Humane embryonale cellers neurologiske potentiale

Transkript

1 Elise Hoffmann Munk Nielsen STAMCELLER 795 Humane embryonale cellers neurologiske potentiale Og immunafstødningsproblematikken Dette er den anden af 5 artikler, der gør status over de senere års resultater inden for human embryonal stamcelleforskning. Artiklerne beskriver først forskning inden for en specifik vævstype, dernæst gives et generelt perspektiv på det, såsom terapeutisk kloning, teratomdannelse, transplantatsafstødning og etiske problemstillinger. Her behandles celler, der har neurologiske karakteristika, og manipulationen med immunsystemet mhp. at undgå afstødning efter transplantation. biografi: Forfatteren er turnuslæge. Hun har som lægestuderende i samarbejde med endokrinologisk afdeling på Odense Universitetshospital lavet et literaturstudie om de seneste års udvikling inden for stamcelleforskning. forfatters adresse: Nørrebrogade 164A, 5. sal, 2200 København N. eniel99@student.sdu.dk I forbindelse med nervesystemets sygdomme f.eks. Parkinson, ALS, sklerose og følger efter blodpropper har forskere arbejdet med mange forskellige muligheder inden for stamcelleterapi. Der arbejdes på at generere flere typer celler, både neuroner og støtteceller som oligodendrocytter og astrocytter til erstatning af dysfunktionelle eller manglende celler. Man arbejder med at dyrke voksne humane precursor-stamceller i laboratorier med henblik på proliferation og uddifferentiering til færdige neuronale celler til transplantation. Endvidere forsøges det at implantere disse voksne stamceller i dyr for at se, hvordan modtagervævet influerer på de transplanterede celler. I andre protokoller forsøges kroppens egne reparationsmekanismer induceret, bl.a. ved indgivelse af den føtale transformationsvækstfaktor-alfa (TGF-alfa). Endelig har man i både dyre- og humane forsøg transplanteret føtale precursor-stamceller, for at undersøge deres indvirkning på et sygdomsforløb. I forbindelse med transplantation af væv arbejder forskere med forskellige muligheder for at omgås immunafstødning af stamcellerne, og dette emne vil blive belyst sidst i artiklen. Forskning i humane embryonale stamceller (Tabel 1) Humane embryonale stamceller (hes) har flere fordele, som på mange måder øger de-

2 796 Celletype Betegnelse Fordele Ulemper Dyreceller Voksne stamceller MSC,* Plasticitet? Totipotens (eks. mus) (specialiserede HSC,* Udvikles til proliferer dårligt stamceller) NSC,* precursor osv. Embryonale (M)ES Pluripotens Opfører sig ikke stamceller Nemme at helt som hes identificere, isolere og dyrke Karcinogene (M)EC Profilerer godt, Kan ikke stamceller mindre afhængige differentiere af feeder layers helt så godt end hes som hes Embryonale Pluripotens Lavere proliferakønsceller Skal ikke dannes tionsevne end hes (progenitor-celler) (M)EG via IVF eller kloning Teratomdannelse Humane Voksne stamceller MSC,* Er i klinisk brug Teratomdannelse celler (specialiserede HSC,* Muligvis plasticitet Prolifererer dårligt stamceller)**** NSC,* Genetisk in vitro osv. reprogrammering Vanskelige at isolere Embryonale hes Pluripotens Etisk kompromitterende stamceller Nemme at identificere, Endnu manglende isolere og dyrke kontrol over specifik Stort udviklings- differentiering potentiale Karcinogene HEC Se musekarcinogene Kan ikke differentiere stamceller stamceller helt så godt som hes Embryonale HEG Pluripotens Lavere proliferation kønsceller Skal ikke dannes via end hes (progenitor-celler) IVF eller kloning Teratomdannelse res potentielle sandsynlighed for at være den celletype, der bliver ophav til fremtidens regenerative vævsterapi, heriblandt evnen til kontinuerlig proliferering og pluripotens. Regenerativ medicin er den fremtidige behandlingsform, hvor defekte eller manglende celler erstattes af nye celler, der evt. er genereret fra hes. James A. Thomson stod i spidsen for den forskergruppe, der i 1998 var først til at udvinde humane udifferentierede og pluripotente stamceller. Man dyrkede det befrugtede æg til blastocytstadiet, hvorfra den indre cellemasse blev isoleret og dyrket på muse/feeder cells, således at cellelinjer etableredes. Gennem celledelinger i 5 6 måneder bevarede disse celler deres oprindelige karyotype, henholdsvis XX eller XY. Cellerne bevarede også evnen til at udtrykke markører, som er karakteristiske for

3 797 Afstamning Markører EBs Findes i kroppens Afhænger af celletypen Nej specialiserede væv Tabel 1. Stamcelletyper. Kilde: Kirschstein R, Skirboll LR. Stem cells: scientific progress and future research directions. National Institute of Health, 2001: Kapitel 3+4+Appendiks D. Blastocyttens indre SSEA-1** Ja cellemasse alkalisk phosphatase, Via IVF****** Oct-4 ***** eller kloning Teratokarcinomer SSEA-1, alkalisk Ja Maligne tumorer phosphatase, Oct-4, fra ovarier eller anormalt kromosom testikler Primordiale køns- SSEA-1, alkalisk Ja celler fra aborterede phosphatase, Oct-4 fostre fra dyr Findes i lav Afhænger af celletype Nej koncentration i Udtrykker kroppens HMC-klasse 1 specialiserede væv Blastocyttens indre HMC-klasse 1, Ja cellemasse SSEA-3 SSEA-4, Via IVF eller TRA-1-60 *** kloning TRA-1-81, alkalisk phosphatase, Oct-4 Teratokarcinomer Som hes + højest Ja Maligne tumorer fra anormalt kromosom ovarier eller testikler Primordiale kønsceller Som hes + SSEA-1, Ja fra aborterede fostre Oct-4? fra mennesker udifferentierede celler, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA Markørerne SSEA- 3 og SSEA-4 er antigener for embryonet i en bestemt fase og er specifikke for de humane stamceller, ligesom proteoglukanoverflade-antistofferne TRA-1-60 og Tra også er specifikke for humane celler. Endvidere udtrykker celler af denne type store mængder telomerase: et ribonukleotid der sætter telomerer på kromosomerne, *) MSC: Mesenkyrnal stamcelle. Isoleret fra knoglemarven. Ophav til chondrocytter, osteocytter osv. HSC: Hæmopoietisk stamcelle. Isoleret fra knoglemarven. Ophav til blodets celler. NSC: Neurologisk stamcelle. Isoleret fra nervevæv. Ophav til neurologsike celler. **) SSEA: Stage-specific embryonic antigen. ***) TRA: Tumor rejection antigen-1 ****) Under voksne stamceller hører også stamceller fra navlestrengsblod. *****) Oct-4: transkriptionsfaktor for udifferentierede væv. ******) IVF: in vitro-fertilisering. hvorved cellerne bevarer evnen til at replicere sig selv (1). isolering Humane embryonale stamceller isoleres fra den indre cellemasse fra blastocytter deriveret fra in vitro-fertiliserede oocytter. Isolering kan ske ved mikrodissektion eller ved tilsætning af antistoffer til vækstmediet. Disse antistoffer genkender humant trofo-

4 798 blastvæv, dvs. den ydre cellemasse, hvorefter dette destrueres med komplementmedieret lyse. Cellerne overføres til videre dyrkning i petriskåle. Disse skåle dækkes af et såkaldt coating layer eller feeder layer af embryonale musehudceller, som dels danner en klistret overflade, hvortil de overførte celler adhærerer, og dels frigiver næringsstoffer til vækstmediet. Der forskes dog i mulighederne for at kultivere stamceller uden dette feeder layer pga. risikoen for overførsel af virus eller makromolekyler (1). proliferation Cellerne deler sig, og i løbet af få dage udfylder de skålens overflade. Cellerne flyttes nu forsigtigt til nye kulturskåle ved såkaldt subkultivering. Subkultivering er nødvendig for at undgå celleinteraktion, da dette medfører spontan differentiering. En sådan spontan differentiering er en god markør for, at de celler, der findes i kulturen, er pluripotente, men en ineffektiv måde at generere specialiseret væv på. Denne subkultiveringsprocedure fortsættes i minimum 6 mdr., indtil der er dannet millioner af pluripotente stamceller. De nydannede cellekulturer kaldes cellelinjer og kan fryses ned eller benyttes i forskning med det samme (1). karakterisering Der findes i dag endnu ikke nogen standardprocedure for verifikation af stamcelleforekomst i en given cellelinje. Det er derfor forskelligt hvilke test, laboratorierne anvender på de fremdyrkede celler til påvisning af stamcellers fundamentale egenskaber: Subkultivering er udtryk for, at cellerne evner langtidsoverlevelse og selvfornyelse. Er denne egenskab bevaret efter nedfrysning, er det endnu en indikator for, at stamceller er til stede. Morfologisk undersøgelse via mikroskopi af mitoser og kromosomnormalitet og -antal. Identificering af overflademarkører specifikke for uddifferentierede celler. Testning for transkriptionsfaktoren OCT- 4, som ligeledes er karakteristisk for udifferentierede celler. Implantation af cellerne i immunosupprimerede mus medfører dannelse af teratokarcinomer, hvis cellerne er pluripotente (2). differentiering Hvis cellerne i kulturen ikke er i kontakt med feeder layer et, men i stedet dyrkes i en suspensionskultur, dvs. på en non-adhærent overflade, begynder cellerne at klumpe sammen. En sådan sammenklumpning vil medføre spontan differentiering til flere typer specialiserede celler med forskellige karakteristika. Udfordringen består i at kunne identificere afgørende faktorer i disse spon-

5 799 tane differentieringsprocesser og efterligne disse under kontrollerede forhold, således at alle cellerne i en kultur specialiserer sig til samme celletype. De hidtil udviklede cellekulturer er ikke homogene, men enkelte celletyper kan dominere kulturen. En metode lader initialt de embryonale stamceller klumpe sammen og danne embryoide bodies (EB) bestående af forskellige celletyper. Celler fra EB dissocieres fra resten af kulturen og re-installeres i monolayerkulturer, som via forskellige metoder påvirkes til videre uddifferentiering. Andre forskningsenheder forsøger at stimulere de embryonale stamceller direkte til differentierede celler uden om mellemstadiet som EB. Differentieringen forsøges bl.a. kontrolleret gennem ændringer i kulturens kemiske sammensætning eller ændring af laboratorieskålens overflade. En hyppig benyttet metode er tilsætning af forskellige vækstfaktorer til cellelinjerne. Vækstfaktorer tænder eller slukker specifikke gener, hvilket medfører kædereaktioner, der i sidste ende inducerer differentiering til en specialiseret celletype (2). Endnu en mulighed for kontrolleret uddifferentiering af stamcellerne er genetisk manipulation. Indsætning af aktive gener kan igangsætte reaktionskaskader, som udmunder i differentiering af cellerne. identifikation Der bruges forskellige metoder til undersøgelse af de fremdyrkede celler og deres karakteristika, heriblandt: Morfologisk undersøgelse, vækstkarakteristika eller funktionelle undersøgelser og ekspression af mrna for specifikke markører. Neurologiske humane embryonale celler Man har vist, at humane stamceller isoleret fra EB, selekteret efter deres udtryk af nestin og neuronspecifik endolase, i nogle tilfælde kan bedre neurologiske symptomer hos forsøgsdyr (3). En kilde til neuronlignende celler er isolering blandt mange andre celletyper fra EB. hes-celler der dyrkes i suspension, klumper som ovenfor beskrevet sammen, og danner EB, indeholdende celler der differentierer i forskellig retning. Disse metoder er dog ineffektive og usikre at anvende i jagten på cellelinjer, der kan forsyne os med væv til terapeutisk brug. I stedet forsøger forskere nu at kontrollere hes initiale differentiering på musefeeder layers, der er under 6 timer gamle, i modsætning til de normale 2 døgn gamle feeder layer-celler (Fig. 1). Feeder layer er den overflade der placeres i petriskåle. Overfladen giver cellerne noget at klistre til, og den frigiver næringsstoffer til vækstmediet. I kraft af hes-cellernes proliferation skubber de deres feeder layer decentralt, hvilket giver vækstbetingelser, der

6 800 Humane embryonale stamceller dyrkes på feeder layer, der er under 6 timer gammelt. Feeder skubbes decentralt. Således dannes krater-celler der udtrykker OCT-4, men ingen SSEA-4, og kun lav nestin og vimentin. Mekanisk fjernelse af alt andet medie omkring krater-celler samt dyrkning i suspension bevirker at ikke-neuronale celler går til grunde. Dyrkning med Med-2 og FGF-2 i 10 dage medfører roset-strukturer af neurale precursor-celler: morfologi, nestin, dopamin-tyrosin-hydrolasepositive neuroner. Rosetterne kan videreudvikles og rummer neuroner. Proteinet map-2 og neurofilamenter identificeres perifert, hvilket indikerer tilstædeværelse af udviklede celler. Mitoseaktiviteten centralt indikerer celledelinger. hes på feeder under 6 timer Dyrkning i suspension Dyrkning med Med-2 og FGF-2 Central dannelse af krater-celler Mekanisk fjernelse af alle andre celler Roset-strukturer af neurale progenitors Neuron med microtubili og neurofilamenter Fig. 1. Neurologiske celler. medfører dannelse af centrale enlagede krater-celler. Disse celler bevarer deres OCT- 4-protein-ekspression, men ikke evnen til at udtrykke SSEA-4. OCT-4 og SSEA-4 er to markører for udifferentierede celler, og man tager den ændrede ekspression som udtryk for, at krater-cellerne er pluripotente, delvist differentierede celler. Cellerne udtrykker ikke nestin eller vimentin nok til, at man regner dem for at være neurale progenitor-celler. Disse celler isoleres ved mekanisk at fjerne kulturens feeder layer og dermed alle andre celler i kulturen. Cellerne dyrkes nu i suspension, dvs. i serumfri omgivelser, svarende til hvordan man ofte dyrker EB. Man undgår herved en uønsket extrinsic cellepåvirkning. En anden konsekvens af denne dyrkningsform er, at ikke-neuronale celler går til grunde. Kulturen består i stedet af Med-2, et medie dyrket fra humane hepatokarcinogene celler, der sandsynligvis medierer overlevelse og proliferation af neurale precursor-celler (Fig. 2). Med-2-mediet tilsættes fibroblast-vækstfaktor 2 (FGF-2) et mitosefremmende protein. Efter 7 10 dage ses i kulturen roset-strukturer, dannet af neurale precursor-celler med karakteristisk morfologisk udsende. Cellerne udtrykker nestin og udvikler neuroner, hvor af nogle er dopamin-, tyrosin- eller hydroxylase-positive. Disse precursor-celler kan videreudvikles til neuroner, der udtrykker markøren Map-2, et mikrotuboli-associeret protein, samt markører for neuronfilament H eller TH. Endnu har man ikke været i stand til at splitte disse rosetter op i enkeltceller, der kan give ophav til cellekulturer, muligvis fordi celleinteraktion har betydning for cellernes overlevelse. Yderligere må man i fremtiden undersøge disse cellers elektriske egenskaber samt kliniske potentiale (4). I et andet arbejde fra 2003 undersøger

7 801 man humane stamcellers evne til at home, overleve og interagere med kroppen. De humane pluripotente stamceller, jeg normalt refererer til, er isoleret fra den indre cellemasse fra blastocytter og kaldes humane embryonale stamceller. De celler, som er anvendt i dette forsøg, stammer fra primordiale kønsceller og benævnes humane embryonale kønsceller. Begge celletyper har evnen til at danne de tredimensionelle aggregater, der kaldes embryoide bodies, hvis celler kaldes embryoid body-deriverede celler, EDBs. Det er disse celler, hvis proliferation og differentiering man forsøger at fremme og kontrollere. Rotter smittes med neuroadapted sindbis virus (NSV), en enkeltstrenget RNA-virus, der primært inficerer motorneuroner i rygraden. Efter 10 dage er rotterne maksimalt paralyserede, og efter 28 dage ses tab af motorneuroner. Allerede på ottendedagen transplanteres EBDs til nogle af disse rotter for at iagttage deres evne til at helbrede/påvirke denne kunstigt påførte neurologiske lidelse. EBDs blev dyrket i et medie af basisk fibroblast-vækstfaktor (bfgf), epidermal vækstfaktor (EGF), vaskulær endotelial vækstfaktor (VEGF) samt insulinlike vækstfaktor (IGF-1). Fra dette medie selekteres celler med højt udtryk af RNA for proteinet nestin og den lette kæde af neurofilament, begge markører for neuronale precursors. Immunreaktive undersøgelser viser, at de transplanterede celler fordeler sig i CNS. Mængden af overlevende EBDs er ens i paralyserede og ikke-paralyserede mus. Derimod er mængden af intraparenkymalt placerede celler størst hos de paralyserede mus, hvilket antyder, at migration ind i parenkymet forudsætter paralyse af motorneuronerne. Via immunhistokemisk mærkning og mikroskopi afslørede man, at cellerne udtrykker markører karakteristiske for astrocytter samt neuroner evt. af kolinerg type. Mærkning med det rottespecifikke antistof MO-1 giver intet resultat, hvilket indikerer, at der ikke sker nogle cellefusioner mellem donor og recipient. Det viser sig endvidere, at cellerne ikke differentierer og danner nye motorneuroner i stedet for de oprindelige. Rotternes funktionelle bedring bedømmes ud fra funktionelle test, og sammenholdes med to kontrolgrupper. Det fastslås, at der er en markant bedring af motorneuronfunktionen hos dyr transplanteret med EBDs. De transplanterede celler virker sandsynligvis ikke ved at modulere endogene faktorer som f.eks. nestin, da man ikke kan registrere ændringer i koncentrationerne af disse faktorer. Ved undersøgelse af de transplanterede dyrs væv konstaterede man to markante påvirkninger: Dels var der en bedre overlevelse af dyrenes egne motorneuroner, dels var den synaptiske kontakt i form af axoner øget. Man formoder, at disse iagttagelser kan forklares med, at EBDs ændrer mikromiljøet ved at frigive hjernederiveret neuro-

8 802 Fig. 2. Fra kraterceller udviklede hes-cellers uddifferentiering i et Med-2-medium. Embryoid bodies i serumfri suspension, med (A) og uden (B) Med-2-medie. Toluidinmærkning af neurologiske celler fremdyrket med (C) og uden (D) Med-2-mediet. E: forstørret roset-struktur der også er markeret i C, røde pile markerer ekstracellulær matrix i kaviteten, grønne pile markerer ekstracellulær matrix omkring rosetten. F: viser rosettens centrum med mitotiske kromosomer indikerende proliferation. Billederne er venligst udlånt af Thomas C. Schulz, der har publiceret dem i (4). trop-faktor (BDNF) og TGF-alfa, hvilket faciliterer vækst og overlevelse af de oprindelige motorneuroner. Dette sandsynliggøres af in vitro-forsøg samt det forhold, at effektiviteten af transplantation øges ved tilsætning af stoffer, der pacificerer antistoffer rettet mod disse antigener (5). Immunologiske problemer og evt. løsninger Menneskekroppens immunsystem er designet til at kunne identificere og destruere celler af fremmed herkomst. Denne egenskab er praktisk i forbindelse med infektioner eller andre angreb på kroppen men skaber problemer i form af afstødning af fremmede celler efter transplantation, f.eks. fremtidig transplantation af neurologisk væv. I de seneste år er man blevet dygtigere til at manipulere immunsystemet, så man undgår denne afstødning, men en sådan dæmpning af kroppens forsvarsmekanisme øger spillerummet for andre angreb på kroppen. Forskere håber i forbindelse med fremtidig transplantering af stamceller at kunne imødegå afstødningsproblematikken på andre måder end ved at dæmpe immunforsvaret. En lidt banal men i praksis vanskelig procedure er, at stamcellerne til transplantation skal oprenses godt, så man ikke risikerer at transplantere flere celletyper,

9 803 heriblandt nogle som kan aktivere immunsystemet (6). Når man således i fremtiden transplanterer eksempelvis neurologiske celler, skal man sikre sig ikke samtidig at transplantere halvt eller helt differentierede celler fra roset-strukturer. Nogle forskere mener, at celler udviklet in vitro fra hes-celler vil have mindre tendens til at aktivere immunsystemet end færdige organer fra et andet individ. Man håbede tidligere, at stamcellerne ville være privilegerede i forhold til immunsystemet ved ikke at udtrykke HLA-vævstype-proteinerne på deres overflade, men nyere studier hævder at have dokumenteret udtryk af sådanne proteiner, om end i små mængder (7). Der arbejdes med forskellige metoder til at omgå den immunreaktion, som på nuværende tidspunkt gør sig gældende. genetisk manipulation Potentielt set kan stamceller genetisk manipuleres til at udtrykke eller ikke udtrykke gener, der gør det sværere eller umuligt for recipientens immunsystem at genkende dem, hvilket forhindrer afstødning. En anden teori går på, at man kan udvikle en form for kapsel til de celler, der skal transplanteres. Kapslen skal tillade små molekyler, såsom næringsstoffer eller secernerede produkter at slippe gennem, men forhindre interaktion mellem cellen (graften) og modtagerens immunsystem (8). cellelinjebank Hypotetisk set vil en»bank«bestående af cellelinjer af mange forskellige HLAprofiler kunne danne basis for udvikling af forskellige organer efter behov. Organer udviklet efter modtagerens HLA-profil vil have reduceret tendens til afstødning. terapeutisk kloning Oocytten råder i sig selv over alle de egenskaber, der skal til for at danne en blastocyt, hvis blot den tilføres genetisk information i form af DNA, hvilket normalt sker ved befrugtning med et spermie. Ved kloning fjernes oocytens eget DNA ved mikrokirurgi, og nyt DNA fra en donorcelle inkorporeres, hvorved dannelsen af et præembryon igangsættes. Ved terapeutisk kloning inkorporeres DNA fra den recipient, der senere skal modtage væv genereret fra den befrugtede oocyt. Terapeutisk kloning inden transplantation af hæmopoietisk væv er forsøgt på dyr. I et forsøg tog man somatiske celler fra musens hale, isolerede DNA et og inkorporerede det i en museægcelle. Fra de herved dannede blastocytter isolerede man den indre cellemasse. Efter inkorporering af et ekstra gen dannedes EB, hvis celler dyrkes i et særligt medie og herefter injiceres i mus. Disse celler viser sig bedre end tidligere transplanterede celler til at gendanne nye blodceller i musen (9). En sådan kernetransplantation eller kloning er sandsynligvis den bedste måde,

10 804 hvorpå man kan danne genetisk matchende væv til transplantation. Teoretisk set kan en sådan behandling minimere eller helt fjerne transplantatets afstødning. På nuværende tidspunkt kan man som ovenfor beskrevet manipulere hes-celler til udvikling af cellekulturer med egenskaber, der minder om neuroners. Selvom man endnu ikke kan isolere cellerne enkeltvis, arbejder man via dyreforsøg med at forstå vilkårene for stamcellers overlevelse efter transplantation, samt cellernes indflydelse på recipientens væv. Aktiveringen af immunsystemet forårsaget af donor-recipient-interaktioner forhindrer fortsat den kliniske anvendelse af stamcellerne. Der arbejdes i dag intensivt med disse problemstillinger for at sikre fremtiden funk tionelle og transplanterbare celler til brug for regenerativ medicin. 4. Schulz TC, Palmarini GM, Noggle SA, Weiler DA, Mitalipova MM, Condie BG. Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells. BMC Neurosci 2003; 4(27): Kerr DA, Lladó J, Shamblott MJ, Maragakis NJ, Irani DN, Crawford TO et al. Human embryonic germ cell derivatives facilitate motor recovery of rats with diffuse motor neuron injury. J Neurosci 2003; 23: Kirschstein R, Skirboll LR. Stem cells: scientific progress and future research directions. National Institute of Health, 2001: Vogel G. Stem cells not so stealthy after all. Science 2002; 297(5579): Kirschstein R, Skirboll LR. Stem cells: scientific progress and future research directions. National Institute of Health, 2001: Daley GQ. From embryos to embryoid bodies generating blood from embryonic stem cells. Ann N Y Acad Sci 2003; 30: Interessekonflikter: ingen angivet. litteratur 1. Draper JS, Fox V. Human embryonic stem cells: multilineage differentiation and mechanisms of self-renewal. Arch Med Res 2003; 34: National Institute of health. Stem cell information. stemcellbasics.asp 3. Kirschstein R, Skirboll LR. Stem cells: scientific progress and future research directions. National Institute of Health, 2001: Kapitel 8.