- PDF Free Download

Transkript

1 B Directigen RSV Til direkte påvisning af respiratorisk syncytialvirus (RSV) L JAA 2006/06 Dansk Se symbolglossaret i slutningen af indlægssedlen UU S Patent No 5,093,231; 5,135,847 Patent pending TILSIGTET BRUG Directigen respiratorisk syncytialvirus (RSV) testen er en in vitro enzymimmunanalyse (EIA) membrantest til hurtig og kvalitativ påvisning af RSV-antigen direkte fra nasopharyngeale præparater RESUMÉ OG FORKLARING De procedurer, der aktuelt anvendes til at diagnosticere respiratorisk syncytialvirus (RSV) infektion, omfatter amplifikation/isolering i vævskultur efterfulgt af immunfluorescens (IF) bekræftelse af cytopatologiske virkninger i cellekultur (CPE), eller påvisning af en firefold stigning i antistoftiter i parrede akutte og rekonvalescentsera I den seneste tid er direkte eller indirekte immunoanalyser med IF og mikrobrønd/glas blevet anvendt med eller uden bekræftelse af kultur som en "hurtig" påvisningsmetode til RSV 1-4 Påvisning af Directigen RSV antigenet anvender en analyse med enzymimmunmembranfilter til at påvise RSV antigen, som er ekstraheret fra egnede præparater fra symptomatiske patienter Den samlede testtid er mindre end 15 min og reaktivitet afgøres ved visuel farveudvikling Hastigheden og arbejdsgangen for Directigen RSV testen gør den anvendelig som en "STAT" RSV test - der giver hurtig og relevant information til hjælp ved specifik antiviral intervention og støtteafgørelser PROCEDURENS PRINCIPPER Ekstraherede nasopharyngeale præparater tilsættes i et ColorPAC testapparat, og RSV antigenet bindes til membranoverfladen, når præparatet passerer gennem membranen Detektorenzymkonjugerede monoklonale antistoffer, der er specifikke for RSV nukleoprotein og fusionsprotein bindes til det fangede antigen efter tilsætning til ColorPAC membranen Dernæst tilsættes to substrater efter hinanden og de inkuberes i fem minutter, som resulterer i en violet trekant, der udvikles på membranen, hvilket indikerer en positiv test REAGENSER Directigen RSV testen inkluderer: ColorPAC apparater (40) 40 testkit (20) 20 testkit Apparater med flowstyringsenheder indeholdende en kontrolprik af inaktiveret RSV i midten af membranen DispensTube (40) 40 testkit Glas og spidser (20) 20 testkit Reagens A (4,5 ml) Ekstrakt, 4 % mukolytisk stof og 16 % vaskemiddel med 0,2 % natriumazid (konserveringsmiddel) Reagens 1 (7,0 ml) Skylning, 50 mm Tris-Saline, med 0,2 % natriumazid (konserveringsmiddel) Reagens 2 40 tests (7,0 ml) Detektor, anti-rsv (Monoklonale antistoffer fra mus) - enzymkon 20 tests (3,5 ml) jugeret, med 0,2 % natriumazid (konserveringsmiddel) Reagens 3 (13,5 ml) Skylning, 50 mm Tris-Saline, med 0,2 % natriumazid (konserveringsmiddel) Reagens 4 (7,0 ml) Farveudviklingssubstrat A, 0,4 mm kromogen, med 0,02 % natriumazid (konserveringsmiddel) Reagens 5 (7,0 ml) Farveudviklingssubstrat B, 7,8 mm kromogen, med 0,2 % natriumazid (konserveringsmiddel) Reagens 6 (7,0 ml) Stop, 150 mm citronsyre Control + (1,0 ml) Positiv kontrol, vaskemiddel-behandlet RSV antigen med 0,2 % natriumazid (konserveringsmiddel) Control (1,0 ml) Negativ kontrol, vaskemiddel-behandlede non-inficerede HEp-2 celler med 0,2 % natriumazid (konserveringsmiddel) 1

2 Advarsler og forholdsregler: Til in vitro diagnostik Reagenser: Må ikke bruges efter udløbsdatoen Reagenser fra forskellige kit-lotnumre må IKKE blandes Hætterne til reagensflaskerne må ikke blandes For at sikre korrekt tilførsel skal DispensTube anordninger og reagensflasker holdes lodrette (ca 2,5 cm fra ColorPAC membranoverfladen eller glasset), mens der forsigtigt dispenseres en dråbe ad gangen i hurtig rækkefølge RSV Control + og kontrolpletten på ColorPAC membranen er præpareret af RSV-inficerede vævskulturceller, som er blevet inaktiveret og derefter testet med bioanalyseprocedurer Undgå at reagenserne får kontakt med hud og slimhinder Hvis reagenser får kontakt med disse områder, skylles med vand og en læge kontaktes Advarsel: Reagenser indeholder natriumazid Meget giftig ved indånding, ved hudkontakt og ved indtagelse Udvikler meget giftig gas ved kontakt med syre Kommer stoffet på huden, vaskes straks med store mængder vand Natriumazid kan reagere med bly- og kobberrør og danne yderst eksplosive metalazider Ved bortskaffelse skylles med rigeligt vand for at forhindre ophobning af azider Podepinde: Det anbefales at bruge podepinde med polyester- eller rayonspids og aluminiumtråd til nasopharyngeale podninger (NPS) Podepinde af calciumalginat anbefales ikke til brug med Directigen RSV testen Kontroller: Kittet må ikke anvendes, hvis Control + og Control - ikke viser passende resultater ColorPAC apparat: Tag apparatet (med den isatte flowstyring) ud af folieposen lige inden anvendelse Opbevaring: Opbevares ved stuetemperatur (15-30 C) eller i køleskab MÅ IKKE FRYSES PRØVEINDSAMLING OG -HÅNDTERING Se illustrationen, side 8 Transportér friske præparater til laboratoriet (så hurtigt som muligt) i et egnet flydende transportsystem Præparater kan opbevares ved 2-8 C i op til 48 h eller -20 C i op til en uge inden bearbejdning Undlad at centrifugere præparaterne inden brug med Directigen RSV testen, da fjernelse af cellulært materiale vil forringe testens følsomhed Stærkt blodige præparater bør ikke testes med Directigen RSV testen Præparater indeholdende synligt blod har vist sig at give enten ikke-tolkelige eller falsk-positive resultater, når de bearbejdes med denne test Advarsel: Patogene mikroorganismer, herunder hepatitisvira og humant immundefekt virus, kan forekomme i kliniske præparater "Standardforholdsregler" 5-8 og institutionelle retningslinier skal overholdes ved håndtering af alle emner, der er kontamineret med blod og andre legemsvæsker KLARGØRING AF PRÆPARAT Acceptable præparater omfatter friske eller frosne nasopharyngeale skylninger, nasopharyngeale aspirater og podninger så vel som trachealaspirater Nasopharyngeale skylninger og aspirater har dog vist sig at være bedre end podninger, og de er de foretrukne præparater 9-11 BEMÆRK: Stærkt mukøse præparater vil muligvis ikke blive absorberet i ColorPAC membranen eller kan give ikke-tolkelige resultater Disse præparater kan enten fortyndes 1:4 med 0,9 % saltvand eller justeres med 0,9 % saltvand til en McFarland standard nr 1, blandes godt, og en 250 µl afmåling testes Som et alternativ til at foretage en fortynding kan stærkt mukøse præparater behandlet med et ekstraktreagens udsættes for en kortvarig sonisk procedure inden tilsætning til ColorPAC apparatet Procedure til brug med nasopharyngeale skylninger: 1 Nasopharyngeale skylningsmængder på 3 til 4 ml anbefales 2 For store skylningsmængder kan resultere i nedsat testfunktion 3 Præparatet bearbejdes som beskrevet i Testprocedure, "Præparatekstraktion" Procedure til brug med nasopharyngeale aspirater: 1 Nasopharyngeale aspirater på under 0,5 ml skal spredes i mindst 3 ml transportmedium eller saltvand inden bearbejdning 2 Aspirater på mere end 0,5 ml kræver en tilsætning af transportmedium eller saltvand på mere end eller lig med 4 ml 3 Præparatet bearbejdes som beskrevet i Testprocedure, "Præparatekstraktion" Procedure til brug med nasopharyngeale podninger: 1 Nasopharyngeale podninger bør tilsættes et 0,75-3 ml transportmedium eller saltvand inden bearbejdning 2 Slyng podningen og transportmediet eller saltvandsopløsningen 3 Fjern så megen væske fra podepinden som muligt 4 Kassér podepinden på korrekt vis 5 Præparatet bearbejdes som beskrevet i "Testprocedure", "Præparatekstraktion" 2

3 PROCEDURER Vedlagte materialer: Se "Reagenser" for vedlagte materialer Nødvendige materialer, der ikke er vedlagt: Der kræves nødvendigt udstyr og laboratorieudstyr til transport, opbevaring, håndtering og tildeling af præparater Transportmedier: Følgende transportmedier er blevet testet og fundet kompatible med Directigen RSV testen: Saltvand, fysiologisk VIB plus 0,5 % BSA Saltvand med fosfatbuffer (PBS) Earle's Minimal Essential Medium (EMEM) PBS plus 0,5 % gelatine EMEM med lactalbuminhydrolysat PBS plus 0,5 % bovint serumalbumin (BSA) Trypticase sojabouillon plus 0,5 % gelatine Viral Culturette M5 medier Kalveinfusionsbouillon (VIB) Andre transportmedier kan anvendes, hvis en passende kvalifikationstest udføres først Som en forholdsregel bør alle transportmedier godkendes med Directigen RSV inden brug For at godkende transportmedier skal afmålinger af medier udsås med et kendt positivt materiale og et kendt negativt materiale, og derefter testes med analysen Der skal opnås passende resultater Udførelse af test: Gennemse afsnittene "Advarsler og forholdsregler", "Præparathåndtering", "Klargøring af præparat" og "Resultater" Reagenser, præparater og ColorPAC apparater skal have stuetemperatur (15-30 C), når de bruges Testprocedure Anbring en DispensTube i det dertil beregnede område af arbejdsstationen Klargøring af ColorPAC Sørg for, at flowstyringen sidder ordentlig fast i ColorPAC apparatet Præparatekstraktion Slyng præparatet Overfør 250 µl af præparatet med pipette til DispensTube anordningen Reagens A Dispensér 3 dråber i DispensTube anordningen Slyng eller bland grundigt BEMÆRK: Kvalitetskontrol Control + eller Control kan bruges i stedet for patientprøver til kvalitetskontrolformål Dispensér 5 dråber grundigt blandet Control + eller Control i en DispensTube anordning, efterfulgt af 3 dråber Reagens A Bland grundigt Indfør en spids i DispensTube anordningen BEMÆRK: Der må ikke anvendes spidser fra andre Directigen produkter Vend op og ned og klem omhyggeligt Al præparatekstraktet dispenseres dråbevis i hurtig rækkefølge (undgå for stor tilsætning af bobler) i ColorPAC testbrønden Hvis præparatet ikke absorberes i apparatet inden for 5 min, fortyndes der som beskrevet i "Klargøring af præparat", og der testes igen 3

4 Farveudvikling Tag flowstyringen af ColorPAC apparatet Bortskaf den som biologisk farligt materiale Reagens 1 bland grundigt Tilsæt 4 dråber på ColorPAC membranen Reagens 2 bland grundigt Tilsæt 4 dråber på ColorPAC membranen Lad det henstå 2 min Reagens 3 bland grundigt Tilsæt 4 dråber på ColorPAC membranen Reagens 4 bland grundigt Tilsæt 4 dråber på ColorPAC membranen Reagens 5 bland grundigt Tilsæt 4 dråber på ColorPAC membranen Lad det henstå 5 min Aflæs resultatet i et velbelyst område og notér testresultaterne Niveau 1 Niveau 2 Kvalitetskontrol: Hvert Directigen RSV ColorPAC apparat indeholder både indvendige positive og negative kontroller (dvs to niveauer) Tilsynekomsten af en violet kontrolprik udløser en intern positiv reaktivitetskontrol (niveau 1), der validerer apparatets immunologiske integritet, korrekt reagensfunktion samt sikrer at den korrekte testprocedure blev fulgt Membranområdet, der omgiver trekanten, er den interne negative kontrol (niveau 2) for apparatet Mangel på farveudvikling i dette baggrundsområde betyder, at testen er blevet udført korrekt Flydende Positive (Control +) og Negative (Control ) kontroller er også vedlagt hvert kit Disse kontroller medfølger som en metode til ekstra kvalitetskontrol Som et minimumskrav bør de flydende kontroller køres som en kvalitetskontrol for hvert lot af hver modtaget levering Dannelsen af en violet trekant på membranen, når Control + anvendes, tyder yderligere på, at membranens RSV antigen bindingsegenskab fungerer Må ikke anvendes, hvis Control + og Control ikke giver passende resultater Væskekontroller kan også bruges til at demonstrere en svag positiv eller negativ reaktion Som beskrevet under "Testprocedure" vil Control + vise en stærk positiv reaktion Fortynding (1:2 maksimum) af Control + med saltvand kan udføres og testes for at påvise en svagere positiv reaktion Reagensers funktion og teknik kan også evalueres ved brug af præparater, der vides at være positive eller negative 4

5 Krav til kvalitetskontrol skal udføres i overensstemmelse med gældende lokale og/eller nationale regulativer eller akkrediteringskrav samt laboratoriets standardkvalitetskontrolprocedurer Det anbefales at læse de relevante CLSI (tidligere NCCLS)-retningslinjer og CLIA-regulativer mht passende kvalitetskontrolprocedurer RESULTATER BEMÆRK: Resultater kan aflæses i op til yderligere 10 min inden tilsætning af Reagens 6 VALGFRIT For yderligere at udvide udlæsningstidsperioden til maksimum 12 h tilsættes 4 dråber af Reagens 6 (Stopopløsning) på ColorPAC membranen Positiv test (antigen til stede) En violet trekant (af en hvilken som helst intensitet) kommer til syne på ColorPAC membranen og indikerer, at RSV antigen kunne påvises i præparatet Baggrundsområdet bør være hvidt til lys violet En violet prik vil være tydelig i midten af trekanten, medmindre den tilsløres af en intens positiv trekant Positiv Negativ Negativ test (antigen ikke fundet) - Ingen violet trekant er synlig, hvilket indikerer, at RSV antigen ikke kunne påvises i præparatet En violet prik kommer til syne på ColorPAC membranen, hvilket indikerer korrekt funktion af testproceduren og reagenser Baggrundsområdet bør være hvidt til lys violet Ikke-tolkelig Ikke-tolkelig test Testen kan ikke tolkes, hvis en violet prik ikke er synlig Enhver ufuldstændig trekant skal betragtes som en ikke-tolkelig test Hvis testen ikke er tolkelig, skal den gentages Testresultatet er også ikke-tolkeligt, hvis en hvid trekant kommer til syne på ColorPAC membranen og hele den omgivende baggrundsmembran er violet En dæmpet kontrolprik kan være tydelig i midten af den hvide trekant En minimumsfortynding af præparatet på 1:4 med 0,9 % saltvand eller en justering til en McFarland standard nr 1 vil typisk korrigere dette problem og vil, når det gentestes, give et tolkeligt resultat Stærkt mukøse præparater vil muligvis ikke blive absorberet i ColorPAC membranen eller kan give ikke-tolkelige resultater Disse præparater kan fortyndes 1:4 med saltvand, blandes grundigt og testes igen Hvis De har behov for yderligere assistance, skal De kontakte den lokale BD repræsentant PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER Ætiologien af luftvejsinfektioner, der er forårsaget af andre mikroorganismer end den respiratoriske syncytialvirus, vil ikke blive fastlagt med denne test Directigen RSV er i stand til at påvise både levedygtige og ikkelevedygtige RSV partikler Directigen RSV testfunktionen afhænger af antigenmængden, og korrelerer muligvis ikke med vævskultur, der dyrkes på samme præparat Det er tidligere blevet fastlagt, at friske præparater foretrækkes frem for frosne til RSV testning Sidstnævnte kan resultere i sub-optimal testfunktion Utilstrækkelig præparatindsamling, forkert prøvehåndtering/transport eller lave virusniveauer kan give et falsk-negativt resultat Derfor kan et negativt testresultat ikke eliminere muligheden for en RSV infektion Patientdiagnosen bør altid omfatte laboratorietestresultater sammen med al anden tilgængelig klinisk information Validiteten af Directigen RSV testen er ikke blevet bevist for identifikation/bekræftelse af vævskulturisolater FORVENTEDE VÆRDIER Hyppigheden af positivitet, der observeres i respiratorisk syncytialvirustestning, vil variere afhængigt af præparatindsamlingsmetoden, det anvendte håndterings/transportsystem, den anvendte påvisningsmetode, årstid, patientens alder, geografisk lokalisering, og vigtigst af alt, den lokale sygdomsprævalens FUNKTIONSDATA Klinisk nøjagtighed: Funktionen af Directigen RSV testen blev bestemt i retrospektive og prospektive evalueringer udført af uafhængige investigatorer I alt 281 frosne præparater, bestående af nasopharyngeale skylninger fra hospitalsindlagte, RSV-symptomatiske patienter blev testet med Directigen RSV testen af to uafhængige investigatorer I alt 170 præparater var negative og 106 præparater var positive for RSV, bestemt med vævskultur Tabel 1 viser en oversigt over resultater Sammenlignet med vævskultur er følsomheden af Directigen RSV testen 97 % (103/106), og specificiteten er 97 % (166/170) Fem ikke-tolkelige resultater 2 % (5/281) blev også opnået 5

6 Tabel 1 Overensstemmelse mellem Directigen RSV resultater og vævskulturresultater Directigen RSV Vævskultur Antal Positiv Negativ Positiv for RSV Negativ for RSV 170 4* 166 *Tre ud af fire var vævskulturnegative og IFA positive I alt 528 nasopharyngeale skylninger fra hospitalsindlagte, RSV-symptomatiske patienter blev evalueret eksternt med Directigen RSV i sæsonen af to uafhængige investigatorer Vævskultur var den primære referencemetode; IFA og blokeringsanalyser afklarede afvigelser, når det var relevant I alt 334 præparater var negative og 194 præparater var positive for RSV, bestemt med referencemetoderne Tabel 2 viser en oversigt over Directigen RSV resultater I denne prospektive undersøgelse er følsomheden af Directigen RSV testen 93 % (181/194), og specificiteten er 90 % (302/334) Tabel 2 Overensstemmelse mellem Directigen RSV resultater og vævskulturresultater Directigen RSV Vævskultur Antal Positiv Negativ Positiv for RSV Negativ for RSV Undersøgelser af krydsreaktivitet/interferens De bakterielle og virale mikroorganismer, der angives i Tabel 3 og 4, blev brugt til at vurdere både krydsreaktivitet og interferens i Directigen RSV testen Der blev ikke bemærket nogen reaktivitet eller interferens i analysen for nogen af de angivne mikroorganismer Tabel 3 Panel af bakteriel krydsreaktivitet/interferens Candida albicans Chlamydia psittaci Chlamydia trachomatis Corynebacterium diphtheriae Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Neisseria meningitidis Tabel 4 Panel af viral krydsreaktivitet/interferens Adenovirus 5 Cytomegalovirus Adenovirus 7 Echovirus 11 Adenovirus 10 Echovirus 3 Coxsackie A9 Echovirus 6 Coxsackie B5 HSV Type 1 Coxsackie B6 HSV Type 2 Pseudomonas aeruginosa Serratia marcescens Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus Streptococcus art gruppe A Streptococcus art gruppe F Streptococcus art gruppe G Streptococcus pneumoniae Influenza A Victoria Rhinovirus 2 Influenza B Great Lakes Rhinovirus 13 Parainfluenza 1 Rhinovirus 15 Parainfluenza 2 Rhinovirus 37 Parainfluenza 3 Varicella (Webster) Rhinovirus 1A BESTILLING Kat nr Beskrivelse Directigen RSV (Respiratorisk syncytialvirus) kit, 20 bestemmelser Directigen RSV (Respiratorisk syncytialvirus) kit, 40 bestemmelser LITTERATUR 1 Waner, J L, N J Whitehurst, S Jonas, L Wall, and H Shalaby 1986 Isolation of viruses from specimens submitted for direct immunofluorescence test for respiratory syncytial virus J Ped 108: Swenson, P D, and M H Kaplan 1986 Rapid detection of respiratory syncytial virus in nasopharyngeal aspirates by a commercial enzyme immunoassay J Clin Microbiol 23: Hughes, J D, D R Mann, and V V Hamparian 1988 Detection of respiratory syncytial virus in clinical specimens by viral culture, direct and indirect immunofluorescence, and enzyme immunoassay J Clin Microbiol 26: Bromberg, K, G Tannis, B Daidone, L Clarke, and M F Sierra 1985 Comparison of orthorespiratory syncytial virus enzyme-linked immunosorbant assay and HEp-2 cell culture J Clin Microbiol 22:

7 National Committee for Clinical Laboratory Standards 2001 Approved Guideline M29-A2 Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed NCCLS, Wayne, Pa Garner, J S 1996 Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U S Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention Guideline for isolation precautions in hospitals Infect Control Hospital Epidemiol 17:53-80 U S Department of Health and Human Services 1999 Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed U S Government Printing Office, Washington, D C Directive 200/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workiers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC) Official Journal L262, 17/10/2000, p Masters, H B, K O Weber, J R Groothuis, C G Wren, and B A Lauer 1987 Comparison of nasopharyngeal washings and swab specimens for diagnosis of respiratory syncytial virus by EIA, FAT, and cell culture Diagn Microbiol Infect Dis 8: Ahluwalia, G J, J Embree, P McNicol, B Law, and G W Hammond 1987 Comparison of nasopharyngeal aspirate and nasopharyngeal swab specimens for respiratory syncytial virus diagnosis by cell culture, indirect immunofluorescence assay, and enzyme-linked immunosorbent assay J Clin Microbiol 25: Greenberg, S B and L R Krilov 1986 Cumitech 21, Laboratory diagnosis of viral respiratory disease Coordinating ed, W L Drew and S J Rubin American Society for Microbiology, Washington, D C 7

8 Procedurer til indsamling af præparater 2 Indsamling af et nasopharyngealt aspirat Forbind den ene ende af en aspirationsfælde til en aspirationspumpe og indfør den anden slange gennem et næsebor og ind i næsekaviteten. Kør aspirationspumpen og indsaml næseaspiratet i aspirationsfælden. 70 Bøj patientens hoved tilbage i en 70 grader vinkel. A Næsebor A B Nedre mediale område af inferiore concha nasalis B C Bagsiden af svælget (posteriore nasopharynx) C 3 Indsamling af en nasopharyngeal podning Indfør en podepind gennem et næsebor og ind i posteriore nasopharynx og drej podepinden rundt flere gange for at indsamle et præparat fra slimhindeepithelet. 1 Indsamling af en nasopharyngeal skylning Fyld en 3-5 ml sprøjte sat på en 20 cm gummislange med fysiologisk saltvand. En gummikugle kan også bruges. Indfør enden af gummislangen eller kuglen gennem et næsebor og ind i næsekaviteten. Injicér saltvandet og sug det straks ud. 8

9 9

10 Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, Maryland USA BENEX Limited Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Shannon, County Clare, Ireland Tel: Fax: BD, BD Logo, Directigen, ColorPAC, Culturette, DispensTube and Trypticase are trademarks of Becton, Dickinson and Company 2006 BD