HORMONSYSTEMER. Øvelsen består af to dele: A. Gl. Thyreoideas funktion og B. Svangerskabsreaktion.

Transkript

1 HORMONSYSTEMER Øvelsen består af to dele: A. Gl. Thyreoideas funktion og B. Svangerskabsreaktion. Den praktiske del af øvelsen afvikles ved at et SAU-12 hold deles i 2 grupper som hver gennemfører øvelsens A- og B-del efter denne vejledning. A. GL. THYREOIDEAS FUNKTION Formål Øvelsens formål er at demonstrere gl. thyreoideas funktion ved følgende tilstande: a) indgift af thyreotropin releasing factor (TRF) b) ernæring med jodfattig kost c) ernæring med jodfattig kost + indgift af KSCN, et stof som hæmmer funktionen (jodidoptagelsen) d) som kontrol for den TRF-behandlede rotte anvendes et dyr på samme kost, men med en beskeden og dog tilstrækkelig mængde jod tilsat drikkevandet. Princip Optagelsen af jodid i gl. thyreoidea er et mål for kirtlens funktionstilstand. Jodisotopen 125 I anvendes som jodidmarkør i form af Na 125 I. Efter indgift af dette stof måles indholdet af 125 I i gl. thyreoidea og koncentrationen i plasma (såvel i plasmavand som i plasmaproteiner) og dette sættes i relation til den indgivne dosis. Oversigt og øvelsen Der anvendes 4 rotter, som er mærket med speed-marker på halen: A. + jod-tilskud: 1. kontrol umærket 2. TRF-behandlet sort mærke B. jodfrit vand: 3. kontrol grønt mærke 4. KSCN-behandlet rødt mærke Ca. 24 timer før øvelsens påbegyndelse injiceres rotterne med Na 125 I. i p. (Der anvendes ca. 18,5 kbq (0,5 µci) pr. dyr. Den faktisk anvendte mængde vil fremgå af tælleresultaterne Standard ). Under anæstesi tages en blodprøve ved aortapunktur, hvorefter dyret dræbes. Ved dissektion udtages først tracheas øverste del med tilhørende gl. thyreoidea, dernæst et stykke muskelvæv, som repræsentativ vævskontrol (vævsblindværdi). Der måles på thyreoidea-trachea-komplex, muskelvævsstykke, plasmaprotein, plasmasupernatant og fortyndet standard. Da dyrene skal forbehandles, kan hele øvelsen ikke afvikles på én dag. Man følger nedenstående tidsskema. TIDSSKEMA 1. dag: sort rotte: injektion i.p. af 200 µg TRF 2. dag: sort rotte: som dagen før rød rotte: injektion i p. af 0,5 ml 6% KSCN alle 4 rotter: Na 125 I (i 0,5 ml 0,9% NaCl) Side 1

2 3. dag (øvelsesdagen): præparation af prøver (da tællingen skal indpasses i instituttets øvrige brug af tælleudstyret, administreres den af instruktøren) 4. dag: tælleresultaterne afhentes. Forsøgsdyr WISTAR hanrotter, ca. 10 uger gamle. Vægt: ca. 200 g. Foder I 3 uger forud for øvelsen er rotterne blevet fodret med en jodfattig kornblanding bestående af lige dele havre, byg og hvede, beriget med vitaminer og mineraler. Halvdelen af dyrene (rotte 1 og 2) har fået tilsat KI til drikkevandet (konc.: 200 liter -1 ). En rotte af den anvendte slags drikker maksimalt ca. 30 døgn -1. Isotop 125 I, T 2 = 60 dage, udsender γ-kvanter af forskelligt energiindhold under henfald (2-toppet spektrum). Størstedelen af henfaldene giver anledning til γ-energier på 0,027 MeV, hvorfor der tælles over denne top. Farmaka TRF (Thyreotropin Releasing Factor) er et syntetisk fremstillet tripeptid, som frigør TSH (Thyreoidea Stimulerende Hormon = Thyreotropin) fra hypofysen. Kaliumthiocyanat - KSCN (analysevare), 6% opløsning. Øvelsens udførelse Retningslinier for omgangen med radioaktive isotoper INDEN ØVELSENS PÅBEGYNDELSE SKAL INSTITUTTETS INSTRUKS VEDRØRENDE BORTSKAFFELSEN AF RADIOAKTIVT AFFALD VÆRE GENNEMLÆST OG FORSTÅET Opsugninger af isotop-standard skal foretages af instruktøren. Ingen af øvelsens procedurer må foregå uden for de borde, der er dækket med plastic. Der må ikke spises eller ryges i lokalet. Alle servietter, vatstykker og eengangssprøjter skal anbringes i de dertil opstillede affaldsbøtter, mærket RADIOAKTIVT STOF. Instrumenterne må ikke fjernes fra bordene og skal efter brugen anbringes i de dertil opstillede bakker. Klargøring af glas, opløsninger, instrumenter m.m. Inden man skrider til præparation af vævene, skal følgende være i orden: 1) Mærkning af glas. For hver rotte (nr. 1-4) mærkes fire små (4 cm) plastglas således, at man får 16 glas mærket 1a, 1b, 1c, 1d, 2a, 2b,...4c, 4d. a: plasmaprotein; b: plasmasupernatant; c: thyreoidea-trachea-komplex; d: muskelvæv Desuden mærkes et glas St. 1/100, idet standarden fremstilles ved fortynding 1:100 af den radioaktive jodopløsning, rotterne har fået. Endelig mærkes 4 10 cm lange plastcentrifugeglas 1-4 (til blodprøverne). Side 2

3 2) Klargøring af a. sektionsplads b. instrumenter c. sprøjte med ca. 0,2 ml heparin-opløsning. Samme sprøjte anvendes til blodprøvetagning fra flere dyr og rengøres mellem hver blodtagning ved grundig skylning med KI-opløsning. d. servietter til aftørring af instrumenter. Generel vejledning om præparation af prøverne til tælling De radioaktiviteter, som man har at gøre med ved disse forsøg, er små, men trods dette kræves der den yderste omhu ved præparationen af dyrene og tælleglassene. Den, der har med dyrene at gøre, rører intet andet og vasker hænderne grundigt efter præparationen. Pas på urin og fæces! Heri kan findes en del 125 I, og selv en ringe forurening med radioaktivitet kan ødelægge egne eller andres tællinger. Der er ikke nogen fare for de personer, der deltager i øvelserne, på grund af de små radioaktiviteter, der er tale om, men der er i højeste grad risiko for, at man kan få ødelagt sine tællinger eller tællingerne for andre, hvis man tilsmudser apparatur, instrumenter, bord etc. Før tællingen anbringes de færdigpræparerede prøver på bunden af de små mærkede reagensglas, som lukkes med en prop. Det er helt væsentligt for tælleproceduren og især for apparatets senere funktion, at glassene ikke udvendigt kontamineres med radioaktiv isotop. Glassene skal altså holdes klart adskilte fra sektionspladsen og må under ingen omstændigheder håndteres af den, der foretager præparationen. Præparation af forsøgsdyrene Man præparerer ét dyr ad gangen. Efter præparation af hver rotte foretages følgende: Instrumenterne afskylles med KI-opløsning og aftørres, papiret på sektionspladsen udskiftes. NB! Undgå at bortkaste arterieklemme samt plasticklods!! Anæstesi Dyrene bedøves ved en intraperitoneal injektion af ca. 0,2 ml Pentotal-natrium (tiomebumal, natriumsalt). Om nødvendigt suppleres anæstesien med 0,1 ml Pentotal-natrium ad gangen. Blodtagning Når rotten efter 5-10 minutter (der optræder en vis individuel variation) er bragt i dyb anæstesi, vejes den, og vægten noteres. Herefter anbringes den i rygleje hen over en lille klods, som hæver lumbaldelen over lejet og derved gør den senere punktur af aorta abdominalis lettere. Abdomen åbnes, og organerne forskydes, så bagvæggen er fri. Peritoneum parietale fjernes ved stump dissektion - bedst med vatpinde - indtil aorta er helt blotlagt. En i.v. kanyle monteres på en sprøjte indeholdende ca. 0,2 ml heparin og føres (lumen nedad!) ind i aorta. Man aspirerer ved et ganske forsigtigt træk i stemplet. Der kan som regel udtages 3-5 ml blod. Kanylen afmonteres for at mindske hæmolyse, blodet sprøjtes ned i et 10 cm plastcentrifugegals, kanylen påmonteres, sprøjten skylles og fyldes med ca. 0,2 ml heparin. Thorax opklippes, og det påses, at lungerne kollaberer. Er aortapunkturen ikke lykkedes, påsættes sprøjten en grov kanyle, og man aspirerer fra hjertets højre ventrikel. Blodet centrifugeres (husk modvægt) i 10 minutter, hvorefter 500 µl plasma forsigtigt pipetteres over i det lille reagensglas, mærket a. Plamaproteinerne fældes ved tilsætning af et lige så stort volumen 10% trikloreddikesyre. Efter forsigtig omrystning anbringes glas a i et plastcentrifugeglas. Proteinpræcipitatet centrifugeres ned i 5 minutter. Det lille glas tages op med en pincet, 500 µl supernatant afpipetteres til glas b: resten af supernatanten afsuges med Pasteurpipette og bortskaffes. Side 3

4 Præparation af gl. thyreoideakomplekset Skindet klippes forsigtigt op fra sternum og helt op i underkæbevinklen. Fascien over den prætracheale muskulatur fjernes, og ved forsigtig stump dissektion med saks (clivage) løsnes og fjernes musklerne, så trachea ses i næsten hele sit forløb. Lige under larynx og helt lateralt på luftrøret ses gl. thyreoidea nu som 3-5 mm lange og 1-3 mm brede, mørkerøde strukturer. Larynx overklippes lige under os hyoideum, en pincet stikkes ind i det, og den del af trachea, på hvilken glandlen sidder, fridissekeres forsigtigt og afklippes (ca. 6 trachealringe), der anbringes i bunden af glas c. Præparation af kontrolvæv (blind-værdi) Fra femurs muskulatur (f.eks. quadriceps) uddissekeres en vævsblok af samme størrelse (skønnet) som thyreoidea-trachea-komplekset. Prøven anbringes i bunden af glas d. Fremstilling af standard ( St 1/100 ) 500 µl af den fortyndede standard pipetteres i det dertil mærkede glas. Resultater De udleverede resultatskemaer anvendes ved talbehandlingen. Størrelsen af fordelingsrummene for frit jod og proteinbundet jod har samme procentuelle værdi som hos mennesket. Rapportvejledning 1. Hvor stort er fordelingsrummet for proteinbundet jod? 2. A. Under hvilke former finder vi jod i organismen? Skitser, hvordan sådanne jod-pools tilføres og mister jod. Beskriv kort thyreoideahormonernes syntese og de regulationsmekanismer, der har betydning for denne. B. Hvilke af de ovennævnte jod-pools svarer til prøve a) og til prøve b). 3. A. Angiv med ord, hvordan den specifikke aktivitet af jodid vil være i de rotter, der har været på jodfattig kost, sammenlignet med de normalt fodrede efter injektion af samme mængde 125 I. B. Angiv for dyr 1 hvilken af prøverne a) eller b) som må forventes at have den største specifikke aktivitet. Begrund svaret. 4. Sammenlign inden for hver af de to grupper de specielt behandlede dyr med kontroldyret. Sammenlign også resultaterne for de to kontroldyr. Beskriv om nyrerne har clearet samme delmængde af 125 I i fordelingsrummet hos rotter fra hver af de 2 fodringsgrupper. Opstil som anført på resultatskemaet forholdet mellem nyreclearance og kirtel-clearance hos de 4 dyr. 5. Anfør koncentrationer i plasma af thyroxin og trijodthyronin hos homo og angiv, i hvor stor udstrækning de findes bundet til protein. Udregn, hvor stor en procentdel af således proteinbundet jod, der må formodes bundet i trijodthyronin. Om thyreoideafunktion i øvrigt 6. Hvorledes virker KSCN og thiouracil? Side 4

5 7. Skitser i et kurvesystem optagelsen af radioaktivt jodid i gl. thyreoidea (som % af den indgivne dosis) som funktion af tiden i 24 timer hos en normal person, en patient med svær hyperthyreoidisme og en patient med svært myxødem. 8. Hvilken virkning ville jodmangel (f.eks. efter indtagelse i lang tid af en jodfri kost) have på den hastighed, hvormed gl. thyreoidea optager jodid? 9. Hvilke virkninger har mangel på thyreoideahormon på væksten? B. SVANGERSKABSREAKTIONEN (GRAVIDITETSTEST) Formål At forstå og kunne anvende princippet i en immunologisk påvisning af choriongonadotropin i urinen. Ved øvelsen anvendes et kommercielt tilgængeligt kit, dvs. en forpakning indeholdende alle nødvendige reagenser og instrumenter, som skal bruges til at udføre reaktionen. Der forhandles adskillige sådanne do-it-yourself-kits, som kan fås på apotekerne. Baggrund Gonadotropiner (FSH = det follikelstimulerende hormon og LH = det luteiniserende hormon) dannes i hypofysen hos voksne personer af begge køn. Derudover dannes i placenta et gonadotropin (humant chorion gonadotropin = HCG) som hovedsageligt har LH virkning. Som hypofyse gonadotropinerne er HCG et glycoprotein, som består af to kæder bundet sammen ved nonkovalente bindinger: α-kæden, som er næsten identisk med α-kæden i de glykosylerede hypofyse hormoner (LH, FSH, TSH) og β-kæden, som udviser ca. 80% homologi med β-kæden i LH. HCG=s molekylvægt er og det kan således udskilles i urinen. Biosyntesen af HCG begynder kort efter konceptionen og hormonet kan påvises i den gravide kvindes urin efter 7-10 dage (målt ved radioimmunoassay. Ved de fleste kommercielt tilgængelige immunoassays som de, der anvendes ved øvelsen, er testen i reglen først med sikkerhed positiv dage efter sidste menstruation). HCG udskillelsen i urinen kulminerer omkring 8. graviditetsuge, men fortsætter i øvrigt gennem resten af graviditeten. Det er påvisninen af HCG i urinen, som danner grundlag for graviditetstesten. Kun 5-25% af HCG i blodet udskilles med urinen i intakt form. Derudover udskilles en del metabolitter af β-kæden af HCG, og disse kan krydsreagere med antistoffer mod HCG eller HCG-β. Andre metoder HCG i urinen kan også bestemmes ved radioimmunoassays eller radioreceptorassays. Begge metoder er mere følsomme end immunoagglutinationshæmnings-testen. Radioreceptorassay-kits er kommercielt tilgængelige i visse lande, dog ikke i Danmark. I øvrigt skal man ikke glemme, at udebleven menstruation hos en fuldstændigt regelmæssigt menstruerende yngre kvinde, oftest er tegn på indtrådt graviditet. Endelig vil multiparae ved indtrådt graviditet i en del tilfælde opleve psykiske og fysiske fænomener, som ud fra et erfaringsgrundlag fortæller dem om deres tilstand. Grundlag Metoden er baseret på en immunoreaktion hvori der indgår antistoffer mod HCG fremstillet ved immunisering af dyr (ofte kaniner). Den konkrete udformning af testen ved øvelsen kan variere noget med det aktuelle produkt man har anskaffet. Den nærmere forklaring gives derfor i hvert tilfælde af instruktøren. Side 5

6 Urin Urinen bør være friskladt (kan dog anvendes efter 2-3 dage, hvis den opbevares i køleskab). Morgenurin er specielt velegnet, fordi den i reglen er mere koncentreret end urin dannet i dagtimerne. Ved udførelse af testen følges brugsanvisningen fra det anvendte kit. Spørgsmål til rapporten vedrørende svangerskabsreaktionen 1. Angiv hvilke laboratoriemetoder til påvisning af svangerskab du kender. 2. Angiv hvilke hormoner, der dannes i placenta. 3. Tegn en kurve over urinkoncentrationerne af gonadotropin, østrogene og gestagene substanser i forløbet af en graviditet. 4. Angiv hvor tidligt i graviditeten kan man forvente at finde positive svangerskabsreaktioner. 5. Redegør for hvorfor den totale plasma koncentration af thyreoidea hormoner er forhøjet under graviditeten samtidigt med, at koncentrationen af frit thyreoidea hormon er normal. 6. Angiv hvilke former for gonadotropin du kender. 7. Redegør for hvorledes man kan forklare, at genitalia interna hos nyfødte aftager i størrelse i tiden efter fødslen. 8. Hvis man hos den ene af 2 parabiose hanrotter fjerner testes, vokser testes hos den anden rotte betydeligt. Redegør for mekanismen. (Parabiosen kan opnås ved et kirurgisk indgreb, hvorved to immunologisk forenelige dyr bibringes fælles blodcirkulation). Efterår 2002 Marek Treiman Side 6