Grampositiv... 3 Gramnegativ Kommentar Kommentar Kommentar Fejlkilder... 17

Transkript

1 Indholdsfortegnelse Resumé... 1 Problembaggrund... 2 Problemformulering... 2 Teori... 3 Hudflora... 3 Cellevæggen... 3 Grampositiv... 3 Gramnegativ... 3 Staphylococcus... 4 S. aureus... 4 Behandling... 5 Resistens... 5 Hvordan virker en kromogen selektiv plade?... 7 Materialer og Metode... 8 Materialer... 8 Bakterier... 8 Metode... 9 Fremgangsmåde Resultater Diskussion Vurderingskriterier MRSASelect, BIORAD Kommentar ChromID MRSA agar, BioMérieux Kommentar Brilliance MRSA agar, Oxoid Kommentar Begrænsninger Fejlkilder Afsluttende Generelt BORSA Sensitiviteten Specificiteten Metode i tørre podninger idag vs. kromogen selektiv plade Konklusion Kommentar Referencer Figure Bilag 1 Procedure ved fund af MRSA Bilag 2 Kontrol stammer anbefalet af biomérieux Bilag 3 Kontrol stammer anbefalet af BIORAD Bilag 4 Kontrol stammer anbefalet af Oxoid Bilag 5 Rådata og udregninger Bilag 6 Vurdering af positive og negative plader... 30

2 Resumé Baggrund MRSA er et globalt problem. I Danmark har vi en lav prævalens i forhold til det meste af verden. Siden indførelsen af anmeldepligt for MRSA tilfælde i november 2006, er antallet af hospital-acquired (HA) infektioner dalende, hvor antallet af community-acquired (CA) infektioner er stigende. Metode Jeg har testet 3 forskellige kromogene selektive plader: MRSASelect fra BIORAD, chromid MRSA agar fra biomérieux og Brilliance MRSA agar fra Oxoid. I mit forsøg har jeg benyttet 43 stammer af typen MRSA og 43 stammer af typen non-mrsa. Herudover har jeg benyttet 5 kontrol stammer (2 MRSA, 2 MSSA og en KNS). Stammerne blev udsået og inkuberet i ca. 22 timer ved 37 C (ydeligerer 24 timer for plader fra chromid MRSA agar, biomérieux, hvis pladen var negativ for MRSA). Herefter vurderede jeg pladerne som enten positiv for MRSA eller negativ for MRSA Konklusion MRSASelect fra BIORAD havde en sensitivitet på 95,4% og en specificitet på 95,4% efter 24 timer. ChromID MRSA agar fra biomérieux havde en sensitivitet på 95,4% og en specificitet på 88,4% efter 24 timer og en sensitivitet på 95,4% og en specificitet på 84,7% efter 48 timer. Brilliance MRSA agar fra Oxoid havde en sensitivitet på 95,4% og en specificitet på 79,1% efter 24 timer. Udfra et helheds indtryk af de 3 plader, her indgår inkubationstiden, nuanceforskelle på kolonierne, sensitiviteten og specficiteten, rangeres de på følgende måde (gående fra god mod mindre god): ChromID MRSA agar fra biomérieux, Brilliance MRSA agar fra Oxoid og MRSASelect fra BIORAD. 1

3 Problembaggrund En del af det menneskelige immunforsvar består den normale bakterielle hudflora. Denne består af bl.a. koagulase negative stafylokker (KNS), coryneformede stave m.m., og i 10-30% af den raske befolkning Staphylococcus aureus (S. aureus (SA)). S. aureus er i besiddelse af en masse virulensfaktorer, som kan forsage alt fra overfladiske hudinfektioner til infektioner med dødelig udgang. Stafylokok infektioner behandles oftest med antibiotika af typen β-laktamer (cephalosporiner, penicillin mm.). Hvis stafylokok bakterien har et resistensgen kaldet meca, vil denne være resistent overfor β-laktamer. Denne type af S. aureus kaldes Methicillin Resistent staphylococcus aureus (MRSA) [1]. Antallet af infektioner med MRSA har været støt stigende siden årtusinde skiftet. 1. november 2006 fik sygehuse og primærsektoren anmeldepligt i forhold til MRSA tilfælde. Dette har resulteret i et fald af MRSA infektioner i disse sektorer. Antallet af MRSA tilfælde udenfor sygehus sektoren, og tilfælde i forbindelse med udlandsophold, er dog fortsat stigende [2]. På klinisk mikrobiologisk afdeling, Rigshospitalet, identificeres MRSA på resistensmønsteret. Hvis en udsået S. aureus er < 34 mm overfor cefoxitin, er der mistanke om MRSA. Stammen sendes til yderligere identifikation hos SSI og viruslaboratoriet for at be- eller afkræfte meca [Bilag 1]. Ved mistanke om MRSA isoleres patienten med det samme. Det er derfor vigtigt at have en form for sikkerhed for, at den pågældende stamme er af typen MRSA. Isolation af en patient der ikke har MRSA, betyder ekstra omkostninger for det offentlige, og er til gene for den isolerede patient. Det ville være i alles interesse at have en metode der kunne identificere MRSA nemt og hurtigt. Samtidig ville det være et plus hvis metoden var nem at udføre for personalet. Problemformulering Hvor god er chromid MRSA agar fra biomérieux, MRSASelect fra Bio-Rad og Brilliance MRSA Agar fra Oxoid til at identificere MRSA, ud fra et udpluk af den normale bakterielle hudflora, heriblandt BORSA-, SA- og KNS-stammer, set ud fra specificiteten og sensitiviteten? 2

4 Teori Hudflora Kroppens yderste lag, og 1. barriere i immunforsvaret, er huden. Den opdeles i flere lag, hvor det yderste er epidermidis. Lige under epidermidis findes dermis, denne del består mest af bindevæv med kollagener og elastiske fibre. I modsætningen til epidermidis, som ikke indeholder blodkar, vil dermis have masser af blodkar. Under dermis findes subcutis, som mest er løst bindevæv og fedtceller. Hårfollikerne går ned igennem epidermidis og dermis, og laver en blød overgang mellem disse to lag [3]. Langt størstedelen af vores hudflora findes på epidermidis. Denne er primært bestående af KNS, coryneformede stave og 10-30% af befolkningen har SA, som en del af deres normalflora. Cellevæggen Meget overordnet kan bakterier inddeles i gram positive og gram negative. Forskellen på de to typer af bakterier, er måden hvorpå cellevæggen er opbygget. Grampositiv Tættest mod cytoplasma er en cytoplasmamembran af fosforlipid i dobbeltlag. Uden på denne et tykt lag peptidoglykanlag (murein). Murein er en blanding af hexose sukkertyperne N-Acetyl Glucosamin (NAG) og N-Acetyl Muramicsyre (NAM) og peptider der linker NAG og NAM sammen. Sammenkoblingen katalyseres af transpeptidase. Laget af murein er meget tykt for at modstå det osmostiske tryk. (Se Fig 1.) Gramnegativ Tættest mod cytoplasma er en cytoplasmamembran af fosforlipid i dobbetlag. Uden om dette findes et periplasmatisk rum med et lag murein. Uden på dette et lag lipopolysakkarid (LPS). Mureinen og LPS forbindes af nogle lipoproteiner (se Fig 2.). LPS-delen af membranen har, pga. sin sammensætning af f.eks. O antigener og lipid A, en endotoksisk effekt mod den menneskelige organisme. LPS stimulerer næsten hele vores immunforsvar, som resulterer i feber og kan ende med septisk shock. [4] Fig 1. Viser opbygningen af cellevæggen hos en grampositiv bakterie. Fig 2. Viser opbygningen af cellevæggen hos en gramnegativ bakterie. 3

5 Staphylococcus Stafylokokker er gram positive ubevægelige bakterier, ca. 0,5-1,5 um i størrelse, som lejres i hobe. Der er ca. 20 forskellige arter, som opdeles i koagulase positive staphyloccocus (KPS) (f.eks. SA og S. hyicus) og KNS (f.eks. S. epidermidis, S. saprophyticus, S. hominis mm.). Der er dog untagelser til dette, da der f.eks. findes koagulase negative SA. Dog kan disse identificeres på andre karakteristika som Protein A og bakteriofag typeinddeling. S. aureus SA adskiller sig fra de andre stafylokokker ved at være meget virulent. SA kan producere en del toxiner og enzymer som er hovedårsagen til dens patogenitet. Koagulase og clumping faktor Det extracellulære enzym koagulase, får plasma til at koagulere. Clumping faktor er et overflade protein med lign. funktion Hæmolytiske toxiner Lysering af erythrocytter Hyaluronidase Nedbryder bindevæv Leukocidin Dræber leukocytter Enterotoxiner Hovedårsagen til madforgiftning Epidermiolytisk toxin Giver Staphylococcal Scaled Skin Syndrome (SSSS) Toxic-shocksyndrome toxis Giver rødt udslæt. Kan resultere i afskalning af hud, feber og hypotension β-laktamase Extracellulært enzym der forhindrer penicilliner i at virke Som en del af hudfloraen, har SA adgang til en del hårfollikler i huden, som ender i dermis. Her er SA godt beskyttet og kan formere sig. Inden for 2-4 dage kan ses en infektion med pus dannelse. SA vil langsomt danne en abscess. Immunforsvaret vil reagere på inflammationen, ved et stort antal af neutrophile celler og fibrin. SA kan med enzymet koagulase og clumping faktor, undgå vores immunforsvar ved at indkapsle sig selv. På et tidspunkt kan SA ende i blodbanen (bakteriæmi) og blive ført med rundt, hvor den kan gøre skade andre steder [1,4]. 4

6 Behandling Penicillin blev første gang benyttet på en patient i 1941 [5]. Siden introduktionen af penicillin som behandlinsmetode i midten af 1940 erne, gik der ikke mange år før de første penicillin resistente SA så dagens lys. I begyndelsen af 1960 erne kom methicillin. I 1980 erne begyndte man at rapportere MRSA. Til patienter med penicillin følsomhed eller MRSA, benyttes vancomycin som behandlingsmetode. Dog findes der også vancomycin resistente SA [4, 6]. Fig 3. Viser udviklingen af resistens i takt med indførelsen af nye antibiotika. Resistens Man har fundet 4 varianter af de penicillin bindende proteiner (transpeptidaser mm.), kaldet PBP (1-4). Penicilliner hæmmer PBP aktiviteten, som er med i opbygningen af krydsbindingerne mellem cellevægslagene. I Danmark er ca. 90% af SA penicillin resistente, dette skyldes β-laktamase produktion som inaktiverer antibiotika indeholdende en β-lactam ring (penicilliner, cephalosporiner, cephamycine, carbapenemer og monobactamer). Under 2%, i Danmark, er på nuværende tidspunkt methicillin resistente. Methicillin resistens skyldes PBP 2A. Produktionen af proteinet skyldes et gen kaldet meca. MecA er lokaliseret på Staphylococcus cassette chromosome mec (SSCmec) [1, 7]. Fig 4. Viser den generelle opbygning af mureinlaget. Krydsbindingerne mellem NAG og NAM er illustereret med en blå farve. 5

7 β-laktam antibiotika hæmmer normalt transpeptidase aktiviteten, og derved hæmmes dannelsen af nye cellevægslag. PBP 2A kan fortsætte katalyseringen pga. sin lave affinitet overfor β-laktam antibiotika. Der er for så vidt ingen forskel i hvor virulent MSSA og MRSA er, forskellen er deres resistens, og dermed muligheden for at bekæmpe dem med antibiotika. Resistens kan også forekomme ved hyperproduction af β-lactamase eller lettere muterede PBP. Disse stammer vil dog ikke blive klassificeret som MRSA-stammer, men borderline (oxacillin) resistente staphylococcus aureus (BORSA). Oxacillin har længe været det anvendte antibiotika til diagnosticering af MRSA, deraf navnet. Flere undersøgelser viser imidlertidig at cefoxitin til diagnostisk brug, er bedre til at identificere MRSA [8]. 6

8 Hvordan virker en kromogen selektiv plade? Mediumet indeholder pepton og agar som en standard plade ville gøre. Der er tilsat en saltkoncentration for at fremme vækstforholdene for S. aureus [9] (mindre selektiv del). Dertil kommer en blanding af antibiotika, for at hæmme så mange uønskede bakterier som muligt (den anden selektive del). Derved vil kun de bakterier der er resistente overfor de anvendte antibiotika i mediumet, vokse. Mediumet indeholder en kromogen blanding (den tredje selektive del), hvor kun de bakterier med det rette enzym kan reagere med de kromogene stoffer, hvilket vil resultere i en farvereaktion. Fig 6. Eksempler på kromogener som kan danne forskellige farver. Fig 5. Viser hvordan et farveløst kromogen ved hydrolyse af acetat danner et farvet kromogen. For plader der udnytter bakteriens evne til at danne alfa-glucosidase, sker farveudviklingen ved at der er koblet et sukkerstof (også kaldet glycosider) til et kromogen. Et enzym fraspalter sukkerdelen ved hydrolyse. Kromogenerne går sammen og danner et farvekompleks (Fig 5). Farven er bestemt af det anvendte kromogen (Fig 6). For plader der udnytter bakteriens evne til at danne phosphatase, vil det være en phosphat gruppe der fraspaltes. Alt efter hvad for et enzym man ønsker at påvise, vil man finde et kromogen med et passsende molekyle koblet på R. [10, 11] 7

9 Materialer og Metode Materialer Til at udføre forsøget blev flg. materialer brugt: 91 stk. MRSASelect fra BIORAD 91 stk. chromid MRSA agar fra BioMeriéux 91 stk. Brilliance MRSA fra Oxoid 264 stk. 5% blodagar plader Engangs podepinde Bakterier Der blev benyttet 5 kontrol stammer, 2 MRSA positive (S. aureus ATCC 43300, S. aureus ATCC 33591) og 3 MRSA negative (S. aureus ATCC 25923, S. aureus ATCC 29213, S. epidermidis ATCC 27840). Anbefalede kontrol stammer af firmaerne [Bilag 2-4] MRSASelect fra BIORAD chromid MRSA agar fra biomérieux Brilliance MRSA agar fra Oxoid S. aureus ATCC X X (negativ kontrol) S. aureus ATCC X X (positiv kontrol) S. aureus ATCC X (negativ kontrol) S. aureus ATCC X (positiv kontrol) S. epidermidis ATCC X (negativ kontrol) Ovenstående skema viser de kontrolstammer som jeg har betyttet i mit forsøg. Skemaet viser også de kontrolstammer som firmaerne hver især har anbefalet brugeren af pladerne at benytte (angivet med et X). Der blev benyttet 43 stk. MRSA stammer. Af disse havde 3 stk. zone for cefoxitin på 25 mm og 1 stk. zone for cefoxitin på 30 mm. 8 stk. BORSA stammer. 20 stk. MSSA stammer, hvor 4 stk. havde en zone på 0 mm for penicillin. 15 KNS stammer (11 stk. S. epidermidis, 2 stk. S. haemolyticus, 1 stk. S. capitis, 1 stk. S. hominis). 8

10 Stammerner er fra Rigshospitalets egen kollektion (opbevaret i en fryser v. -80 C). De 15 KNS er blev fundet i rutinen i løbet af projektet. Metode Til at vurdere de kromogene selektive plader udregnes sensitiviteten og specificiteten. Sensitivteten er et mål for hvor god metoden er til at identificere den pågældende sygdom, i mit forsøg hvor god pladen er til at identificere MRSA. Så en høj sensitivitet betyder få falsk negative resultater. Specificiteten er et mål for hvor god metoden er til at udelukke alle dem som ikke har sygdommen, i mit forsøg hvor god pladen er til at identificere non-mrsa. En høj specificitet betyder få falsk positive resultater. Så hvis en plade både har en høj sensitivitet og specificitet betyder et positivt resultat at patienten med stor sandsynlighed har MRSA, og et negativt resultat at patienten med stor sansynlighed ikke har MRSA [1] Sensitiviteten angiver alle de sandt positive som har MRSA. Specificiteten angiver alle de sandt negative som ikke har MRSA. Rigtigheden angiver hvor god pladen er til at finde dem der har MRSA og dem der ikke har MRSA. Sensitivitet og Specificitet, forklaring Syg Rask T+ A B T- C D Syg = MRSA positive, Rask = MRSA negative, T+ = Positiv test, T- = Negativ test Sensitivitet: Specificitet: Rigtighed: A x 100% / A+C ; Sandt positive / (Sandt positivt+falsk negative) D x 100% / B+D ; Sandt negative / (Sandt negative+falsk positive) (A+D) x 100% / A+B+C+D Har ikke medtaget udregninger af den diagnostiske specificitet og diagnostiske sensitivitet. Fordelingen af MRSA og non-mrsa er 1:1, og derfor vil den diagnostiske specificitet og diagnostiske sensitivitet være tæt på den nosografiske sensitivitet og specificitet. Det havde være mere relevant at benytte de diagnostiske værdier hvis prævalensen af MRSA havde været meget lav, f.eks. 2%. 9

11 Fremgangsmåde Alle pladerne blindes på forhånd af vejlederen. Generelt De kromogene selektive plader skal have stuetemperatur, før der må udsåes kolonimateriale på dem. Ved udsåning på de kromogene selektive plader, benyttes kolonier fra en ca. 1 døgn gammel 5% blodplade (har nummer B-1 B-91). Ved udsåning på de kromogene selektive plader, benyttes en ny podepind for hver plade der udsåes på. Dette er for at undgå der overføres plademateriale fra én selektiv plade til en anden. Ved udsåning findes en enkeltliggende koloni (størrelse 1,0-1,5 mm i diameter), i 2. eller 3. strøg, som opdeles i ca. 3 lige store dele. Altså den samme koloni benyttes til de 3 typer af chromogene selektive plader, som har samme nummer. Der benyttes 3-trins spredning, ved udsådningen af kolonimateriale på de kromogene selektive plader og på 5% blodpladerne. For MRSASelect, BIORAD Pladerne skal inkuberes ved i timer, areobt Pladerne må ikke inkuberes i CO 2, da dette kan give falsk negative kolonier Én pink koloni betyder MRSA positiv. Ingen vækst, eller farveløs/svagt pink kolonier, betyder MRSA negativ. For ChromID MRSA agar, BioMérieux Pladerne skal inkuberes ved i timer, areobt Én grøn koloni betyder MRSA positiv. Ingen vækst, eller farveløs/svagt grønnne kolonier, betyder MRSA negativ. Ved et negativt svar, inkuberes pladen i 24 timer mere. For Brilliance MRSA, Oxoid Pladerne skal inkuberes ved i timer, dog ikke over 24 timer. Én blå koloni betyder MRSA positiv. Ingen vækst, eller farveløs/svagt blå kolonier, betyder MRSA negativ. 10

12 Resultater Se [Bilag 5] for udregninger. MRSASelect, BIORAD Non- MRSA Antal Totalt Positive Negative MRSA MRSA-zc* MRSA MSSA SA MSSA-pr** KNS BORSA S. epidermidis S. haemolyticus S. capitis S. hominis *MRSA med zone for cefoxitin (3 stk 25 mm, 1 stk. 30 mm) **MSSA med Penicillin resistens (penicillin zone 0 mm) MRSASelect, BIORAD Syg Rask T T Sensitivitet: 95,4% Specificitet: 95,4% Rigtighed: 95,4% chromid MRSA agar, biomérieux Antal Non- MRSA Totalt Positive 24 timer Negative 24 timer Positive 48 timer MRSA MRSA-zc* MRSA SA KNS Negative 48 timer MSSA MSSA-pr** BORSA S. epidermidis S. haemolyticus S. capitis S. hominis *MRSA med zone for cefoxitin (3 stk 25 mm, 1 stk. 30 mm) **MSSA med Penicillin resistens (penicillin zone 0 mm) 11

13 chromid MRSA agar, biomérieux (efter 24 timer) Syg Rask T T Sensitivitet: 95,4% Specificitet: 88,4% Rigtighed: 91,9% chromid MRSA agar, biomérieux (efter 48 timer) Syg Rask T T Sensitivitet: 95,4% Specificitet: 83,7% Rigtighed: 89,5% Brilliance MRSA agar, Oxoid Non- MRSA Antal Totalt Positive Negative MRSA MRSA-zc* MRSA SA KNS MSSA MSSA-pr** BORSA S. epidermidis S. haemolyticus S. capitis S. hominis *MRSA med zone for cefoxitin (3 stk 25 mm, 1 stk. 30 mm) **MSSA med Penicillin resistens (penicillin zone 0 mm) Brilliance MRSA agar, Oxoid Syg Rask T T Sensitivitet: 95,4% Specificitet: 79,1% Rigtighed: 87,2% 12

14 Diskussion Alle 3 pladetyper, MRSASelect fra BIORAD (MSBR), chromid MRSA agar fra biomérieux (CMBM) og Brilliance MRSA agar fra Oxoid (BMO), fandt de 5 kontrol stammer. MSBR havde anbefalet 2 ud af de 5 kontrolstammer som kontrol for deres plader. CMBM havde anbefalet 2 ud af de 5 kontrolstammer som kontrol for deres plader, hvor S. aureus ATCC var fælles for MSBR og CMBM. BMO havde anbefalet 3 ud af de 5 kontrolstammer som kontrol for deres plade, hvor MSBR og BMO havde S. aureus ATCC til fælles. Der blev benyttet 86 stammer til forsøget, hvor de 43 af disse var MRSA positive og 43 MRSA negative, heriblandt 8 BORSA stammer, 20 MSSA stammer og 15 KNS stammer (11 stk. S. epidermidis, 2 stk. S. haemolyticus, 1 stk. S. capitis, 1 stk. S. hominis). Alle pladerne blev inkuberet v. 37 C i ca. 22 timer. Dette er i overensstemmelse med den angivne data for alle 3 producenter. Før brug blev alle pladerne opbevaret i køleskab ved ca. 5 C, hvilket også er i overensstemmelse med de angivne data. Alle plader havde stuetemperatur før der blev udsået kolonimateriale på dem. Vurderingskriterier Positiv Hvis der voksede en farvet koloni (henholdvis pink/grøn/blå) på pladen, blev den vurderet til at være positiv for MRSA. (Dog blev en kolonimasse ved påførelsesstedet af kolonimateriale, vurderet som negativ). Negativ Hvis der voksede hvide kolonier på pladen blev den vurderet til at være negativ for MRSA (dette gælder også for hvidekolonier med svage farver af pink/grøn/blå). Ingen vækst på pladen blev vurderet til at være negativ for MRSA. (Se [Bilag 6] for billeder) 13

15 MRSASelect, BIORAD MSBR mediumet har en hvid/beige farve. Farvereaktionen sker i mediumet, og en positiv farvet koloni betyder man kan se farven igennem kolonien fra mediumet. Fjernes en koloni fra pladen ses tydeligt en pink farve nedeunder. MSBR havde en sensitivitet på 95,4% og en specificitet på 95,4%. Dette stemmer godt overens med firmaets egen test, som angiver en sensitivitet på 95,8% og en specificitet på 97,9%. BIORAD har 3013 prøver til grundlag for deres tal. Resultater for MRSASelect, BIORAD Sensitivitet: 95,4% Specificitet: 95,4% Rigtighed: 95,4% Artikel [12] giver et overblik over forskellige kromogene medier, i artikler bruges swabs som udsådningsmateriale, hvor jeg bruger renkolonier. De forskellige artikler der har testet MRSASelect (van Hal et. al., 2007, Louie et al., 2006, Stoakes et al., 2006, Ben Nsira et al., 2006, Cherkaoui et al., 2007) får en gennemsnits sensitivitet på 82,9% efter 24 timer og en specificitet på 98,6. Generelt en meget høj specificitet, dvs. en lav hyppighed af falsk positive. Van Hal et al., 2007 [13] har i deres undersøgelse generelt en lavere sensitivitet, specielt ved podninger fra perineum. Louie et al, 2006 [14] finder en høj sensitivitet for perineum, det skal nævnes at denne undersøgelse er finansieret af bl.a. BIORAD. Antallet af prøver er langt højere (6.199 prøver) end for de andre artikler. Van Hal et al., 2007 [13] har f.eks. 205 prøver til deres rådighed. Kommentar I mit forsøg stod det klart for mig at det ikke er nok kun at kigge på pladen. I tilfælde med svage positive, dog positive, bør man fjerne en koloni eller 2 for at se farven på agaren nede under. Jeg testede renkolonier, og dermed havde jeg en stor koncentration af bakterier på hver plade. MSBR havde flere plader hvor der var mange positive kolonier med en stærk pink farve, men på samme plade en masse kolonier med en svag pink farve, som isoleret set ville været blevet tolket som negative af mig. Var disse plader blevet tolket negative ville det havde resulteret i en lavere sensitivitet. 14

16 ChromID MRSA agar, BioMérieux CMBM mediumet har en gennemsigtig farve. Farvereaktionen sker i mediumet, og ved vækst på pladen som er positiv for MRSA, ses grønne kolonier. Farven kan observeres både forfra og bagfra, hvor BioMeriéux angiver at farven er mere instens bagfra. CMBM havde en sensitivitet på 95,4% og en specificitet på 88,4% efter 24 timer, og en sensitivitet på 95,4% og en specificitet på 83,7% efter 48 timer. BioMeriéux angiver 2 forskellige tests i deres vejledning. En fra Frankring hvor de inokulerer fra podninger og får en sensitivitet på 93,3% efter timer og 95,6% efter 48 timer. En fra Belgien hvor de først inokulerer direkte fra podepinde og derefter beriger med BHI-bouillon med 7,5% NaCl før inokulation. De får en sensitivitet på 63,6% efter timer og på 98,1% efter 48 timer. Efter berigelse får de en sensitivitet på 92,7% efter timer og 96,4% efter 48 timer. Testen fra Frankrig har 298 nasale podninger til grundlag for deres tal, testen fra Belgium har 491 prøver (heriblandt nasale, hals, perineum mm.). Resultater for chromid MRSA agar, BioMérieux 24 timer Sensitivitet: 95,4% Specificitet: 88,4% Rigtighed: 91,9% 48 timer Sensitivitet: 95,4% Specificitet: 83,7% Rigtighed: 89,5% Artikel [12] giver et overblik over forskellige kromogene medier, og de forskellige artikler der har testet disse, her er gennemsnittet for 4 forskellige artikler en sensitivitet på 71,2% efter 24 timer og en specificitet på 97,5%. En sensitivitet på 84,2% efter 48 timer og en specificitet på 77,3%. Mine resultater angiver ingen ændring i sensitiviteten efter henholdsvis 24 timer og 48 timer inkubation. Der ses et mindre fald i specificiteten efter 48 timer. Mine resultater passer godt overens med de angivet data i brugervejledningen. Mine resultater for sensitiviten og specificiteten er væsentlig højere end hvad van Hal et al., 2007 [13] finder. De har et stort fald i specificiteten efter pladen har stået i 48 timer, og en stigning i sensitiviteten. En længere inkubationstid har betydet et større antal fundne MRSA, og et større antal falsk positive i form af non-mrsa vurderet som positive. Kommentar Mine observationer igennem forsøget viste at man bør vurdere pladen både forfra og bagfra, især ved svage positive reaktioner (som f.eks. S. epidermidis). Jeg så en tendens efter 48 timer til en grønlig farve, ved nogle af prøverne, dog var den grønne farve ikke grøn som ved f.eks. den positive kontrol. 2 ud af de 4 artikler har et større fald i specificiteten efter 48 timer, 15

17 men en stigning i sensitiviteten, Jeg mener at hvis man går på kompromis med specificiteten for at få en højere sensitivitet, så er det iorden, da det væsentlige er at fange de MRSA positive. Brilliance MRSA agar, Oxoid BMO mediumet har en hvid/beige farve. Farvereaktionen sker i mediet, og en positiv farvet koloni betyder man kan se farven igennem kolonien fra mediet. Fjernes en koloni fra pladen ses tydeligt en blå farve nedeunder. BMO havde en sensitivitet på 95,4% og en specificitet på 79,1%. Oxoid angiver i deres vejledning en sensitivitet på 90,3% og en specificitet på 97,4%. Har ingen artikler til rådighed som har testet BMO. I forhold til Oxoid s egne tal har jeg fundet en langt lavere specificitet. Resultater for Brilliance MRSA, Oxoid Sensitivitet: 95,4% Specificitet: 79,1% Rigtighed: 87,2% Kommentar BMO havde i mine øjne en tendens til at være meget blå, også ved non-mrsa bakterier som voksede på pladen. Hvor både MSBR og CMBM havde svage farvereaktioner ved f.eks. S. epidermidis, havde BMO en mere intens blå farve, som lænede sig op ad den som ses ved den positive kontrol. Fjernede jeg en koloni på pladen, var den også blå, som ved en MRSA positiv. Havde det været nemmere at skelne de blå nuancer fra hinanden, ville specificiteten for BMO havde været langt højere, da jeg ikke var endt med så mange falsk positive. Begrænsninger Som tidligere nævnt udsåede jeg fra renkolonier på de kromogene selektive plader, hvor de artikler jeg refererer til, har udsået fra podepinde/swabs. Koncentrationen af bakterier på mine plader vil i en del tilfælde være langt højere end hvis der var blevet udsået fra podepinde. Jeg har dog prøvet at tage højde for dette ved bl.a. at negligere kolonier der er vokset der hvor jeg har påført kolonimaterialet ved udsåning. I mit forsøg tolkede jeg 3 plader ved siden af hinanden. I de andre undersøgelser er det uvist om pladerne blev tolket i forhold til hinanden eller hver for sig. Det kan have sløret min vurderingsevne når jeg har siddet med pladerne på den måde, og dermed resulteret i en for høj sensitivitet og lav specificitet fra min side. Her tænkes på hvis kolonifarven ligger på grænsen mellem positiv og negativ, og jeg har set en/to af de andre plader været positiv(e), og derfor også vurderet den sidste plade som positiv, kan det f.eks. resultere i en for høj sensitivitet. 16

18 I mit forsøg har jeg kun benyttet stafylokokker. Havde jeg haft podepinde til rådighed, fra patienter og lign., havde der været flere forskellige bakterier som var blevet udsået. Dette kunne f.eks. have resulteret i flere falsk positive kolonier. Så kunne jeg have checket alle positive kolonier for koagulase og vurderet morfologien på pladen, i tvivlstilfælde i et mikroskop, som man ville have gjort i rutinen. Grunden til jeg ikke lavede direkte påvisning af koagulase på kolonierne fra pladerne er at f.eks. BIORAD anbefaler at man overfører en koloni til et generelt vækstmedie for videre identifikation med andre konventionelle metoder. Så for at undersøge dette, skulle jeg have undersøgt tilstedeværelsen af koagulase direkte fra de kromogene plader og fra en 5% blodplade. Dette var ikke den oprindelig idé med forsøget, og ydeligerer forsøg må be- eller afkræfte om der kan laves konventionelle tests direkte fra de kromogene plader. Jeg har testet pladernes evne til at finde MRSA og non-mrsa. Fejlkilder Generelt vil alle bakterier som er resistente, eller hvis de er af typen BORSA, overfor den anvendte mængde af antibiotika i pladerne, kunne vokse. Dertil kommer, at de bakterier som samtidig kan producere det enzym som testes for, vil resultere i farvede kolonier på pladen. Dog vil koloni morfologien højst sandsynlig være anderledes for bakterier som ikke er af typen stafylokokker. Bakterier som er intolerante overfor salt, eller som ikke, trods besiddelse af meca, har kunnet producere nok PBP2 (hypoproduktion), vil ikke vokse frem på pladerne. Hvis en SA ikke kan producere det enzym der er påkrævet for at radikalet kan frakobles kromogenet, vil en evt. MRSA stamme vokse frem, men der vil ikke opstå nogen farvereaktion. 17

19 Afsluttende Generelt De 3 plader set i forhold til hinanden, klarede sig lige godt hvis man kigger på sensitiviten. Hvis man kigger på specificiteten alene, klarede MSBR sig bedst, med kun at fejlidentificere 2 BORSA stammer som MRSA positiv. CMBM og BMO fejlidentificerede hver 5 BORSA stammer og 2 MSSA stammer. BMO fejlidentificerede ydeligerer 2 KNS (S. epidermidis). Specificitet Sensitivitet Overblik over de 3 forskellige kromogene selektive plader (efter 24 timer) 79,1 88,4 95,4 95,4 95,4 95,4 Brilliance MRSA ChromID MRSA MRSASelect Sensitivitet Specificitet Brilliance MRSA 95,4 79,1 ChromID MRSA 95,4 88,4 MRSASelect 95,4 95,4 Ovenstående skema giver et samlet overblik over de 3 pladers sensitivitet og specificitet. BORSA Ved vurdering af resultaterne skal det tages i mente at prævalensen af BORSA stammer højst sandsynlig er langt højere end normalen (ca. 18% af de stammer som er brugt i forsøget er af typen BORSA). BORSA-stammer vil oftest være intermediær for cefoxitin på en resistensplade, hvor den er positiv på de kromogene selektive plader. Både CMBM og BMO fejlidentificerede 5 BORSA stammer, og ved en lavere prævalens af BORSA, ville begge plader højst sandsynlig have haft en højere specificitet. De hyppigste forkomne bakterier i rutinen er KNS og MSSA. Sensitiviteten Det væsentlige for en kromogen selektiv plade er en høj sensitivitet, altså at pladerne kan finde alle de syge. Dette er fordi patienter med MRSA skal i behandling hurtigts muligt og isoleres for at undgå at smitte andre. 18

20 Specificiteten Det er ikke lige så vigtigt med en høj specificitet for de kromogene selektive plader, som det er for sensitiviteten. En høj specificitet vil hurtigt frikende de raske, uden ydeligerer undersøgelser. En lav specificitet vil: 1. Forlænge et evt. negativ svar 2. Betyde ydeligere omkostninger for afdelingen, i form af MRSA meca gentest. Metode i tørre podninger idag vs. kromogen selektiv plade Ved kun at udså på en kromogen selektiv plade, opnår man flg. i forhold til den nuværende metode i tørre podninger: Halvering af udsåningen på pladerne når der screenes for MRSA. På nuværende tidspunkt udsåes på en 5% blodplade og en resistens plade (hvis man antager man kan lave konventionelle test direkte fra de kromogene selektive plader). Hurtigere diagnostistik. Det er nemmere at identificere en farvet koloni end at identificere en SA koloni på en 5% blodplade og derefter skulle måle en diameter zone for cefoxitin. Ydeligere kan der være så mange bakterier på samme plade, at den skal udsåes igen som renkoloni, før man kan finde zonen for cefoxitin. Dette vil forlænge svaret, om det er en MRSA eller non-mrsa, med op til 1 dag, eller mere. Dog kan man ved brug af CMBM skulle vente i op til 48 timer, da den ved negativ svar efter 24 timer, skal inkuberes i ydeligere 24 timer. For at de kromogene selektive plader, ideelt set, kan erstatte den nuværende metode, på klinisk mikrobiologisk afdeling, Rigshospitalet, bør omkostningerne være lig med den nuværende eller lavere (her tænkes på den totale omkostning), og/eller tidsbesparende. Det er svært at få et overordnet overblik over den totale omkostning, da dette omfatter prisen på de kromogene selektive plade, de plader der benyttes på nuværende tidspunkt, personalets tidsforbrug, brug af konventionelle tests (før og efter introduktionen af en kromogen selektiv plade). Herunder afdelingens reelle pris for de ovenstående materialer/produkter. Et positivt resultat for MRSA på de kromogene selektive plader er kun indikativt, og bør bekræftes ved gentest for meca. PCR metoden anses som gold standard de fleste steder. 19

21 Konklusion - MRSASelect fra BIORAD havde en sensitivitet på 95,4% og en specificitet på 95,4% efter 24 timer. -ChromID MRSA agar fra biomérieux havde en sensitivitet på 95,4% og en specificitet på 88,4% efter 24 timer og en sensitivitet på 95,4% og en specificitet på 84,7% efter 48 timer. - Brilliance MRSA agar fra Oxoid havde en sensitivitet på 95,4% og en specificitet på 79,1% efter 24 timer. Kommentar Alle 3 plader havde samme høje sensitivitet. MRSASelect er nem at aflæse og har den højeste specificitet. På pladen har de fremvoksende positive kolonier mange pink nuancer. Det er uvist om en lav koncentration af MRSA vil have en indflydelse på sensitiviteten i en negativ retning. ChromID MRSA agar fra biomeriéux er nemmest at aflæse. Med en høj specificitet efter 24 timer og lidt lavere efter 48 timer. Pladens største ulempe er inkubation tiden, som ved et negativt svar er 48 timer om at frikende den raske patient, hvor de 2 andre plader kun er 24 timer om det samme. Brilliance MRSA fra Oxoid har i testen den laveste specifitet. Den blå farve er meget nem og karakteristisk at aflæse. Udfra et helheds indtryk af de 3 plader, her indgår inkubationstiden, nuanceforskelle på kolonierne, sensitiviteten og specficiteten, rangeres de på følgende måde (gående fra god mod mindre god): ChromID MRSA agar fra biomérieux, Brilliance MRSA agar fra Oxoid og MRSASelect fra BIORAD. Her vægtes sensitiviteten som den vigtigste faktor herefter nuanceforskelle på kolonierne, da det er disse to faktorer der er afgørende for identifikationen af MRSA. 20

22 Perspektivering For ydeligere at kunne fastslå den reelle sensitivitet og specificitet for pladerne, bør pladerne testes med podepinde fra de steder man normalt poder fra. Det tyder på det har betydning for sensitivitet og specificiteten alt efter hvor man poder fra. Tænker man på at benytte pladen i urinerne eller andre steder bør dette også undersøges først. Det tyder på man kan lave konventionelle tests direkte fra pladerne, dog er dette ikke fastslået i mit forsøg. 21

23 Referencer Nr. Kilde 1 Høiby N, Skinhøj P.Klinisk Mikrobiologi og Infektionsmedicin. 3. udgave 1. oplag. København: FADLs forlag A/S; EPI-NYT - MRSA 2007 Zostavax, vaccine mod herpes zoster. Uge 26, Haug E, Sand O, Sjaastad ØV. Menneskets Fysiologi. 4. oplag. København: G.E.C.Gads forlag; Goering RV, Dockrell HM, Zuckerman M, Wakelin D, Roitt IM, Mima Cedric et al. Mim s Medical Microbiology. 4 th Edition. Mosby Elsevier; Frimodt-Møller N. Penicillin og antibiotika. 3. januar, 2000, nr Garhn-Hansen B, Espersen F, Frimodt-Møller N, Riegels-Nielsen P, Perdersen SS. Infektioner med Staphylococcus aureus - klinik og behandling. Ugeskrift for læger, 2002, 164(32): Berger- Bächi B, Rohrer S. Factors influencing methicillin resistance in staphylococci. Arch Microbiology, 2002, 178, Velasco D, Tomas MM, Cartelle M, Beceiro A, Perez A, Molina F et al. Evaluation of different methods for detecting methicillin (oxacillin) resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2005, 55, Jorgensen JH, Redding JS, Maher LA, Ramirez PE. Salt-Supplemented Medium for Testing Methicillin-Resistant Staphylococci with Newer β-lactams. Journal of Clinical Microbiologi, Sep 1988, Brown A. Chromogenic media: bacteriology in colour. The Biomedical Scientist, Jun 2007, Perry JD, Freydière AM. The application of chromogenic media in clinical microbiology. Journal of Applied Microbiology, 2007, 103, Malhotra-Kumar S, Haccuria K, Michiels M, Ieven M, Poyart C, Hryniewicz W et al. Current Trends in Rapid Diagnostics for Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus and Glycopeptide-Resistant Enterococcus Species. Journal of Clinical Microbiology, May 2008, Van Hal SJ, Stark D, Lockwood B, Marriott D, Harkness J. Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Detection: Comparison of Two Molecular Methods (IDI- MRSA) PCR Assay and GenoType MRSA Direct PCR Assay) with Three Selective MRSA Agars (MRSA ID, MRSASelect, and CHROMagar MRSA) for Use with Infection-Control Swabs. Journal of Clinical Microbiology, Aug 2007, Louie L, Soares D, Meaney H, Vearncombe M, Simor AE. Evaluation of a new chromogenic medium, MRSA Select. For Detection of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Microbiology, Dec 2006, Type Bog Nyhed sbrev Bog Bog Artikel Artikel Artikel Artikel Artikel Artikel Artikel Artikel Artikel Artikel 22

24 Øvrig anvendt litteratur 1 Brugervejledning/indlægsseddel til MRSASelect, BIORAD 2 Brugervejledning/indlægsseddel til chromid MRSA agar, biomérieux 3 Brugervejledning/indlægsseddel til Brilliance MRSA agar, Oxoid Figure Goering RV, Dockrell HM, Zuckerman M, Wakelin D, Roitt IM, Mima Cedric et al. Mim s Medical Microbiology. 4 th Edition. Mosby Elsevier; Figure Brown A. Chromogenic media: bacteriology in colour. The Biomedical Scientist, Jun 2007, Fig 3. 6 Brown A. Chromogenic media: bacteriology in colour. The Biomedical Scientist, Jun 2007, Fig 4. 23

25 Bilag 1 Procedure ved fund af MRSA 24

26 Bilag 2 Kontrol stammer anbefalet af biomérieux Kvalitetskontrol Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus aureus ATCC Forventede resultater: Stamme Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus aureus ATCC Resultater ved C Vækst inden Grønne kolonier for 24 timer Ingen vækst inden for 48 timer Ovenstående er et uddrag af den medfølgende brugervejledning fra biomérieux vedrørende chromid MRSA agar. 25

27 Bilag 3 Kontrol stammer anbefalet af BIORAD Kvalitetskontrol S. aureus ATCC Test organisms at a concentration of CFU/plate S. aureus ATCC Test organisms at a concentration of CFU/plate Test strain Expected Results after hours at C S. aureus ATCC Ingen Vækst S. aureus ATCC Vækst små pink kolonier Ovenstående er et uddrag af den medfølgende brugervejledning fra BIORAD vedrørende MRSASelect. 26

28 Bilag 4 Kontrol stammer anbefalet af Oxoid Kvalitetskontrol Positive Controls: Staphylococcus aureus NCTC10442 Staphylococcus aureus ATCC Negative Controls: Staphylococcus epidermidis ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Staphylococcus aureus ATCC Proteus mirabilis ATCC Expected results Blue colonies Blue colonies Inhibited Inhibited Inhibited Inhibited Ovenstående er et uddrag fra Oxoid s hjemmeside vedrørende Brilliance MRSA agar ( 27

29 Bilag 5 Rådata og udregninger Nedenstående skema viser et udpluk af den måde jeg vurderede mine plader på, og de medfølgede kommentar jeg havde undervejs. Nr. Firma(plade) Vækst/farve Pos/Neg Kommentar MRSASelect, Biorad + / Pink Pos Pink kolonier i alle 3 strøg B-1 CHROMagar, BioMeriéux + / Grøn Pos Grønne kolonier i alle 3 strøg Brlliance MRSA, Oxoid + / Blå Pos Blå kolonier i alle 3 strøg B-2 MRSASelect, Biorad (+) / Hvidpink Neg Vækst i strøg, hvidpink v. Påførelsessted CHROMagar, BioMeriéux + / Hvidgrøn Neg Vækst i strøg hvide kolonier. Minimal hvidgrøn farve. Neg v. 48t Brlliance MRSA, Oxoid + / Hvidblå Pos Vækst i strøg hvidblå, mest ved påførelsesstedet. Få blå kolonier MRSASelect, Biorad + / Pink Pos Pink kolonier i alle 3 strøg B-3 CHROMagar, BioMeriéux + / Grøn Pos Grønne kolonier i alle 3 strøg Brlliance MRSA, Oxoid + / Blå Pos Blå kolonier i alle 3 strøg MRSASelect, Biorad - Neg Pink v. påførelsessted minus koloni B-4 CHROMagar, BioMeriéux - Neg - / Neg v. 48t Brlliance MRSA, Oxoid - Neg Blå v. påførelsessted minus koloni MRSASelect, Biorad + / Pink Pos Pink kolonier i alle 3 strøg B-5 CHROMagar, BioMeriéux + / Grøn Pos Grønne kolonier i alle 3 strøg Brlliance MRSA, Oxoid + / Blå Pos Blå kolonier i alle 3 strøg Efter at havde vurderet alle mine plader som enten positiv eller negativ for MRSA, blev de sammenlignet med blindingslisten. Nedenstående skema viser et udpluk af blindingslisten Nr. Blind Navn Nr. Blind Navn Nr. Blind Navn nr. nr. nr A8 BORSA 1487/ B8 BORSA 1509/ C8 BORSA 1558/ A1 MRSA A2 MRSA A3 MRSA A1 MSSA A2 MSSA A3 MSSA D8 BORSA 2245/ E8 BORSA 2428/ F8 BORSA 2806/ D7 MRSA 66223/ E7 MRSA F7 MRSA 29833/04 Herefter blev alle pladerne katagoriseret og data udregnet i henhold til nedenstående skema 28

30 Eksempel på udregning MRSASelect fra BIORAD Syg Rask T T Sensitivitet: 41 x 100% / 2+41 = 95,4% Specificitet: 41 x 100% / 2+41 = 95,4% Rigtighed: (41+41) x 100% / = 95,4% 29

31 Bilag 6 Vurdering af positive og negative plader MRSASelect, BIORAD Ovenstående billede viser en MRSA-negativ bakterie stamme, til venstre, og en MRSA-positiv bakterie stamme, til højre. ChromID MRSA agar, biomérieux Ovenstående billede viser en MRSA-negativ bakterie stamme, til venstre, og en MRSA-positiv bakterie stamme, til højre. Brilliance MRSA agar, Oxoid Ovenstående billede viser en MRSA-negativ bakterie stamme, til venstre, og en MRSA-positiv bakterie stamme, til højre. 30