Transkript

1 BProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay U 2006/04 Dansk USA patent nr 5,270,184; 5,547,861; 5,648,211; 5,712,124; 5,744,311; 5,846,726; 5,851,767; 5,866,336; 5,919,630; 5,928,869; 5,958,700; 6,054,279; 6,090,552; 6,117,635; 6,251,609; 6,316,200; 6,656,680; 6,743,582 Se symbolglossaret i slutningen af indlægssedlen TILSIGTET BRUG BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay (BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) forstærkede DNA-analyse) til brug med BD ProbeTec ET systemet anvender amplifikation ved hjælp af strengforskydning (Strand Displacement Amplification, SDA) teknologi til den direkte, kvalitative påvisning af Legionella pneumophila DNA (serogrupper 1-14) på ekspektoratpræparater fra patienter, hvor der er klinisk mistanke om pneumoni Analysen er beregnet som en hjælp ved sandsynlig diagnosticering af legionærsygdom forbundet med dyrknings- og andre metoder RESUMÉ OG FORKLARING Legionærsygdom kan erhverves ved inhalation af aerosoler indeholdende Legionella eller ved mikroaspiration af kontamineret vand I undersøgelser fra Europa og Nordamerika er det rapporteret, at Legionella har forårsaget 2-15 % af tilfælde af samfundserhvervet pneumoni (community-acquired pneumonia, CAP), som kræver hospitalisering Farlighedsraten for patienter med legionellosis er 5-30 %, hos ældre og patienter med nedsat immunforsvar er der større risiko for død 1 Der er identificeret fyrre forskellige Legionella arter, hvoraf halvdelen er forbundet med menneskelig sygdom Legionella pneumophila forårsager 90 % af diagnosticerede tilfælde af legionellosis Selvom fjorten serogrupper af L pneumophila er kendte, forårsages 80 % af L pneumophila infektioner af serogruppe 1 2 Vigtigheden af at stille diagnosen pneumoni og dens ætiologi forstærkes af den stigende bekymring over et overforbrug af antibiotika Diagnostiske testresultater for L pneumophila bør hurtigt være tilgængelige for klinikeren, fordi det er vist, at dødeligheden stiger, hvis indgivelse af relevant behandling forsinkes Traditionelle dyrkningsmetoder kræver mindst to dage til at dyrke Legionella organismer fra positive spytpræparater og i alt syv til ti dage at afslutte et negativ resultat Som et supplement til dyrkning findes enzym-immunanalysekits i handelen til påvisning af antigen fra L pneumophila serogruppe 1 i urinpræparater 3 Imidlertid er diagnostiske tests for Legionella infektioner, som giver hurtige resultater med god sensitivitet og specificitet, begrænsede PROCEDURENS PRINCIPPER BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) forstærket DNA-analyse er baseret på den samtidige amplifikation og påvisning af fokus-dna ved hjælp af amplifikationsprimere og en fluorescensmærket detektorprobe SDAreagenserne tørres i to separate engangsmikrobrønde Den bearbejdede prøve tilsættes primermikrobrønden, som indeholder amplifikationsprimere, fluorescensmærket detektorprobe og andre reagenser, som er nødvendige for amplifikation Primere amplificerer et 68-base-par område i L pneumophila makrofag infektivitetspotentia (mip) (Macrophage Infectivity Potentiator, MIP) genet, som er konserveret på tværs af alle serogrupper i arten Efter inkubation overføres reaktionsblandingen til amplifikationsmikrobrønden, som indeholder to enzymer (en DNA polymerase og en restriktionsendonuklease), som er nødvendig for SDA Amplifikationsmikrobrøndene forsegles for at forhindre kontaminering, og de inkuberes derefter i en varmekontrolleret fluorescensaflæser, som overvåger hver reaktion for dannelsen af forstærkede produkter Hver reaktion sam-forstærker og påviser en intern amplifikationskontrol (Internal Amplification Control, IAC), hvis formål er at verificere, at de rigtige forhold eksisterer til amplifikation og at reducere muligheden for rapportering af et falsk negativt resultat på grund af tilstedeværelse af analysehæmmere Tilstedeværelsen eller fraværet af L pneumophila DNA bestemmes ved at beregne PAT scores (Passes After Threshold) for prøven baseret på forudbestemte tærskelværdier Instrumentet rapporterer automatisk resultaterne som positive, negative eller inkonklusive REAGENSER OG MATERIALER Hver BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) forstærket DNA-analyse reagenspakke indeholder: Legionella pneumophila (LP) primermikrobrønde, (1x24) 6 oligonukleotider 7,5pmol, dntp'er 15,2nmol, 2 detektorprober 22,5pmol, Syntetisk oligonukleotid 1500 kopier Legionella pneumophila (LP) amplifikationsmikrobrønde, (1x24) Restriktionsenzym: 33 enheder, DNA polymerase 14 enheder 10 Primerlåg, 16 amplifikationsforseglere (1/2), 8 engangsposer BD ProbeTec ET luftvejspræparat- og mediefortynder og kontrolkit) (CF*/LP/MP**): Indhold: Luftvejspræparat- og mediediluent: Bicin, kaliumphosphat, kaliumhydroxid, DMSO og Proclin; 10 (CF/LP/MP) positive kontroller: 1050 ng laksesædvæske-dna, 47,3 µg Tris, 9,0 µg EDTA, 3600 kopier CF plasmid, 4800 kopier LP plasmid, 5400 kopier MP plasmid; 10 (CF/LP/MP) negative kontroller: 1050 ng laksesædvæske-dna, 47,3 µg Tris, 9,0 µg EDTA; mL glas med trykhætte * Refererer til BD ProbeTec ET Chlamydiaceae familien (CF) amplificeret DNA-analyse ** Refererer til BD ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae (MP) amplificeret DNA-analyse Instrumenter, udstyr og materialer: BD ProbeTec ET instrument og instrumentplade, BD ProbeTec ET Lysing Heater (lyseringsvarmeapparat), BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater (primer- og opvarmerapparat), BD ProbeTec ET Pipettor (pipettor), platform og strømforsyning, 2 ml prøveglasstativ, BD ProbeTec ET Accessories Kit (tilbehørssæt), BD ProbeTec ET Pipette Tips (pipettespidser)

2 Nødvendige materialer, der ikke er vedlagt: Klasse II biologisk sikkerhedsskab (biological safety cabinet, BSC), vortexmixer, -20 C og/eller -70 C (eller koldere) en ikke-selvafrimende fryser, mikrocentrifuge, der kan klare x g, vandbade, digitalt termometer, vandbadstativ med låg, der kan skrues på, andre hensigtsmæssige prøveglasstativer, QIAGEN QIAamp DNA fæces minikits, % ethanol, BBL CultureSwab EZ podepinde, BD ProbeTec ET 2 ml Sample Tubes and Caps (prøveglas og hætter), engangshandsker, sprit-resistente penne, mikropipetter i stand til at overføre volumener på µl, aerosol-resistente pipettespidser, destilleret vand, L pneumophila ATCC (Philadelphia-1), oksealbumin (Fraktion V) 0,2 % (vægt/vol) i 0,85 % (vægt/vol) saltvand, 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox * * Opløs 7,5 g Alconox med 1 L af en 1 % (vol/vol) natriumhypochloritopløsning og bland Klargør frisk blanding dagligt Krav til opbevaring og håndtering: BD ProbeTec ET LP reagenspakker kan opbevares ved 2-33 C De uåbnede reagenspakker må ikke anvendes efter udløbsdatoen Så snart en pose er åbnet, er mikrobrøndene stabile i 12 uger, hvis de genlukkes korrekt, eller indtil udløbsdatoen, alt efter hvad der kommer først Må ikke fryses BD ProbeTec ET luftvejspræparat- og mediefortynder og kontrolkit (CF/LP/MP) kan opbevares ved 2-33 C Reagenserne må ikke anvendes efter udløbsdatoen Må ikke fryses Advarsler og forholdsregler Til in vitro diagnostik 1 Patogene mikroorganismer, herunder hepatitisvira og humant immundefekt virus, kan forekomme i kliniske prøver "Standardforholdsregler" 4-7 og institutionelle retningslinier skal overholdes ved håndtering af alle emner, der er kontamineret med blod og andre legemsvæsker 2 Håndtering og bearbejdning af præparater fra de nedre luftveje inden 70 C inkubationstrinet bør udføres i et Klasse II biologisk sikkerhedsskab (BSC) 3 Under 70 C inkubationstrinet bruges en vandbadstativ med et låg, der kan skrues på, til at sørge for ekstra inddæmning af potentielt biologisk farlige præparater fra de nedre luftveje 4 BD ProbeTec ET luftvejspræparat- og mediefortynder og kontrolkit indeholder dimethylsulfoxid (DMSO) DMSO er skadelig ved indånding, ved hudkontakt eller ved indtagelse Undgå kontakt med hud og øjne og bær altid handsker ved håndtering Kommer stof i øjnene, skylles straks grundigt med vand og læge kontaktes Kommer stoffet på huden, vaskes straks med store mængder vand 5 Se QIAamp DNA fæces minikit håndbogen for sikkerhedsoplysninger om QIAGEN reagenser, der anvendes i denne procedure QIAGEN reagenser må ikke bortskaffes i blegeopløsninger QIAGEN reagenser må ikke udsættes for blegeopløsninger 6 Der har været rapporter, der antyder, at QIAGEN DNA ekstraktionskits ikke er egnet til Legionella PCR (Polymerase Chain Reaction, polymerasekædereaktion), på grund af muligheden for, at reagenserne bliver forurenet med Legionella DNA 8,9 Selvom sandsynligheden for dette er ringe, og andre Legionella arter ud over L pneumophila blev identificeret i disse undersøgelser, bør brugeren verificere funktionen af hvert nyt lot af QIAGEN reagenser inden brug med patientpræparater 7 Selv om specielle arbejdsområder ikke kræves, fordi BD ProbeTec ET designet nedsætter muligheden for kontaminering med forstærket DNA-fragment i testmiljøet, er andre forholdsregler til kontrol af kontaminering nødvendige, især for at undgå kontaminering af præparater under bearbejdning 8 Reagensposer indeholdende ubrugte primermikrobrønde og amplifikationsmikrobrønde SKAL lukkes omhyggeligt igen efter åbning Bekræft, at der findes et tørremiddel, inden reagensposerne lukkes 9 Pladen indeholdende amplifikationsmikrobrønde SKAL være korrekt lukket med amplifikationsforsegleren, inden pladen flyttes fra BD ProbeTec ET primer- og opvarmerapparat til BD ProbeTec ET instrumentet Forsegling sikrer en lukket reaktion til amplifikation og påvisning og er nødvendig for at undgå kontaminering med amplifikationsprodukter af instrumentet og arbejdsområdet Forseglingsmaterialet må ikke på noget tidspunkt fjernes fra mikrobrønde 10 Primermikrobrønde med residualvæske (efter overførsel af væske fra primermikrobrønde til amplifikationsmikrobrønde) udgør en kilde til kontaminering af fokus Forsegl omhyggeligt primermikrobrønde med en pladeforsegler inden bortskaffelse 11 For at forhindre kontaminering af arbejdsmiljøet med amplifikationsprodukter bruges engangsposerne, der følger med reagenspakkerne, til at kassere testede amplifikationsmikrobrønde Sørg for, at poserne er korrekt lukket inden bortskaffelse 12 SKIFT HANDSKER ved specificerede trin under bearbejdning af prøver og analyseproceduren for at undgå krydskontaminering af præparater Hvis handsker får kontakt med præparater, skiftes handskerne straks for at undgå at kontaminere andre præparater 13 I tilfælde af, at arbejdsområdet eller udstyret kontamineres med prøver eller kontroller, rengøres det kontaminerede område grundigt med 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox, og der skylles grundigt med vand Lad overfladen tørre fuldstændigt, inden De fortsætter med yderligere testning Inden eventuel QIAGEN prøvebearbejdningsreagenser tørres op, aftørres de pågældende områder med vand inden den 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit opløsning med Alconox bruges 14 Brug kun BD ProbeTec ET pipettor og BD ProbeTec ET pipettespidser til overførsel af bearbejdede prøver til primermikrobrønde og overførsel af prøver fra primermikrobrøndene til amplifikationsmikrobrøndene 15 Anvend fastlagt laboratoriepraksis ved bortskaffelse af brugte pipettespidser, prøveglas, primermikrobrønde og andre engangsartikler Bortskaf engangsartikler omhyggeligt Forsegl og kassér affaldsbeholdere, når de er ¾ fyldte eller dagligt (alt efter hvad der kommer først) 16 Mikrobrønde, kontroller eller bearbejdningsreagenser fra kits med forskellige lotnumre må ikke ombyttes eller blandes 17 Kontakt Teknisk service i tilfælde af en usædvanlig situation, som for eksempel, hvis der spildes ned i BD ProbeTec ET instrumentet, eller kontaminering med DNA, som ikke kan fjernes ved hjælp af rengøring OPSAMLING OG TRANSPORT AF PRØVE 1 Prøveopsamling Præparater skal opsamles som anbefalet i Clinical Microbiology Procedures Handbook 10 (håndbogen om kliniske mikrobiologiprocedurer) eller Deres laboratoriemanual 2

3 2 Prøveopbevaring og -transport Reagenser kan opbevares/transporteres ved C i højst 6 h Reagenser kan opbevares i køleskab ved 2-8 C i højst 3 dage Præparater kan opbevares ved eller under -20 C i højst 14 uger TESTPROCEDURE Der henvises til brugermanualen til BD ProbeTec ET systemet for specifikke instruktioner i betjening og vedligeholdelse af komponenterne i systemet A Klargøring af instrument: 1 Der skal være tændt for strømmen til instrumentet, og det skal have tid til at varme op, inden analysen påbegyndes a Primer- og opvarmerapparatet kræver ca 90 min til opvarmning og stabilisering Indstillingspunktet for primerkomponenten i primer- og opvarmerapparatet er 72,5 C Indstillingspunktet for opvarmerkomponenten i primer- og opvarmerapparatet er 54 C b BD ProbeTec ET instrumentet er softwarestyret og kræver ca 30 min til opvarmning 2 Varmeapparatets temperaturer skal kontrolleres inden analysen påbegyndes Notér temperaturerne på BD ProbeTec ET systemets vedligeholdelsesjournal a Primer- og opvarmerapparat Termometret i primervarmerapparatet skal vise mellem C Termometret i opvarmerapparatet skal vise mellem 53,5-54,5 C 3 Kontrollér temperaturen, der vises på BD ProbeTec ET skærmbilledet Termometret skal vise mellem 47,5-55,0 C Notér temperaturerne på BD ProbeTec ET systemets vedligeholdelsesjournal B Pipettor: Der henvises til brugermanualen til BD ProbeTec ET systemet for en detaljeret forklaring på tastaturfunktionerne i BD ProbeTec ET Pipettoren Desuden skal BD ProbeTec ET pipettoren rengøres efter hver brug Der henvises til repræsentanten fra Teknisk service for vejledning om korrekt rengøring og vedligeholdelse af BD ProbeTec ET pipettoren Følgende programmer er påkrævet til udførelse af BD ProbeTec ET LP analyser Program 1 overfører væske fra de bearbejdede prøver til LP primermikrobrøndene Program 5 overfører væske fra LP primermikrobrøndene til LP amplifikationsmikrobrøndene Programmér pipettoren som følger: Program 1: 1 TÆND for pipettoren Pipettoren vil bippe en gang, blinke "ZERO," (nul), blinke softwareversionsnummer og bippe en gang til 2 Tryk på den blå "Prog" (Program) tast Tryk på "Vol" (Volumen) tasten, indtil "1" vises for at vælge Program 1 Tryk på "Enter " 3 Tryk på "Prog" (Program) tasten for at gå i programmeringsmodus Mens De trykker på "Prog" (Program) tasten, trykker De samtidigt på specialfunktionstasten med en pipettespids eller enden af en papirclips 4 Tryk på "Fill" (Fyld) Tryk på pil-op-tasten, indtil der står 200 Tryk på "Enter " 5 Tryk på "Disp" (Dispensér) Tryk på pil-op-tasten, indtil der står 150 Tryk på "Enter " 6 Tryk på "Enter" endnu en gang for at gemme programmet og afslutte De skulle høre et "bip," der angiver, at programmeringen er færdig 7 Bekræft programmet ved at trykke på udløseren for at gå frem gennem hvert punkt Efterhånden som De går gennem hvert punkt, indstiller De hastigheden på aspiration/dispensér med "Vol" (Volumen) tasten Hastighedsindikatoren fremkommer ved hvert punkt Brug "Vol" (Volumen) tasten til at justere hastighedsindikatoren til at vise 2 firkanter for "Fill" (Fyld) og "Disp" (Dispensér) punkterne Program 5 1 Tryk på "Prog" (Program) tasten Tryk på "Vol" (Volumen) tasten, indtil "5" vises for at vælge Program 5 Tryk på "Enter " 2 Tryk på og hold "Prog" (Program) tasten for at gå i programmeringsmodus Mens De trykker på "Prog" (Program) tasten, trykker De samtidigt på specialfunktionstasten med en pipettespids eller enden af en papirclips 3 Tryk på "Fill" (Fyld) Tryk på pil-op-tasten, indtil der står 100 Tryk på "Enter " 4 Tryk på "Disp" (Dispensér) Tryk på pil-op-tasten, indtil der står 100 Tryk på "Enter " 5 Tryk på "Mix" (Bland) Tryk på pil-op-tasten, indtil der står 50 Tryk på "Enter " 6 Tryk på "Enter" endnu en gang for at gemme programmet og afslutte De skulle høre et "bip", der angiver, at programmeringen er færdig 7 Bekræft programmet ved at trykke på udløseren for at gå frem gennem hvert punkt Efterhånden som De går gennem hvert punkt, indstiller De hastigheden på aspiration/dispensér/bland med "Vol" (Volumen) tasten Hastighedsindikatoren fremkommer ved hvert punkt Brug "Vol" (Volumen) tasten til at justere hastighedsindikatoren til at vise 2 firkanter for funktionerne aspiration og dispensér Brug "Vol" (Volumen) tasten til at justere hastigheden for blandingen, så den viser 3 firkanter Programgennemgang Programmerne skal gennemgås, inden proceduren påbegyndes Sæt pipettoren til TÆNDT for at gennemgå programmet Tryk på den blå "Prog" (Program) tast Tryk på "Vol" (Volumen) tasten, indtil det rette programnummer (1 eller 5) vises Tryk på "Enter" tasten Brug pipetteringsudløseren for at gå frem punkt for punkt gennem programmet Program 1: Dette program aspirerer 200 µl; dispenserer 150 µl i LP mikrobrønden Pipettorens display skal vise som følger: Fill 200 µl SII Dispense 150 µl SII 3

4 Program 5: Dette program aspirerer 100 µl; dispenserer 100 µl, og blander 50 µl tre gange Pipettorens display skal vise som følger: Fill 100 µl SII Dispense 100 µl SII Mix 50 µl SIII Zero (nul) (blinker skiftevis) C Pladelayout: Pladelayoutrapporten genereres fra BD ProbeTec ET instrumentet efter analysetype, præparatidentifikation, kontrollotnumre, og kitlotnumre logges ind i systemet Pladelayoutrapporten viser det fysiske layout af præparater og kontroller for hver plade, der skal testes Denne orientering bruges til både primermikrobrøndpladen og amplifikationsmikrobrøndpladen For LP analysen er primermikrobrøndene fuldkommen grå mikrobrøndstrimler Amplifikationsmikrobrøndene er gråstribede mikrobrøndstrimler D Bearbejdning af præparater fra de nedre luftveje: Procedurerelaterede bemærkninger: Gennemse QIAGEN QIAamp DNA fæces minikit håndbogen for vigtige procedurerelaterede bemærkninger og forholdsregler inden De starter Fyld et vandbad med destilleret vand og opvarm til 70 C (± 5 C) inden De starter på bearbejdning af præparater Brug sprit-resistente penne til at mærke beholdere og glas Skift pipettespidser mellem alle væskeoverførsler Det anbefales at bruge spidser med aerosolbarriere Lad BD ProbeTec ET luftvejspræparat- og mediefortynder (CF/LP/MP) opnå stuetemperatur og bland forsigtigt ved at vende den op og ned inden brug Afmål den nødvendige mængde BD ProbeTec ET luftvejspræparat- og mediefortynder (CF/LP/MP) ned i en ren beholder Den nødvendige mængde bestemmes ved at bruge 0,4 ml for hvert præparat og tilsætte yderligere 1-2 ml, så det er let at pipettere Undgå kontaminering af fortynderen - Hæld ikke tiloversbleven fortynder tilbage i flasken 1 Klargør QIAGEN reagenser (se "Klargøring af reagenser" i QIAamp DNA fæces minikit håndbogen) 2 Lad præparaterne nå stuetemperatur 3 Mærk et 2 ml glas med trykhætte for hvert præparat, der skal testes Følgende trin skal udføres i et biologisk sikkerhedsskab (BSC): 4 Udsæt præparaterne for impulsslyngning i 5-15 s for at blande grundigt 5 Pipettér 350 µl af præparatet i det mærkede glas BEMÆRK: Det kan være vanskeligt at pipettere nøjagtige prøver fra ekspektoratpræparater Hvis dette er tilfældet, bruges gradueringerne på glassets side som en hjælp til at sikre, at det korrekte volumen tilføres i glasset Alternativt bruges et glas, hvori der er blevet dispenseret 350 µl vand som en vejledning 6 SKIFT HANDSKER efter tilsætning af præparater 7 Pipettér 150 µl QIAGEN ASL buffer i hvert prøveglas 8 Pipettér 25 µl QIAGEN proteinase K i hvert prøveglas 9 Pipettér 500 µl QIAGEN ASL buffer i hvert prøveglas 10 Sæt hætte på hvert glas og foretag impulsslyngning i 5 s Anbring glassene i et vandbadstativ med et låg, der kan skrues på Følgende trin kan udføres uden for et biologisk sikkerhedsskab (BSC): 11 Inkubér glassene i det 70 C (± 5 C) vandbad i 15 min 12 Efter 15 min tages glassene op af vandbadet, og de centrifugeres ( x g) i ca 5 s 13 Tag glassene ud af centrifugen Åbn hvert glas og tilsæt 500 µl af % ethanol 14 Sæt igen hætte på hvert glas og udsæt det for impulsslyngning i 5 s 15 Centrifugér præparaterne ( x g) i ca 5 s 16 Mærk en QIAGEN udskillelseskolonne og et opsamlingsglas for hvert præparat 17 Overfør 700 µl af præparatet i den korrekt mærkede QIAGEN udskillelseskolonne 18 Centrifugér glassene ( x g) i 1 min 19 Overfør kolonnerne til de nye QIAamp opsamlingsglas Bortskaf glassene med filtratet 20 Overfør forsigtigt 700 µl mere af præparatet i den korrekte kolonne 21 Centrifugér glassene ( x g) i 1 min 22 Overfør kolonnerne til rene QIAamp opsamlingsglas Bortskaf glassene med filtratet 23 Åbn QIAamp kolonnerne og tilsæt 500 µl QIAGEN AW1 vaskebuffer til hver 24 Centrifugér glassene ( x g) i 1 min 25 Overfør kolonnerne til de nye QIAamp opsamlingsglas Bortskaf glassene med filtratet 26 Åbn QIAamp kolonnerne og tilsæt 500 µl QIAGEN AW2 vaskebuffer til hver 27 Centrifugér glassene ( x g) i 3 min 28 Overfør kolonnerne til endelige, mærkede QIAamp opsamlingsglas Bortskaf glassene med filtratet BEMÆRK: Opsamlingsglasset skal være mærket på dette tidspunkt BEMÆRK: Vær omhyggelig med at sørge for, at der ikke hænger væske fast i bunden af kolonnen Overførsel af residualvask i opsamlingsglasset kan påvirke resultaterne 29 Åbn kolonnerne og tilsæt 225 µl QIAGEN AE elueringsbuffer til hver 30 Inkubér ved stuetemperatur i 1 min 31 Centrifugér glassene ( x g) i 1 min 32 Bortskaf kolonnerne 4

5 33 Mærk et 2 ml glas med skruehætte for hvert præparat 34 Overfør 400 µl luftvejspræparat- og mediefortynder (CF/LP/MP) til hvert glas med skruehætte BEMÆRK: Fyld et vandbad med destilleret vand og bring badet i kog til brug ved trin Overfør 200 µl eluat til det korrekt mærkede glas indeholdende 400 µl luftvejspræparat- og mediefortynder (CF/LP/MP) 36 Sæt hætte på glasset og udsæt det for impulsslyngning i 5 s 37 Præparér kontrollerne Se Præparering af kontroller fra de nedre luftveje (Afsnit E) 38 Overfør præparater og kontroller til et vandbadstativ 39 Anbring vandbadstativet i det kogende vandbad i 5 min 40 Når de 5 min er gået, tages vandbadstativet op og glassene får lov at afkøle ved stuetemperatur i mindst 15 min ADVARSEL: Vær forsigtig med at undgå forbrændinger fra det kogende vand, vandbadstativet eller flader af vandbadet, der kan være meget varme 41 Efter afkøling centrifugeres ( x g) i ca 5 s BEMÆRK: Efter kogning af prøver: a De kan opbevares ved C i op til 6 h og kan testes uden at koges igen b De kan opbevares op til 3 dage ved 2-8 C Prøver skal slynges og koges igen inden testning c De kan opbevares i op til 14 uger ved -20 ºC Prøver skal optøs ved stuetemperatur, slynges og koges igen inden testning 42 Præparaterne er klar til Testningsprocedure for BD ProbeTec ET LP analysen (Afsnit F) E Præparering af kontroller fra de nedre luftveje: 1 For hver kørsel (plade), der skal testes, klargøres et negativt kontrolglas (CF/LP/MP) og et positivt kontrolglas (CF/LP/MP) Hvis en plade indeholder mere end et reagenspakke-lotnummer, skal kontroller testes med hvert lot 2 Vend forsigtigt QIAGEN buffer AE og luftvejspræparat- og mediefortynder op og ned inden brug 3 Tag hætten af det negative kontrolglas (CF/LP/MP) 4 Med en ny pipettespids for hvert kontrolglas tilsættes 200 µl QIAGEN buffer AE 5 Med en ny pipettespids for hvert kontrolglas tilsættes 400 µl luftvejspræparat- og mediefortynder 6 Sæt hætten godt fast på glasset 7 Tag hætten af det positive kontrolglas (CF/LP/MP) 8 Med en ny pipettespids for hvert kontrolglas tilsættes 200 µl QIAGEN buffer AE 9 Med en ny pipettespids for hvert kontrolglas tilsættes 400 µl luftvejspræparat- og mediefortynder 10 Sæt hætten godt fast på glasset 11 Slyng kontrolglassene 5 s 12 Kontrollerne er klar til at blive kogt Se Bearbejdning af præparater fra de nedre luftveje (Afsnit D) F Testningsprocedure for BD ProbeTec ET LP analysen: BEMÆRK: Inden udførelse af testningsproceduren arrangeres de bearbejdede præparater og kontroller i et stativ, der kan håndtere 2 ml prøveglas, som fx BD ProbeTec ET 2 ml prøveglasstativet, som er kompatibelt med BD ProbeTec ET pipettoren 1 Fjern og bortskaf hætterne fra de afkølede præparater og kontroller 2 SKIFT HANDSKER, inden De fortsætter for at undgå kontaminering 3 Klargør primermikrobrøndpladen ved hjælp af pladelayoutrapporten - se Pladelayout (Afsnit C) 4 Forsegl mikrobrøndposerne igen som følger: a Anbring posen på en plan flade Hold den åbne ende fladt med den ene hånd b Med påføring af tryk køres fingeren hen over ydersiden af forseglingen fra den ene kant af posen til den anden c Se efter for at sikre, at posen er forseglet 5 Vælg Program 1 på BD ProbeTec ET pipettoren 6 Saml pipettespidserne op Udvid BD ProbeTec ET pipettoren ved at trække afstandsknappen helt ud BEMÆRK: Sørg for, at spidserne er sat forsvarligt på pipettoren, så lækage undgås 7 Aspirér 200 µl fra den første kolonne af prøver 8 Pres forsigtigt pipettoren sammen, lad pipettespidser berøre siderne af brøndene og dispensér 150 µl i den tilsvarende kolonne af primermikrobrønde (1 A - H) BEMÆRK: Pipettoren må ikke presses sammen over prøver eller mikrobrønde, da dette kan give kontaminering Pludselige bevægelser kan give dråber eller aerosoler 9 Kassér spidserne Tryk ned på pipetteringsudløseren for at nulstille pipettoren BEMÆRK: Kassér spidserne forsigtigt for at undgå små dråber eller aerosoler, som kan kontaminere arbejdsområdet 10 Saml nye spidser op, udvid pipettoren og aspirér 200 µl fra den anden kolonne af prøver 11 Pres forsigtigt pipettoren sammen, lad pipettespidser berøre siderne af brøndene og dispensér 150 µl i den tilsvarende kolonne af primermikrobrønde (2 A - H) 12 Kassér spidserne 13 Fortsæt med at overføre de resterende prøver til kørslen 14 Dæk primermikrobrøndpladen med primerlåget og lad pladen inkubere ved stuetemperatur i mindst 20 min (Kan inkubere op til 6 h) BEMÆRK: Sæt nye hætter på de bearbejdede prøver SKIFT HANDSKER 15 Når inkubationen af primeren er færdig, klargøres amplifikationsmikrobrøndpladen Konfigurér amplifikationsmikrobrønden i en plade, der matcher pladelayoutrapporten (samme som primerpladen) Forsegl mikrobrøndposerne igen som beskrevet i punkt 4 16 Tag låget af primermikrobrøndpladen og overfør pladen til primervarmeapparatet Anbring STRAKS amplifikationsbrøndpladen i opvarmerapparatet for at forvarme 17 Indstil uret til 10 min (BEMÆRK: Dette punkt er vigtigt for tiden ) 5

6 18 Ved afslutningen af de 10 min (± 1 min) inkubation vælges Program 5 på pipettoren 19 Saml pipettespidser op og overfør 100 µl fra kolonne 1 i primermikrobrøndenpladen til kolonne 1 i amplifikationsmikrobrøndpladen Lad pipettespidserne berøre siderne af brøndene og dispensér væsken Lad efter dispenseringen pipettoren blande væsken i brøndene automatisk Løft forsigtigt pipettoren væk fra pladen Undgå berøring af andre brønde 20 Kassér spidserne Saml nye spidser op og fortsæt med at overføre reaktionsblandingen fra primermikrobrøndene til amplifikationsmikrobrøndene, kolonne efter kolonne, idet der bruges nye spidser for hver kolonne 21 Når den sidste kolonne er blevet overført, fjernes bagbeklædningen fra en amplifikationsforsegler (En amplifikationsforsegler (1/2) vil dække op til 6 kolonner Hvis pladen overstiger 6 kolonner, SKAL et helt forseglerark bruges) Hold forsegleren i kanterne og læg den over mikrobrøndene Brug retningslinierne på opvarmerapparatet for at hjælpe Dem med at lægge forsegleren over Tryk nedad på forsegleren for at sikre, at alle mikrobrønde er fuldstændig forseglet 22 Ved BD ProbeTec ET brugerkontaktfladen flyttes bæreren ud og døren åbnes og pladelåget løftes Overfør STRAKS (inden for 30 s) den forseglede amplifikationsmikrobrøndplade til BD ProbeTec ET instrumentet og start kørslen (Der henvises til brugermanualen til BD ProbeTec ET systemet for detaljerede instruktioner ) 23 Når kørslen er startet, fortsættes med følgende del af rengøringsproceduren: a Forsegl primermikrobrøndene med amplifikationsforsegleren og fjern pladen fra primer- og opvarmerapparatet ADVARSEL: Temperaturen er over 70 C Brug den varmebestandige handske til at fjerne pladen b Lad pladen afkøle på bordet i 5 min c Fjern de forseglede primermikrobrønde fra pladen ved at holde fat i begge sider af forsegleren og løfte brøndene lige op som en enhed Anbring de forseglede mikrobrønde i en engangspose og forsegl d Rengør metalpladen: Skyl pladen med 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit - Alconox opløsning Skyl pladen med vand Vikl pladen ind i et rent papirhåndklæde og lad den tørre, inden den tages i brug igen 24 Når kørslen er færdig, vil der genereres en udskrift af testresultaterne 25 Flyt pladebæreren ud af platformen, åbn døren og fjern pladen Luk døren og sæt pladeplatformen tilbage ind i instrumentet 26 Fjern de forseglede amplifikationsmikrobrønde fra pladen FORSIGTIG: Forseglingsmaterialet må ikke fjernes fra mikrobrøndene De forseglede mikrobrønde kan let fjernes som en enhed ved at holde fat i top og bund af forsegleren og løfte lige op og ud af pladen Anbring de forseglede mikrobrønde i engangsposen Forsegl posen 27 Rengør metalpladen: Skyl pladen med 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit - Alconox opløsning Skyl pladen med vand Vikl pladen ind i et rent papirhåndklæde og lad den tørre, inden den tages i brug igen 28 Ved dagens sidste kørsel udføres følgende rengøringsprocedurer: a Gennemvæd papirhåndklæder eller gazestykker med 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox opløsning og påfør det på bordflader og på de udvendige flader af primer- og opvarmerapparatet, 2 ml prøveglasstativet, vandbade, centrifuge og BD ProbeTec ET instrumentet Lad opløsningen sidde på overfladerne i 2-3 min Gennemvæd papirhåndklæder eller gazestykker med vand og aftør rengøringsopløsningen Skift håndklæder eller gaze hyppigt, når der påføres rengøringsopløsning og skylles med vand Fugt papirhåndklæder eller gazestykker med 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox og aftør pipettorens håndtag (KUN HÅNDTAGET) Efter 2-3 min aftørres håndtaget med papirhåndklæder eller gazestykker fugtet med vand b Læg vandbadstativet og plader i blød i 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox i 1-2 min Skyl grundigt med vand og lad det lufttørre c Genoplad pipettoren d Bortskaf den forseglede engangspose og biofareposen i overensstemmelse med fastlagte procedurer for bortskaffelse af kontamineret affaldsmateriale 29 Udfør de følgende procedurer mindst én gang om ugen: a Bortskaf vandet i vandbadene b Rengør vandbadene med 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox Skyl grundigt med vand og lad dem lufttørre c Fyld op med destilleret vand Kvalitetskontrol Krav til kvalitetskontrol skal udføres i overensstemmelse med gældende lokale og/eller nationale regulativer eller akkrediteringskrav samt laboratoriets standardkvalitetskontrolprocedurer Det anbefales at læse de relevante CLSI (tidligere NCCLS)-retningslinjer og CLIA-regulativer mht passende kvalitetskontrolprocedurer Luftvejspræparat- og mediefortynder og kontroller leveres sammen i Luftvejspræparat- og mediefortynder og kontrolkit (CF/LP/MP) En positiv og en negativ kontrol skal inkluderes for hver analysekørsel på en plade og for hvert nyt reagenskit-lotnummer Kontroller kan placeres tilfældigt Den positive kontrol overvåger for væsentlige reagensfejl Den negative kontrol overvåger for reagens- og/eller miljømæssig kontaminering Den positive og negative kontrol skal teste som henholdsvis positiv og negativ for at rapportere prøveresultater Hvis kontrollerne ikke præsterer som forventet, betragtes analysekørslen som ugyldig og instrumentet vil ikke rapportere patientresultater Hvis kørselskontrollerne ikke giver de forventede resultater, gentages hele kørslen med et nyt sæt kontroller, nye mikrobrønde og de bearbejdede præparater Hvis der resterer utilstrækkelig bearbejdet præparat for en gentagen test, genbearbejdes en anden afmåling af det primære præparat Hvis de gentagede kontroller ikke giver de forventede resultater, kontaktes Teknisk service (se "Tolkning af testresultater") En intern amplifikationskontrol (IAC) tørres i primermikrobrønden IAC indeholder nukleinsyrefokus, som forstærkes ved tilstedeværelsen af prøvematricen IAC er designet for at bekræfte gyldigheden af amplifikationsreaktionen og for at identificere potentiel hæmning fra det bearbejdede præparat 6

7 Præparatbearbejdningskontroller Præparatbearbejdningskontroller kan testes i overensstemmelse med kravene fra relevante akkrediteringsorganisationer En positiv kontrol bør teste hele analysesystemet Til dette formål kan kendte positive præparater tjene som kontroller ved at blive bearbejdet og testet sammen med ukendte præparater Præparater, der bruges som bearbejdningskontroller, kan lagres, bearbejdes og testes i henhold til produktindlægssedlen Præparatbearbejdningskontroller, som simulerer præparater fra de nedre luftveje, kan også klargøres som beskrevet nedenfor: 1 Tag et hætteglas med frysetørret L pneumophila ATCC (Philadelphia-1) ud, som har været opbevaret ved -20 C eller derunder 2 Rehydrér det med 1 ml 0,85 % (vægt/vol) saltvandsopløsning indeholdende 0,2 % (vægt/vol) oksealbumin (Fraktion V) 3 Fortynd rehydreret L pneumophila stamme til 1: i 0,85 % (vægt/vol) saltvand indeholdende 0,2 % oksealbumin (Fraktion V) 4 Pipettér 350 µl fortyndet L pneumophila i et glas med trykhætte 5 Bearbejd som beskrevet i Bearbejdning af præparater fra de nedre luftveje (Afsnit D) Overvågning af tilstedeværelsen af kontaminering med DNA Mindst en gang om måneden bør følgende testprocedurer udføres for at overvåge arbejdsområdet og udstyrsflader for tilstedeværelse af kontaminering med DNA Overvågning af miljøet er væsentligt for at påvise kontaminering, inden der opstår et problem 1 For hvert område*, der skal testes, bruges en BBL CultureSwab EZ podepind 2 Mærk et 2 ml glas med skruelåg for hvert område, der skal testes Pipettér 600 µl luftvejspræparat- og mediefortynder i hvert glas og tilsæt 300 µl QIAGEN buffer AE eller molekylært, destilleret vand Slyng i 5 s for at blande 3 Dyp den første podepind i fortynderen, som blev klargjort i trin 2, og aftør det første område med en bred, fejende bevægelse 4 Hvirvl podepinden rundt i fortynderen, tryk af mod glassets side Sæt hætte på glasset og slyng det i 5 s Bortskaf podepinden 5 Gentag proceduren for hvert område, som skal testes 6 Anbring glassene i et vandbadstativ og opvarm dem i kogende vandbad i 5 min Tag stativet op af det kogende vandbad og lad prøverne afkøle i 15 min ved stuetemperatur, inden der fortsættes 7 Efter afkøling centrifugeres ( x g) i ca 5 s 8 Mens glassene varmes op, bruges rene håndklæder vædet med vand til at fjerne rester af bufferblandingen fra de testede overflader 9 Når prøverne er afkølet, fortsættes med Testningsprocedure for BD ProbeTec ET LP analysen (Afsnit F) *Anbefalede områder, der skal testes, omfatter: Overflader på vandbadstativet, mikrocentrifugen, primer- og opvarmerapparatet, sorte mikrobrøndplader, pipettorhåndtaget, instrumentets taster, instrumentets tastatur, de tørre overflader på vandbadene, overfladerne på prøvestativerne og arbejdsbordene, herunder områder hvor prøver bearbejdes Hvis et område giver et positivt resultat, rengøres området med frisk 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox Sørg for, at hele området er vædet med rengøringsopløsningen og lad rengøringsopløsningen få lov at blive på fladen i mindst 2 min, eller indtil tørhed opnås Fjern overskydende rengøringsopløsning med et rent håndklæde, hvis det er nødvendigt Aftør området med et rent håndklæde vædet med vand og lad fladen tørre Test området igen Gentag, indtil der foreligger negative resultater Hvis der bliver ved med at være kontaminering, kontaktes Teknisk service for yderligere information TOLKNING AF TESTRESULTATER Tilstedeværelsen eller fraværet af L pneumophila DNA bestemmes ved at beregne PAT scores (Passes After Threshold) for prøven baseret på forudbestemte tærskelværdier PAT scoren er en metrik, der anvendes til at vurdere signalstørrelsen som et resultat af reaktionen Ved denne metrik indikerer store tal, at tærsklen blev nået i de tidlige faser af amplifikation, mens små tal betyder, at tærsklen blev nået senere i reaktionsforløbet PAT scorens størrelse antyder ikke niveauet af L pneumophila DNA i præparatet Hvis analysekontrolresultater ikke er som forventet, skal patientresultaterne ikke rapporteres Se afsnittet Kvalitetskontrol for forventede kontrolværdier Rapporterede resultater bestemmes som følger: 7

8 PAT Score LP fokus IAC fokus Resultat Tolkning Rapport > 0 > eller = 0 Positiv L pneumophila DNA påvist ved SDA = 0 > 0 Negativ L pneumophila DNA ikke påvist ved SDA Positiv for organismer tilhørende L pneumophila serogrupperne 1-14, antydende aktuel infektion Yderligere testning nødvendig for at identificere serogrupperne, hvis dette er påkrævet af epidemiologiske årsager Formodet negativ for L pneumophila serogrupperne 1-14 i et præparat fra de nedre luftveje, antydende ingen nylig eller aktuel infektion Infektion pga Legionella kan ikke udelukkes, fordi: 1) serogrupper ud over 1-14 og andre Legionella arter kan forårsage sygdom og, 2) niveauet af tilstedeværende DNA kan være under påvisningsgrænsen for testen = 0 = 0 Inkonklusiv Amplifikationskontrol inhiberet Yderligere testning nødvendig for tolkning af resultat a a Gentag BD ProbeTec ET LP analysen fra det bearbejdede prøveglas Hvis der ikke er tilstrækkelig volumen tilbage fra den bearbejdede prøve, gentages fra det oprindelige præparat Hvis resultatet fra gentagelsen er positivt eller negativ, tolkes som beskrevet ovenfor Hvis resultatet gentager som inkonklusivt, bør der anmodes om et nyt præparat Bestemmelse af LP og IAC tærskel: Tærskelværdierne for L pneumophila fokus-dna og IAC blev initialt fastlagt ved hjælp af Receiver Operator Characteristic kurveanalyse af data opnået fra positive og negative kontroller Disse tærskelværdier blev verificeret i kliniske undersøgelser og med retrospektive L pneumophila-positive og -negative præparater fra de nedre luftveje Tærskelværdierne blev dernæst valideret i yderligere kliniske undersøgelser PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER 1 BD ProbeTec ET LP analysen er kun specifik for L pneumophila serogrupperne 1-14 Andre L pneumophila serogrupper er ikke blevet testet 2 BD ProbeTec ET LP analysen påviser ikke infektioner forårsaget af andre Legionella arter 3 Funktionsdata for BD ProbeTec ET LP analysen er kun blevet fastlagt med ekspektoratpræparater Ydelse med andre præparattyper er ikke blevet bestemt 4 BD ProbeTec ET LP analysen er kun evalueret med patienter på 13 år og ældre 5 Som det er tilfældet med mange diagnostiske tests, bør resultater fra BD ProbeTec ET LP analysen tolkes sammen med andre laboratorie- og kliniske data, som er til rådighed for lægen 6 Et negativt testresultat udelukker ikke muligheden for infektion, fordi testresultater kan være påvirket af ukorrekt opsamling af præparatet, teknisk fejl, sammenblanding af præparater, samtidig antibiotikabehandling eller tilstedeværelsen af en mængde L pneumophila DNA i præparatet, som ligger under testens analytiske sensitivitet 7 BD ProbeTec ET LP analysen kan ikke bruges til at vurdere terapeutisk succes eller fiasko, da nukleinsyrer fra L pneumophila kan persistere efter behandling med antibiotika 8 BD ProbeTec ET LP analysen er ikke blevet evalueret med miljøprøver (fx drikkevand eller vandkvalitetstestning) 9 Optimal ydelse af denne analyse kræver adækvat præparatopsamling og -håndtering 10 Brug af BD ProbeTec ET LP analysen begrænses til personale, som er blevet uddannet i analyseproceduren og BD ProbeTec ET systemet 11 BD ProbeTec ET LP analysen giver kvalitative resultater Der kan ikke bestemmes en sammenhæng mellem størrelsen af PAT scoren og mængden af L pneumophila DNA i en prøve FORVENTEDE RESULTATER A Prævalens Hastigheden af positiviteten, der kan observeres i L pneumophila testning, vil variere afhængigt af prøvetagningsmetoden, patientens alder, tilstedeværelse af underliggende risikofaktorer, geografisk beliggenhed, og vigtigst af alt, den lokale sygdomsprævalens, herunder mulige udbrudssituationer B Fordeling af PAT score hyppighed Der blev opsamlet i alt 83 retrospektive ekspektoratpræparater fra fire kliniske steder i USA, Europa og Canada og testet med BD ProbeTec ET LP analysen En fordeling af hyppigheden af LP PAT scores sammenlignet med dyrkning vises i Figur 1 8

9 Figur 1: Fordeling af hyppighed af LP PAT score sammenlignet med dyrkning Hyppighed (-) (+) 19 Dyrkning - Dyrkning LP PAT score Dyrkningsresultat I alt Negativ Positiv I alt C Kontroller Under den kliniske evaluering blev kontrolfejl iagttaget i en ud af 46 kørsler for BD ProbeTec ET LP analysen (dvs en kørsel havde en procedurerelateret fejl) LP PAT scores for de resterende 45 kørsler er sammenfattet i Tabel 1 Tabel 1: Fordeling af LP PAT score for kontroller fra luftvejsprøver og medier Kontrol N Område 5 percentil Middel Median 95 percentil LP Negativ LP Positiv 45 29,4 50,7 40,1 46,7 47,6 49, FUNKTIONSDATA Prospektiv undersøgelse BD ProbeTec ET LP analysen blev evalueret prospektivt ved syv kliniske centre i USA og Canada i sæsonen for luftvejslidelser Et ekspektoratpræparat og en urinprøve blev opsamlet fra hver patient Ekspektoratpræparaterne blev testet ved hjælp af BD ProbeTec ET LP analysen, Legionella dyrkning og en Direkte Fluorescens Antistof (Direct Fluorescent Antibody, DFA) analyse Urinprøverne blev testet ved hjælp af en kommercielt tilgængelig L pneumophila urin antigen analyse I alt 118 patienter opfyldte kriterierne for inklusion i undersøgelsen (dvs radiologisk tegn på pneumoni, patienter på 13 år, på antibiotika 14 dage, valide præparattyper opsamlet, relevante referencemetoder udført osv ) Af de 118 patienter var der 114 valide resultater med BD ProbeTec ET LP analysen Resultater for ekspektoratpræparaterne blev sammenlignet med resultatet fra ekspektoratdyrkningen for at give et estimat af funktionsdata Et præparat blev betragtet som positivt, hvis dyrkningsresultatet var positivt Et resultat blev betragtet som negativt, hvis dyrkningsresultatet var negativt Alle initialt inkonklusive resultater skulle gentages med det bearbejdede præparat eller med det oprindelige præparat (hvis der ikke var tilstrækkeligt bearbejdet præparat til rådighed) Præparater, som gav et initialt og et gentaget (dvs endeligt) inkonklusivt resultat, blev ikke inkluderet i funktionsdataene Et præparat, som gav et initialt inkonklusivt resultat og ved gentagelse gav et positivt eller negativt resultat, blev inkluderet i funktionsdataene Et præparat, som gav et initialt inkonklusivt resultat, og som ikke kunne gentages på grund af en utilstrækkelig præparatmængde, gav fortsat et "initialt inkonklusivt" resultat og blev ikke inkluderet i funktionsdataene BD ProbeTec ET LP analysens resultater for ekspektoratpræparaterne sammenlignet med resultater fra dyrkning er sammenfattet i Tabel 2 9

10 Tabel 2: BD ProbeTec ET LP analyse - Prospektive resultater fra ekspektoratpræparater sammenlignet med dyrkning sammenlignet med dyrkning Sted Sensitivitet (95 % konfidensinterval) 1 IR 2 IR 3 IR 6 IR 7 IR Samlet IR Specificitet (95 % konfidensinterval) 100% (17/17) (80,5% 100%) 100% (2/2) (15,8% 100%) 100% (31/31) (88,8% 100%) 100% (33/33) (89,4% 100%) 100% (31/31) (88,8% 100%) 100% (114/114) a (96,8% 100%) InkonklusivInitial/ Endelig 0/0 0/0 0/0 2/0 b 3/2 c 5/2 a Af de 114 dyrknings-negative præparater var alle negative over for direkte fluorescens antigen (Direct Fluorescent Antibody, DFA) Syvogfirs af de 114 patienter blev desuden testet med en urin antigen analyse og fundet at være negative b Ét præparat gav negativt resultat ved gentagelse og blev inkluderet i specificitetsberegningen Mængden af ét præparat var ikke tilstrækkelig til at testen kunne gentages c To præparater var fortsat inkonklusive ved gentaget testning Mængden af ét præparat var ikke tilstrækkelig til at testen kunne gentages IR = Ikke relevant Retrospektiv undersøgelse BD ProbeTec ET LP analysen blev også evalueret med 83 retrospektive ekspektoratpræparater fra kliniske steder i USA, Europa og Canada De retrospektive præparater blev opbevaret i frossen tilstand i op til seks år, med størstedelen af præparaterne (65,1 %; 54/83) opbevaret i under to år Hvert sted registrerede det oprindelige dyrkningsresultat for hvert retrospektivt præparat Hvert sted testede ekspektoratpræparaterne i BD ProbeTec ET LP analysen og sammenlignede resultaterne med dyrkningsresultatet Et præparat blev betragtet som positivt, hvis dyrkningsresultatet var positivt Et præparat blev betragtet som negativt, hvis dyrkningsresultatet var negativt BD ProbeTec ET LP analyseresultater fra de retrospektive ekspektoratpræparater sammenlignet med dyrkningsresultater er sammenfattet i Tabel 3 Tabel 3: BD ProbeTec ET LP-analyse - Retrospektive resultater fra ekspektoratpræparater sammenlignet med dyrkning Dyrkning Procent overensstemmelse estimater (95 % konfidensinterval) Sted LP Resultat Positiv Negativ I alt Positiv Negativ Samlet 6 Positiv Negativ I alt Positiv Negativ I alt Positiv Negativ I alt Positiv Negativ I alt Samlet Positiv 21 8 a 29 Negativ 2 b I alt 23 c % (1/1) (2,5% 100%) 94,1% (16/17) (71,3% 99,9%) 100% (1/1) (2,5% 100%) 75% (3/4) (19,4% 99,4%) 91,3% (21/23) (72% 98,9%) IR 82,8% (24/29) (64,2% 94,2%) 88% (22/25) (68,8% 97,5%) 100% (6/6) (54 1% 100%) 86,7% (52/60) (75,4% 94,1%) 100% (1/1) (2,5% 100%) 87% (40/46) (73,7% 95,1%) 88 5% (23/26) (69,8% 97,6%) 90% (9/10) (55,5% 99,7%) 88% (73/83) (79% 94,1%) a Otte præparater var dyrknings-negative, BD ProbeTec ET LP analyse-positive Samtlige otte præparater var positive i en urin antigen analyse PCR testning blev udført på seks af de otte præparater; alle seks præparater var positive med PCR b To præparater var dyrknings-positive, BD ProbeTec ET LP analyse-negative Begge præparater var negative i en urin antigen analyse PCR testning blev udført på begge præparater; et præparat var positivt med PCR c De 23 dyrknings-positive præparater blev fordelt blandt de følgende serogrupper: 47,8 % (11/23) serogruppe 1; 17,4 % (4/23) serogruppe 3; 13,0 % (3/23) serogruppe 4; 4,3 % (1/23) serogruppe 5; 4,3 % (1/23) serogruppe 6 og 13 % (3/23) serogruppe information ikke tilgængelig IR = Ikke relevant 10

11 BEMÆRK: PCR metoden anvendt til at teste diskordant dyrkning og BD ProbeTec ET LP analyseresultater var ikke en metode, der er godkendt af FDA Analytiske undersøgelser BD ProbeTec ET LP analysens amplifikationsreaktionsvolumen er 100 µl bearbejdet prøve Analytisk sensitivitet Den analytiske sensitivitet af BD ProbeTec ET LP analysen på tværs af 14 forskellige serogrupper af L pneumophila blev bestemt ved at fortynde bakterielle suspensioner til niveauer på 0, 150, 300 og 450 kolonidannende enheder (CFU) pr reaktion Prøver blev bearbejdet og analyseret tredobbelt Baseret på 100 % positivitet var den analytiske sensitivitet for serogruppe 2-10 og CFU/reaktion; den faktiske påvisningsgrænse (Limit of Detection, LOD) kan dog være under det laveste testede niveau Baseret på 100 % positivitet var den analytiske sensitivitet for serogruppe 1 og CFU/reaktion; serogruppe 13 var 450 CFU/reaktion; og serogruppe 14 var 700 CFU/reaktion Den analytiske sensitivitet af BD ProbeTec ET LP analysen ved tilstedeværelse af en lavere matrix af præparater fra de nedre luftveje blev bestemt ved at spike en makrofag-inficeret stamme af L pneumophila serogruppe 1 i spyt ved niveauer på 0, 150, 300 og 450 CFU pr reaktion Præparaterne blev bearbejdet og analyseret tredobbelt Baseret på 100 % positivitet var den analytiske sensitivitet for spikede præparater fra de nedre luftveje 150 CFU/reaktion; den faktiske LOD kan dog være under det laveste testede niveau Analytisk specificitet I alt blev 79 mikroorganismer (69 bakterier, en gærsvamp og ni vira) evalueret ved hjælp af BD ProbeTec ET LP analysen Bakterieisolater blev testet ved koncentrationer, der gik fra 1 x 10 6 CFU/mL til 1 x 10 8 CFU/mL Vira blev testet ved en koncentration på 1 x 10 6 virale partikler/ml Coccidioides immitis blev præpareret som en myceliumsuspension svarende til en McFarland standard på 5 Ingen af de testede mikroorganismer frembragte et positivt resultat eller hæmmede IAC (Tabel 4) Tabel 4: BD ProbeTec ET LP analyse - Analytisk specificitet Acinetobacter calcoaceticus Actinomyces israelii Adenovirus-5 Aeromonas hydrophila Blastomyces dermatitidis Bordetella bronchiseptica Bordetella parapertussis Bordetella pertussis Branhamella catarrhalis Candida albicans Chlamydia trachomatis, serogruppe L2 Chlamydophila pneumoniae, AR-39 Citrobacter freundii Coccidioides immitis Corynebacterium diphtheriae Corynebacterium jeikeium Cryptococcus neoformans Cytomegalovirus Eikenella corrodens Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterovirus (Echovirus) Escherichia coli Fusobacterium nucleatum Haemophilus influenzae Haemophilus parainfluenzae Herpesvirus-1 Histoplasma capsulatum Influenzavirus A Influenzavirus B Kingella kingae Klebsiella pneumoniae subsp ozaenae type 4 Klebsiella pneumoniae subsp pneumoniae Lactobacillus acidophilus Legionella anisa Legionella bozemanii Legionella cherrii Legionella cincinnatiensis Legionella dumoffii Legionella erytha Legionella fairfieldensis Legionella feeleii Legionella gormanii Legionella hackeliae Legionella jordanis Legionella longbeachae Legionella maceachernii Legionella oakridgensis Legionella sainthelensi Legionella spiritensis Legionella worsleiensis Moraxella osloensis Mycobacterium tuberculosis Mycoplasma pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Neisseria mucosa Parainfluenza type 1 Peptostreptococcus anaerobius Porphyromonas asaccharolytica Prevotella oralis Pseudomonas aeruginosa Respiratorisk syncytialvirus, lang stamme Rhinovirus Salmonella choleraesuis serotype Enteritidis Salmonella choleraesuis serotype Typhi Serratia marcescens Staphylococcus aureus, protein A-producerende Staphylococcus aureus, non-protein A- producerende Staphylococcus epidermidis Stenotrophomonas maltophilia Streptococcus gruppe B Streptococcus mutans Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Tatlockia (Legionella) micdadei Veillonella parvula INTERFERERENDE STOFFER Potentielle, interfererende stoffer, som kan mødes i præparater fra de nedre luftveje, blev testet med BD ProbeTec ET LP analysen ved fravær af fokus eller ved tilstedeværelse af 750 CFU/reaktion af L pneumophila Ved fravær af fokus frembragte ingen af de testede stoffer et positivt resultat eller hæmmede IAC ved de koncentrationer, der er angivet i Tabel 5 Når fokus var i tilstedeværelse af stoffer ved de koncentrationer, der er angivet i Tabel 5, frembragte alle testede prøver et positivt resultat 11

12 Tabel 5: BD ProbeTec ET LP analyse - Stoffer screenet for interferens Præparater fra nedre luftveje Testede stoffer Koncentration Fuldblod (heparin) 2,65% Lidokain 2 % 0,21% Spyt induktionopløsning (3 % NaCl) 0,32% Azithromycin 0,42 µg/ml Penicillin G 17 µg/ml Tetracyclin 2,3 µg/ml Doxycyclin 26,5 µg/ml Ciprofloxacin 4,88 µg/ml Mycoplasma pneumoniae 5 x 10 6 cells/ml Chlamydophila pneumoniae 1,06 x 10 7 EBs/mL Mycoplasma pneumoniae og Chlamydophila pneumoniae Hhv 1,06 x 10 7 celler/ml og 1,06 x 10 7 EB'er/mL Reproducerbarhed Reproducerbarheden hos BD ProbeTec ET LP analysen blev vurderet ved tre laboratorier ved at teste et panel bestående af 24 prøver, der blev spiket i PBS/BSA Panelet omfattede 12 prøver, der var negative for L pneumophila; tre lave (300 CFU/reaktion) og tre høje (500 CFU/reaktion) positive prøver af L pneumophila; og tre lave (hhv 30 elementærlegemer (Elementary Bodies, EB)/reaktion, 300 CFU/reaktion, 900 celler/reaktion) og tre høje (hhv 50 EB/reaktion, 500 CFU/reaktion, 1500 celler/reaktion) positive prøver hver indeholdende Chlamydophila pneumoniae (CP), L pneumophila (LP), og Mycoplasma pneumoniae (MP) En operatør pr sted testede panelerne en gang om dagen i tre dage Resultaterne er sammenfattet i Tabel 6 Tabel 6: Reproducerbarhedsestimater efter prøveniveau af præparater fra de nedre luftveje Mellem daginden for stedet Mellem stedet Panelmedlem N % korrekt Middel PAT SD % CV SD % CV LP-HIGH ,0% 47,2 0,94 2,00 1,42 3,02 LP-LOW ,0% 44,8 0,44 0,98 2,06 4,59 CP/LP/MP-HIGH ,0% 46,2 1,13 2,45 1,79 3,88 CP/LP/MP-LOW 26 a 100,0% 43,0 0,00 0,00 2,59 6,01 Negativ ,0% 0,0 IAC med LP-negative prøver ,0% 47,8 0,43 0,91 0,34 0,70 a En prøve ekskluderet fra analysen på grund af en procedurerelateret fejl BESTILLING De følgende BD ProbeTec ET produkter er disponible: Kat nr Beskrivelse BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit BD ProbeTec ET Accessories Kit (10 primerlåg, 16 amplifikationsforseglere ½ og 8 engangsposer) BD ProbeTec ET Pipette Tips 6 x BD ProbeTec ET 2 ml Sample Tubes and Caps, 200 af hver BD ProbeTec ET 2 ml Caps, BD ProbeTec ET Instrument, uden for USA BD ProbeTec ET Instrument, USA og Canada BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater, 220V BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater, 120V BD ProbeTec ET Pipettor BD ProbeTec ET Lysing Rack LITTERATUR 1 Cloud J L, Carroll K C, Pixton P, Erall M, Hillyard D R (2000) Detection of Legionella species in respiratory specimens using PCR with sequencing confirmation J Clin Micro 38: Stout, J E, Yu, V L 2000 Legionellosis N Engl J Med 337: Bartlett, J G, Dowell, S F, Mandell, L A, File, T M, Musher, D M, Fine, M J 2000 Guidelines from the Infectious Diseases Society of America - Practice guidelines for the management of community-acquired pneumonia in adults Clin Infect Dis 31: National Committee for Clinical Laboratory Standards 2001 Approved Guideline M29-A2 Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed NCCLS, Wayne, Pa 5 Garner J S 1996 Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U S Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention Guideline for isolation precautions in hospitals Infect Control Hospital Epidemiol 17:

13 6 U S Department of Health and Human Services 1999 Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed U S Government Printing Office, Washington, D C 7 Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC) Official Journal L262, 17/10/2000, p Van der Zee, A, Peeters, M, de Jong, C, Verbakel, H, 2002 QIAGEN DNA extraction kits for sample preparation for Legionella PCR are not suitable for diagnostic purposes J Clin Microbiol 40 (3): Evans, G E et al 2003 Contamination of QIAGEN DNA extraction kits with Legionella DNA J Clin Microbiol 41 (7): Isenberg, H D (ed ) 1992 Clinical Microbiology Procedures Handbook Vol 1 American Society for Microbiology, Washington, D C m e r A I 0 Consult i Manufacturer / Výrobce / Producent / Fabrikant / Tootja / Valmistaja / Fabricant / Hersteller / ÊáôáóêåõáóôÞò / Gyártó / Ditta produttrice / Gamintojas / Producent / Fabricante / Výrobca / Tillverkare Use by / Spotøebujte do / Anvendes før / Houdbaar tot / Kasutada enne / Viimeinkäyttöpäivä / A utiliser avant / Verwendbar bis / Çìåñïìçßá ëþîçò / Felhasználhatóság dátuma / Usare entro / Naudokite iki / Brukes før / Stosowaæ do / Utilizar em / Použite do / Usar antes de / Använd före / YYYY-MM-DD / YYYY-MM (MM = end of month) / RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = konec mìsíce) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutning af måned) / JJJJ-MM-DD / JJJJ-MM (MM = einde maand) AAAA-KK-PP / AAAA-KK (KK = kuu lõpp) VVVV-KK-PP / VVVV-KK (kuukauden loppuun mennessä) AAAA-MM-JJ / AAAA-MM (MM = fin du mois) / JJJJ-MM-TT / JJJJ-MM (MM = Monatsende) / ÅÅÅÅ-ÌÌ-ÇÇ / ÅÅÅÅ-ÌÌ (ÌÌ = ôýëïò ôïõ ìþvá) / ÉÉÉÉ-HH-NN / ÉÉÉÉ-HH (HH = hónap utolsó napja) AAAA-MM-GG / AAAA-MM (MM = fine mese) / MMMM-MM-DD / MMMM-MM (MM = mënesio pabaiga) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutten av måneden) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec miesi¹ca) AAAA-MM-DD / AAAA-MM (MM = fim do mês) / RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec mesiaca) aaaa-mm-dd / aaaa-mm (mm = fin del mes) / ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutet på månaden) Catalog number / Katalogové èíslo / Katalognummer / Catalogusnummer / Kataloogi number / Tuotenumero / Numéro catalogue / Bestellnummer / Áñéèìüò êáôáëüãïõ / Katalógusszám / Numero di catalogo / Katalogo numeris / Numer katalogowy / Número do catálogo / Katalógové èíslo / Número de catálogo Authorized Representative in the European Community / Autorizovaný zástupce pro Evropskou unii / Autoriseret repræsentant i EU / Erkend vertegenwoordiger in de Europese Unie / Volitatud esindaja Euroopa Nõukogus / Valtuutettu edustaja Euroopan yhteisössä / Représentant agréé pour la C E E / Autorisierte EG-Vertretung / ÅîïõóéïäïôçìÝíïò áíôéðñüóùðïò óôçí ÅõñùðáúêÞ Êïéíüôçôá / Hivatalos képviselet az Európai Unióban / Rappresentante autorizzato nella Comunità europea / Ágaliotasis atstovas Europos Bendrijoje / Autorisert representant i EU / Autoryzowane przedstawicielstwo w Unii Europejskiej / Representante autorizado na União Europeia / Autorizovaný zástupca v Európskom spoloèenstve / Representante autorizado en la Comunidad Europea / Auktoriserad representant i EU In Vitro Diagnostic Medical Device / Lékaøské zaøízení urèené pro diagnostiku in vitro / In vitro diagnostisk medicinsk anordning / Medisch hulpmiddel voor in vitro diagnose / In vitro diagnostika meditsiiniaparatuur / Lääkinnällinen in vitro -diagnostiikkalaite / Dispositif médical de diagnostic in vitro / Medizinisches In-vitro-Diagnostikum / In vitro äéáãíùóôéêþ éáôñéêþ óõóêåõþ / In vitro diagnosztikai orvosi eszköz / Dispositivo medico diagnostico in vitro / In vitro diagnostikos prietaisas / In vitro diagnostisk medisinsk utstyr / Urz¹dzenie medyczne do diagnostyki in vitro / Dispositivo médico para diagnóstico in vitro / Medicínska pomôcka na diagnostiku in vitro / Dispositivo médico de diagnóstico in vitro / Medicinsk anordning för in vitro-diagnostik Temperature limitation / Teplotní omezení / Temperaturbegrænsning / Temperatuurlimiet / Temperatuuri piirang / Lämpötilarajoitus / Température limite / Zulässiger Temperaturenbereich / ¼ñéï èåñìïêñáóßáò / Hõmérsékleti határ / Temperatura limite / Laikymo temperatûra / Temperaturbegrensning / Ograniczenie temperatury / Limitação da temperatura / Ohranièenie teploty / Limitación de temperatura / Temperaturbegränsning Instructions for Use / Prostudujte pokyny k použití / Læs brugsanvisningen / Raadpleeg gebruiksaanwijzing / Lugeda kasutusjuhendit / Tarkista käyttöohjeista / Consulter la notice d emploi / Gebrauchsanweisung beachten / Óõìâïõëåõôåßôå ôéò ïäçãßåò ñþóçò / Olvassa el a használati utasítást / Consultare le istruzioni per l'uso / Skaitykite naudojimo instrukcijas / Se i bruksanvisningen / Zobacz instrukcja u ytkowania / Consulte as instruções de utilização / Pozri Pokyny na používanie / Consultar las instrucciones de uso / Se bruksanvisningen 13

14 B m A Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, Maryland USA BENEX Limited Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Shannon, County Clare, Ireland Tel: Fax: Alconox is a trademark of Alconox, Inc ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection QIAamp is a trademark of QIAGEN Inc CultureSwab is a trademark of Difco Laboratories, subsidiary of Becton, Dickinson and Company BD, BD Logo, BBL and ProbeTec are trademarks of Becton, Dickinson and Company 2006 BD