) MS2 minishaker IKA MS2 minishaker IKA 10 ml prøverør (Sarstedt LOT ) 20

22 DNA-oprensning og PCR-analyse MagNa Pure Compact (Roche Diagnostics GmbH) MagNa Pure Compact Sample tubes 2,0 ml 7900 HT Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems ) MicroAmp TM Splash free 96-well base LOT MagNa Pure Compact Eluation tubes 2,0 ml MicroAmp Optical 96-well reaction plate LOT MagNa Pure Compact Eluation tube caps MicroAmp Optical adhesive film LOT MagNa Pure Compact Tip tray Thermo Scientific Finnpipette 1 10 μl LOT MagNa Pure Compact LOT MagNa Pure Compact Nucleic acid isolation kit I Thermo Scientific Finnpipette μl Thermo Scientific Finntip Filter 10 μl LOT Thermo Scientific Finntip Filter 100 μl Heraeus Sepatech Megafuge 1,0 21

23 Antal succesfulde DNA-oprensninger Resultater Herunder fremgår resultaterne fra det udførte projekt. Der er fremstillet tabeller og søjlediagrammer over forskellige værdier, som alle er fremkommet ved simpel optælling og i nogle tilfælde som udregning af gennemsnit på baggrund af 0 til 5 resultater af samme art. Desuden findes billeder fra databehandlingsprogrammet SDS 2.4, som anvendes i forbindelse med real time TaqMan PCR-analysen udført på ABI 7900HT. Rådata fra PCR-analysen kan findes i Bilag 4. DNA-oprensning på MagNa Pure Compact Figur 8 viser antallet af succesfulde DNA-oprensninger på MPC ud af 15 mulige for hvert opblandingsforhold indenfor hver forarbejdningsmetode. DNA-oprensning på MPC ml 3 ml Sonikering DTT 5-prime vand Vatpind Figur 8: Antal succesfulde DNA-oprensninger på MPC. 22

24 Antal cyklusser (Ct-værdier) Real time TaqMan PCR-analyse på ABI 7900HT Cytomegalovirus (CMV) Gennemsnittene som de følgende tre diagrammer er lavet ud fra, kan stamme fra 0 til 5 målinger, afhængig af hvor mange prøver der har gennemgået succesfuld oprensning på MPC og fået en målbar Ct-værdi ved PCR-analyse. (De tilgrundliggende værdier for gennemsnittene kan ses i Bilag 5) Figur 9 viser gennemsnitlige Ct-værdier af CMV for hver forarbejdningsmetode og for hver koncentration ved opblanding med 1 ml. PCR - CMV - 1 ml ,9 38,7 35,8 36,9 38,2 34,2 31,0 Sonikering DTT 5-prime vand Vatpind 10(-2) 10(-3) 10(-4) Figur 9: Gennemsnitlige Ct-værdier for CMV fra de fire forarbejdningsmetoder opblandet med 1 ml. 23

25 Antal cyklusser (Ct-værdier) Antal cyklusser (Ct-værdier) Figur 10 viser gennemsnitlige Ct-værdier af CMV for hver forarbejdningsmetode og for hver koncentration ved opblanding med 3 ml. PCR - CMV - 3 ml ,1 36,6 36,4 33,7 33,3 34,2 37,4 33,8 31,0 10(-2) 10(-3) 10(-4) Sonikering DTT 5-prime vand Vatpind Figur 10: Gennemsnitlige Ct-værdier for CMV fra de fire forarbejdningsmetoder opblandet med 3 ml. Figur 11 viser en samlet oversigt over gennemsnitlige Ct-værdier af CMV for hver forarbejdningsmetode opblandet med hhv. 1 og 3 ml PCR - CMV (1 og 3 ml) 38,7 37,9 36,6 38,1 38,2 36,9 35,8 36,4 37,4 33,7 33,3 34,2 34,2 33,8 31,0 31,0 Sonikering DTT 5-prime vand Vatpind 1 ml 10(-2) 3 ml 10(-2) 1 ml 10(-3) 3 ml 10(-3) 1 ml 10(-4) 3 ml 10(-4) Figur 11: Samlet oversigt over gennemsnitlige Ct-værdier for CMV fra de fire forarbejdningsmetoder opblandet med hhv. 1 og 3 ml. 24

26 Antal cyklusser (Ct-værdier) Antal cyklusser (Ct-værdier) Intern kontrol (INTC) Figur 12 viser gennemsnitlige Ct-værdier af INTC for hver forarbejdningsmetode og for hver koncentration ved opblanding med 1 ml. PCR - INTC - 1 ml ,2 35, ,7 36,8 34,8 35,7 37,4 31,831,331, (-2) 10(-3) 10(-4) Sonikering DTT 5-prime vand Vatpind Figur 12: Gennemsnitlige Ct-værdier for INTC fra de fire forarbejdningsmetoder opblandet med 1 ml. Figur 13 viser gennemsnitlige Ct-værdier af INTC for hver forarbejdningsmetode og for hver koncentration ved opblanding med 3 ml. PCR - INTC - 3 ml ,3 35,9 36,0 33,6 34,0 34,4 34,4 32, ,629,7 29, (-2) 10(-3) 10(-4) Sonikering DTT 5-prime vand Vatpind Figur 13: Gennemsnitlige Ct-værdier for INTC fra de fire forarbejdningsmetoder opblandet med 3 ml. 25

27 Standardkurver Tabel 2 viser Ct-værdier for CMV målt på projektets tre standardkurver og en udregnet differens mellem første og sidste standardkurve. Derudover den gennemsnitlige stigning i Ct-værdier pr 10-foldsfortynding indenfor hver standardrække. Koncentration: (mol/l) Gns. stigning Dag 1* U 16,8 20,1 23,8 27,5 31,3 34,7 3,6 Dag 3 U 16,4 20,1 24,7 29,0 34,3 U 4,5 Dag 4 U 16,4 20,1 25,4 29,9 34,8 U 4,6 Difference: (mandag torsdag) U -0,4 0 1,6 2,4 3,5 -- Tabel 2: Difference mellem standardrækkernes Ct-værdier for CMV. (U = Undetermined Ct-value) * Ct-værdier for 1. dags standardkurve bygger på et gennemsnit af dobbeltbestemmelser for hver fortynding (værdierne for disse dobbeltbestemmelser kan ses i Bilag 4 og udregninger af gennemsnit kan ses i Bilag 6) Tabel 3 viser Ct-værdier for INTC målt på projektets tre standardkurver Koncentration: (mol/l) Dag 1* 29,1 U U U 28,8 29,0 28,5 Dag 3 29,2 U U 29,2 29,0 29,0 28,4 Dag 4 28,4 U U 28,8 28,1 29,0 28,6 Tabel 3: Ct-værdier for standardrækkernes INTC. * Ct-værdier for 1. dags standardkurve bygger på et gennemsnit af dobbeltbestemmelser for hver fortynding (værdierne for disse dobbeltbestemmelser kan ses i Bilag 4) 26

28 Nedenstående amplifikationsplots stammer fra databehandlingsprogrammet SDS 2.4. Figur 14 viser et amplifikationsplot over 1. dags standardkurve Figur 14: Amplifikationsplot over CMV for en standardkurve med dobbeltbestemmelser (dag 1). 27

29 Figur 15 viser et amplifikationsplot over målinger af INTC for sonikering med CMVkoncentration på 10-3 Figur 15: Eksempel på amplifikationsplot over INTC for sonikering med CMV-konc. på Grøn = 1 ml, Blå = 3 ml. 28

30 Diskussion Formålet med dette projekt var at afprøve forskellige forarbejdningsmetoder til at opløse og homogenisere specielt viskøse sekreter med henblik på optimering af DNA-oprensning på MPC og efterfølgende real time PCR på ABI 7900HT. KMA s aktuelle forarbejdningsmetode repræsenteres ved forarbejdningsmetoden, hvor der anvendes hhv. 1 og 3 ml 5- prime vand til opløsning af sekret. Det er altså ønsket med dette projekt at vurdere, om en eller flere af de 3 andre afprøvede forarbejdningsmetoder er den aktuelle metode overlegen. Dette vil blive belyst i det følgende ved at vurdere de afprøvede forarbejdningsmetoders evne til at opløse og homogenisere viskøse sekreter samt forarbejdningsmetodernes evne til at bevare indhold af virus-dna i sekretet. Desuden vil selve opbygningen og validiteten af projektet blive diskuteret i forhold til de anvendte standardkurver og andre kvalitetssikringsprocedurer, ligesom fejlkilder og deres eventuelle indvirkning på projektet vil blive belyst. Forarbejdningsmetodernes evne til at opløse og homogenisere sekret I dette afsnit vurderes forarbejdningsmetodernes evne til at opløse og homogenisere prøvemateriale i kraft af antallet af succesfulde DNA-oprensninger på MPC. På Figur 8 i resultatafsnittet ses et diagram med antallet af DNA-oprensninger for hver forarbejdningsmetode ved opblanding med hhv. 1 og 3 ml, som vil blive diskuteret nedenfor. For hver metode var der to opblandingsforhold og indenfor disse tre forskellige koncentrationer. Af hver af disse muligheder blev der oprenset 5 prøver, hvilket giver et højst muligt antal af succesfulde oprensninger på 30 for hver metode; 15 ved hvert opblandingsforhold. I denne del af analysen skulle koncentrationen af virus ikke spille nogen rolle, og der ses derfor udelukkende på antallet af succesfulde oprensninger metoderne imellem og fra det ene opblandingsforhold til det andet. Dvs. at selve slutresultatet af DNA-oprensningerne ikke tages med i denne del af vurderingen. Kun prøvernes fysiske konsistens og homogenitet er udslagsgivende for, om DNA-oprensning på MPC kan forløbe uden fejl som f.eks. sample clots. 29

31 Figur 8 Ud fra Figur 8 kan man tydeligt se, at to forarbejdningsmetoder er bedre end de resterende to. Dette ses specielt, hvis man kigger på det samlede antal succesfulde oprensninger pr metode, hvor DTT med 29 og vatpind med 30 ligger klart i spidsen foran sonikering med 23 og 5-prime vand med 22. Desuden bør det bemærkes, at 5-prime vand, som er den aktuelle metode på KMA, Skejby, er den dårligste af alle 4 afprøvede metoder. Ser man på forarbejdningsmetodernes individuelle forskelle fra opblanding med 1 ml til 3 ml, er der også her størst forskel at observere ved sonikering og 5-prime vand. Her ses en tydelig forskel fra 1 ml, hvor begge metoder har 8 succesfulde oprensninger, til 3 ml hvor de to metoder har hhv. 15 og 14 succesfulde oprensninger. Generelt set observeres det, at alle metoder har 14 eller 15 succesfulde oprensninger ud af 15 mulige ved opblanding med 3 ml, hvilket altså tyder på, at opblanding med tilstrækkelig væske vil sikre succesfulde oprensninger, lige meget hvilken af de afprøvede væsker, der er tale om. Dette må desuden være grunden til, at metoden med vatpind præsterer godt, også ved opblanding med kun 1 ml, da dette opblandingsforhold er større end ved 1 ml for metoden med 5-prime vand. Det skyldes, at man ved alle andre metoder end vatpinden anvender 0,5 ml sekret til opblanding med hhv. 1 og 3 ml opblandingsvæske, mens man ved metoden med vatpind kun anvender den mængde sekret, som følger med ved overførsel af vatpinden fra sekret til 1 eller 3 ml opblandingsvæske. Dermed svarer denne fortynding ikke til de andre, og har derfor større chancer for at gennemgå succesfuld oprensning. Fra slutningen om at succesfulde oprensninger kan opnås ved tilstrækkelig mængde af opblandingsvæske, har den videre undren så lydt på, hvilken eventuel indflydelse denne fortynding af prøven kan have for detektionen af prøvens indhold? Dette vil blive belyst i efterfølgende afsnit om forarbejdningsmetodernes evne til at bevare detekterbart indhold af virus-dna i sekret. Ud fra Figur 8 tyder det altså på, at forarbejdningsmetoden med brug af vatpind er bedst i forhold til DNA-oprensning på MPC, men ser man på tallene for DTT, vil man bemærke, at der kun er en enkelt succesfuld oprensning til forskel mellem de to metoder. Bemærkelsesværdigt er det desuden, at denne ene fejlede DNA-oprensning ved DTT finder sted ved opblanding med 3 ml mens ingen er fejlede ved opblanding med 1 ml. Dette strider mod de andre resultater i projektet, da det er usædvanligt at se flere 30

32 succesfulde oprensninger ved 1 ml end ved 3, og man kan derfor stille spørgsmålstegn ved, om det er et pålideligt resultat eller måske rettere et udtryk for en tilfældighed i form af en klump i sekretet, pipetteringsfejl i MPC eller noget lignende? Man kan opstille samme hypotese i vurderingen af de to dårligste forarbejdningsmetoder til DNA-oprensning på MPC. Forskellen mellem sonikering og 5-prime vand er nemlig også blot en enkelt fejlet oprensning mere ved 5-prime vand end ved sonikering. Her er der dog ikke noget, der tyder på, at resultatet af antal succesfulde oprensninger ikke skulle være reelt, men der vil rent statistisk set være lige så stor mulighed for, at denne ene fejlede oprensning ved 5-prime vand med 3 ml er et udtryk for en fejl eller tilfældighed, som den ovenfor nævnte. Med det in mente tyder det dog på, at sonikering kan have spillet en lille rolle i forhold til opløsning af sekretet, da de 10 min i sonikeringbadet er det eneste, der adskiller forarbejdningsmetoderne sonikering og 5-prime vand fra hinanden. Vender vi tilbage til sammenligningen mellem forarbejdningsmetoden med vatpind og DTT, kan man argumentere for, at DTT faktisk er et lige så effektivt opløsningsmiddel som 5-prime vand, hvis ikke bedre, da det kan opløse sekretet ved mindre blandingsforhold end 5-prime vand. Det, at man anvender en vatpind til at overføre sekret, medfører som nævnt et meget større blandingsforhold end ved de andre metoder, og hvis man kun sammenligner de tre metoder med samme opblandingsforhold må DTT ses som en klar favorit. Jævnfør det højere antal succesfulde oprensninger ved opblanding med 1 ml ved DTT frem for 5-prime vand og sonikering på Figur 8. Fejlkilder angående DNA-oprensning på MPC Præanalytisk kan der være forskellige fejlkilder, som kan have betydning for prøvernes forløb på MPC. Bl.a. kan afmåling af 0,5 ml sekret være vanskelig, når der er tale om specielt viskøse sekreter, som var interessante for dette projekt. Derudover er alle skridt, lige fra opsamling og spikening af sekret til opblanding med de forskellige forarbejdningsmetoders opblandingsvæske, udført af bioanalytikerstuderende og dermed altid udsatte for mulige menneskelige fejl, som ikke bliver opdaget og udbedret med det samme. Erfaring fra tidligere udførte pilotforsøg og dobbelttjekning af de fleste arbejdsprocedurer skulle dog holde denne form for fejl på et minimum, og der blev da heller ikke opdaget nogen fejl under eller efter forsøget, som kunne have betydning for de opnåede resultater fra DNA-oprensning på MPC. 31

33 Den mest betydningsfulde fejlkilde for denne del af projektet, må derimod være den ringe homogenitet, som ses ved luftvejssekreter af den slags, der blev anvendt i projektet. Selvom det samlede prøvemateriale forsøgtes nogenlunde homogeniseret vha. sammenrystning, vil der stadig være klumper i sekretet, for ikke at tale om diverse udefrakommende elementer, som vil kunne have haft betydning for DNA-oprensningen på MPC, da denne forudsætter opsugning af sekretet i tynde pipettespidser. (4) Forarbejdningsmetodernes evne til at bevare detekterbart CMV-DNA i sekret I dette afsnit vurderes de forskellige forarbejdningsmetoders evne til at bevare indhold af detekterbart virus-dna i prøverne. For at vurdere dette er eluater fra alle succesfulde DNA-oprensninger på MPC blevet analyseret vha. real-time TaqMan PCR på afdelingens ABI 7900HT. Resultaterne af samtlige PCR-kørsler er samlet i passende diagrammer (figur 9 11) i resultatafsnittet, som illustrerer det målte indhold af CMV i prøverne udtrykt vha. Ct-værdier. Disse figurer vil her blive diskuteret med henblik på at finde en eller flere forarbejdningsmetoder, som resulterer i lave Ct-værdier og dermed store mængder af detekterbart CMV i prøverne. Diagrammernes Ct-værdier stammer fra et udregnet gennemsnit af 0 til 5 målinger, afhængig af hvor mange prøver ud af 5 mulige af hver art, der gennemgik succesfuld DNA-oprensning og dermed gik videre til PCRanalysen. Antallet af resultater, som gennemsnittene er beregnet ud fra, afhænger desuden af resultaterne fra selve PCR-analysen. Ikke alle prøver resulterede i en målbar Ct-værdi og betegnes i stedet undetermined. Et skema over prøveresultaterne fra PCR-analysen, og dermed hvor mange resultater de enkelte gennemsnit bygger på, kan ses i Bilag 5. Figur 9 På Figur 9 ses gennemsnit af Ct-værdier fra de forskellige metoder og de forskellige koncentrationers 5 mulige prøver. Her ved opblanding med 1 ml af det valgte opblandingsmiddel. De søjler, som ikke er påført værdier, er ubestemte pga. få succesfulde oprensninger og/eller PCR-resultater af typen undertermined. Ved sonikering og 5-prime vand er det kun lykkedes at få Ct-værdier fra prøverne med den højeste CMV-koncentration på Det var de samme to metoder, som havde færrest succesfulde oprensninger på MPC, og dermed har de også haft færre muligheder for at få 32

34 detekterbare Ct-værdier, men at Ct-værdierne stiger, og i nogle tilfælde slet ikke bliver detekteret, jo svagere CMV-koncetrationer man kommer ud i, er naturligvis forventeligt. DTT har fået detekterbare værdier ved CMV-koncentrationen på 10-3, men den eneste af metoderne, der har fået målbare Ct-værdier ved alle tre CMV-koncentrationer, er vatpinden. Sammenligner man de forskellige metoder indbyrdes ses desuden lavere Ctværdier ved alle tre CMV-koncentrationer for metoden med vatpind i forhold til de andre metoder. Det viser klart af den større fortynding af sekretet har en betydning, ikke bare for DNA-oprensningen men også for PCR-analysen. Holder denne hypotese, vil vi se lavere Ct-værdier på Figur 10, som vil blive diskuteret herunder. Figur 10 På Figur 10 ses gennemsnit af Ct-værdier fra de forskellige metoder og de forskellige koncentrationers 5 mulige prøver. Her ved opblanding med 3 ml af det valgte opblandingsmiddel. Det observeres, at der her er færre søjler, hvor det ikke har været muligt at detektere Ct-værdier, som bekræfter den overfornævnte hypotese om at yderligere fortynding vil resultere i flere detekterede Ct-værdier. For at illustrere dette er der desuden fremstillet et diagram indeholdende Ct-værdier for de forskellige metoder både ved omblanding med 1 ml og 3 ml. Dette diagram ses på Figur 11. På Figur 10 ser vi, at metoden med vatpind endnu engang skiller sig ud ved lavere og flere detekterede Ct-værdier. Altså er et fortyndingsforhold på 1:7, som de tre resterende metoder anvender, ikke et udtryk for den maksimale fortynding af sekretet, som stadig medfører målbare mængder af CMV. Metoden med vatpind ligger altså som favorit både på baggrund af DNA-oprensning og PCR-analyse. Ser man derimod på DTT, som lå lige i hælene på vatpinden efter DNAoprensning og også på en klar 2. plads ved PCR-analysen ved opblanding med 1 ml, ser man her ved opblanding med 3 ml, at forskellen mellem DTT, sonikering og 5-prime vand er betydelig mindre. Det er faktisk næsten ikke længere muligt at differentiere mellem disse tre metoders evne til at bevare indholdet af detekterbart CMV-DNA i det viskøse sekret. 33

35 Figur 11 Figur 11 illustrerer alle de gennemsnitlige Ct-værdier og dermed sammenhængen mellem et større opblandingsforhold og lavere Ct-værdier. Dette er tilfældet for alle metoder og ved alle CMV-koncentrationer, også for metoden med vatpind, som allerede ved opblanding i 1 ml repræsenterer et større opblandingsforhold end de resterende metoder i projektet pga. den mindre mængde sekret. Fejlkilder angående real-time PCR-analysen: Resultatet af de afprøvede forarbejdningsmetoder viser som før nævnt, at jo mere sekretet fortyndes, jo lavere Ct-værdier opnås. Det kan tyde på, at der sker en hæmning eller forstyrrelse af PCR-analysen, som skyldes indholdet af sekretet. Hvad det kan være af egenskaber ved sekretet, eller i indholdet af sekretet, som hæmmer PCR-analysen, har det desværre ikke været muligt at undersøge videre. Luftvejssekreter indeholder en række forskellige mikroorganismer og urenheder, som vil kunne forårsage denne hæmning, og desuden vil der være mulighed for, at nogle patienter allerede vil have påbegyndt antibiotikabehandling på prøvetagningstidspunktet. Dermed er det sandsynligt, at den indsamlede pool af sekret indeholder rester af medicin, som vil kunne forstyrre PCRanalysen. Også biofilm og andre inhiberende stoffer som madrester eller ganske normal svælgflora kan være problematiske i forbindelse med den essentielle DNA-oprensning af luftvejssekreter. (1) Den hæmning af PCR-analysen, som finder sted ved næsten alle de analyserede prøver i dette projekt, ses specielt på Ct-værdierne af de interne kontroller (INTC), som detekteres samtidig med CMV i samtlige brønde ved PCR-analyserne. Ser man på figurerne 12 og 13, som viser gennemsnitlige Ct-værdier for INTC målt på de forskellige prøver indeholdende sekret, ligger værdierne fra 29,6-37,4, hvilket er noget højere end værdierne fra INTC målt på standardkurves fortyndinger, hvor der ikke er tilført sekret. Disse værdier ligger mellem 28,1 og 29,2 som det kan ses i Tabel 3. På Figur 15 ser vi desuden et eksempel på, at den interne kontrol detekteres tidligere ved opblanding med 3 ml end ved opblanding med 1 ml. Dette viser igen, at fortynding af sekretet og dermed fortynding af hæmstoffet resulterer i lavere Ct-værdier. Hermed 34

36 bekræftes en hæmning af PCR-analysen, samt at denne hæmning stammer fra enten sekret eller 5-prime vand, som er de to gennemgående substanser ved alle prøver i projektet. En anden kilde til varierende DNA-udbytte fra dette projekt til andre lignende forsøg studeret i litteraturen kan være inkubationstiderne eller rettere manglen på samme. I andre forsøg (1) (11), er der anvendt inkubationstider fra 15 min til 2 timer efter tilførslen af DTT. I artiklen af A. Pye et al (11) nævnes et tidligere forsøg af Hammerschlag et al, som viser at DTT har haft en hæmmende virkning på væksten af visse bakterier ved efterfølgende dyrkning. Dette har ikke været resultatet af A. Pye s forsøg, og han foreslår, at Hammerschlag s inkubationstider på 2 timer i forhold til A. Pye s på 15 min kan være det udslagsgivende, da DTT ved så lang inkubationstid kan have medført uoprettelige skader på de undersøgte organismer. Delkonklusion Forarbejdningsmetoderne med vatpind og DTT har altså klaret sig bedst med hensyn til opløsning og homogenisering af sekretet med hhv. 30 og 29 succesfulde DNAoprensninger ud af 30 mulige. Herefter følger sonikering med 23 og referencemetoden 5- prime vand med 22 succesfulde DNA-oprensninger. For udbytte af detekterbart CMV- DNA i sekret er favoritten igen vatpindmetoden med detekterbare Ct-værdier for alle tre CMV-koncentration og for begge opblandingsforhold. Dernæst kommer igen DTT som har fået detekterbare Ct-værdier ved begge opblandingsforhold ved de to højeste CMVkoncentrationer. Ct-værdierne for DTT er også en anelse lavere for prøverne ved den højeste CMV-koncentration end dem fra Sonikering og 5-prime vand, som kun har fået detekterbare Ct-værdier ved begge opblandingsforhold ved højeste CMV-koncentration og ved opblanding med 3 ml ved næsthøjeste CMV-koncentration. Alt dette kan ses på Figur 11, som viser de samlede gennemsnitlige Ct-værdier for hele projektet. Vi kan altså konkludere, at forarbejdningsmetoden med vatpind har præsteret bedre end de andre metoder i dette projekt, hvis man udelukkende ser på resultaterne, men der er naturligvis mange forhold, som er afgørende for, hvilken metode der er bedst og mest effektiv med henblik på en evt. indførelse på en mikrobiologisk afdeling. Man kan bl.a. se på mængden af anvendt opblandingsmiddel, ved at sammenligne forarbejdningsmetoden 35

37 med vatpind med projektets runner-up DTT. Effektivitetsmæssigt er DTT faktisk bedre til at opløse og homogenisere sekret. Det ses ved at kigge på Figur 8, som viser at DTT som den eneste metode har 15 succesfulde DNA-oprensninger ud af 15 mulige ved et blandingsforhold på 1:3 altså 0,5 ml sekret til 1 ml DTT. Vatpindmetoden har også 15 succesfulde DNA-oprensninger ved opblanding i 1 ml, men på grund af den mindre mængde af overført sekret, er blandingsforholdet noget større, måske omtrentligt svarende til 1:7 eller 1:8 hvor referencemetoden jo faktisk også præsterer 14 ud af 15 mulige succesfulde DNA-oprensninger. Der findes altså en række forhold ved dette projekt, som kan have indflydelse på de umiddelbare resultater, hvoraf nogle af disse vil bliver belyst i det følgende. Kvalitetssikring I dette afsnit vil der blive sat fokus på selve kvalitetssikringen af den del af projektet, som omhandler real-time TaqMan PCR-analysen på ABI 7900HT. Sammenligning af resultater fra de forskellige PCR-kørsler blev gjort muligt ved, at der for hver PCR-kørsel blev medtaget en standardrække bestående af oprenset CMV-DNA i 10-folds fortyndinger opblandet med 0,9 % NaCl. Ct-værdien for den fortynding med en CMV-DNAkoncentration på 10-2 blev således anvendt som reference for indstilling af Ct på alle PCRkørsler. Fremstilling og resultater af disse standardkurver og deres betydning for projektets troværdighed vil sammen med PCR-analysens interne kontrol blive behandlet i dette afsnit. Standardkurver Standardkurverne er som tidligere nævnt 10-folds fortyndinger af CMV-DNA fra 10-1 til 10-6 mol/l. Med en sådan fortynding, vil Ct-værdierne teoretisk set skulle stige med 3,3 mellem hver fortynding (9). Ud fra resultaterne i Tabel 2, kan vi se at den gennemsnitlige stigning i Ct-værdier for 1. dags standardrække er en lille smule højere, nemlig på 3,6, men tager man højde for de menneskelige og apparaturmæssige usikkerheder, der kan være ved fremstillingen af sådanne fortyndinger, må dette antages at være acceptabelt. På amplifikationsplottet i Figur 14, ses resultatet af 1. dags standardrække, og man ser tydeligt, at fortyndingernes Ct-værdier falder jævnt. 36