1 plade Kvalitativ påvisning af IgM-antistoffer mod borrelia burgdorferi sensu lato i humant serum eller plasma ved enzymimmunanalyse

Transkript

1 PLATELIA LYME IgM 1 plade Kvalitativ påvisning af IgM-antistoffer mod borrelia burgdorferi sensu lato i humant serum eller plasma ved enzymimmunanalyse /11 1. FORMÅL Platelia Lyme IgM er en immunanalyse, der anvender specifik antistofbinding til kvalitativ påvisning af IgM-antistoffer mod Borrelia burgdorferi sensu lato i humant serum eller plasma. 2. KLINISK VÆRDI Lyme-borreliose (eller Lyme-sygdom) er en ikke-smittefarlig infektion, forårsaget af en bakterie fra spirochetaceae-familien, Borrelia burgdorferi, som overføres af flåter af slægten Ixodes (2). Forskellige dyr fungerer som vært for bakterierne, og overførsel til mennesker sker via bid fra inficerede flåter. Overførselsrisikoen er større, jo længere flåtens bid varer. Prævalensen af Lyme-sygdom er høj i lande med tempereret og koldt klima på den nordlige halvkugle fra Kina til Nordamerika og fra Skandinavien til Nordafrika. Det anslås, at der er ca tilfælde årligt i USA (3) og sandsynligvis mere end i Europa, hvor der findes en positiv gradient fra vest mod øst (4). Det er nu klar påvist, at Borrelia burgdorferi, der er beskrevet i 1984 som en unik bakterieart, i virkeligheden er et kompleks af adskillige arter, hvoraf fem er patogene for mennesker: Borrelia burgdorferi sensu stricto (ss), Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia spielmanii og Borrelia bavariensis (7,8). To andre arter er potentielt patogene: Borrelia valaisiana og Borrelia lusitaniae. Disse syv arter findes i Europa, mens kun B. burgdorferi sensu stricto er til stede i USA. De kliniske symptomer på Lyme-sygdom er meget forskellige og sommetider svære at erkende (6). Der kan skelnes mellem 3 stadier i den kliniske udvikling af sygdommen. Det tidlige stadium (stadium I) kan være asymptomatisk og er karakteriseret ved et influenza-lignende syndrom. I 50 til 80 % af tilfældene opstår der flere dage eller uger efter flåtbidet et karakteristisk lokalt hududslæt med centrifugal udbredelse kaldet erythema migrans (EM). Uden behandling vil hæmatogen spredning af Borrelia flere uger senere fremkalde inflammatorisk artrit, neurologiske eller meningeale sygdomme samt kutane eller kardielle symptomer (stadium II). Efter adskillige måneder eller år kan sygdommen udvikle sig til et kronisk stadium med forskellige niveauer af acrodermatitis chronica atrophicans, encefalopati, encefalomyelit og kronisk artrit (stadium III) (1). Hver art af Borrelia burgdorferi har specifik tropisme. Erythema migrans i stadium I er associeret med alle tre arter. Neurologiske komplikationer er imidlertid oftere associeret med B. garinii og artrit med B. burgdorferi ss, mens acrodermatitis chronica atrophicans er specifik for B. afzelii. Diagnosen Lyme-sygdom må ikke bekræftes uden omhyggelig undersøgelse af patientens generelle anamnese, kliniske og biologiske kriterier samt vurdering af sandsynligheden for patienteksponering for bid af flåter. Da direkte påvisning, dyrkningsisolation eller anvendelse af molekylærbiologiske metoder er vanskelig, forbliver serologi et hovedelement i biologisk udredning af Lyme-sygdom (1,5,9). IgM-antistoffer mod Borrelia burgdorferi dukker op ca. 3 til 6 uger efter smitte og kan vare ved gennem sygdommens udvikling. IgG-antistoffer viser sig senere og topper først efter måneder eller år. Selvom serologi er mindre anvendeligt i det tidlige stadium, er det essentielt i andet og tredje stadium - især ved fravær af erythema migrans. Hvis serologien er negativ på trods af mistænkelig klinisk status, skal der udføres en ny serologisk test 3 uger efter den første test. Tilstedeværelse af specifikke IgM-antistoffer er ikke synonymt med nylig infektion. På samme måde er tilstedeværelse af specifikke IgG-antistoffer ikke altid tegn på tidligere infektion. Antigenerne og antistofferne i Platelia Lyme IgM (ref )- og Platelia Lyme IgG (ref )-analyserne er blevet udvalgt for at muliggøre påvisning af hhv. specifikke IgM-antistoffer og specifikke IgG-antistoffer mod de forskellige amerikanske og europæiske stammer af Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi ss, B. garinii, B. azfelii). 3. PRINCIP Platelia Lyme IgM er en kvalitativ test til påvisning af IgM-antistoffer mod Borrelia burgdorferi sensu lato i humant serum eller plasma via enzymimmunanalyse med binding af IgM på den faste fase. Den faste fase (brønde på mikropladen) er coatet med antihumane μ-kædeantistoffer. En blanding af nativt Borrelia-antigen og det monoklonale anti-borrelia-flagellaantigen-antistof mærket med peroxidase anvendes som konjugat. Testen omfatter følgende trin: Trin 1 Patientprøver og kontroller fortyndes 1/101 og fordeles derpå i brøndene på mikropladen. Der inkuberes i 1 time ved 37 C, hvorunder IgM-antistofferne mod Borrelia burgdorferi i prøven binder sig til belægningen med anti-µ-antistoffer i mikropladebrøndene. Efter inkubation fjernes ubundne nonspecifikke antistoffer og andre serumproteiner ved vask. 1

2 Trin 2 Konjugatet (blanding af Borrelia-antigen og anti-borrelia-antistof mærket med peroxydase) tilføjes til mikropladebrøndene. Der inkuberes i 1 time ved 37 C, hvorunder konjugatet binder sig til de specifikke IgM anti-borrelia-antistoffer. Efter endt inkubation fjernes det ubundne konjugat ved vask. Trin 3 Tilstedeværelsen af immunkomplekser (anti-humane µ-kæder/igm anti-borrelia/borrelia-antigen/monoklonalt anti-borreliaantistof mærket med peroxydase) påvises ved tilsætning af et farveudviklende enzymsubstrat. Trin 4 Efter inkubation ved stuetemperatur ( C) standses enzymreaktionen ved tilsætning af 1N-svovlsyreopløsning. Den aflæsning af optisk densitet, der opnås med et spektrofotometer indstillet til 450/620 nm, er proportional med mængden af IgMantistoffer mod Borrelia burgdorferi i prøven. 4. PRODUKTOPLYSNINGER De leverede reagensmængder er afpasset, så de muliggør 96 test i maks. 6 kørsler. Alle reagenser er udelukkende beregnet til in vitro-diagnosticering. Mærkning Reagenstype Præsentation R1 R2 R3 R4 R5 R6a Microplate Concentrated Washing Solution (20x) Negative Control Cut-off Control Positive Control Antigen Mikroplade (brugsklar) 12 strimler med 8 aftagelige brønde, som er coatet med antihumane µ-kæder Koncentreret vaskeopløsning (20x) Tampon TRIS-NaCl (ph 7,4), 2 % Tween 20 Konserveringsmiddel: 0,04 % ProClin 300 Negativ kontrol Humant serum negativt for IgM-antistoffer mod Borrelia burgdorferi og negativt for HBs-antigen, anti-hiv1, anti-hiv2 og anti-hcv Konserveringsmiddel: 0,15 % ProClin 300 Cut-off-kontrol Humant serum reaktivt for IgM-antistoffer mod Borrelia burgdorferi og negativt for HBs-antigen, anti-hiv1, anti-hiv2 og anti-hcv Konserveringsmiddel: 0,15 % ProClin 300 Positiv kontrol Humant serum reaktivt for IgM-antistoffer mod Borrelia burgdorferi og negativt for HBs-antigen, anti-hiv1, anti-hiv2 og anti-hcv Konserveringsmiddel: 0,15 % ProClin 300 Antigen (frysetørret) Bovin serumalbumin, Borrelia-antigen 1 mikroplade 1 x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 2 x qsp. 8,0 ml R6b R7 R9 Conjugate (51x) Diluent Chromogen TMB Konjugat (51x) Murint monoklonalt anti-borrelia-antistof mærket med peroxydase Konserveringsmiddel: 0,16 % ProClin 300 Fortynder til prøver og konjugat (brugsklart) Tris-NaCl (ph 7,7), serum fra kalvefostre, 0,1 % Tween 20 og fenolrød Konserveringsmiddel: 0,15 % ProClin 300 Kromogen (brugsklar) tetramethylbenzidin (< 0,1 %), H 2O 2 (<1 %) 1 x 0,4 ml 2 x 65 ml 1 x 28 ml R10 Stopping Solution Stopopløsning (brugsklar) 1N-svovlsyreopløsning 1 x 28 ml Opbevaringsbetingelser og udløbsdato fremgår af æsken. 5. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Resultaternes pålidelighed afhænger af korrekt implementering af følgende regler for god laboratoriepraksis: Brug ikke reagenser efter udløbsdatoen. Undgå sammenblanding eller nogen form for forbindelse mellem reagenser fra forskellige partier i samme kørsel. 2

3 BEMÆRK: Det gælder for vaskeopløsning (R2, etiketidentifikation: 20x, grøn), kromogen (R9, etiketidentifikation: TMB, turkisfarvet) og stopopløsning (R10, etiketidentifikation: 1N, rød), at det er muligt at anvende andre partier end de indeholdte i dette sæt under forudsætning af, at reagenserne er fuldstændig tilsvarende, og at samme parti anvendes i hele kørslen. Vent 30 minutter før brug, så reagenserne kan stabilisere sig ved stuetemperatur ( C). Rekonstituér eller fortynd reagenserne forsigtigt for at undgå kontaminering. Undgå at udføre testen i nærheden af reaktive dampe (syre, alkaliske dampe og aldehyddampe) eller støv, der kan påvirke konjugatets enzymaktivitet. Benyt engangsmateriale, eller hvis dette ikke er muligt, udstyr af glas, som er vasket grundigt og skyllet med deioniseret vand. Grundig vask af mikropladen er et afgørende trin i proceduren: Udfør det anbefalede antal vaske, og sørg for, at alle brønde bliver helt fyldt og derefter helt tømt. Ukorrekt vask kan føre til unøjagtige resultater. Undgå, at mikropladen bliver tør mellem vaskene og fordelingen af reagenserne. Benyt aldrig den samme beholder til at fordele konjugatet og enzymsubstratet. Enzymreaktionen er meget følsom over for metaller eller metalioner. Undgå derfor, at metalelementer kommer i berøring med de forskellige opløsninger med konjugat eller kromogen. Kromogenopløsningen (R9) bør være farveløs. Hvis farven bliver blå, kan reagenset ikke anvendes og skal udskiftes. Anvend en ny pipettespids til hver prøve. Kontrollér, at pipetterne og andet udstyr er i orden og fungerer korrekt. Sundheds- og sikkerhedsmæssige forholdsregler Materiale af human oprindelse, der er brugt til forberedelse af reagenser, er blevet testet og fundet ikke-reaktivt over for hepatitis B-overfladeantigen (HBsAg), antistoffer mod hepatitis C-virus (anti-hcv) samt antistoffer mod HIV 1 og HIV 2. Eftersom ingen metode kan give fuld garanti for fravær af smitsomme stoffer, skal reagenser af human oprindelse og patientprøver håndteres som potentielt smittefarlige. Alt materiale, herunder vaskeopløsninger, der kommer i direkte kontakt med prøver og reagenser, som indeholder materiale af human oprindelse, skal betragtes som potentielt smittefarligt. Brug engangshandsker ved håndtering af prøver og reagenser. Undlad at pipettere med munden. Undgå at spilde prøver eller opløsninger, der indeholder prøve. Spildte materialer skal skylles af med blegemiddel i en opløsning på 10 %. Ved spild af syre skal syren først neutraliseres med natriumbikarbonat. Derefter skal der foretages rengøring med blegemiddel i en 10 %-opløsning og aftørring med sugende papir. Det materiale, der anvendes til rengøringen, skal bortskaffes i en beholder til kontamineret affald. Patientprøver, reagenser med materiale af human oprindelse samt kontaminerede materialer og produkter skal dekontamineres før bortskaffelse: - enten ved nedsænkning i blegemiddel med en endelig koncentration på 5 % natriumhypoklorit i 30 minutter - eller ved autoklavering ved 121 C i mindst to timer. ADVARSEL: Benyt ikke opløsninger, der indeholder natriumhypoklorit, i autoklaven. Undgå, at hud og slimhinder kommer i kontakt med kromogen og stopopløsning (fare for forgiftning, irritation eller forbrændinger). Kemiske og biologiske rester skal håndteres og bortskaffes i henhold til god laboratoriepraksis. Alle reagenser i sættet er udelukkende beregnet til in vitro-diagnosticering. Se piktogrammet(merne), som er angivet på mærkaterne, og informationerne sidst i brugsanvisningen i forbindelse med farer og forholdsregler for kemiske komponenter i dette testsæt. Sikkerhedsdatabladet kan findes på 6. PRØVETAGNING, FORBEREDELSE OG OPBEVARING 1. Serum og plasma (EDTA, heparin eller citrat) anbefales som prøvetyper. 2. Bemærk følgende anbefalinger for håndtering, behandling og opbevaring af blodprøver: Tag alle blodprøver under overholdelse af de generelle forholdsregler vedrørende venepunktur. Lad serumprøver koagulere fuldstændigt, før de centrifugeres. Sørg for, at glassene altid holdes lukkede. Adskil serummet eller plasmaet fra koaglet eller de røde blodlegemer i et tæt tillukket opbevaringsglas efter centrifugeringen. Prøverne kan opbevares ved +2-8 C, hvis testen udføres inden for 7 dage. Hvis testen ikke udføres inden for 7 dage, eller hvis prøverne skal transporteres, skal de nedfryses til mindst -20 C. Prøver, der har været optøet mere end fem gange, må ikke anvendes. Tidligere nedfrosne prøver bør omrøres grundigt (Vortex) efter optøning, før testen udføres. 3. Prøver, der indeholder op til 90 g/l albumin eller 100 mg/l ukonjugeret bilirubin, lipæmiske prøver, der indeholder, hvad der svarer til 36 g/l triolein (triglycerid), og hæmolyserede prøver, der indeholder op til 10 g/l hæmoglobin, påvirker ikke resultaterne. 4. Prøverne må ikke opvarmes. 3

4 7. ANALYSEPROCEDURE 7.1 Påkrævede materialer, der ikke medfølger Vortex-mixer. Mikropladelæser med filtre på 450 nm og 620 nm (*). Mikropladeinkubator termostatindstillet til 37±1 C (*). Automatisk, halvautomatisk eller manuel mikropladevasker (*). Sterilt destilleret eller deioniseret vand. Engangshandsker. Beskyttelsesbriller. Sugende papir. Automatiske eller halvautomatiske, justerbare eller forudindstillede pipetter eller multipipetter til udmåling og dispensering af µl samt 1, 2 og 10 ml. Måleglas med en volumen på 25 ml, 50 ml, 100 ml og 1000 ml. Natriumhypoklorit (blegemiddel) og natriumbikarbonat. Beholder til biologisk farligt affald. Engangsreagensglas. * Kontakt vores tekniske afdeling for at få detaljerede oplysninger om det anbefalede udstyr. 7.2 Rekonstituering af reagenser R1: Lad mikropladen henstå ved stuetemperatur i 30 minutter ( C), før posen åbnes. Tag transportbakken ud, læg straks ubrugte teststrimler tilbage i posen, og kontrollér, at posen indeholder tørremiddel. Forsegl posen omhyggeligt, og opbevar den ved +2 8 C. R2: Fortynd vaskeopløsningen R2 i destilleret vand i forholdet 1:20, fx 50 ml R2 og 950 ml destilleret vand, for at få den brugsklare vaskeopløsning. Klargør 350 ml fortyndet vaskeopløsning til én plade med 12 strimler, hvis der foretages manuel vask. R3, R4, R5: Fortynd reagenserne i forholdet 1:101 med fortynderen R7 (fx 10 µl R3 + 1 ml R7). R6a: Til én plade rekonstitueres det frysetørrede antigen ved at tilsætte 8 ml fortynder (R7) i hver flaske. Bland grundigt. Vent 15 minutter, før der blandes med konjugat (R6b), så der opnås en ensartet rehydrering af antigenet. R6b: Klargør den påkrævede mængde konjugat til én kørsel ved at tilsætte 1 del koncentreret konjugat (51x) til 50 dele fortynder (R7). Til én plade blandes 0,3 ml R6b og 15 ml R7. R6 (R6a+R6b): Bland lige dele af de rekonstituerede reagenser R6a og R6b. Til én plade blandes 12 ml af den rekonstituerede opløsning R6a og 12 ml af den rekonstituerede opløsning R6b. Vent 45 minutter før brug. 7.3 Opbevaring og validitet af åbne og/eller rekonstituerede reagenser Sættet skal opbevares ved +2-8 C. Hvis opbevaring sker ved +2-8 C før åbning, kan hver komponent anvendes frem til udløbsdatoen, der fremgår af yderetiketten på sættet. R1: Efter åbning er strimlerne stabile i op til 1 måned, hvis de opbevares ved +2-8 C i den samme omhyggeligt lukkede pose (kontrollér, at posen indeholder tørremiddel). R2: Efter fortynding kan vaskeopløsningen gemmes i 2 uger ved C. Når den koncentrerede vaskeopløsning opbevares ved C, er den stabil indtil udløbsdatoen på etiketten, forudsat der ikke forekommer kontamination. R3, R4, R5, R6b, R7: Efter åbning og uden kontamination er reagenserne stabile i op til 1 måned ved opbevaring ved +2-8 C. R6a+R7: Efter rekonstituering er antigenet stabilt i 15 dage ved +2-8 C eller nedfrosset til -20 C. Det rekonstituerede og nedfrosne antigen må ikke optøs mere end 3 gange. R6b+R7: Efter rekonstituering er konjugatopløsningen stabil i 8 timer ved stuetemperatur ( C) eller i 24 timer ved +2 8 C. R6 (R6a+R6b): Efter rekonstituering er konjugat-arbejdsopløsningen stabil i 8 timer ved stuetemperatur ( C). R9: Efter åbning og uden kontamination er reagenset stabilt i op til 2 måneder ved opbevaring ved +2-8 C. R10: Efter åbning og uden kontamination er reagenset stabilt indtil udløbsdatoen på etiketten ved opbevaring ved +2-8 C. 7.4 Procedure Følg analyseproceduren og reglerne for god laboratoriepraksis nøje. Lad reagenserne stabilisere sig ved stuetemperatur ( C), før de anvendes. Benyt negative og positive kontroller samt cut-off-kontroller ved hver kørsel for at validere analyseresultaterne. 1. Opret en præcis fordelings- og identifikationsplan for kontroller og patientprøver. 2. Forbered den fortyndede vaskeopløsning (R2) (se afsnit 7.2). 3. Tag transportbakken og strimlerne (R1) ud af beskyttelsesposen (se afsnit 7.2). 4. Rekonstituér antigen R6a-flasken ved at tilsætte 8 ml fortynder (R7). Bland grundigt. 5. Fortynd kontrollerne R3, R4, R5 og patientprøverne (S1, S2 ) med fortynder (R7) i forholdet 1:101: 10 µl prøve og 1,0 ml fortynder (R7). Bland de fortyndede prøver i Vortex-mixeren. 6. Forbered konjugat-arbejdsopløsningen (R6): Fortynd den påkrævede mængde konjugat (R6b) med fortynderen (R7) i forholdet 1:51. Bland derefter lige dele rekonstitueret R6a- og R6b-reagens (se afsnit 7.2). Konjugat-arbejdsopløsningen skal tilberedes mindst 45 minutter før fordeling på mikropladen. Bland grundigt. 7. Følg den nedenfor angivne rækkefølge nøje, og tilfør hver brønd 200 µl fortyndet kontrol og patientprøve: 4

5 A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 8. Dæk mikropladen med selvklæbende pladeforsegling, som presses fast ned mod pladen, så den slutter helt til overalt. Inkubér straks mikropladen i et termostatkontrolleret vandbad eller et varmeskab ved 37 ± 1 C i 1 time ± 5 minutter. 9. Fjern den selvklæbende pladeforsegling efter første inkubationsperiode. Sug indholdet af alle brønde op i en beholder til biologisk farligt affald (en beholder med natriumhypoklorit). Vask mikropladen 4 gange med 350 µl vaskeopløsning (R2). Vend mikropladen på hovedet, og dup den forsigtigt mod sugepapiret for at fjerne resterende væske. 10. Fordel 200 μl konjugat-arbejdsopløsning (R6) i alle brøndene. Opløsningen skal rystes forsigtigt før brug. 11. Dæk mikropladen med selvklæbende pladeforsegling, som presses fast ned mod pladen, så den slutter helt til overalt. Inkubér straks mikropladen i et termostatkontrolleret vandbad eller et varmeskab ved 37 ± 1 C i 1 time ± 5 minutter. 12. Fjern den selvklæbende pladeforsegling efter anden inkubationsperiode. Sug indholdet af alle brønde op i en beholder til biologisk farligt affald (en beholder med natriumhypoklorit). Vask mikropladen 4 gange med 350 µl vaskeopløsning (R2). Vend mikropladen på hovedet, og dup den forsigtigt mod sugepapiret for at fjerne resterende væske. 13. Fordel hurtigt og i mørke 200 µl kromogenopløsning (R9) i hver brønd. Lad reaktionen foregå i mørke i 30 ± 5 minutter ved stuetemperatur ( C). Benyt ikke selvklæbende pladeforsegling til denne inkubation. 14. Stands enzymreaktionen ved at tilsætte 100 µl stopopløsning (R10) i hver brønd. Benyt samme rækkefølge og fordelingshastighed som for enzymsubstratet. 15. Tør undersiden af pladen omhyggeligt af. Aflæs den optiske densitet ved 450/620 nm ved hjælp af en mikropladelæser inden for 30 minutter efter standsning af reaktionen. Strimlerne skal opbevares i mørke før aflæsning. 16. Kontrollér, at der er overensstemmelse mellem aflæsningen, fordelingsplanen for pladen og prøverne, før resultaterne rapporteres. 8 BEREGNING OG FORTOLKNING AF RESULTATER 8.1 Beregning af cut-off-værdi (CO) Cut-off-værdien (CO) svarer til middelværdien af de optiske densiteter (OD) for de to cut-off-kontrolreplikater (R4): CO = gennemsnit af OD for R Beregning af prøveforhold Prøveresultatet udtrykkes i forhold ved brug af følgende formel: Prøveforhold = Prøves OD/CO 8.3 Kvalitetskontrol Medtag alle kontrollerne for hver mikroplade og for hver kørsel, og analysér de opnåede resultater. Nedenstående kriterier skal opfyldes ved validering af analysen: Værdier for optisk densitet: - CO > 0,2-0,80 x CO < OD R4 replikat 1 < 1,20 x CO - 0,80 x CO < OD R4 replikat 2 < 1,20 x CO (Den enkelte OD for hvert replikat af cut-off-kontrollen (R4) må ikke afvige mere end 20 % fra OD-værdien). Optisk densitetsforhold: - Forhold R3 (OD R3 / CO) < 0,5 - Forhold R5 (OD R5 / CO) > 2,0 Hvis kriterierne for kvalitetskontrollen ikke er opfyldt, skal testkørslen gentages. 8.4 Fortolkning af resultater Prøveforhold Resultat Fortolkning Forhold < 0,80 Negativ Prøven betragtes som ikke-reaktiv for tilstedeværelse af IgMantistoffer mod Borrelia burgdorferi sensu lato. 0,80 forhold < 1,2 Tvivlsom Prøven betragtes som tvivlsom for tilstedeværelse af IgMantistoffer mod Borrelia burgdorferi sensu lato. Resultatet skal bekræftes ved ny test af en anden prøve udtaget mindst 3 uger efter den første. Forhold 1,2 Positiv Prøven betragtes som positiv for tilstedeværelse af IgMantistoffer mod Borrelia burgdorferi sensu lato. Hvis der er mistanke om infektion, kan supplerende serologiske test, som fx påvisning af IgG anti-borrelia-antistoffer, være nyttige til at bekræfte diagnosen. Hvis serologien er positiv eller tvivlsom, anbefales det, at prøven testes med en bekræftelsesmetode som fx Western-blot (9). 5

6 8.5 Hjælp til fejlfinding Reaktioner, der ikke kan valideres eller gentages, skyldes ofte: Utilstrækkelig vask af mikroplader. Kontamination af negative prøver med serum eller plasma med en høj antistoftiter. Kontamination af enzymsubstratet med kemiske oxidationsmidler (blegemiddel, metalioner osv.) Kontamination af stopopløsning. 8.6 Eksempel på beregning Bemærk: Følgende data er angivet som eksempel og må ikke bruges i stedet for egne resultater. Kontroller og patientprøver OD (450/620 nm) Forhold Resultat R3 0,155 0,22 Negativ R4 0,709 / / R4 0,697 / / R5 2,280 3,24 Positiv Prøve 1 1,181 1,67 Positiv Prøve 2 osv. 0,597 0,85 Positiv Cut-off-værdi: - CO = (0,709+0,697)/2 = 0,703 Værdier for optisk densitet: - OD CO = 0,703 (N > 0,200) - OD R4 replikat 1 = 0,709 (0,80 x OD CO < OD R4 replikat 1 < 1,20 x OD CO) - OD R4 replikat 2 = 0,697 (0,80 x OD CO < OD R4 replikat 2 < 1,20 x OD CO) Optisk densitetsforhold: - Forhold R3 = 0,22 (N < 0,5) - Forhold R5 = 3,24 (N > 2,0) Kvalitetskontrol: Godkendt 9 YDEEVNE 9.1 Prævalens Prævalensbestemmelse af IgM-antistoffer mod Borrelia burgdorferi sensu lato i humant serum blev udført vha. et panel på 296 prøver indhentet fra bloddonorer fra den nordlige del af Frankrig. Følgende resultater blev opnået: 286 negative, 8 tvivlsom og 2 positive sera. Prævalensen er vha. Platelia Lyme IgM-analysen fastlagt til 0,68 % (2/296). 9.2 Specificitet Specificitet i ikke-endemisk område Specificiteten blev estimeret på et panel af 286 sera indhentet fra sunde bloddonorer, der er bosat i et ikke-endemisk område i den nordlige del af Frankrig. Prøverne blev valgt ud fra negative resultater opnået vha. en kommercielt tilgængelig EIA-analyse, der blev anvendt i Europa (CE-mærket) og anses som reference Specificitet i endemisk område Specificiteten blev ligeledes bestemt ud fra et panel bestående af 197 sera indhentet fra sunde bloddonorer bosat i et endemisk område i den østlige del af Frankrig. Ingen af disse donorer udviste kriterier med relation til Lyme-sygdom (ingen kliniske symptomer på borreliose eller flåtbid i anamnesen). Prøverne blev valgt ud fra negative resultater opnået vha. en kommercielt tilgængelig EIA-analyse, der blev anvendt i Europa (CE-mærket) og anses som reference. De opnåede resultater vises i følgende tabel: Panel af sera Negativ Tvivlsom (1) Positiv (2) Specificitet Ikke-endemisk område (n=286) (3) ,6 % (280/281) [98,0 %-] Endemisk område (n=197) ,0 % (191/193) [96,3 %-99,9 %] (1) Tvivlsomme resultater blev ekskluderet ved specificitetsberegning. (2) En af de tre positive prøver fundet ved Platelia Lyme IgG-analysen blev ligeledes fundet positiv med Western blot. (3) IC 95 %: 95 % konfidensinterval. 6

7 9.3 Sensitivitet Sensitiviteten for Platelia Lyme IgM-analysen blev beregnet og inkluderet i sensitivitetsresultater fra Platelia Lyme IgGanalysen (Ref ) på et panel af 70 prøver fra patienter, der udviste forskellige former for Lyme-sygdom i forskellige kliniske stadier. Resultaterne vises i følgende tabel og blev sammenlignet med sensitiviteter fundet med kommercielt tilgængelige EIAanalyser, der blev anvendt i Europa (CE-mærket) og anses som reference: Klinisk stadium Erythema migrans (Stadium I) Neuroborreliose (Stadium II) Antal sera Platelia Lyme (1) Reference Europa (1) IgM IgG IgM + IgG IgM + IgG 58,8 % [32,9 %-81,6 %] 36,7 % [19,9 %-56,1 %] 66,7 % [38,4 %-88,2 %] 96,9 % [83,4 %-99,9 %] 82,4 % [56,6 %-96,2 %] 96,9 % [83,4 %-99,9 %] 93,3 % [68,1 %-99,8 %] 97,0 % [84,2 %-99,9 %] Acrodermatitis chronica atrophicans (Stadium III) 5 20,0 % [0,05 %-71,6 %] [54,9 %-100,0%] [54,9 %-] [54,9 %-] Lyme Arthritis (Stadium III) 15 0,0 % [0,0 %-18,1 %] (1) Tvivlsomme resultater blev ekskluderet ved sensitivitetsberegning. [81,9 %-100,0%] [81,9 %-] [81,9 %-] Sensitiviteten for Platelia Lyme IgM-analysen blev også påvist på et dokumenteret panel af prøver leveret af CDC (Center for Disease Control), og blev sammenlignet med sensitiviteter indhentet vha. kommercielt tilgængelige EIA-analyser, der blev anvendt i Europa (CE-mærket) og USA (FDA-godkendt) og anses som reference. Resultaterne vises i følgende tabel: Klinisk stadium Erythema migrans Antal sera 28 Platelia Lyme (1) Reference Reference USA Europa (1) (1) IgM IgG IgM + IgG IgM + IgG IgM + IgG 73,7 % [48,8 %-90,9%] 38,5 % [20,2 %-59,5%] 86,4 % [65,1 %-97,1%] 70,4 % [49,8 %-86,3 %] 87,0 % [66,4 %-97,2 %] Arthritis / Arthralgia 6 40,0 % [5,3 %-85,3 %] [60,7 %- 100,0%] [60,7 %- 100,0%] [60,7 %-100,0%] [60,7 %-100,0%] Ukendt stadium 4 [0,05 %- 100,0%] [36,8 %- 100,0%] [47,3 %- 100,0%] [19,4 %-99,9 %] [36,8 %-100,0%] (1) Tvivlsomme resultater blev ekskluderet ved sensitivitetsberegning. 9.4 Præcision Præcision inden for kørsel (repetérbarhed): Med henblik på at evaluere repetérbarheden inden for analysen blev én negativ og tre positive prøver testet 30 gange i løbet af den samme kørsel. Forholdet (prøvens OD/CO) blev bestemt for hver prøve. Middelforholdet, standardafvigelsen (SD) og variationskoefficienten (% CV) for hver af de fire prøver vises nedenfor i tabellen: Præcision inden for kørsel (repetérbarhed) N=30 Negativ prøve Lav positiv prøve Positiv prøve Høj positiv prøve Forhold (prøvens OD/cut-off-værdi) Middel 0,24 1,17 1,88 4,23 SD 0,040 0,052 0,070 0,104 % CV 15,2 % 4,4 % 3,7 % 2,5 % 7

8 Præcision mellem kørsler (reproducérbarhed): Med henblik på at evaluere reproducérbarheden mellem kørsler blev hver af de fire prøver (én negativ og tre positive prøver) testet i dobbelttest i to kørsler om dagen over en periode på 20 dage. Forholdet (prøvens OD/CO) blev bestemt for hver prøve. Middelforholdet, standardafvigelsen (SD) og variationskoefficienten (% CV) for hver af de fire prøver vises nedenfor i tabellen: Præcision mellem kørsler (reproducérbarhed) N=80 Negativ prøve Lav positiv prøve Positiv prøve Høj positiv prøve Forhold (prøvens OD/cut-off-værdi) Middel 0,24 1,21 1,76 4,18 SD 0,029 0,067 0,104 0,153 % CV 12,0 % 5,5 % 5,9 % 3,7 % 9.5 Krydsreaktivitet 338 prøver med karakteristika, der potentielt kan resultere i ikke-specifikke reaktioner, blev testet med Platelia Lyme IgManalysen. Resultaterne vises i følgende tabel: Panel Antal prøver Tvivlsom (1) Positiv Krydsreaktivitet % Syfilis ,2 % (2) CMV ,3 % (2) EBV ,4 % (3) Leptospirose ,3 % (3) Malaria ,0 % (3) Antinukleære antistoffer (ANA) ,0 % Heterofile antistoffer (HAMA) ,0 % Rheumatoidfaktor ,0 % HSV ,0 % Toksoplasmose ,6 % (2) Røde hunde ,0 % Mæslinger ,0 % Fåresyge ,0 % HIV ,0 % VZV ,0 % I alt ,8 % (1) Tvivlsomme resultater blev ekskluderet ved krydsreaktivitetsberegning. (2) Ikke væsentlig forskellig fra prævalensen i endemisk område (Fisher-test, p>0,05). (3) Væsentlig forskellig fra prævalensen i endemisk område (Fisher-test, p<0,05). 8

9 De 16 prøver, der blev fundet positive med Platelia Lyme IgM-analysen, blev ligeledes testet med kommercielt tilgængelige EIA-analyser anvendt i Europa (CE-mærket) samt med Western blotting. Resultaterne vises i følgende tabel: Prøve EIA analyse Western blot (1) Prøve EIA analyse Western blot (1) Syfilis Negativ Negativ Leptospirose Positiv Positiv CMV Negativ Negativ Malaria Tvivlsom IT EBV Positiv Positiv Malaria Positiv IT EBV Positiv Negativ Malaria Tvivlsom IT EBV Positiv Negativ Malaria Positiv IT EBV Positiv IT Malaria Negativ IT EBV Positiv Tvivlsom Malaria Negativ IT Leptospirose Negativ Positiv Toksoplasmose Positiv Negativ (1) IT: Ikke testet pga. utilstrækkelig prøvestørrelse. 10 PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER Diagnosen Borrelia burgdorferi-infektion kan kun fastlægges på baggrund af en kombination af kliniske og biologiske data. Resultatet af en enkelt test til påvisning af IgM anti-borrelia burgdorferi-antistoffer er ikke tilstrækkeligt bevis for diagnosen infektion med Borrelia burgdorferi sensu lato. Hvis serologien er positiv eller tvivlsom, anbefales det, at prøven testes med en bekræftelsesmetode som fx Western-blot (9). Det er blevet rapporteret, at patienter med malaria eller patienter smittet med Epstein-Barr-virus eller andre spirokætarter (leptospirose m.v.) potentielt kan vise falskt positive reaktioner med diagnosticeringsanalyser af antistoffer mod Borrelia burgdorferi. Der bør tages hensyn til dette ved fortolkning af resultater indhentet med sådanne tests. 11 PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL Alle producerede reagenser fremstilles i henhold til vores kvalitetssikringssystem, lige fra modtagelsen af råmaterialer til markedsføringen af slutproduktet. Hvert parti gennemgår kvalitetskontrol og frigives kun til salg, hvis det opfylder de foruddefinerede kvalitetskriterier. Dokumentation vedrørende produktion og kontrol af hvert parti opbevares hos virksomheden. 12 REFERENCER 1. Aguero-Rosenfeld, M. E., Wang, G., Schwartz, I., Wormser, G Diagnosis of Lyme borreliosis. Clin. Microbiol. Rev. 18: Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J.P Lyme disease a tickborne spirochetosis? Science. 216: Center for Disease Control and Prevention Lyme disease United States, Morb. Mortal. Wkly. Rep. 53: Hubalek, Z., Halouzka, J Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato genomic groups in Europe, a review. Eur. J. Epidemiol. 13: Reed, K. D Laboratory testing for Lyme disease: possibilities and practicalities. J. Clin. Microbiol. 40: Stanek, G., Strle, F Lyme borreliosis. Lancet. 362: Wang, G., Van Dam, A. P., Spanjaard, L., Dankert, J Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato: taxonomic, epidemiological, and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 12: Rudenko, N., Golovchenko, M., Grubhoffer, L Updates on Borrelia burgdorferi sensu lato complex with respect to public health. Ticks Tick Borne Dis. 2(3): Wilske, B Diagnosis of Lyme borreliosis in Europe. Vector Borne Zoonotic Dis. 3:

10 10

11 11

12 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /11 Fax : +33 (0)