Opgavens omfang: anslag. Klinisk Diagnostisk Afdeling, Patologi, Finsensgade 35, 6700 Esbjerg. Vejledere: Liselotte Olesen og Inge Marie Bayer

Transkript

1 Optimering af immunhistokemisk metode til diagnosticering af maligne melanomer ved brug af antistofferne Mel A og HMB45. Optimization of immunohistochemical method for the diagnosis of malignant melanoma using the antibodies Mel A and HMB45. Opgavens omfang: anslag Klinisk Diagnostisk Afdeling, Patologi, Finsensgade 35, 6700 Esbjerg Vejledere: Liselotte Olesen og Inge Marie Bayer Marianne Worm Hovgaard - BA13S014 UC Syddanmark, Degnevej 16, 6705 Esbjerg Ø

2 Indhold Forord... 1 Abstrakt... 1 Baggrund... 1 Formål... 1 Metode... 2 Resultater... 2 Konklusion... 2 Introduktion... 2 Problembaggrund... 2 Formål... 4 Problemformulering... 4 Teori... 5 Cutis... 5 Melanin, melanocytter og melanosomer... 6 Fiksering... 7 Antigener og antistoffer... 8 Afblegning... 8 Immunhistokemisk analyse med analyseprincip... 9 Kernefarvestoffer Hæmatoxylin-Eosin farvemetode Kvalitetssikring Materialer og metoder: Design Metode Fremstilling af reagenser til pilotprojekt og projekt: Pilotprojekter: VBU Projekt: Materialer Etik Litteratursøgning... 37

3 Databearbejdning Resultater Diskussion Forventninger Intern validering Pilotprojekt 1 og Pilotprojekt Pilotprojekt Projektet Fejlkilder Ekstern validering Konklusion Perspektivering Referenceliste: Bilag... 74

4 Forord Jeg vil gerne takke Klinisk Diagnostisk Afdeling (KDA) i Esbjerg for at få mulighed for at udføre mit bachelorprojektet hos dem, samt takke Liselotte Olesen og Inge Marie Bayer for vejledning og hjælp i forbindelse med projektet. En særlig tak til Bente Dammark Kristensen for hjælp til udstansning, indstøbning samt mikrotomering af væv til bachelorprojektet. Tak til det øvrige personale på afdelingen for hjælp og interesse i vores projekt. En tak til patolog Niels Korsgaard for medvirken til frigivelse af patientmateriale og tak til sekretær Lisbeth Sørensen for hjælp til at fremskaffe data, så vi kunne udvælge patientprøver til projektet, samt hjælp ved betjening af apparaturet Hamahatsu Nano Zoomer 2,0 HT, der blev brugt til indscanning af færdige resultater. Tak til mine medstuderende på projektet Meral Kiyak og Mia S. Andersen for godt samarbejde. Tak til min søster Diana Worm for korrekturlæsning. Abstrakt Baggrund Ved diagnosticering af Maligne Melanomer (MM) kan melanin interferere i billedet med den immunhistokemiske (IHC) reaktion. Der benyttes på flere laboratorier Ventana Benshmark Ultra (VBU) apparatur til detektion af MM med antistofferne Anti-MART-1 (Mel A) og Anti- Melanosome (HMB45) samt detektionskittet UltraView Universal Alkalisk Phosphatase Red Detection Kit (UltraView). Der observeres uspecifik baggrundsfarvning i bindevævet i de færdig analyserede præparater, og dette gør analysen uspecifik. Formål Vi ønsker at undersøge, om vi kan finde et alternativ, til metoden hvor kvaliteten af analysen forbedres. Kan metoden forbedres ved at udskifte detektionskittet UltraView med OptiView DAB IHC Detection (OptiView DAB), og kan metalkompleksfarvestoffet hæmatoxylin erstattes med 1

5 kationfarvestoffet Azur B? Er det muligt at afblege melanin og efterfølgende bruge detektionskittet OptiView DAB og derved få en bedre kvalitet af analysen? Metode Der blev udført pilotprojekter, hvor hensigten var at undersøgt ved hvilken ph og inkubationstid, hvor Azur B virker optimal, samt afprøvning af kontrastfarvning af melanin med Azur B. Der blev undersøgt 10 patientprøver, der alle var diagnosticeret med MM og med et varierende indhold af melanin. Der blev udført IHC analyser, hvor kernefarvestoffet hæmatoxylin blev udskiftet med Azur B og detektionssystemet blev udskiftet med OptiView DAB. Der blev udført afblegning af melanin med 10%-opløsning af H2O2 inden IHC- analyse med OptiView DAB. Alle analyser blev udført på VBU. Afblegning og kontrastfarvning med Azur B blev udført manuelt. Resultater Resultat af afblegning med den efterfølgende IHC analyse viser sig at fungere udmærket, og er et godt alternativ til den nuværende metode til diagnosticering af MM. Kernefarvestoffet Azur B virker på farvning af melanin, således melanin ses blågrønt i forhold til den brune reaktionsudfældning fra Optiview DAB. Resultatet af denne metode er dog ikke overbevisende. Konklusion Det bedste resultat viser sig at være afblegning af melanin med en 10% H2O2-opløsning, der er fortyndet i ionbyttet vand. Melanin afbleges helt efter 40 min i vandbad ved 65ºC. Analysen er mere specifik end den nuværende, og kan med fordel indføres i rutinen, dog udløser det en ekstra analysetid på ca. 1 time. Resultat med kontrastfarvning med Azur B, viser ikke et entydigt resultat, men der ses en blågrøn farvning af melanin i nogle prøver. Det vil være tilrådeligt, at få udført yderligere analyser såfremt denne metode ønskes indført i rutinen. Introduktion Problembaggrund Der er på KDA i Esbjerg observeret, at der ved brug af detektionskittet UltraView til brug på VBU, der benyttes til IHC - analyser for HMB45 og Mel A til diagnosticering af MM, viser sig en uspecifik farvning i bindevævet i de færdige præparater. Der er således en svaghed ved kvaliteten af det færdige præparat, som jo gerne skulle vise det specifikke område, hvor det maligne melanom detekteres. Der ses ikke et problem, de første tre måneder, hvor kittet er åbnet, men efterfølgende 2

6 ses den uspecifikke farvning af bindevævet. UltraView benyttes til detektion ved analyserne, da det er nemt at skelne melanin pigmentet, som er brunt, fra den røde udfældning af IHC- reaktionen, og derfor interfererer melaninen ikke, når der skal stilles en diagnose. Metoden er derfor ikke optimal til diagnosticering, når kittet er over de 3 måneder. Vi ønsker derfor at undersøge, om der kan findes alternativer til metoden. Detektionssystemet OptiView DAB benyttes til ca. 80% af alle IHC - analyser på KDA. Grunden til at detektionssystemet ikke benyttes til analyserne for HMB45 og Mel A er, at visualiseringen af reaktionsproduktet er brunt, og det er derfor umuligt at differentiere mellem reaktionsproduktet fra IHC- reaktionen og melanin i vævet, som også er brunt. Derfor er det interessant, at undersøge om vores projekt med en modificeret udgave med OptiView DAB kan visualisere et resultat, hvor der tydeligt kan ses forskel på melanin og reaktionsproduktet. Vi vil forsøge med at afblege melanin inden IHC-analyse samt kontrastfarve melanin med Azur B. Vi er blevet inspireret til disse undersøgelser via en videnskabelig artikel.(1) Vi vil udføre pilotprojekterne inden selve projektet. Disse resultater vil vi overføre til projektet, hvor også IHC- analysen indgår. Pilotprojekter drejer sig om, at finde den optimale ph og inkubationstid for Azur B til farvning af melanin og kerner, samt at finde det rette afblegningsmedie og inkubationstid. Vigtigt er også, at der ikke ændres markant på svartiden ved at analysen modificeres, da tidsrammen for svar tider stadig skal kunne overholdes.(2) Vores håb er, at vi med vores projekt kan være behjælpelige med en løsning til KDA, som KDA kan benytte fremadrettet. Interessant er emnet jo også, da incidensen i Danmark for MM er 2085 tilfælde - en af de højeste i verden (2), og at metoden til diagnosticering er så specifik og billig som muligt. Det fravælges at undersøge holdbarheden af Fast Red i detektionskittet UltraView, pga. den korte periode til at udføre analyserne i. Endvidere fravælges metoden med afblegning med KMnO4, da andre studier har vist dårlige erfaringer med denne metode.(1), (3). Vi har også valgt ikke at afblege efter, men før, den IHC - analyse, da dette er beskrevet i en videnskabelig artikel, og det giver ikke et særlig godt resultat.(4) 3

7 Formål Resultaterne fra pilotprojekterne skal være med til at optimere parametrene ph, inkubationstid og afblegningsmetode, inden det endelige projekt udføres. Projektet skal være med til at give et svar på, om det er muligt ved at udskifte kernefarvestoffet hæmatoxylin med Azur B samt benytte detektionskittet OptiView DAB, således der kan differentieres mellem melanin og reaktionsproduktet fra IHC-analysen. Endvidere give svar på om afblegning af melanin med H2O2 inden IHC- reaktionen kan resultere i en metode til detektion af MM, hvor melanin ikke interfererer i billedet og antigeniciteten bevares. Vi vil, på baggrunde af tidligere undersøgelser i videnskabelige artikler, udføre flere pilotprojekter omkring ph og inkubationstid for Azur B til kontrastfarvning af melanin og kernefarvning. Vi blev inspireret af artiklerne(1) og (5). Vi vil teste metoder for afblegning af melanin, hvor vi blev inspireret af artikel(3), inden udførelse af det endelige projekt. Der er taget udgangspunkt i NordiQC s anbefalinger til vurderingen af det færdige resultat. Vi har til vores pilotprojekter ikke benyttet patientmateriale, men let tilgængeligt kontrolmateriale fra rutinen. Problemformulering Hvordan er det muligt, at optimere kvaliteten af detektionen af Mel A og HMB45 til diagnosticering af maligne melanomer, ved afblegning af melanin samt anvendelse af kationfarvestoffet Azur B, således at UltraView Universal Alkalisk Phosphatase Red Detection Kit kan udskiftes med OptiView DAB IHC Detection Kit? Begrebs afklaring: Ved kvalitet, forstås sensitivitet og specificitet, som vurderes ud fra et scoringssystem baseret på NordiQC s anbefalinger. Sensitivitet er et udtryk for, hvor små mængder af antigen-antistof reaktion der kan detekteres, og specificiteten er et udtryk for, hvor specifik reaktionen er. Sidstnævnte skal sikre, at der kun ses en reaktion der, hvor antigenet er til stede. 4

8 Teori I mit afsnit omkring teori vil jeg komme ind på opbygning af cutis, samt melanin, melanocytter og melanosomer. Et afsnit omkring fiksering af væv, samt antigener og antistoffer. Jeg vil forklare omkring afblegning og det immunhistokemiske princip på VBU. Jeg vil komme ind på metalkompleks- og kationfarvestoffer samt kvalitetssikring. Cutis Figur 1 viser opbygning af cutis med epidermis og dermis x 5(eget billede) Cutis er opbygget af flere lag. Yderst findes epidermis, der består af forhornede døde celler yderst og et flerlaget pladeepithel celler derunder. Det er overvejende keratinocytter der befinder sig i dette lag. Her findes også stratum basale. Stratum basale består af kubiske eller cylindriske celler der er enkeltlaget. Under stratum basale findes dermis, som inddeles i stratum papillare og stratum reticulare. I Stratum papillare findes løst bindevæv indeholdende tynde kollagene og elastiske fibre. Stratum reticulare består af grovere og mere tætte kollagene fibre, som ligger i bundter med mange elastiske fibre i et større netværk. Der findes endvidere svedkirtler og fedtvæv, samt sanseceller der har kontakt direkte til nervesystemet.(6)(7) 5

9 Melanin, melanocytter og melanosomer I epidermis tæt ved basalmembranen i epithellaget, ligger melanocytterne der danner melanin, som er et pigment. Melanocytterne har forgrenede udløbere, som kan ses mellem epithelcellerne. Melanin kan ses som gulligbrune korn, der primært ligger som granula i udløberne fra melanocytterne. (6) I væv, hvor der er MM ses melanin både i epidermis og dermis, nogle gange dybt i dermis. Melanin dannes ud fra aminosyren tyrosin, som et polymerisationsprodukt, hvor enzymet tyrosinase katalyserer reaktionen. Se figur 2. Der dannes et specifikt celleorganel i melanocytterne et melanosom, hvor dannelsen af melaninen sker. Når melanosomet er opfyldt med melanin og protein, bliver den indre struktur helt kompakt. (6) Det er melanin, karotener og hæmoglobin samt spredning af lys, der giver cutis farve.(6) Melanin optager det ultraviolette lys fra solens stråler, og omdanner det til varme i kroppen.(8) Melanocytternes funktion er at beskytte basalcellernes DNA mod UV-stråling, således der ikke sker mutationer.(6),(9) Ved øget ultraviolet stråling af cutis igangsættes en øget produktion af melanocytter, da det melanocytstimulerende hormon(msh) aktiveres ved øget stråling.(6) Melanin er formentlig en polymer, der er afledt af indol- 5,6-quinon. Strukturen ses på figur 2.(10) 6

10 Figur 2 viser dannelse af melanin ud fra tyrosin(10) Fiksering Fiksering af celler har til formål, at stabilisere form og struktur, således de bevares bedst muligt. Fiksering skal forhindre autolyse, inaktivere mikroorganismer og hindre tab af cellekomponenter. Histologiske præparater fikseres med 4% Neutral Buffered Formalin (NBF), som er et gelerende fiksativ. Der dannes kovalente bindinger imellem amino- og aldehydgrupperne samt tværbroer/methenbroer i vævet, der hindrer bevægelse af antigener (12),(13) Fikseringstiden på KDA er minimum 24 timer. Præanalysen har stor betydning for det efterfølgende 7

11 analysearbejde.(12) Ved IHC- metoden ophæves fikseringen i vævet vha. demaskering, dvs. opvarmning til 100 ºC i 48 min. Herved brydes bindingerne, som blev dannet ved fikseringen og antigeniciteten bliver tilgængelig.(11) Antigener og antistoffer Antigener er molekyler, der er fremmede for organismen, hvilket udløser en reaktion fra immunsystemet, idet der sker en dannelse af antistof. Antigener kan være proteiner, lippoproteiner, polysakkarider m.v. Antigener har en eller flere epitoper, hvorpå antistofferne kan binde sig. Epitoper består ofte af 4-8 aminosyrer.(11) Antistoffer inddeles i fem klasser, IgA, IgD, IgE, IgG og IgM. I immunhistokemien bruges oftest antistoffer af IgG-klassen. Der forekommer også antistoffer af IgM-klassen. Monoklonale antistoffer udvindes fra f.eks. mus, kanin, eller ged. Antistofferne genkender én epitop på antigenet, dvs. det er meget specifikt. Antistoffer kan købes som ready to use (RTU) eller som koncentrater, hvor der skal foretages fortynding. HMB45 fra Ventana er rettet mod det onkoføtale antigen der findes i de umodne melanosomer i cytoplasmaet af aktiverede og neoplastiske melanocytter.(14) Mel A detekterer kvalitativt antigenet melan A, som findes i melanocytter og melanosomer. Det detekterer både hvilende og aktive melanocytter i cytoplasmaet.(15) Afblegning Afblegning af melanin er forsøgt på flere måder i forskellige artikler (3), (16), (17). Det gøres enten med H2O2 eller KMnO4/oxalsyre. Begge stoffer er oxidationsmidler. Der sker en kemisk reaktion, hvor H2O2 i reaktionen reduceres til H2O og melanin oxideres. Ved oxidereingen af melanin vil dobbeltbindinger brydes og derfor vil melanin blive farveløs, da der ikke længere er minimum seks konjugerede dobbeltbindinger, dvs. at der ikke er skiftevis enkelt- og dobbeltbindinger, som gør, at melanin er kromofor. (12) Ved oxidation sker der en afgivelse af en elektron /optagelse af et oxygenatom, ved reduktion sker der en optagelse af en elektron/afgivelse af et oxygenatom.(18) Brintperoxid fortyndes med en fosfat buffer saltvandsopløsning (PBS) og med ionbyttet vand i vores projekt. En buffer er en opløsning med en syre og dens korresponderende base en slags stødpude. Den modvirker større ph-ændringer. PBS-opløsningen også er en isotonisk opløsning, hvilket vil sige, at cellerne i opløsningen ikke ødelægges, de forbliver intakte. (18) 8

12 Immunhistokemisk analyse med analyseprincip På figur 3 ses hvorledes arbejdsgangen er ved en IHC- analyse. De fire første trin hører under præanalysen. De efterfølgende trin foretages på VBU. Figur 3 viser flowchart over de metodiske parametre i teknikken for immunhistokemi (egen figur) Analyse med OptiView DAB med antistof HMB45: Inden påsætning af prøver på VBU sættes prøver i varmeskab i 60 min. ved 60 ºC, således vævet hærdes fast på objektglasset. Der blev først udført en afparaffinering med opvarmning til 75 ºC i Cell Conditioning EZ Prep i 4 min., temperaturen nedsættes til 72 ºC. Varmen smelter paraffinen, og EZ Prep der er en sæbeopløsning, vil nedsætte overfladespændingen, og vil fjerne paraffinen fra væv og glas. En hvirvelstrøm og skylning vil fjerne paraffinen helt. (19) Der påføres coverslip, der bevirker at reaktionerne sker i et lukket system, så der ikke spildes reagenser og reaktionerne sker optimalt. Dette skylles af og lægges på flere gange under analysen. Efterfølgende demaskeres 9

13 vævet med varmebehandling også kaldet HIER (Heat Induced Epitop Retrieval) i buffer CC1 i 48 min. ved 100 ºC. De dannede tværbroer/methenbroer og kovalente bindinger brydes ved hydrolyse i CC1 bufferen, som er en let basisk buffer, og epitoperne i antigenerne blotlægges. (20) Efterfølgende blev endogen enzymaktivitet blokeret ved, at der blev tilsat OptiView DAB peroxidase inhibitor, hvor det naturligt forekommende peroxidase i vævet neutraliseres med H2O2. Dvs. H2O2 spaltes til vand og ilt, og enzymet forbruges. RTU HMB45 blev tilsat, og det binder sig til antigener i vævet og der inkuberes i 16 min. Skylleprocedure med Reaction Buffer sker efterfølgende for at fjerne overskydende antistof. Skylning med Reaction Buffer sker ofte mellem processerne, da det vedligeholder et nødvendigt vandholdigt miljø.(21) Der tilsættes sekundært antistof OptiView DAB HQ universal linker, som binder sig til det primære antistof. Der tilsættes et tertiært antistof, OptiView DAB HRP multimer, der reagerer med det sekundære antistof. HRP er ikke synligt, så reaktionen visualiseres ved at der tilsættes et hydrogenperoxidsubstrat og 3,3 diaminobenzidin tetrahydrochlorid (DAB) kromogen. DAB fungerer som elektrondonor i reaktionen og DAB oxideres.(13) For at forstærke DAB reaktionen blev der tilsat OptiView DAB copper, der gør udfældningen mere skarp, og der ses et mørkere brunt uopløselig udfældningsprodukt. Metoden der anvendes er den indirekte. Processen er den samme ved brug af RTU Mel A. Tilladelse for brug af figurer se bilag 1. Figur 4 viser reaktionen i OptiView DAB (22) 10

14 Analyse med UltraView med HMB45: Prøver sættes i varmeskab i en time ved 60 ºC. Der sker en afparaffinering med EZ Prep ved 75 ºC i 4 min. Der påføres coverslip, der bevirker at reaktionerne sker i et lukket system, så der ikke spildes reagenser og reaktionerne sker optimalt. Dette skylles af og lægges på flere gange under analysen. Demaskering sker ved 100 ºC i 64 min. Det primære RTU antistof HMB45 tilsættes og binder sig til antigenet. Der inkuberes i 28 min. Sekundært antistof Ultra universal Ap Red multimer, er enzymmærket med Alkalisk Phosphatase. Enzymet katalyserer reaktionen, som senere sker, når der tilsættes napthol-substrat. Enzymet katalyserer processen, hvor det fraspalter fosfat fra naphtolphosphatesterforbindelsen i naptholsubstratet, ved højt ph(13), (23). Det binder sig til det primære antistof og inkuberes i 12 min. Skylleprocedure med Reaction Buffer sker efterfølgende for at fjerne overskydende antistof. Skylning med Reaction Buffer sker ofte mellem processerne, da det vedligeholder et nødvendigt vandholdigt miljø. Der tilsættes Ultra universal Ap Red enhancer, som er en forstærker, der inkuberes i 4 min. Antigen/antistofkomplekset visualiseres vha. naptholsubstratet, Ultra universal Ap Red naphtol samt Fast Red-kromogen, Ultra universal Ap Red Fast Red A, hvor der inkuberes i 8. min og Ultra universal Ap Red Fast Red B, hvor der inkuberes i 8 min. Den resterende del af naptholforbindelsen kobler sig på diazoniumforbindelser (kromogen Fast Red).(13) Sluttelig tilsættes kernefarvestof hæmatoxylin og som inkuberer i 8 min. Sidst tilsættes Bluing Reagent, der inkuberer i 4 min. Her sker der en ændring i ph og kernerne ændrer farve til blå. Analyseprincip for UltraView ses på figur 5. Dette sker via den indirekte metode. 11

15 Figur 5 viser reaktionen i UltraView (24) Analyse med UltraView med Mel A: Forskellen mellem analyser for HMB45 og Mel A er, at der tilsættes Amplifier A, der inkuberer i 8 min og efterfølgende Amplifier B som også inkuberer i 8. min. Amplifier A og B forstærker reaktionen, således gøres mere sensitiv. Reagenserne tilsættes efter inkubationstid med RTU Mel A. Ellers er det samme fremgangsmåde som for HMB45. Kernefarvestoffer Der bruges hematoxylin II, der er et modificeret Mayers hæmatoxylin,(25) et metalkompleksfarvestof, fra Ventana til kernefarvning i celler, når detektionssystemet UltraView benyttes. Kernerne i cellernes DNA indeholder negativt ladede phosphatgrupper, de er tilgængelige fra ph 3 og op efter(12). Der vil ske en reaktion med metalkompleksfarvestoffet, der har en positiv ladning i opløsning og de negativt ladede phosphatgrupper. Binding sker her ved kompleksbinding.(12) Fremstilling af metalkompleksfarvestoffet sker ved at hematoxylin oxideres til hæmatein, og dertil tilsættes en opløsning indeholdende aluminium ioner, og der dannes et Al- hæmatein-kompleks. Reaktionen ses på figur 6. Farvestoffet er positivt ladet i sur opløsning.(12) 12

16 Figur 6 viser fremstilling af Al-hæmatein Vi benytter Azur B til kernefarvning samt til farvning af melanin. Azur B er et kationfarvestof. I melanin findes tilgængelige carboxylsyregrupper, hvor der muligvis vil ske en udskiftning af OHgruppen med Azur B, der binder sig med sin positive del, med ionbinding. Komplekses ses som blågrønt. Formel for det plane molekyle Azur B i opløsning: 13

17 Figur 7 viser molekyleformel for Azur B i opløsning(12) I artiklerne (5) og (26) skriver de, at melanin farves metakromatisk med Azur B. Ved metakromatisk farvning vil farvestoffet under nogle forhold bindes til granula/væv på en sådan måde, at farvestoffet absorberer lys af anden bølgelængde. Det farvede væv får en anden farve end farvestoffet og dette kaldes metakromasi. Komponenter i vævet, der farves metakromatisk kaldes chromotropisk. Azur B vil farve chromotropiske vævskomponenter i nuancer af blåviolet. Hæmatoxylin-Eosin farvemetode Hæmatoxylin-Eosin farvemetoden (HE) bruges som oversigtsfarvning af præparater, hvor morfologien af vævet vurderes. Aluminium-hæmatein komplekset binder sige som beskrevet ovenstående til de negativt ladede phosphatgrupper i kernernes DNA. Bindingen sker ved hydrofob stabilisering ved ph<3. Eosin er et anionfarvestof, der farver positivt ladede grupper i cytoplasmaet lys pink. Det er proteiner, kollagen, erytrocytter og keratin der farves. Bindingen sker ved hydrofob stabilisering og ionbinding.(12) Kvalitetssikring Kvalitetssikring er en vigtig del af hverdagen på alle laboratorier, således de resultater der fremkommer er valide og den korrekte diagnose kan stilles. Kvaliteten i arbejdet, der udføres, skal være der fra start til slut, dvs. lige fra prøvematerialet udtages af patienten til det endelige resultat foreligger. Der udføres daglig kvalitetskontrol med kontrolmateriale. Til IHC- analyser påsættes hvert objektglas et kontrolmateriale for hhv. positiv og negativ reaktion af antistoffet. Der findes forskellig kontroller afhængig af, hvilken analyse der skal foretages. NordiQC, som er en professionel og videnskabelig organisation, udsender eksternt prøvemateriale til test på de histologiske laboratorier, der tilmelder sig ordningen. Analyserne udføres på 14

18 prøvematerialet, og resultatet sendes tilbage til NordiQC. Laboratorierne får sendt svar tilbage på resultatet, således protokoller evt. skal redigeres. NordiQC offentliggør samtlige resultater fra de forskellige tests. Det er ofte apparatur og reagenser fra firmaet Dako, der viser de bedste resultater.(27), (28) Ofte hænger valg af apparatur sammen med, hvilke typer der findes på markedet på det tidspunkt, hvor apparaturer skal indkøbes, samt om flere laboratorier i samme region, der har behov for apparatur, og om der derved kan opnås en økonomisk gevinst ved indkøb af flere apparaturer samtidig. Materialer og metoder: Dette afsnit beskriver hvordan, pilotprojekter og selve projektet er udført. Hvordan prøverne er blevet indsamlet, præpareret og analyseret samt hvilket apparatur, reagenser og utensilier der er benyttet. Design I denne kvantitative undersøgelse, blev der taget udgangspunkt i flere pilotprojekter, hvor der blev undersøgt ved hvilken ph Azur B bedst reagerer ved samt inkubationstiden med denne. Der er undersøgt effekten af afblegning med en H2O2 - opløsning, hhv. fortyndet i ionbyttet vand samt PBS-buffer, samt test af farvning af melanin. Disse resultater blev overført til det endelige projekt, hvor IHC - analysen indgik. Der blev foretaget analyser på 10 patientprøver, der alle var diagnosticeret med MM samt indeholdt varierende mængder af melanin. Disse blev udvalgt fra ITsystemet CGI, på patientprøver fra januar 2016 maj 2016 og fra patienter der var ældre end 40 år. Kontrolmaterialet blev udvalgt ud fra anbefalinger fra NordiQC. Efterfølgende blev vores resultater scoret også efter retningslinjer fra NordiQC. Metode Fremstilling af reagenser til pilotprojekt og projekt: I pilotprojekter og projektet blev der benyttet en 10% H2O2-opløsning, hvor ionbyttet vand blev brugt som fortyndingsmiddel. Der blev taget udgangspunkt i en 30% H2O2-opløsning. Endvidere blev der fremstillet en 10 % H2O2-opløsning med 0,5M PBS-buffer som fortyndingsmiddel, der blev indstillet til ph 7,4. 15

19 10% H2O2-opløsning: Der blev fremstillet en 10% H2O2-opløsning ud fra en 30% H2O2-opløsning. konc. * volumen = konc. * volumen 30% * X = 10% * 150 ml X = 50 ml Der blev afmålt 100 ml ionbyttet vand i et måleglas og overført til en kolbe. Heri blev der afmålt 50 ml 10% H2O2-opløsning i et måleglas og overført til kolben med ionbyttet vand. Herefter blev det blandet. Fremstilling af PBS-buffer: Der blev afvejet: 20,0159 g NaCl 0,5075 g KCl 3,6182 g Na2HPO4 * 2 H2O 0,7268 g KH2PO4 Ovenstående blev opløst i ionbyttet vand i en kolbe, 500 ml ionbyttet vand blev afmålt i et måleglas, og overført til kolben. Derefter blev der udtaget 50 ml 30% H2O2 og overført til 100 ml PBS-buffer, i alt 150 ml. 0,1 % Azur B opløsning: Der blev afvejet 0,1502 g Azur B og dette blev opløst i 150 ml ionbyttet vand under omrøring og varme i 3 timer. Herefter blev opløsningen filtreret og fordelt i 3 bægerglas, hvor ph blev indstillet til hhv. 4,6 og 8 med et ph-meter. 16

20 Pilotprojekter: 1. Prøvemateriale til test af kernefarvning var colonvæv, der normalt bruges som HE-kontrol i rutinen. Vævet var på forhånd skåret på mikrotom af personale i afdelingen og påsat objektglas. Vævet blev påsat Tissue-Tek Prisma på special afparaffinerings program, og blev behandlet som det ses på figur 8. Efter påsætning af film blev resultatet vurderet i mikroskop. Figur 8 viser skematisk oversigt over pilotprojekt 1 2. Prøvematerialet til test af afblegning var væv fra cutis, der var højpigmenteret. Vævet blev skåret på mikrotom af Liselotte Olesen og påsat objektglas. Prøver blev afparaffineret på Tissue-Tek Prisma og rehydreret manuelt. Brintperoxid-opløsningerne blev opvarmet til 65ºC. Efterfølgende blev prøver behandlet som det ses på figur 9. Efter påsætning af film, blev resultatet vurderet i mikroskop. 17

21 Figur 9 viser skematisk oversigt over pilotprojekt 2 3. Der blev foretaget en ny test af kernefarvning, med forskellig inkubationstider. Prøvemateriale til test var colonvæv. Vævet var på forhånd skåret på mikrotom af personale i afdelingen og påsat objektglas. Vævet blev påsat Tissue-Tek Prisma på special afparaffinerings program. Figur 10 viser forløbet. Efter påsætning af film blev resultatet vurderet i mikroskop. Figur 10 viser skematisk oversigt over pilotprojekt 3 18

22 4. Endelig udførte vi en test omkring farvning af melanin, hvor prøvematerialet var højpigmenteret cutis. Det blev udskåret af Liselotte Olesen og påsat objektglas. Vævet blev påsat Tissue-Tek Prisma på special afparaffinerings program. Det blev farvet med 0,1 % Azur B opløsning i 1 min. og ved ph 4. Efterfølgende blev det skyllet i rindende vand i 2 min, dehydreret og påsat film. Efterfølgende vurderet i mikroskop. VBU IHC - analyser blev foretaget på apparaturet VBU, som ses på figur 11. I den øverste del af apparaturet blev der indsat dispensere med antistoffer, reagenskit, amplifier og kernefarvestof. Eksempel på dispensere ses på figur 12 (hæmatoxylin II og bluing reagent). Objektglas med prøver blev lagt i hver sin skuffe med stregkodelabel på, således apparatet kunne scanne hvilken analyse, der skulle foretages på det enkelte objektglas. Under disse skuffer findes alle depoter med EZ Prep, CC1, CC2 og Reaction buffer, der også benyttes til analyserne, se figur 13. Bagerst i apparatet blev disse reagenser trukket/suget ind, som skulle benyttes til den forestående analysering af prøver. Nederst bag lågerne fandtes affaldsbeholdere til opsamling af brugte reagenser. 19

23 Figur 11 viser VBU med åbne skuffer til objektglas med vævsprøver 20

24 Figur 12 viser dispensere med reagens på VBU Figur 13 viser reagensbeholdere på VBU, bag lågerne findes affaldsbeholdere til opsamling af brugte reagenser 21

25 Projekt: Kontrolmateriale til kvalitetssikring af vores projekt, blev udvalgt fra NordiQC s anbefalinger. Det var for Mel A: normal binyre som positiv kontrol, hvor stort set alle kortikale epitelceller skulle vise en moderat til stærk cytoplasmisk granulær farvning. Nyre som negativ kontrol, hvor der ikke måtte være reaktion i epitelceller, der kunne dog ses en spredt granulær farvning i epitelceller, som skyldes lipofucin.(28) For HMB45: der blev anbefalet blå nævus som positiv kontrol, hvor hovedparten af de neoplastiske celler skulle vise en svag til moderat og tydelig granulær cytoplasmisk farve reaktion. Nyre eller appendix blev anbefalet som negativ kontrol, hvor der ikke skulle ses nogen reaktion i epitelcellerne. (27)Vi brugte MM i stedet for blå nævus, da vi vidste, at der var MM til stede i alle vores prøver. NordiQC skrev dog, at blå nævus var MM overlegen mht. reaktion. De fire vævsprøver blev udstanset og samlet i én blok - se figur 14 og sidste kassette på figur 15. Figur 14 viser udstansning af væv (eget billede) 22

26 Figur 15 viser kassette A og B med hver 5 stk. patientvæv og den sidste med 4 stk. kontrolvæv klar til indstøbning i paraffin (eget billede) Figur 16 viser prøver, der indstøbes i paraffin (eget billede) 23

27 De 10 stk. udvalgte patientmaterialer blev udstanset se figur 14, og fordelt i 2 blokke med 5 stk. patientmateriale i hver se figur 15, i kassette A og B, hvorefter de blev indstøbt i paraffin se figur 16. Der blev mikrotomeret 18 snit af kontrolblokken og fordelt på 18 Tomo objektglas. Der blev mikrotomeret 9 snit af blok A og 9 snit af blok B med patientmaterialer, der efterfølgende blev påsat objektglassene med kontrolsnit. Alle snit blev skåret på 4µm. To objektglas med kontrolmateriale og patientmateriale blev farvet med HE én fra blok A og én fra blok B. Efterfølgende blev 2 objektglas (med hver et kontrolsnit og et snit med 5 patientprøver fra hhv. blok A og blok B) analyseret efter nedenstående skema se figur 17. I projektet blev benyttet RTU-museantistoffer til alle analyser. Analyse Protokol nr. Detektions kit Kernefarvestof Antistof Afblegning 1 43 UltraView Hæmatoxylin II HMB45 Nej 2 31 UltraView Hæmatoxylin II Mel A Nej OptiView Azur B HMB45 Nej DAB OptiView Azur B Mel A Nej DAB OptiView Hæmatoxylin II HMB45 Ja DAB OptiView Hæmatoxylin II Mel A Ja DAB OptiView Azur B HMB45 Ja DAB OptiView DAB Azur B Mel A Ja Figur 17 viser en skematisk oversigt over projektet Alle objektglas blev til start indsat i varmeskab ved 60ºC i en time, således vævet hæftede godt til objektglassene. Herefter blev objektglassene 1-4 sat på VBU og analyseret efter respektive protokoller. Objektglassene 3-4 blev udtaget fra Ventana og skyllet i sæbevand, derefter i rindende vand og manuelt farvet med 0,1% Azur B - opløsning i et minut. Skyllet i rindende vand i 2 min. og manuelt dehydreret og påsat dækglas på Tissue-Tek Film. Objektglassene 1-2 blev skyllet i sæbevand, derefter rindende vand, manuelt dehydreret og påsat dækglas på Tissue-Tek Film. 24

28 Objektglassene 5 8 blev sat på Tissue-Tek Prisma til special afparaffinering samt rehydrering og efterfølgende sat i et coplin glas med den opvarmede 10% H2O2 opløsningen, som var fortyndet med ionbyttet vand, i 40 min. ved 65ºC. Herefter kom objektglassene i rindende vand i 5 min., og objektglassene blev sat på VBU og analyseret efter respektive protokoller. Efterfølgende blev objektglassene 5 6 skyllet i sæbevand, og derefter rindende vand, manuel dehydreret og påsat dækglas på Tissue-Tek Film. Objektglassene 7 8 blev taget af VBU og skyllet i sæbevand, og derefter i rindende vand og manuelt farvet med 0,1% Azur B - opløsning i et minut. I rindende vand i 2 min., manuelt dehydreret og påsat dækglas på Tissue Tech Film. Protokoller for analyserne ses nedenfor på figur Protokollerne blev oprettet på baggrund af de eksisterende protokoller for HMB45 (protokol 43) og Mel A (protokol 31). Derefter blev protokol 393 og 394 tilrettet således, at der stoppes inden kernefarvningen startede. Protokoller 395 og 396 blev tilrettet således, at der blev foretaget afparaffinering og rehydrering samt afblegning manuelt, og der blev startet ved demaskeringen. Vi har i protokoller 393, 394, 395 og 396 ændret tiden for demaskering til 48 min., da det er den tid protokol 325 (figur 24) for OptiView DAB brun er fastsat til i IT-systemet for VBU. Vi har ændret på tiden for inkubation med primært antistof i forhold til protokoller for UltraView, da vi har rettet os efter Ventana s Package Insert for HMB45 og Mel A, som foreskriver 16 min. (14), (12) 25

29 Figur 18 viser protokol 43 for HMB45 på UltraView 26

30 Figur 19 viser protokol 31 for Mel A på UltraView 27

31 Figur 20 viser protokol 393 for HMB45 + Azur B med OptiView DAB Figur 21 viser protokol 394 for Mel A + Azur B med OptiView DAB 28

32 Figur 22 viser protokol 396 for HMB45 + afblegning med OptiView DAB 29

33 Figur 23 viser protokol 395 for Mel A + afblegning med OptiView DAB 30

34 Figur 24 viser protokol 325 med OptiView DAB På figur 25 har jeg forsøgt at vise proceduren for dehydrering og rehydrering i samme tegning. Startes der fra venstre mod højre, så dehydreres vævet og den modsatte vej vil vævet blive rehydreret. Figur 25 viser oversigt over de- og rehydrering (egen tegning) 31

35 Materialer Afsnittet indeholder oplysninger om de apparaturer, utensilier og reagenser, der er benyttet til pilotprojekter og projektet. Det indeholder også information omkring arbejdsmiljø, hvor jeg oplyser faresymbolerne og hvad de betyder i forbindelse med reagenserne. I tabel 1 ses oversigten over apparaturer, utensilier og reagenser. Væv der er benyttet til projektet ses på figur 26. På figur 27 ses informationer omkring arbejdsmiljø. Tabel 1 viser oversigt over apparatur, utensilier og reagenser Termas varmeskab Tissue-Tek Prisma Tissue-Tek Film Ventana BenshmarkUltra Ventana E bar II Apparatur Nikon eclipse Ci mikroskop MeterLab PHM 201 ph-meter Memmet vandbad Hamahatsu NanoZoomer 2,0 HT Testo 108 termometer Thermo scientific microm HM 355S rotationsmicrotom Utensilier Tragt Bægerglas - forskellige størrelser Kolber forskellige størrelser Opbevaringsflasker Filterpapir Engangspipetter Vugger Tomo objektglas Lotnr R-SP3A Plastkar Ionbyttet vand Nitrilhandsker Coplin glas Reagenser Magnetomrører med varmelegeme Ethanol, 70%,96% og 99% 32

36 Xylen Pertex Hydrogen peroxid 30% EMSURE ISO Producenten Merck Azur B/Bleu Azur B 1 B 489 Chroma-Gesellschaft Schmid & co. Indkøbt 15/ Ultra universal Ap Red enhancer Lotnr. G01030 G01031 Ultra universal Ap Red multimer Lotnr. G01030 G01032 Ultra universal Ap Red naphtol Lotnr. G01030 G01034 Ultra universal Ap Red Fast Red A Lotnr. G01030 G01035 Ultra universal Ap Red Fast Red B Lotnr.G01030 G01036 Amplifier A Lotnr. G01269 G01270 Amplifier B Lotnr. G01269 G01271 Antistof - Mel A Lotnr. G02344 Antistof - HMB45 Lotnr. G02367 Hæmatoxylin Lotnr. G02647 Bluing Reagent Lotnr. G03169 Amplifier A Lotnr. G01269 G01270 Amplifier B Lotnr. G01269 G01271 OptiView DAB peroxidase inhibitor Lotnr. G03904 G03908 OptiView DAB HQ universal linker Lotnr. G03904 G03908 OptiView DAB HRP multimer Lotnr. G03904 G03909 OptiView DAB Lotnr. G03904 G

37 OptiView DAB H2O2 Lotnr. G03904 G03912 OptiView DAB copper Lotnr. G03904 G03913 NaCl Merck g KCl Merck 750TA Art kg Na2HPO4, 2H2O AppliChem A3905, kg KH2PO4 Merck A kg CellConditioning CC1 Ventana EZ Prep Ventana CC Medium Coverslip Ventana Vi har benyttet let tilgængelig væv fra rutinen til pilotprojekterne samt patientvæv til projektet. Væv fra rutinen var colonvæv og højpigmenteret cutis. Vores prøver til projektet er patientvæv, der er udvalgt efter diagnose med MM og indeholdende melanin, så højpigmenteret som muligt. Vores patient- og kontrolvæv til projektet ses på nedenstående oversigt. Figur 26 viser hvilket væv der er benyttet til projektet 34

38 Arbejdsmiljø: Det er vigtigt at orientere sig om, hvordan reagenser og affald skal håndteres på afdelingen. Hvornår der skal benyttes handsker, og at der arbejdes i stinkskabe med udsugning. Det er også vigtigt, at man sørger for gode arbejdsstillinger under det daglige arbejde. På KDA opsamles farvevæsker, ethanol m.m. i dunke, der efterfølgende sendes til destruktion på EkoKem i Nyborg. Det er også vigtigt, at vide hvor øjenskylleflasker og andet udstyr befinder sig i tilfælde af, der skulle blive brug for det. Nedenfor på figur 27 er vist en oversigt over de reagenser, vi har brugt i pilotprojekter og projektet med faresymboler og tekst.(29) Handelsnavn Mærkning Tekst Symbol ULTRAVIEW UNIVERSAL AP RED DETECTION KIT OptiView DAB Detection Kit GHS05 Ætsende GHS08 Sundhedsfare kronisk sundhedsfarligt OptiView DAB Amplification Kit GSH08 Sundhedsfare kronisk sundhedsfarligt Azur B Ethanol GHS02 Brændbart 35

39 Xylen GHS02 Brændbart GHS07 Sundhedsfare kronisk sundhedsfarligt 1M HCl 1M NaOH GHS05 Ætsende KCl NaCl Na2HPO4, 2H2O KH2PO4 H2O2 GHS05 Ætsende Figur 27 viser en oversigt over de reagenser vi har benyttet og deres mærkninger mht. arbejdsmiljø(29) Etik Der er benyttet patientmateriale indeholdende MM samt melanin til projektet. Materialet blev vurderet egnet til, at der kunne udtages væv fra blokkene til brug for projektet, inden der blev indhentet tilladelse ved patologen. Tilladelsen er givet/vurderet ud fra, om det var i orden at udtage væv til forsøg, og at der samtidig var nok væv, såfremt der evt. skulle laves nye analyser på patienternes væv. Idet der er tale om materiale til brug til forskning, er det ikke nødvendigt at indhente tilladelse hos patienterne.(30) Resultaterne af projektet kan måske komme nye patienter til gode, i form af en optimeret IHC-metode til diagnosticering af MM. 36

40 Litteratursøgning Jeg har søgt informationer på Google ad flere gange. Jeg har søgt på antistofferne Mel A og HMB45. Søgt på hjemmesiderne Ventana, Roche, NordiQC, Kræftens bekæmpelse, sundhedsstyrelsen og sundhed.dk. Jeg har via PubMed ad flere gange søgt efter videnskabelige artikler til brug til projektet. Jeg har bl.a. søgt med søgeordene Azur B, melanin, bleaching, comparison, malign melonoma, HMB45, Mel A. Jeg har fundet en del artikler, som jeg henviser til i min opgave. Artiklerne er udgivet i perioden Jeg har desuden søgt i lærebøger, som jeg har benyttet på uddannelsen og på UC Syd bibliotekets hjemmeside. Databearbejdning Jeg vil bearbejde mine resultater med Excel 2010, og data vil blive bearbejdet som beskrivende statistik. Der vil ikke være statistisk bearbejdning af pilotprojekterne, de fremstilles med billeder. Selve projektet vil blive fremstillet med billeder samt beskrivende statistik med cirkel- og søjlediagrammer. Resultater Resultater vises med pilotforsøgene som de første, hvor det er billeder, der viser resultaterne. Alle præparater er indscannet på Hamahatsu Nano Zoomer 2,0 HT. Dernæst selve projektet med billeder og beskrivende statistik. Billeder der vises under scoringsskemaerne, viser de billeder, som jeg har vurderet som hhv. optimal, good og borderline. Jeg medtager ikke billeder fra kombinationen med afblegning og Azur B, da der er fejl ned udførsel af metoden. Statistik vises som cirkeldiagrammer for test af metoder samt sammenligning mellem fælles scoring kontra min egen. Søjlediagrammer vises for metoderne med afblegning og Azur B, for at undersøge hvilken metode der viser sig bedst i forhold til patientmaterialet. 37

41 Pilotprojekt 1: Test af kernefarvning med 0,1 % Azur B - opløsning på colonvæv. Figur 28 viser farvning ved ph 4 og i 4 min. Figur 29 viser farvning ved ph 6 i 4 min 38

42 Figur 30 viser farvning ved ph 8 og 4 min Pilotprojekt 2: Test af afblegning med 10% H2O2 i ionbyttet vand og 10% H2O2 i PBS-buffer på højpigmenteret cutis. Farvet HE. Figur 31 viser cutis med melanin før afblegning x 5,9 39

43 Figur 32 viser cutis efter afblegning med H2O2 x 5,24 Figur 33 viser cutis efter afblegning med PBS-buffer x 5,19 40

44 Pilotprojekt 3: Test af kernefarvning ved ph 4 i 1,2 og 3 min på colonvæv. Figur 34 viser ph 4-1 min. x 0,78 Figur 35 viser ph 4-2 min. x 0,77 Figur 36 viser ph 4-3 min. x 0,77 41

45 Pilotprojekt 4: Test af farvning af melanin med 0,1 % Azur B - opløsning på højpigmenteret cutis. Figur 37 viser farvning af melanin der bliver blågrøn med Azur B Projekt: Ved scoring af væv efter NordiQC er betegnelserne optimal og good ensbetydende med, at analysen /protokollen er i orden/valid. Betegnelsen borderline betyder, her kan analysen bruges, med den skal udføres korrigerende handlinger for at få analysen løftet op på good gerne optimal. Protokollen skal optimeres. Ved betegnelsen poor, her skal protokollen optimeres hurtigst muligt.(31) Scoringssystemer med udgangspunkt i anbefalinger fra NordiQC Klassificering for HMB45 på UltraView Fast-red Malignt melanom samt neoplastiske melanocytter røde. Melanin pigment - brunt. Epidermis, bindevæv samt kerner blå. Optimal Good Borderline Poor 42

46 Moderat til stærk cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske cellerrødt. Den kromogene farve er afgrænset til områder med malignt melanom. Der ses ingen uspecifik farvning af bindevæv. Kernerne fremstår blå. Moderat til svag cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske celler - rødt. Den kromogene farve er afgrænset til områder med malignt melanom. Der ses svag uspecifik farvning af bindevæv. Kernerne fremstår blå. Moderat til svag cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske celler - rødt. Den kromogene farve ses spredt i reaktive celler. Der ses svag uspecifik farvning af bindevæv svag rød. Kernerne fremstår blå. Farven er ikke distinkt, og diffunderer ud i omkringliggende væv. Der ses ingen reaktion i malign melanom og neoplastiske melanocytter. Figur 38 Optimal - prøve 8 x 11,5 Good - prøve 9 x 11,4 Figur 39 Borderline - prøve 10 x 11,2 43

47 Klassificering for Mel A på UltraView Fast-red Melanocytter og udløbere røde. Melanin pigment brunt. Epidermis, bindevæv samt kerner blå. Optimal Good Borderline Poor Moderat til stærk distinkt granulær cytoplasmisk farvereaktion rødt. Den kromogene farve er afgrænset til cytoplasma i melanocytterne samt udløbere. Der ses ingen uspecifik farvning af bindevæv svag rød. Kernerne fremstår blå Moderat til svag distinkt granulær cytoplasmisk farvereaktion- rødt. Den kromogene farve er afgrænset til cytoplasma i melanocytterne samt udløbere. Der ses svag uspecifik farvning af bindevæv svag rød. Kernerne fremstår blå. Moderat til svag cytoplasmisk farvereaktion - rødt. Den kromogene farve ses spredt i reaktive celler. Der ses svag uspecifik farvning af bindevæv svag rød. Kernerne fremstår blå. Farven er ikke distinkt, og diffunderer ud i omkringliggende væv. Der ses ingen reaktion i melanocytter. Figur 40 Optimal - prøve 6 x11,1 Good - prøve 8 x11,1 44

48 Figur 41 Borderline - prøve 10 x 11,6 Klassificering for HMB45 på OptiView DAB med afblegning Malignt melanom og neuplastisk melanocytter brune. Melanin afbleget. Epidermis og kerner blå. Optimal Good Borderline Poor Moderat til stærk cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske celler - brunt. Den kromogene farve er afgrænset til områder med malignt melanom. Der ses ingen uspecifik farvning af bindevæv. Der ses intet melanin pigment. Moderat til svag cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske celler - brunt. Den kromogene farve er afgrænset til områder med malignt melanom. Der ses ingen uspecifik farvning af bindevæv. Der ses intet melanin pigment. Moderat til svag cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske celler - brunt. Den kromogene farve ses spredt i reaktive celler. Der ses svag uspecifik farvning af bindevæv. Farven er ikke distinkt, da der stadig ses melanin pigment. Der ses ingen reaktion i malign melanom og neoplastiske melanocytter. Figur 42 viser HE-farvning - prøve 6 inden afblegning x15,8 Optimal afbleget - prøve 6 45

49 Figur 43 viser HE-farvning - prøve 10 inden afblegning x 15,5 Borderline - afbleget - prøve 10 Klassificering for Mel A på OptiView DAB med afblegning Melanocytter brune. Melanin afbleget. Udløbere lysebrune. Epidermis og kerner blå. Optimal Good Borderline Poor Moderat til stærk distinkt cytoplasmisk farvereaktion - brunt. Den kromogene farve er afgrænset til cytoplasma i melanocytterne og udløbere fremstår lysebrune. Der ses ingen uspecifik farvning af bindevæv. Der ses intet melanin pigment. Moderat til svag distinkt granulær cytoplasmisk farvereaktion- brunt. Den kromogene farve er afgrænset til cytoplasma i melanocytterne samt udløbere. Der ses ingen uspecifik farvning af bindevæv svag rød. Der ses intet melanin pigment. Moderat til svag cytoplasmisk farvereaktion - brunt. Den kromogene farve ses spredt i reaktive celler. Der ses svag uspecifik farvning af bindevæv. Kernerne fremstår svagt blå. Farven er ikke distinkt, og diffunderer ud i omkringliggende væv. Der ses ingen reaktion i melanocytter. Der er stadig melanin pigment i præparatet. 46

50 Figur 44 viser HE-farvning - prøve 6 inden afblegning x15,8 Optimal afbleget - prøve 6 Figur 45 viser HE- farvning - prøve 9 inden afblegning x15,5 Good -afbleget - prøve 9 x15,2 Figur 46 viser HE-farvning - prøve 10 inden afblegning x 15,5 Borderline -afbleget - prøve 10 x15,4 Klassificering for HMB45 på OptiView DAB med Azur B Malign melanom samt neuplastiske melanocytter brune. Epidermis og bindevæv blå. Kerner og melanin granula i cytoplasma blågrønne. Optimal Good Borderline Poor 47

51 Moderat til stærk cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske celler - brune. Den kromogene farve er afgrænset til områder med malignt melanom. Der ses ingen uspecifik farvning af bindevæv. Kernerne fremstår blågrønne. Melanin pigment vil fremstå blågrønne. Moderat til svag cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske celler - brune. Den kromogene farve er afgrænset til områder med malignt melanom. Der ses ingen uspecifik farvning af bindevæv. Kernerne fremstår blågrønne. Melanin pigment vil fremstå svag blågrønne. Moderat til svag cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske cellerbrune. Den kromogene farve ses spredt i reaktive celler. Der ses svag uspecifik farvning af bindevæv. Kernerne fremstår blågrønne. Melanin pigment vil fremstå kraftig blågrønne. Farven er ikke distinkt, kontrasten mellem elementerne er ikke tydelig nok. Der ses ingen reaktion i malign melanom og neoplastiske melanocytter. Figur 47 viser HE-farvning - prøve 4 inden Azur B x15,8 Optimal prøve 4 med Azur B x 15,8 Figur 48 viser HE-farvning - prøve 2 inden Azur B x 15,6 Good prøve 2 - med Azur B prøve 2 x 15,2 48

52 Figur 49 viser HE-farvning prøve - 10 inden Azur B x 15,5 Borderline -prøve 10 med Azur B x 15,6 Klassificering for Mel A på OptiView DAB med Azur B Melanocytter og udløbere brune. Epidermis og bindevæv blå. Kerner og melanin granula blågrønne. Optimal Good Borderline Poor Moderat til stærk cytoplasmisk farvereaktion - brunt. Den kromogene farve er afgrænset til cytoplasma i melanocytterne samt udløbere. Der ses ingen uspecifik farvning af bindevæv. Kerner samt melanin fremstår blågrønne. Moderat til svag distinkt granulær cytoplasmisk farvereaktion- brunt. Den kromogene farve er afgrænset til cytoplasma i melanocytterne samt udløbere. Der ses ingen uspecifik farvning af bindevæv. Kernerne fremstår blågrønne. Melanin pigment vil fremstå blågrønne. Moderat til svag cytoplasmisk farvereaktion - brunt. Den kromogene farve ses spredt i reaktive celler. Kernerne fremstår svagt blågrønne, og der er svag uspecifik binding. Melanin pigment vil fremstå blågrønne. Farven er ikke distinkt, kontrasten mellem elementerne er ikke tydelig nok. Der ses ingen reaktion i melanocytter. Figur 50 viser HE-farvning - prøve 6 inden Azur B x15,1 Optimal prøve 6 med Azur B x 15,8 49

53 Figur 51 viser He-farvning - prøve 5 inden Azur B x 15,6 Good prøve 5 med Azur B x 15,8 Nedenfor vises eksempler på vores kontroller for HMB45 og Mel A med OptiView DAB, der er kontrast farvet med Azur B. Figur 52 viser MM - HMB45 med Azur B x 15,8 Figur 53 viser nyre - HMB45 med Azur B x 15,6 50

54 Figur 54 viser Binyre - Mel A med Azur B x 15,7 Figur 55 viser Nyre - Mel A med Azur B x 15,7 51

55 Skematisk visning af scorede resultater. Først vises mine scoringer af prøverne og dernæst vores samlede scoringer. Figur 56 viser mine scoringer for metoderne afblegning og Azur B med OptiView DAB 52

56 Figur 57 vise mine scoringer for UltraView samt kombinationen med afblegning og Azur B med OptiView DAB 53

57 Samlet scoringsskema for Meral, Mia og Marianne på de 10 patientprøver. Figur 58 viser fælles scoringer for metoderne afblegning og Azur B med OptiView DAB Figur 59viser fælles scoringer for UltraView og kombinationen med afblegning og Azur B med OptiView DAB 54

58 Cirkeldiagrammer viser vores fælles scoringer overfor mine egne. Figur 60 viser fælles scoring for afblegning HMB45 Min scoring for afblegning HMB45 Figur 61 viser fælles scoring for afblegning - Mel A Min scoring for afblegning - Mel A 55

59 Figur 62 viser fælles scoring med Azur B - HMB45 Min scoring med Azur B - HMB45 Figur 63 viser fælles scoring med Azur B - Mel A Min scoring med Azur B - Mel A 56

60 Good 3% HMB45 ultraview Borderline 17% Poor 0% Good 10% HMB45 ultraview Borderline 10% Optimal 80% Optimal Good Borderline Poor Optimal 80% Optimal Good Borderline Poor Figur 64 viser fælles scoring for ultraview HMB45 Min vurdering for ultraview HMB45 Borderline 20% Mel A ultraview Poor 0% Borderline 20% Mel A ultraview Good 7% Good 20% Optimal 60% Optimal 73% Optimal Good Borderline Poor Optimal Good Borderline Poor Figur 65 viser fælles scoring for ultraview - Mel A Min scoring for ultraview Mel A 57

61 HMB45 OptiView DAB afblegning Azur B Borderline 10% Poor 0% HMB45 OptiView DAB afblegning og Azur B Borderline 10% Optimal 20% Good 40% Optimal 50% Optimal Good Borderline Poor Good 70% Optimal Good Borderline Poor Figur 66 viser fælles scoring for afblegning og Azur B Min scoring for afblegning og Azur B Good 17% Mel A OptiView DAB afblegning og Azur B Borderline 10% Poor 0% Mel A OptiView DAB afblegning og Azur B Borderline 10% Good 10% Optimal 73% Optimal Good Borderline Poor Optimal 80% Optimal Good Borderline Poor Figur 67 viser fælles scoring for afblegning og Azur B Mel A Min scoring for afblegning og Azur B Mel A 58

62 Nummer på patientprøver Marianne W. Hovgaard Søjlediagrammer viser metoden med antistoffet for de 10 patientprøver. Øverst mine scoringer og de fælles scoringer neden under. Figurer Figur 68 Min scoring med afblegning og HMB OptiView DAB med afblegning + HMB45 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Personer - kun i hele Optimal Good Borderline Figur 69 Fælles scoring med afblegning og HMB45 59

63 Nummer på patientprøver Marianne W. Hovgaard Figur 70 Min scoring med afblegning og Mel A OptiView DAB med afblegning + Mel A ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Personer - kun helel Optimal Good Borderline Figur 71 Fælles scoring med afblegning og Mel A 60