Faktor V Leiden mutation

Transkript

1 Faktor V Leiden mutation Formål: finde ud af om individ har mutation i faktor V Leiden gen (missense: arginin glutamin) Materiale: oprens DNA fra leukocytter Metode: PCR med specifikke primere, oprens, enkeltbase forlængelse (SB) med biotin mærket primer og DIG d-ctp eller DIG d-utp Binding af Biotin til streptavidin beklædte brønde LISA med peroxidase konjugeret antistof mod DIG, bortskyl ubundet antistof, tilsæt peroxidase, aflæs farvet produkt dannelse fotometrisk (LISA reader) Kun DIG d-ctp signal: homozygot normal, kun DIG d- UTP signal: homozygot syg (trombose risiko), begge: heterozygot syg kako@viauc.dk

2 Metoden til Faktor V Leiden mutationsanalyse Homozygot normal: 37, 49, 163 bp fragmenter Gamle : RFLP analyse med Mn1 Heterozygot: Opformer exon 10 med PCR primere: APC-1 og APC-5 Homozygot muteret: Oprens for primere og nukleotider (QIAquick nukleotid fjernelses kit) Minisekventering med PCR G/A 5 5 (biotin bundet) grønfarve DIGd-CTP eller DIGd-UTP (2 rør)

3 Spørgsmål: Vil en blive forlænget med dctp eller dutp Oprenset - PCR opformeret DNA: 5?AGGAATACAGGTATT TCCTTATGTCCATAA 5 - biotin

4 Homozygot G/G Begge alleler har G PCR reaktion med, PCR buffer Detektionsprimer og Dig-dUTP Dig-dUTP TCCTTATGTCCATAA 5 - biotin TCCTTATGTCCATAA 5 - biotin Dig-dUTP Ingen baseparring mellem G og U, så DigdUTP bliver ikke sat på af n!

5 Homozygot G/G Begge alleler har G PCR reaktion med, PCR buffer Detektionsprimer og Dig-dCTP Dig-dCTP TCCTTATGTCCATAA 5 - biotin TCCTTATGTCCATAA 5 - biotin Dig-dCTP Baseparring mellem G og C, så Dig-dCTP bliver sat på af n!

6 Homozygot G/G Tegnforklaring: Detektionsprimer: DIGd-CTP eller DIGd-UTP: : 5 (biotin bundet) Reaktion med Dig-UTP Uden peroxidase ingen grøn farve Reaktion med Dig-dCTP grønfarve Ingen binding af

7 Homozygot A/A Begge alleler Har A PCR reaktion med, PCR buffer Detektionsprimer og Dig-dUTP Dig-dUTP TCCTTATGTCCATAA 5 - biotin TCCTTATGTCCATAA 5 - biotin Dig-dUTP Baseparring mellem A og U, så Dig-dUTP bliver sat på af n!

8 Homozygot A/A Begge alleler Har A PCR reaktion med, PCR buffer Detektionsprimer og Dig-dCTP Dig-dCTP TCCTTATGTCCATAA 5 - biotin TCCTTATGTCCATAA 5 - biotin Dig-dCTP Ingen baseparring mellem A og C, så DigdCTP bliver ikke sat på af n!

9 Homozygot A/A Tegnforklaring: Detektionsprimer: DIGd-CTP eller DIGd-UTP: : 5 (biotin bundet) Reaktion med Dig-UTP Reaktion med Dig-dCTP grønfarve Uden peroxidase ingen grøn farve Ingen binding af

10 Heterozygot G/A PCR reaktion med, PCR buffer Detektionsprimer og Dig-dCTP Dig-dCTP TCCTTATGTCCATAA 5 - biotin TCCTTATGTCCATAA 5 - biotin Dig-dCTP Baseparring mellem G og C, så Dig-dCTP bliver sat på af n! Ingen baseparring mellem A og C, så DigdCTP bliver ikke sat på af n!

11 Heterozygot G/A PCR reaktion med, PCR buffer Detektionsprimer og Dig-dUTP Dig-dUTP TCCTTATGTCCATAA 5 - biotin TCCTTATGTCCATAA 5 - biotin Dig-dUTP Baseparring mellem A og U, så Dig-dUTP bliver sat på af n! Ingen baseparring mellem G og U, så DigdUTP bliver ikke sat på af n!

12 Heterozygot G/A Tegnforklaring: Detektionsprimer: DIGd-CTP eller DIGd-UTP: : 5 (biotin bundet) Reaktion med Dig-UTP Reaktion med Dig-dCTP grønfarve grønfarve