Creation of a tissue microarray(tma)-block intended for implementation of antibodies for diagnostication of endometrialcancer

Transkript

1 Bachelorprojekt: Fremstilling af tissue microarray(tma)-blok til implementering af antistoffer til diagnosticering af endometriecancer Creation of a tissue microarray(tma)-block intended for implementation of antibodies for diagnostication of endometrialcancer Martin Lenskjold, studienr , hold SB511 university college lillebælt, modul 14 Klinisk vejleder: Kirsten Hartmann, bioanalytikerunderviser på Afdelingen for klinisk patologi, Odense universitets hospital. Teoretisk vejleder: Aino Elmegaard Larsen, uddannelseschef på University college lillebælt, Odense Antal anslag: Side 1 af 105

2 Resume Baggrund Endometriecancer inddeles i subtyperne endometriod adenokarcinom grad 1-3(EA1-3), serøst adenokarcinom(sac) og clearcelle karcinom(ccc). Afhængig af subtypen vil patienten modtage en bestemt behandling. Korrekt subtypebestemmelse er vigtig for at undgå fejlbehandling så en EA1 patient ikke behandles som en EA3 patient, da denne operation er mere omfattende. Subtypen kan ikke bestemmes makroskopisk grundet ensartet udseende, og immunhistokemi(ihc) er derfor nødvendig. Formål Formålet med bachelorprojektet er at fremstille en tissue microarray(tma)-blok, der skal anvendes til at implementere antistoffer til subtypebestemmelse, når endometriecancer diagnosticeres Materialer og metode Paraffinblokke fra 20 patienter, fire patienter for hver subtype, udstanses og kommes i en støbeblok. Snit skæres på mikrotom, hvorefter der anvendes ni antistoffer; anti-cytokeratin 7(CK7), antivimentin(vim), anti-østrogen receptor(er), anti-tumor protein 53(P53), anti-tumor protein 16(P16), anti-paired box gene 8(PAX8), anti-napsin a(napsa), anti-hepatocyt nuclear factor 1(HNF1β) og anti-trefoil factor 3(TFF3), til IHC Resultater Der er næsten enighed i observationerne baseret på kappa koefficienterne. Det er kun ER, der ligger under den godkendte værdi. Det ses desuden at antistofferne giver reaktion i de ønskede snit som de forventes at have positiv reaktion i. Resultaterne kan anvendes, da kontrolsnittene er positive i de forventede væv. Konklusion Det er lykkedes at fremstille en TMA-blok, der kan mikroskoperes og scores af fem observatører, der har mikroskoperet individuelt, uden de store afvigelser. Grundet størrelsen påtma-blokken er det på nuværende tidspunkt ikke muligt at anvende den til implementering af nye antistoffer på AKP. TMA-blokke er dog brugbar med henblik på fremtidig diagnostik, da det er muligt at samle patient i én blok. Side 2 af 105

3 Forord Bacheloropgaven er skrevet af bioanalytikerstuderende Martin Lenskjold der går på modul 14 på bioanalytikeruddannelsen, University College Lillebælt. Bachelorprojektet er udarbejdet på afdelingen for klinisk patologi(akp) på OUH. Der skal lyde stor tak til medarbejderne på AKP der har været behjælpelige med projektet. Der skal især lyde en stor tak til Doris Schledermann og Iben Johnsen, overlæger på AKP. De har stået for undervisning af teorien angående de anvendte antistoffer samt undervisning i det mikroskopiske udseende og hvordan antistofferne skulle scores. En sidste tak skal gives til mine medstuderende Michelle Puk Hansen, Natasha Jakobsen og Rasmus Rene Andersen som har været en fantastisk hjælp i bachelorperioden både som venner men også som sparringspartnere og været en stor grund til at alt er forløbet godt. Side 3 af 105

4 Indhold Resume... 2 Baggrund... 2 Formål... 2 Materialer og metode... 2 Resultater... 2 Konklusion... 2 Forord... 3 Indhold... 4 Introduktion... 8 Problembaggrund... 8 Opbygning af uterus... 8 Endometriecancer... 9 Ætiologi og symptomer... 9 Diagnosticering og behandling Præoperativt Peroperativt Afgrænsning Problemformulering Metodiske overvejelser CK VIM ER P P PAX Side 4 af 105

5 NAPSA HNF1β TFF Mikroskopi HE IHC Fri marginal kappa test Materialer og metode Materialer Apperatur Reagenser Metoder Søgeord TMA-blok HE IHC Resultater Resultatguide Figurer Tabeller Kontrolsnit CK VIM ER P P Side 5 af 105

6 PAX NAPSA HNF1β TFF Diskussion Kontrolsnit EA1 og EA EA Opsummering af resultater Implementering Konklusion Perspektivering Litteraturliste Bilag 1: Overblik over kontrolglas K Bilag 2: Overblik over kontrolglas K Bilag 3: Overblik over kontrolglas K Bilag 5: Immunprotokol for antistoffet CK Bilag 6: Immunprotokol for antistoffet VIM Bilag 7: Immunprotokol for antistoffet ER Bilag 8: Immunprotokol for antistoffet P Bilag 9: Immunprotokol for antistoffet P Bilag 10: Immunprotokol for antistoffet PAX Bilag 11: Immunprotokol for antistoffet NAPSA Bilag 12: Immunprotokol for antistoffet HNF1β Bilag 13: Immunprotokol for antistoffet TFF Bilag 14: Dannelse af TMA-blok i billeder Side 6 af 105

7 Bilag 15: Overblik over hvordan de udstansede snit placeres i paraffinblokken Side 7 af 105

8 Introduktion Problembaggrund Endometriecancer(EC) er den næsthyppigste gynækologiske cancer efter ovariecancer. EC inddeles overordnet i subtyperne endometrioide adenokarcinom(ea) grad 1(EA1), grad 2(EA2, grad 3(EA3), serøse adenokarcarcinom(sac) og clearcelle karcinom(ccc). Subtyperne har forskellige overlevelsesprocenter samt forskellige behandlingsmetoder, og det er derfor vigtigt at kunne diagnosticere korrekt, hvilken subtype af EC der er tale om. Makroskopisk er det ikke muligt at skelne subtyperne fra hinanden, og en diagnosticering kan derfor først ske mikroskopisk v.h.a immunhistokemisk(ihc) farvning, da subtyperne reagerer forskelligt på bestemte antistoffer. Afdelingen for klinisk patologi(akp) vil gerne kunne implementere nye antistoffer på afdelingen, der kan hjælpe med at forbedre subtypebestemmelsen af EC. AKP ønsker derfor at få fremstillet en tissue micro array(tma)-blok, med et udvalg af flere patienter med EC, for lettere at kunne implementere nye antistoffer og se hvordan de reagerer i de enkelte subtyper i én samlet TMA-blok. Som kontrol for nye antistoffer vælges der at teste TMA-blokken med, for afdelingen, kendte antistoffer; anti-cytokeratin 7(CK7), anti- vimentin(vim), anti-østrogen receptor(er), antitumorprotein 53(P53), anti-tumorprotein 16(P16), anti-paired box gene 8(PAX8), anti-napsin a(napsa), anti-hepatocyt nuclear factor 1 beta(hnf1β) og anti-trefoil factor 3(TFF3) Opbygning af uterus Væggen i uterus består af tre lag, hvor det inderste lag hedder endometriet. Det er her de fleste EC udgår fra[1]. Som det ses i figur 1, så kan endometriet opdeles i to lag, det basale og det funktionelle lag. Det basale lag har en stor mængde af lamina propria samt uterin kirtler. Det funktionelle lag indeholder også lamina propria, der dog ikke er lige så fast i strukturen som det der befinder sig i det basale lag. Desuden er der et større antal uterin kirtler. I dagene op til ægløsning fortykkes endometriet. Hvis der ingen befrugtning sker, påbegyndes menstruationscyklussen hvor der sker store ændringer i det funktionelle lag. Her vil myometriet, der er opbygget af glatte muskelfibre adskilt af bindevæv, der indeholder mange blodkar, forsyne laget med et bestemt antal arterier. Under menstruationscyklussen afstødes endometriet, og arterierne fra myometriet sprænger og der sker en blødning. Efter endt menstruation vil det funktionelle lag gennemgå en stor proliferationsfase for at blive genopbygget. Det basale lag forbliver uændret igennem en menstruationscyklus. Side 8 af 105

9 Figur 1 Oversigt over opbygningen af uterus. Den røde firkant markerer det område af figuren der er mest essentielt for denne opgave og viser hvor endometriet befinder sig. Billedet i bunden til højre, viser desuden hvordan endometriet er opbygget mikroskopisk[1]. Endometriecancer Endometriecancer(EC) rammer omkring kvinder hvert år i Europa, og incidensen er stigende[2]. I Danmark er EC den hyppigste gynækologiske cancer, og omkring 700 kvinder rammes af det årligt. Dette svarer til ca. 2 %, af alle danske kvinder vil få EC[3]. Det er typisk kvinder i overgangsalderen med kraftig overvægt, der rammes af EC. Afhængig af International Federation of Gynecology and Obsterics(FIGO)-stadiet er der forskellige procentsatser for tre års overlevelsen. FIGO stadie I er der 90% chance for overlevelse, stadie II 76%, Stadie III 47% og ved FIGO stadie IV er 23% chance for at overleve. Samlet er fem års overlevelsen på 81%[4] Ætiologi og symptomer EC inddeles overordnet i type-i(ea1 og EA2) og type-ii(ea3, SAC og CCC). Ved type-i EC vil endometriet have atypisk hyperplasi, og menes at være relateret til mængden af østrogen, som en Side 9 af 105

10 kvinde har været udsat for gennem sin levetid[5]. Jo flere menstruationscyklusser en kvinde har, desto flere celledelinger undergår hun, og der er derfor øget risiko for mutation og for udvikling af EC type-i. Øget BMI er dermed også en stor risikofaktor, da øget lipid i kroppen kan omdanne visse hormoner til østrogen. Det hyppigste symptom på EC er vaginal blødning mellem menstruationscyklusserne eller efter menopausen. Dette opstår som regel i de tidligere stadier, og i 80 % af tilfældene bliver canceren opdaget tidligt[3]. Ætiologien for type-ii er fortsat ukendt men er ikke østrogenafhængig, og vil kun opstå i et endometrium der er atrofisk. Type-II er associeret til Her/neu-2 og p53 mutation[5]. Diagnosticering og behandling Præoperativt Kvinder med vaginal blødning vil blive sendt til udredning, hvor tykkelsen på endometriet vil blive målt via en ultralydscanning[6]. Et normalt endometrie vil have en tykkelse på under 4mm. En kvinde i tamoxifen behandling har dog ofte en endometrietykkelse på over 5mm, og mere end 50 % af kvinderne der er tamoxifen behandlede, har et endometrie tykkere end 8mm. I alle tilfælde, ved en ultralydscanning, er det vigtigt at endometriet er skarpt afgrænset til myometriet. Hvis ikke er dette en indikation om, at der skal foretages en histologisk undersøgelse vha. en abrasio/vabrasio/biopsi. Disse prøver vil blive vurderet mikroskopisk. Side 10 af 105

11 1= Sekrerende cylindrisk epithel. 5= Papillære strukturer 2=Makronukleoler. 6= Pleomorfe celler med tomt cytoplasma 3=Solid vækst. 7= Celler der er skåret over i mikrotomen 4=Hobnail Tabel 1: Overblik over hvad tallene i figur 2-6 hentyder til at der kan ses i de mikroskpisk præparater ved en HE-farvning Histologisk udseende Det histologiske udseende er med til at give indikationer for patologen om, hvilken EC subtype der er tale om. Hver af cancerne har bestemte karakteristika, dog kan nogle af cancerne minde så meget om hinanden, at det først er ved immunhistokemisk(ihc) farvning, at en endelig diagnosticering kan finde sted. Endometrioid adenokarcinom grad 1 Ved EA1 vil der være solid vækst i <5% af vævet, og der vil samtidig ses sekretdannende cylindrisk epithel, der dog ikke fremstår lige så pænt som normalt[7]. Dette skyldes at type-i EC er karakteriseret ved bl.a. at have mutationer i tumorsupressorgenet PTEN, hvilket resulterer i så stor celleproliferation at der ikke vil være plads til, at de kan stå normalt. Dette kan ses i figur 2, hvor det er tydeligt at morfologien virker meget sammenpresset. Der vil desuden ses let kerneatypi samt makronukleoler. I forbindelse med IHC vil denne subtype udtrykke særlig positiv reaktion for antistofferne CK7,VIM, TFF3 og ER. Figur 2: Eksempel på Endometrioid adenokarcinom grad 1 for patient EA1(1) i HE-snit. 1 markerer sekretdannende cylindrisk epithel. 2 markerer makronukleoler. Billedet er taget ved x10 forstørrelse Side 11 af 105

12 Endometriod adenokarcinom grad 2 Her vil der være en solid vækst på 6-50% som det tydeligt ses i figur 3. Generelt har den samme karakteristika som EA1[7]. EA1 og EA2 er type-i cancere og genkendes generelt ved at have en høj differentieringsgrad, modsat type-ii der har en lav differentieringsgrad. Desuden adskiller de sig fra type-ii ved at være lavmaligne og have en højere overlevelsesrate. Antistofferne der specielt vil blive udtrykt for EA2 ved IHC er CK7, VIM, TFF3 og ER Figur 3 Eksempel på endometrioid adenokarcinom grad 2 for patient EA2(2) i HE-snit. 1 viser sekretdannende cylindrisk epithel. 3 viser solid vækst. Billedet er taget ved x5 forstørrelse Side 12 af 105

13 Endometriod adenokarcinom grad 3 Denne cancer vil være karakteristisk ved at indeholde solid vækst på >50 %. Der vil derfor være en meget lille mængde glandulært væv til stede[7]. Dette ses tydeligt i figur 4 hvor hele vævet indeholder solid vækst, og ingen tegn på sekretdannende cylindrisk epithel. Der vil ses meget nekrose samt inflammatoriske celler, der vil fremstå små og helt sorte i strukturen. Nekrosen vil skyldes så stor celleproliferation, at angiogenesen ikke kan nå at forsyne alle cellerne med blodtilførsel. Cellerne vil derfor gå til grunde. I forbindelse med IHC vil antistofferne CK7, VIM, ER især blive udtrykt. Arkitekturen i EA1, EA2 og EA3 kan variere meget. Den kan variere fra at have <5% solid vækst, en såkaldt grad 1, til solid vækst på >50% solid vækst, en såkaldt grad 3. Kerneatypien graderes også fra værende let, hvor de er meget ensartede, til grad 3 hvor kernerne vil være store og pleomorfe samt irregulære nukleoler. Differentieringsgraden kan hæves med én hvis arkitekturen kun vurderes som grad 1 eller 2, men kerneatypien vurderes til grad 3. EA er den hyppigst forekomne form med en incidens på 72,3% af alle tilfælde af EC i 2012 i Danmark[3]. Figur 4: Eksempel på endometrioid adenokarcinom grad 3 for patient EA3(1).3 markerer at der i næsten hele snittet ses solid vækst. Billedet er taget ved x5 forstørrelse Side 13 af 105

14 Serøst adenokarcinom Denne cancer vil minde meget om EA, og disse kan derfor være meget svære at adskille fra hinanden [7]. SAC er dog histologisk karakteriseret ved at have papillære strukturer i stedet for glandulært væv som det ses i figur 5. Kerner vil være afrundende men have meget atypi. De kan være vesikulære, store eller små. Der vil desuden ses hobnail celler samt nekrose. Hobnail betyder, at cellerne ofte er pæreformede, ligger i papillære strukturer, er hyperkromatiske og oftest vender indad i kirtellumen. CK7, VIM, P53, P16, PAX8 kan anvendes til at diagnosticere denne subtype i forbindelse med IHC. SAC havde i 2012 en incidens på 7,4% i Danmark[3] Figur 5: Eksempel på serøst adenokarcinom for patient SAC(1).4 markerer hobnail celler. 5 markerer papillære strukturer. Billedet til venstre er taget ved x10 forstørrelse og billedet til højre ved x5 forstørrelse Side 14 af 105

15 Clearcelle karcinom CCC er kendetegnet ved store pleomorfe celler, der har et stort tomt cytoplasma som det ses i figur 6. Der vil ses store kerner, der kan have tendens til at være vesikulære med lyst nukleoplasma[7]. Visse steder i vævet kan det virke som om at cellerne er tomme, men dette skyldes at størrelsen på cellerne er så store, at de er blevet skåret over i mikrotomet. I CCC kan der også ses hobnail celler som ved SAC. Antistofferne CK7, VIM, NAPSA og HNF1β vil især blive udtrykt i denne subtype. I 2012 havde CCC en incidens på 2,1% af alle EC tilfælde i Danmark[3] En samlet oversigt hvilke antistoffer der forventes at være positive i de respektive subtyper kan ses i tabel 2. Figur 6: Eksempel på clearcelle karcinom for patient CCC(1). 6 markerer typiske eksempler på pleomorfe celler med tomt cytoplasma. 7 markerer celler der er blevet skåret over i mikrotomet. Billedet er taget ved x20 forstørrelse EA1 EA2 EA3 SAC CCC CK VIM ER P53 + P16 + PAX8 + NAPSA + HNF1β + TFF3 + + Tabel 2: Oversigt over hvilke antistoffer der forventes at være positive, markeret med +, i de respektive EC subtyper Side 15 af 105

16 Peroperativt Efter at have identificeret og graderet subtypen mikroskopisk vil patienten, afhængig af subtypen af EC samt FIGO-stadiet, modtage en bestemt operation. FIGO-stadiet kan dog først endeligt fastlslås peroperativt, hvor patologen modtager en ufikseret og uopklippet uterus til makroskopisk vurdering[5]. Figur 7 Oversigt over FIGO-stadierne[8] I figur 7 ses det at en vigtig del af FIGO-stadieinddelingen er at identificere, hvor meget invasion der er i myometriet. Denne vurdering foretages ved først at afmærke den perifere tumorbegrænsning på det mikroskopiske præparat og efterfølgende, som det ses i figur 8 billede A, måle afstanden fra nærmest tilgrænsede endometrie-myometrie overgang, der ikke er tumorinvolveret, til det tilsvarende område der er afmærket på det mikroskopiske præparat. Efterfølgende måles tykkelsen på myometriet der er afstanden fra nærmest tilgrænsede endometrie-myometrie overgang, der ikke er tumorinvolveret, til serosa. Tumorinvasionen kan variere meget i længden og bredden, og der er derfor flere metoder til at måle myometrieinvasionen. Et eksempel på dette kan ses i figur 8 billede B, hvor der er tale om en type-i EC, da endometriet har atypisk hyperplasi. I dette tilfælde måles der fra den stiplede linje, lige under endometriet, til det tilsvarende område afmærket i det mikroskopiske præparat. Invasionsdybden kan dog være svær at vurdere, da tumor kan være opdelt i flere små områder. Side 16 af 105

17 Figur 8: Måling af invasion i myometriet. Billede A viser hvordan en direkte invasion til myometriet måles, og dette sker ved at måle afstanden fra nærmeste tilgrænsede endometrie-myometrie overgang, der ikke er tumorinvolveret, til området svarende til det der er afmærket på det mikroskopiske præparat. Billede B viser et eksempel på hvor meget tumor kan variere i udseende. I dette tilfælde måles der fra den stiplede linje, til området svarende til det der er afmærket på det mikroskopiske præparat[5]. Når der præoperativt ved en IHC er blevet påvist EA1 eller EA2, vil der blive foretaget en simpel hysterektomi samt bilateral salpingo-ooforektomi(bso) og udtagning af peritonealskyllevæske. Ved denne operation fjernes uterus, begge tuba uterina samt ovarierne. Hvis der ved makrovurderingen påvises FIGO-stadie IB eller stadie II, vil de pelvine lymfeknuder også blive fjernet. Er der i biopsien blevet påvist en af de såkaldte type-ii cancerne, vil der blive foretaget simpel hysterektomi, BSO, fjernelse af pelvine lymfeknuder, samt evt. paraaortale lymfeknuder og fjernelse af fedtomentet. Hvis der præoperativt er påvist FIGO-stadie II vil det kræve en radikal hysterektomi. Udover den simple hysterektomi fjernes der her også, parametrierne, den uterusnære del af vagina, de pelvine lymfeknuder samt udtagning af peritoneal skyllevæske. I disse tilfælde vil der hermed ikke blive foretaget en makrovurdering. Dog vil der stadig blive foretaget mikroskopiske undersøgelser for at undersøge om canceren har spredt sig til parametrier, fedtomentet samt om der er lymfeknude metastaser. Grunden til at lymfeknuder fjernes er at der er risiko for at patienter har lymfeknudemetastaer, og patienter der får påvist lymfeknudemetastaser vil postoperativt modtage onkologisk behandling[7]. Korrekt stadieindeling er dog utrolig vigtig da der også er risici forbundet med fjernelse af lymfeknuder. Udover at det forlænger operationstiden, så er der riskiko for blødning, venetrombose samt lymfødem[4]. Side 17 af 105

18 Afgrænsning I bachelorprojektet er der fokus på at få dannet en TMA-blok ud fra udvalgte områder i patienternes paraffinblokke. Dette sker med henblik på at fremstille en tissue micro array(tma)-blok, der skal anvendes til at implementere nye antistoffer på afdelingen for klinisk patologi(akp), til korrekt subtypebestemmelse når endometriecancer diagnosticeres. De udvalgte områder der skal udstanses, er valgt på baggrund af hvor det er mest tydeligt, at der er tale om f.eks CCC. Dette gør at selvom det ustansede område består af mere end 50% solidt væv, som det vil i en EA3, kan der godt være tale om en EA2, da denne subtypebestemmelse vil være baseret på mikroskopering i hele paraffinblokken og ikke kun et lille område. Det store antal af antistoffer er udvalgt på baggrund af, at der ikke findes ét bestemt antistof der kan underbygge en diagnose af f.eks SAC. Et stort udvalg af antistoffer er derfor nødvendigt for at kunne stille en korrekt diagnose, da de hver især er med til underbygge hvilken subtype der er tale om. I forbindelse med bachelorprojektet blev antistoffet TFF3 implementeret på AKP. Da dette antistof er forholdsvis ukendt, var det vanskeligt at finde videnskabelige artikler der omtalte hvordan antistoffet reagerede i de respektive subtyper. Et egentligt overblik over hvilke subtyper der var positive og negative for antistoffet kom derfor først i forbindelse med mikroskopien. De udvalgte patienters paraffinblokke er desuden nødt til at blive støbt om i andre blokke. Dette skyldes at den oprindelige støbeform ingen fast bund har, og ved ustansning vil paraffinindstøbningen blive bøjet så meget at flere udtansninger i samme blok ikke er mulig, samt at den kan risikere at gå i stykker. Omstøbning til blok med en mere fast bund er derfor nødvendig, før TMA-blokken kan fremstilles. Side 18 af 105

19 Problemformulering Hvilke muligheder giver det AKP, med henblik på fremtidig diagnostik af endometriecancer, at der fremstilles en TMA-blok med subtyperne EA, SAC og CCC? Metodiske overvejelser I starten af bachelorprojektet fandt overlæge Doris Schledermann(DS), de 20 patienter der skulle anvendes i projektet. Vha. tidligere anvendte hæmatoxylin-eosin(he)-snit vurderede og udvalgte hun de områder der skulle udstanses. Områderne blev markeret med cirkel på HE-objektglassene, således at det tilsvarende område i paraffinblokken efterfølgende kunne findes. Introduktion til korrekt udstansning samt hvordan en TMA-blok bliver lavet, blev foretaget af bioanalytiker Kirsten Schnor fra AKP. TMA-blokken bruges på AKP til at kunne udføre flere analyser, på flere patienter, på samme tid. Dette skyldes at den modsat den traditionelle paraffinblok, vha. udstansninger kan have flere prøver samlet i én blok. I bachelorprojektet er det derfor muligt at have alle subtyper af endometriecancer i samme blok, som på den måde kan give et overblik over, hvordan de forskellige subtyper reagerer ved IHC-farvning, da de alle vil være samlet på ét glas. I projektet blev det besluttet, at der skal anvendes fire patienter pr. subtype, da der ønskes at fremstille en TMA-blok, som er i stand til at tage højde for den biologiske patientvariation inden for den enkelte subtype. Grunden størrelsen af støbeformen var det kun muligt at have plads til 20 patienter. Disse 20 patienter er dog tilstrækkeligt data nok til at lave en kappa test med frie marginaler. Da subtyperne SAC og CCC er sjældne havde DS problemer med at fine homogene patienter. Nogle af patienterne har derfor blandingstumorer hvor de kan bestå af mere end én subtype. Visse af immunprofilerne kan derfor afvige i forhold til de forventede reaktioner. I TMA-blokken blev der desuden påsat to fixpunkter, et leversnit og et colonsnit. Disse anvendes til at kunne orientere sig i de skårne TMA-snit, da disse ikke altid vil blive vendt ens på glasset. Lever Side 19 af 105

20 og colon er valgt, da disse væv er nemme at identificere og samtidig adskille fra hinanden. Af den færdige TMA-blok skar laborant Gitte Stentoft 20 snit på mikrotomen. I tabel 3 kan det ses hvilke snit der blev anvendt til HE-farvning samt hvilke der blev anvendt til kontrolglassene K2, K5 og K HE TFF3 TFF3 ER ER P53 P53 P16 P16 CK CK7 VIM VIM PAX8 PAX8 NAPSA NAPSA HNF1β HNF1β HE Tabel 3 Oversigt over rækkefølgen for hvordan snittene blev skåret Af tabellen kan det ses at snit 1 og snit 20 blev anvendt til HE-farvning. Grunden til dette er for at se, om noget af vævet eventuelt forsvinder ved den kontinuerlige skæring på mikrotom, og er derfor anvendt som en del af kvalitetssikringen bag projektet. Efter snittene blev skåret blev de IHC-farvet med de forskellige antistoffer. De udvalgte antistoffer blev valgt fordi de fungerer på følgende måde som antigen og som antistof: CK7 Det er et intermediat filament protein(ifp), der kan blive udtrykt i epithelceller i lunger, ovarierne og brystet[9]. Dette kan påvises med klonen SP52, der vil være rettet mod et bestemt type-ii CK protein, der findes i det meste ductale og glandulære epithel[10]. Ved IHC vil der ses cytoplasmatisk reaktion, der vil komme til udtryk i alle subtyper[11]. VIM Det er et IFP som udgør en del af celleskelletet i vertebratceller[12]. VIM hører til IFP klasse III, som findes i meget høj grad i celler af mesenkymal oprindelse som lipocytter, muskelceller og endotelceller. Klonen V9 anvendes og er beregnet til at mærke celler i normal og neoplastisk væv af mesenkymal oprindelse. Ved IHC vil der ses cytoplasmatisk reaktion, som er særlig god at anvende ved EA, hvor den altid vil være positiv. Ved SAC og CCC vil antistoffet være positiv i 50% af tilfældene, og er derfor ikke optimal at anvende til at diagnosticere disse[7]. Side 20 af 105

21 ER ER er et protein der fungerer som et østrogen afhængig kerne hormon receptor, og er til stede i kernerne i epithel celler i bryst og endometrie væv[13]. Det antistof der specifikt anvendes er af klonen SP1, og er rettet mod en specifik epitop, der befinder sig i ER proteinet[14] I forbindelse med IHC vil der være positiv kernereaktion i EA, især EA1 og EA2. Sammen med VIM er dette antistof særlig godt hvis der er tvivl om diagnosen, da SAC og EA kan minde om hinanden mikroskopisk[7] P53 Det er et kernefosforprotein, som kan opdeles i vildtype og muteret protein[15]. Vildtypen vil være til stede i en lang række normale celler, men grundet kort halveringstid vil det kun være til stede i små mængder. Vildtypen fungerer som en transkriptionsfaktor Modsat fungerer muteret P53 protein som et onkogen, og vil være mere stabil og til stede i store mængder. Ved IHC vil der være kernereaktion og sammen med P16 og HNF1β, adskiller den sig fra de andre antistoffer hvad angår tolkning af IHC. Ved P53 tales der om en alt eller intet reaktion, før at der er tale om at denne kan erklæres positiv. Dette betyder at der enten skal være meget kraftig positiv reaktion i >50-75% af kernerne, eller ingen reaktion overhovedet[7]. Antistoffet vil især være positiv ved SAC. P16 Det er et tumorsupressor protein som er kodet af cyclin dependent kinase inhibitor 2A på kromosom 9p21. Det spiller hermed en vigtig rolle i regulering af cellecyklussen[16]. Ved IHC vil den være positiv i både kerner og cytoplasma[7]. Som nævnt skal dette antistof også tolkes på. Før der er tale om en positiv reaktion skal der være tale om en diffus reaktion og dette sker kun ved SAC. Ved de resterende subtyper vil der ses fokal reaktion. Desuden kan den anvendes til EA da der her vil ses en karakteristik mosaik reaktion. PAX8 Det er med i PAX familien af transkriptionsfaktorer, som koder for proteiner der har et paired box domæne, en octapeptid og en paired-type homeodomæne. Selve proteinet er involveret i follikulær celle udvikling i thyreodea[17]. Ved IHC vil der være positiv kernereaktion[7]. Dette antistof er mest sensitiv for SAC, hvor den er positiv i 95% af tilfældene, men kan også fremstå som værende positiv i de resterende subtyper. Side 21 af 105

22 NAPSA Det er et protein som er lokaliseret på kromosom 19, og befinder sig i type-ii pneumocytter[18]. Det antistof der anvendes er af klonen IP64, der vil være rettet mod cytoplasma i celler fra alveolære makrofager, type-ii pneumocytter og plasma celler[19]. Ved IHC vil der være cytoplasmatisk reaktion[7]. Som antistof vil det være en særlig markør for CCC, hvor den vil være positiv. HNF1β Det er en transkriptionsfaktor som spiller en signifikant rolle i fosterdannelsen, hvor det er med til at udvikle nefronerne samt regulere udviklingen af pancreas[20]. Det menes desuden at være ansvarlig for at fusionere de müllerske gange, der er med til at udvikle tuba uterina[21]. Ved IHC vil der være kernereaktion[7]. Ifølge teorien vil den være positiv i både EA og CCC. På AKP har de dog vedtaget, at denne markør kan anvendes til at diagnosticere CCC. Grunden til dette er, at den positive reaktion ved EA vil fremstå fokal og svag, hvorimod den ved CCC vil fremstå moderat/diffus og intens. TFF3 Det er en del af trefoil factor protein familien, som er stabile sekrektoriske proteiner, der befinder sig på kromosom 21q22.3 og findes i mucous sekrerende epithel[22]. Dette antigen er nyt, og en egentlig funktion er endnu ukendt[23]. Det er dermed også en ny antistofmarkør men ifølge teorien bør den hovedsageligt være positiv ved type-i cancerne men fokal eller negativ ved type-ii cancerne. Mikroskopi I projektet vurderes det v.h.a mikroskop om IHC-snittene, er blevet farvet korrekt v.h.a kontrolsnittene, der vil befinde sig i bundet af hvert kontrolglas som kan ses i bilag 1-3. Disse kontroller medtages som en del af kvalitetssikringen, da det undersøges om antistoffet giver reaktion i de forventede væv eller ej. Er dette ikke tilfældet er det et udtryk for, at IHC-farvningen ikke er forløbet korrekt og at patientmaterialet evt. heller ikke giver en korrekt reaktion. Efterfølgende blev patientmaterialet vurderet individuelt af de studerende og DS, således at ingen kendte hinandens resultater, hvorefter en score blev givet til hver patient. Scoren (-) blev givet, hvis der var tale om en negativ reaktion og scoren (+), hvis der var tale om en positiv reaktion. Denne score blev givet ved den mindste positive reaktion i alle antistoffer med undtagelse af P53, P16 og HNF1β. Ved P53 blev scoren (+) givet hvis der var tale om en diffus eller helt blank reaktion. (+) Side 22 af 105

23 blev givet ved P16, hvis der var tale om en diffus reaktion, og scoren (+) blev givet ved HNF1β ved moderat/diffus reaktion. HE HE-farvning er en metode, der bruges som overssigtfarvning til at vurdere vævets morfologi[24]. HE består af metalkompleksfarvestoffet Carazzi og det anione farvestof Eosin Y. Det at Carazzi er et metalkompleksfarvestof, betyder at det er metalioner, som kan gå ind og binde til passende farvestoffer, således at der vil blive dannet komplekse bindinger mellem negativt ladede phosphatradikaler, der befinder sig i kernernes DNA, og Carazzi. Kompleksbindingerne vil blive fastholdt af Al-ioner. Bindingen gør at kernerne vil blive farvet røde, og efter blåning i vand vil de fremstå blå. Eosin Y anvendes som kontrastfarvning, da det er et anion farvestof, og kan binde sig til bestemte positive bestanddele som f.eks histonerne i DNA. Eosin Y farver primært cytoplasma og histoner lyserødt, og kontrastfarvningen gør at kernerne vil fremstå mere blåviolette. HE-Farvningen udføres på AKP s maskine Tissue-Tek Prisma efter afdelingens egen forskrift, og opstillingen i maskinen kan ses i bilag 4. IHC IHC foregår på BenchMark Ultra IHC/ISH Staining Module fra firmaet Ventana. Dette sker efter AKP s protokoller, som kan ses i bilag IHC anvendes til at påvise proteiner i væv. Dette betyder at hvis f.eks tumor proteinet P53 er til stede i cellerne, vil disse fungere som antigener. Derfor tilsættes der antistoffer rettet mod antigenet, i dette eksempel anti-p53. Det betyder at hvis proteinet der ønskes påvist er til stede, vil antistoffet binde sig til dette. IHC starter med afparaffinering efterfulgt af varmebehandlingen heat induced epitope retrieval(hier), som sker i en kombination af varmebehandling samt Cell Conditioner 1(CC1)[25]. Tiderne for CC1 og de andre reagenser varierer fra antistof til antistof, og kan ses i et kort sammendrag af immunprotokollerne i metode afsnittet. I paraffinsnit vil mange af antigenernes epitoper ikke kunne påvises, da de er blevet maskeret p.g.a methenbroer eller Ca-ioner. Denne maskering skyldes det gelerende fiksativ natural buffer formalin(nbf). For at disse epitoper skal kunne påvises, er demaskering nødvendig. Demaskeringen sker via HIER, som er en varmebehandling hvor methenbroerne vil blive brudt, og komplekst bundne og epitopmaskerende Ca-ioner fjernet. Efterfulgt af HIER følger blokering af endogen aktivitet, som sker via peroxidase inhibitor. Enzymer som peroxidase eller alkalisk Side 23 af 105

24 phosphatase forkommer naturligt(endogent) i en række celler i det humane væv. For at forhindre uspecifik farvning af baggrunden ønskes disse enzymer blokeret, da de kan føre til forkerte resultater. Herefter følger inkubering af de primære antistoffer. Påvisning af alle disse antistoffer sker via detektionssytemet Optiview der er en indirekte 3- lagsteknik, og kan ses i figur 9. Figur 9 Billede af hvordan 3-lagsteknikken fra OptiView fungerer. Det primære antistof(grøn) vil binde sig til antigenerne i vævet. Det sekundære antistof(gul) vil herefter adhere til det primære antistof. Til sidst kan det tertiære antistof(orange) binde sig til det sekundære antistof. HRP der befinder sig på det tertiære antistof kan visualiseres med H 2 O 2 og DAB. Denne visualisering forstærkes af COPPER[26] Efter at have inkuberet med det primære antistof, inkuberes der med et sekundært antistof der binder til det primære antistof. Det sekundære antistof vil være rettet mod det immunglobulin fra den dyreart, som det primære antistof kom fra. Dette antistof vil have HQ haptener, der er med til at øge farveintensiteten, og det er disse som det tredje antistof, det tertiære antistof, vil binde sig til i sidste inkubationstrin. Det tertiære antistof vil være rettet mod det immunglobulin, fra den dyreart som det sekundære antistof kommer fra, og vil være konjugeret med enzymlabelet horse radish peroxidase(hrp), der er usynligt, men som kan visualiseres via hydrogen peroxid(h 2 O 2 ) og kromogenet 3,3 - Diaminobenzidin(DAB). Kromogenet vil blive oxideres til et farvet tungtopløseligt produkt, der giver et brunt reaktionsprodukt. Dette sker dog kun, hvis antistofferne Side 24 af 105

25 har bundet til hinanden og til antigenet. For at forstærke den brune farve anvendes der kobbersulfat(copper). Figur 10 Billede af hvordan 3-lagsteknikken fra OptiView fungerer ved antistoffet PAX8. Det primære antistof(grøn) vil binde sig til antigenerne i vævet. Det sekundære antistof(gul) vil herefter adhere til det primære antistof. Til sidst kan det tertiære antistof(orange) binde sig til det sekundære antistof. Efterfølgende tilsættes der endnu et lag HQ haptener konjugeret med tyramid der er med til at forstærke signalet. Efterfølgende tilsættes et nyt lag tertiært antistof hvorefter HRP der befinder sig på det tertiære antistof kan visualiseres med H 2 O 2 og DAB. Denne visualisering forstærkes af COPPER[26] Alle antistoffer følger denne ovennævnte protokol bortset fra PAX8, som følger figur 10. Til demaskering anvendes der en kombination af HIER og det proteolytiske enzym protease 3. Proceduren for PAX 8 er efterfølgende ens, men efter det tertiære antistof tilsættes der i stedet for DAB endnu et lag HQ haptener, der yderligere kan forstærke signalerne. Disse kaldes amplifiers og vil være konjugeret med tyramid[25,27]. Peroxiden vil spalte de nye HQ haptener, så tyramid bliver Side 25 af 105

26 aktivt. Da tyramid er meget reaktivt vil det lave kovalente bindinger til frie tyrosin- eller tryptophan-aminosyreradikaler. Tyramid molekyler der støder sammen vil ligeledes lave kovalente bindinger til hinanden. Tyramid kan på denne måde ikke nå ud i hele vævet, men binde sig i nærheden af de antigen epitoper der ønskes påvist. Efterfølgende vaskes de overskydende amplifiers væk, og der tilsættes et nyt lag tertiært antistof, der blot har en højere koncentration end tidligere, da de skal binde til endnu flere amplifiers. Disse vaskes efterfølgende væk hvorefter DAB, H 2 O 2 og COPPER tilsættes for at visualisere HRP. Som det sidste trin i IHC-proceduren, og dette gælder alle antistoffer, udføres der en kernefarvning med hæmatoxylin II. Hæmatoxylin II gør at cellekernerne vil fremstå blå, og gør det muligt at lokalisere føromtalte reaktionsprodukt i forhold til væv og cellemorfologien. Fri marginal kappa test Denne test er valgt da den er i stand til at fortælle, i hvor høj grad en række personer vurderer f.eks mikroskopibilleder ens[28]. Testen anvendes hermed til at fortælle, hvor god eller dårlig overensstemmelse der er i mellem observatørerne, de studerende og DS, i vurderingen af de enkelte antistoffer. Testen udføres via hjemmesiden der er i stand til at udregne den frie marginal kappa koefficient. Figur 11 Eksempel på udregning af kappa koefficienten på hjemmesiden I NO of Cases indtastes tallet 20 da det er antallet af patienter. I No of Categories indtastes tallet 2 da der er mulighed for at give scoren (+) eller (-) og i NO of Raters indtastes tallet 5, da dette er antallet af observatører. Antallet af observatører ud for hver patient der har givet scoren (+) indtastes i kolonnen category 0 og dem der har givet scoren (-) indtastes i kolonnen Category 1. Side 26 af 105

27 Dette gøres, som det kan ses i figur 11, ved først at indtaste antallet af patienter(20) efterfulgt af antallet af kategorier. Her vælges tallet 2 da scoren enten kunne være (+) eller (-). Til sidst indtastes antallet af observatører(5). Efterfølgende indtastes der hvor mange af observatørerne der synes antistoffet havde scoren (+) og dette gøres i kategorien 0, og hvor mange af observatørerne der gav scoren (-) som indtastes i kategorien 1. Hjemmesiden er herefter i stand til at udregne den frie marginal kappa koefficient, hvor resultatet betyder følgende: <0 = Ingen overensstemmelse 0-0,2 = svag overensstemmelse 0,2 0,4 = mindre svag overensstemmelse 0,4 0,6 = moderat overensstemmelse 0,6 0,8 = God overensstemmelse 0,8 1= Næsten perfekt overensstemmelse En kappa koefficient på 0,7 eller derover vil være udtryk for en godkendt overensstemmelse mellem observatørerne[29]. Grunden til at det er den frie marginal test der er valgt, skyldes at det er ligegyldigt hvordan observatørerne har fordelt sig mellem de to kategorier, så længe der i sidste ende bare er samlet fem observationer. Side 27 af 105

28 Materialer og metode Materialer I projektet anvendes der 20 patienter med EC, hvor fire har EA1, fire har EA2, fire har EA3, fire har SAC og fire har CCC. Der anvendes desuden kontrolglassene K2 til CK7, PAX8, NAPSA, HNF1β og TFF3, K5 til P53 og P16, samt K8 til ER Apperatur Indstøbningsmaskine Tissue Tek TEC fra Sakura HE farvning Tissue-Tek Prisma CK7, VIM, P53, P16, PAX 8, ER, NAPSA, HNF1β og TFF3 BenchMark Ultra IHC/ISH Staining Module fra firmaet Ventana Side 28 af 105

29 Reagenser Histoclear 96% ethanol 99% ethanol Hæmatoxylin Carazzi Eosin Y arbejdsopløsning (340 ml destilleret vand, 340 ml eosinopløsning blandet 2,1% og 200µl konc. Eddikesyre 100%) NH 3 -vand arbejdsopløsning (680ml postevand og 1,25 ml konc. NH 3 opløsning) EZ Prep fra Ventana Coverslip fra Ventana Cell Conditioner 1 fra Ventana Reaktionsbuffer fra Ventana OptiView Peroxidase inhibitor fra Ventana Anti-CK7 fra Ventana, SP52 Anti-Vimentin fra Ventana, V9 Anti-P53 fra Ventana, DO7 Anti-P16 fra Santa Cruz, JC8, prep kit 20 på AKP Anti-PAX 8 fra Cell Marque, prep kit 13 Anti-ER fra Ventana SP1 Anti-HNF1β fra Atlas Antibodies, prep kit 145 på AKP Anti-NAPS-A fra NovoCastra, IP64, prep kit 9 på AKP Anti-TFF3 fra ABNOVA, 3D9, prep kit 164 OptiView HQ Universal Linker fra Ventana HRP Multimer fra Ventana OptiView H 2 O 2 fra Ventana OptiView DAB fra Ventana OptiView COPPER fra Ventana Hæmatoxylin II fra Ventana Bluing Reagent fra Ventana Side 29 af 105

30 Metoder Søgeord Alle anvendte artikler blev fundet på PubMed databasen. På databasen er det muligt at kombinere flere søgeord på én gang i såkaldte MESH-termer. De anvendte MESH-kombinationer markeres med +. Når der i søgeordene skrives antistoffer betyder dette at der er søgt på alle antistofferne i forskellige kombinationer som f.eks: Endometrial cancer + Cytokeratin 7 og Endometrial cancer + Paired Box 8, osv. Alt andet materiale blev enten fundet i bøger på underviser Kirsten Hartmanns kontor eller udleveret af DS og projekoordinator ansat på OUH Ole Nielsen. Endometrial cancer Endometrial cancer + Immunhistochemistry Endometrial cancer + Antistoffer Endometrial adenocarcinoma + immunhistochemistry Endometrial adenocarcinoma + antistoffer Clear cell carcinoma + immunhistochemistry Clear cell carcinoma + anstistoffer Serous adenocarcinoma + immunhistochemistry Serous adenocarcinoma + antistoffer Endometrial Cancer + FIGO FIGO + endometrium FIGO Tissue Micro Array Endometrial cancer + survival rate

31 TMA-blok Proceduren for dannelse af TMA-blokken i billeder kan ses i bilag 14. Paraffin hældes i en støbeform og sættes på kuldepladen. En bestemt tidslængde på hvor længe paraffinen skal afkøles er ikke fastsat, men den skal blot være fast nok til at kunne udstanses. Hvis den bliver helt afkølet, vil støbeblokken blive ødelagt under ustansningen. Herefter udstanses der 20 huller med en diameter på 4mm, samt to huller til fixpunkterne med en diameter på 3mm. Disse fixpunkter placeret efter bilag 15. I de udvalgte paraffinblokke fra patienterne, udstanses de områder der er svarendes til dem, DS har markeret med cirkel på HE-glas. Disse udstansninger placeres efterfølgende i hullerne i støbeblokken efter bilag 15. Når dette er gjort for alle de udvalgte paraffinblokke, anbringes støbeblokken med de respektive væv(omtales nu TMA-blokken) i varmeskuffen i ca. 3 minutter, til bunden er let smeltet. Bunden af en kapsel monteres efterfølgende på toppen af TMA-blokken og der fyldes op med paraffin, hvorefter den stilles til afkøling på kuldepladen. Når nedkølingen af færdig, tages TMA-blokken ud af formen. Enden der skal skæres på mikrotomet(snitfladen), placeres på et objektglas og anbringes i varmeskab i 10 minutter ved 60 C. Efter 10 minutter tages TMA-blokken ud og objektglasset anvendes til at udglatte snitfladen på blokken. TMA-blokken placeres herefter på kuldeplade igen. Når den er blevet tilstrækkeligt afkølet, er den klar til at blive skåret på mikrotom i 2-4µm tykke snit, der herefter kan anvendes til HE- og IHC-farvning. HE Selve opsætningen af HE-farvningen på Tissue Tek Prisma kan ses i bilag 4 hvor der også er beskrivelser af hvad de enkelte arbejdsopløsninger består af 1. 2x Histoclear á 5 min. 2. 2x 99% ethanol á 3 min 3. 2x 96% ethanol á 3 min 4. Snit vaskes i vand i 2min 5. 2x farvning med Carazzi á 4 min 6. Snit vaskes i vand i 4 min 7. NH 3 arbejdsopløsning i 2 min 8. Snit vaskes i vand i 4 min 9. Eosin Y arbejdsopløsning i 3 min 10. Snit vaskes i vand i 1 min Side 31 af 105

32 11. 96% ethanol i 3 min 12. 2x 99% ethanol á 3 min 13. Montering af dækglas IHC Dette er blot sammendrag af IHC-protokollerne. De fulde protokoller kan ses i bilag Figur 12: Sammendrag af protokolloen der udføres på maskinen BenchMark Ultra IHC/ISH Staining Module på antistoffet CK7 Side 32 af 105

33 Figur 13: Sammendrag af protokolloen der udføres på maskinen BenchMark Ultra IHC/ISH Staining Module på antistoffet VIM Figur 14: Sammendrag af protokolloen der udføres på maskinen BenchMark Ultra IHC/ISH Staining Module på antistoffet ER Side 33 af 105

34 Figur 15: Sammendrag af protokolloen der udføres på maskinen BenchMark Ultra IHC/ISH Staining Module på antistoffet P53 Figur 16: Sammendrag af protokolloen der udføres på maskinen BenchMark Ultra IHC/ISH Staining Module på antistoffet P16 Side 34 af 105

35 Figur 17: Sammendrag af protokolloen der udføres på maskinen BenchMark Ultra IHC/ISH Staining Module på antistoffet PAX8 Side 35 af 105

36 Figur 18: Sammendrag af protokolloen der udføres på maskinen BenchMark Ultra IHC/ISH Staining Module på antistoffet NAPSA Figur 19: Sammendrag af protokolloen der udføres på maskinen BenchMark Ultra IHC/ISH Staining Module på antistoffet HNF1β Side 36 af 105

37 Figur 20: Sammendrag af protokolloen der udføres på maskinen BenchMark Ultra IHC/ISH Staining Module på antistoffet TFF3 Side 37 af 105

38 Resultater Resultatguide Figurer I forbindelse med figur viser de sorte pile, hvor der er sket en positiv reaktion i snittet i forbindelse med IHC. Denne positive reaktion vil generelt kunne ses via den brune farve i snittene, og pilene vil derfor ofte blot henvise til et eksempel i vævet, hvor den positive reaktion er sket, da visse snit vil have en diffus reaktion. På figurerne er der i de respektive tekstbokse først beskrevet hvilken subtype, EA1, EA2, EA3, SAC og CCC der er tale om, efterfulgt af et tal, 1-4, der står i parentes. Dette tal henviser til, hvilken patient der er tale om, således at denne kan genfindes i de fælles observationsskemaer, der er i tabel I tekstboksene er der desuden angivet scoren (+) eller (-) ud for de respektive snit, der indikerer hvad undertegnede observatør har angivet i observationsskemaerne. Selvom der i visse snit kan være sorte pile, kan der godt være tale om snit der har fået scoren (-). Her henvises der til metodiske overvejelser afsnittet hvor der er beskrevet, hvordan de enkelte antistoffer bliver scoret som enten (+) eller (-). Til sidst i teksboksene er der angivet ved hvilken mikroskopisk forstørrelse, det enkelte billede er taget. Tabeller De enkelte observationsskemaer ud fra hvert antistof vil være vist i tabel I første kolonne(lodret) fra venstre vil der være angivet, hvilket antistof der er tale om i det respektive skema, efterfulgt af hvilken subtype, EA1, EA2, EA3, SAC og CCC samt patient, 1-4, der vil være tale om. Dette vil være angivet i parentes. Til sidst i kolonnen vil der være angivet den samlede kappa koefficient for observationerne ved det pågældende antistof. I første række(vandret) øverst vil der være angivet, hvilket antistof der er tale om, efterfulgt af hvilken observatør der har givet den enkelte score. DS vil være angivet som patolog, og de studerende involveret i projektet vil hedde observatør 1-4. Side 38 af 105

39 Kontrolsnit I kontrolsnittene, der kan ses i bilag 1-3, var følgende væv positive i forbindelse med IHC af hvert antistof: K2 CK7 VIM PAX8 NAPSA HNF1β TFF3 Hud Tonsil Nyre Lever Colon Prostata Malignt melanom Cerebellum Tabel 4: Oversigt over hvilke væv der var positive og negative på kontrolglasset K2 for antistofferne CK7, VIM, PAX8, NAPSA, HNF1β og TFF3 K5 P53 P16 Thymus - - Hodgkin lymfom + + Seminom + + Føtal lever + + Serøst ovarie carcinom + + Neuroblastom + + Tabel 5: Oversigt over hvilke væv der var positive og negative på kontrolglasset K5 for antistofferne P53 og P16 K8 Mammacancer 0% ER - Mammacancer 30-50% ER + Mammacancer 100% ER + Portio ER 3+ + ER Tabel 6: Oversigt over hvilke væv der var positive og negative på kontrolglasset K8 for antistoffet ER Side 39 af 105

40 CK7 EA1(2). (+). X5 EA2(2). (+). X5 EA3(4). (+). X5 SAC(3). (+). X5 CCC(1). (+). X5 Figur 21: Uddrag af resultaterne fra CK7 i forbindelse med IHC. Tallet, 1-4, efter subtypen indikerer hvilken patient der er tale om. Scoren (+) markerer at der er sket en positiv reaktion Side 40 af 105

41 CK7 Patolog Observatør 1 Observatør 2 Observatør 3 Observatør 4 EA1 (1) EA1 (2) EA1 (3) EA1 (4) EA2 (1) EA2 (2) EA2 (3) EA2 (4) EA3 (1) EA3 (2) EA3 (3) EA3 (4) SAC (1) SAC (2) SAC (3) SAC (4) CCC (1) CCC (2) CCC (3) CCC (4) Samlet Kappa Koefficient 1.00 Tabel 7:Oversigt over samlet observationsskema for patologen og de fire observatører i forbindelse med CK7. Scoren (+) markerer at der er observeret en positiv reaktion. I bunden af tabellen er den samlede kappa koefficient. Side 41 af 105

42 VIM EA1(1). (+). X5 EA2(2). (+). X5 EA3(2). (+). X5 SAC(3). (+) X20 SAC(4). (+). X5 CCC(1). (+). X20 CCC(4). (+). X5 Figur 22 Uddrag af resultaterne fra VIM i forbindelse med IHC. Tallet, 1-4, efter subtypen indikerer hvilken patient der er tale om. Scoren (+) markerer at der er sket en positiv reaktion Side 42 af 105

43 Vimentin Læge Observatør 1 Observatør 2 Observatør 3 Observatør 4 EA1 (1) EA1 (2) EA1 (3) EA1 (4) EA2 (1) EA2 (2) EA2 (3) EA2 (4) EA3 (1) EA3 (2) EA3 (3) EA3 (4) SAC (1) SAC (2) SAC (3) SAC (4) CCC (1) CCC (2) CCC (3) CCC (4) Samlet kappa koefficient 0,90 Tabel 8: Oversigt over samlet observationsskema for patologen og de fire observatører i forbindelse med mikroskopisk score af VIM. Scoren (+) markerer at der er observeret en positiv reaktion i vævet for den enkelte patient. I bunden af tabellen er den samlede kappa koefficient Side 43 af 105

44 ER EA1(1). (+). X20 EA1(2). (+). X5 EA1(3). (+). X20 EA1(4). (+). X20 EA2(1). (+). X20 EA2(2). (+). X20 EA2(3). (+). X20 EA2(4). (+). X20 EA3(1). (+). X20 EA3(2). (+). X20 EA3(3). (+). X5 EA3(4). (+). X20 SAC(1). (+). X20 SAC(2). (+). X20 SAC(3). (+). X20 SAC(4). (+). X20 Side 44 af 105

45 CCC(1). (+). X20 CCC(2). (+). X20 CCC(3). (+). X20 CCC(4). (+). X20 Figur 23: Uddrag af resultaterne fra ER i forbindelse med IHC. Tallet, 1-4, efter subtypen indikerer hvilken patient der er tale om. Scoren (+) markerer at der er sket en positiv reaktion ER Læge Observatør 1 Observatør 2 Observatør 3 Observatør 4 EA1 (1) EA1 (2) EA1 (3) EA1 (4) EA2 (1) EA2 (2) EA2 (3) EA2 (4) EA3 (1) EA3 (2) EA3 (3) EA3 (4) SAC (1) SAC (2) SAC (3) SAC (4) CCC (1) CCC (2) CCC (3) CCC (4) Samlet kappa koefficient 0,60 Tabel 9: Oversigt over samlet observationsskema for patologen og de fire observatører i forbindelse med ER. Scoren (+) markerer at der er observeret en positiv reaktion. Scoren (-) markerer at patologen og/eller observatørerne ingen positiv reaktion har observeret. I bunden af tabellen er den samlede kappa koefficient Side 45 af 105

46 P53 EA1(1). (-). X5 EA1(2). (-). X20 EA1(3). (-). X20 EA1(4). (-). X20 EA2(1). (-). X20 EA2(2). (-). X5 EA2(3). (-). X20 EA2(4). (-). X20 EA3(1). (+). X5 EA3(2). (-). X20 EA3(3). (-). X20 EA3(4). (-). X20 SAC(1). (+). X5 SAC(2). (-). X20 SAC(3). (+). X5 SAC(4). (+). X20 Side 46 af 105

47 CCC(1). (-). X20 CCC(2). (-). X5 CCC(3). (-). X20 CCC(4). (-). X20 Figur 24:Uddrag af resultaterne fra P53 i forbindelse med IHC. Tallet, 1-4, efter subtypen indikerer hvilken patient der er tale om. Scoren (+) markerer at der er sket en positiv diffus reaktion eller helt blank reaktion. Scoren (-) markerer hvor der kun er tale om fokal positiv reaktion P53 Læge Observatør 1 Observatør 2 Observatør 3 Observatør 4 EA1 (1) EA1 (2) EA1 (3) EA1 (4) EA2 (1) EA2 (2) EA2 (3) EA2 (4) EA3 (1) EA3 (2) EA3 (3) EA3 (4) SAC (1) SAC (2) SAC (3) SAC (4) CCC (1) CCC (2) CCC (3) CCC (4) Samlet kappa koefficient 0,76 Tabel 10: Oversigt over samlet observationsskema for patologen og de fire observatører i forbindelse med P53. Scoren (+) markerer at der er observeret en diffus og intens positiv reaktion eller en helt blank reaktion. Scoren (-) indikerer at patologen og/eller observatørerne har observeret en fokal reaktion. I bunden af tabellen er den samlede kappa koefficient Side 47 af 105

48 P16 EA1(1). (-). X5 EA2(2). (+). X5 EA3(2). (+). X5 SAC(1). (+). X5 SAC(3). (+). X20 CCC(4). (-). X5 Figur 259: Uddrag af resultaterne fra P16 i forbindelse med IHC. Tallet, 1-4, efter subtypen indikerer hvilken patient der er tale om. Scoren (+) markerer at der er sket en diffus og intens positiv reaktion. Scoren (-) markerer at der er sket en fokal positiv reaktion P16 Læge Observatør 1 Observatør 2 Observatør 3 Observatør 4 EA1 (1) EA1 (2) EA1 (3) EA1 (4) EA2 (1) EA2 (2) EA2 (3) EA2 (4) EA3 (1) EA3 (2) EA3 (3) EA3 (4) SAC (1) Side 48 af 105

49 SAC (2) SAC (3) SAC (4) CCC (1) CCC (2) CCC (3) CCC (4) Samlet kappa koefficient 0,92 Tabel 11: Oversigt over samlet observationsskema for patologen og de fire observatører i forbindelse med P16. Scoren (+) markerer at der er observeret en diffus og intens positiv reaktion. Scoren (-) er givet hvis der er observeret en helt blank eller fokal reaktion i vævene. I bunden af tabellen er den samlede kappa koefficient Side 49 af 105

50 PAX8 EA1(2). (+). X5 EA2(1). (+). X5 EA3(2). (+). X20 EA3(3). (+). X5 SAC(2). (+). X20 CCC(1). (+). X20 CCC(2). (+). X20 Figur 2610: Uddrag af resultaterne fra PAX8 i forbindelse med IHC. Tallet, 1-4, efter subtypen indikerer hvilken patient der er tale om. Scoren (+) markerer at der er sket en positiv reaktion PAX8 Læge Observatør 1 Observatør 2 Observatør 3 Observatør 4 EA1 (1) EA1 (2) EA1 (3) EA1 (4) EA2 (1) EA2 (2) EA2 (3) EA2 (4) EA3 (1) EA3 (2) EA3 (3) EA3 (4) SAC (1) SAC (2) Side 50 af 105

51 SAC (3) SAC (4) CCC (1) CCC (2) CCC (3) CCC (4) Samlet kappa koefficient 0,86 Tabel 12: Oversigt over samlet observationsskema for patologen og de fire observatører i forbindelse med PAX8. Scoren (+) markerer at der er observeret en positiv reaktion og scoren(-) markerer at der ingen positiv reaktion er observeret i vævet. I bunden af tabellen er den samlede kappa koefficient Side 51 af 105

52 NAPSA EA1(1). (-). X5 EA2(2). (-). X5 EA2(3). (-). X20 EA3(3). (-). X5 SAC(2). (-). X20 SAC(3). (-). X20 SAC(4). (-). X5 CCC(1). (-). X5 CCC(2). (+). X5 Figur 27: Uddrag af resultaterne fra NAPSA i forbindelse med IHC. Tallet, 1-4, efter subtypen indikerer hvilken patient der er tale om. Scoren (+) markerer at der er sket en positiv reaktion og scoren (-) markerer er der ingen reaktion er sket i vævet. Napsin A Læge Observatør 1 Observatør 2 Observatør 3 Observatør 4 EA1 (1) EA1 (2) EA1 (3) EA1 (4) EA2 (1) EA2 (2) Side 52 af 105

53 EA2 (3) EA2 (4) EA3 (1) EA3 (2) EA3 (3) EA3 (4) SAC (1) SAC (2) SAC (3) SAC (4) CCC (1) CCC (2) CCC (3) CCC (4) Samlet kappa koefficient 0,82 Tabel 13: Oversigt over samlet observationsskema for patologen og de fire observatører i forbindelse med NAPSA. Scoren (+) markerer at der er observeret en positiv reaktion. Scoren (-) er givet hvis der ingen positiv reaktion er observeret i. I bunden af tabellen er den samlede kappa koefficient Side 53 af 105

54 HNF1β EA1(3). (-). X5 EA2(2). (-). X5 EA3(3). (-). X5 SAC(1). (-). X20 SAC(2). (-). X5 SAC(3). (+). X20 SAC(4). (+). X5 CCC(1). (+). X5 Figur 28: Uddrag af resultaterne fra HNF1β i forbindelse med IHC. Tallet, 1-4, efter subtypen indikerer hvilken patient der er tale om. Scoren (+) markerer at der er sket en positiv diffus og intens reaktion. Scoren (-) markerer hvor der er sket en fokal svag reaktion Side 54 af 105

55 HNF-1β Læge Observatør 1 Observatør 2 Observatør 3 Observatør 4 EA1 (1) EA1 (2) EA1 (3) EA1 (4) EA2 (1) EA2 (2) EA2 (3) EA2 (4) EA3 (1) EA3 (2) EA3 (3) EA3 (4) SAC (1) SAC (2) SAC (3) SAC (4) CCC (1) CCC (2) CCC (3) CCC (4) Samlet kappa koefficient 0,78 Tabel 14: Oversigt over samlet observationsskema for patologen og de fire observatører i forbindelse med HNF1β. Scoren (+) markerer at der er observeret en diffus og intens positiv reaktion. Scoren (-) er givet hvis der er observeret blank eller fokal reaktion. I bunden af tabellen er den samlede kappa koefficient Side 55 af 105

56 TFF3 EA1(1). (+). X5 EA1(2). (+). X20 EA1(3). (+). X5 EA1(4). (+). X20 EA2(1). (+). X20 EA2(2). (+). X5 EA2(3). (+). X5 EA2(4). (+). X20 EA3(1). (+). X20 EA3(2). (+). X5 EA3(3). (+). X5 EA3(4). (+). X20 SAC(1). (+). X5 SAC(2). (+). X5 SAC(3). (+). X20 SAC(4). (+). X20 Side 56 af 105

57 CCC(1). (-). X20 CCC(2). (-). X20 CCC(3). (+). X5 CCC(4). (-). X20 Figur 29: Uddrag af resultaterne fra TFF3 i forbindelse med IHC. Tallet, 1-4, efter subtypen indikerer hvilken patient der er tale om. Scoren (+) markerer at der er sket en positiv reaktion og scoren (-) markerer at der ingen reaktion er sket. TFF3 Læge Observatør 1 Observatør 2 Observatør 3 Observatør 4 EA1 (1) EA1 (2) EA1 (3) EA1 (4) EA2 (1) EA2 (2) EA2 (3) EA2 (4) EA3 (1) EA3 (2) EA3 (3) EA3 (4) SAC (1) SAC (2) SAC (3) SAC (4) Side 57 af 105

58 CCC (1) CCC (2) CCC (3) CCC (4) Samlet kappa koeffiecient 0,80 Tabel 15: Oversigt over samlet observationsskema for patologen og de fire observatører i forbindelse med TFF3. Scoren (+) markerer at der er observeret en positiv reaktion og scoren (-) er givet hvis der ingen reaktion er sket. I bunden af tabellen er den samlede kappa koefficient Side 58 af 105

59 Diskussion Kontrolsnit Kontrolsnittene er positive i de forventede væv, se tabel 4-6, og alle IHC-glassene kan derfor anvendes i bacheloropgaven. Idet kontrolsnittene stemmer overens med hvad der forventes, så vil en negativ reaktion være ensbetydende med at de proteiner der ønskes påvist, ikke er til stede i de respektive patientsnit. Modsat vil en positiv reaktion betyde at proteinerne er til stede, og der vil derfor fremkomme en positiv reaktion mod de tilsatte antistoffer, da proteinerne i snittene vil fungerer som antigener. EA1 og EA2 I forbindelse med scoregivning af snittene angående subtyperne EA1 og EA2 anvendes der ifølge teorien en lang række antistoffer, der kan være med til at give indikationer om, hvilken af subtyperne der er tale om. Ifølge teoriundervisning fra DS[7] bør CK7 altid være positiv for begge subtyper. Det samme gælder for VIM, ER og TFF3. På figur 21 for CK7 ses det da også i eksemplerne fra mikroskopien at der er positiv reaktion i vævene EA1(2) og EA2(2). Generelt havde observatørerne let ved at angive en score i forbindelse med dette antistof, da vævene som regel udtrykte stor positivitet og gik fra at være diffus og intensiv, til fokal men stadig intens. Det ses da også i observationsskemaet i tabel 7, at der var enighed i at antistoffet var positivt i alle vævssnit fra patienter med EA1 og EA2. For VIM var der også enighed i angivelse af scoren(+). I figur 22 er det tydeligt, at der også her var en diffus og intens reaktion i vævsnittene. Denne diffuse og intensive positive reaktion gjorde sig gældende i alle vævssnittene, og derfor ses der også den store enighed i observationsskemaet i tabel 8. Antistoffet ER adskilte sig i forbindelse med mikroskoperingen, en smule fra CK7 og VIM i forhold til intensiteten og udbredelsen af positive reaktioner i snittene. I figur 23 for patienterne EA1(1), EA1(2) og EA1(3) var der en diffus og intens reaktion. For EA1(4) kom den positive reaktion dog blot til udtryk ved små, meget spredte områder. Dette gjorde at observatørerne og DS, var nødt til at undersøge snittet nærmere i forhold til de resterende EA1 patienter for at finde den positive reaktion. Observatørerne og DS var dog stadig enige i angivelse af scoren(+) jævnfør tabel 9. Denne enighed var også gældende ved patienterne med EA2. For TFF3 ligner resultaterne meget det, der blev observeret ved CK7 og VIM. I figur 29 ses et Side 59 af 105

60 overblik over alle snittene hvor der igen ses væv der var diffust og intens positivt. Heller ikke her havde DS eller observatørerne problemer med at være enige om, at alle EA1 og EA2 patienterne skulle have scoren(+). I studiet omtalt i artiklen Mhawech-Fauceglia et.al[23] blev der anvendt 146 patienter med EA1 og 104 patienter med EA2. Studiet er dermed stort nok, til at give indikationer om hvilke reaktioner antistofferne ER og TFF3 forventes at have i disse subtyper. For ER var 131 EA1 patienter positive, svarende til (90%) og 75 EA2 patienter (72%). For TFF3, der forventes positiv, var 126 EA1 patienter (86%) positive og 79 (76%) EA2 patienter positive. Tallene viser dermed, at der kan være enkelte udslag i positiviteten. Dette kan skyldes patientvariation, eller at der er tale om blandingstumorer. Størstedelen af patienterne med EA1 og EA2 burde dog være positive for antistofferne. Vores resultater stemmer dermed overens med artiklen. Alle patienterne i artiklen blev dog kun mikroskoperet af én person. Et større udvalg af observatører ville have været med til at højne kvaliteten for artiklen en smule, da der ved flere observatører kunne have været inkluderet en kappa koefficient, der kunne give et indblik i hvor stor overensstemmelse der var. Det sidste antistof der viste positivitet for EA1 og EA2 var PAX8. I figur 26 ved patient EA1(2) ses det igen at der er tale om en intens, men fokal positiv reaktion. Den fokale reaktion gjorde sig gældende i alle vævsnittene. EA1 patienterne i tabel 12 var alle enige om skulle have scoren(+). Men ved patient EA2(1) kan det i tabellen ses at DS har scoret denne som værende (-), mens de resterende observatører har denne som positiv. I figuren er der afbilledet det område, som parterne var uenige om, hvordan skulle scoreangives. Det er tydeligt at se, at der er tale om en positiv reaktion, men DS fortalte på et efterfølgende møde, at hun havde scoret denne som værende (-), da hun synes der ikke var en stor nok positiv reaktion i hele vævet, men at hun godt kunne forstå hvorfor os studerende havde givet den scoren(+). Her kommer det til udtryk, at der endnu ikke er grundlagt et egentligt regelsæt for hvordan de enkelte antistoffer skal scores, samt at der ved en TMA-blok, blot er tale om såkaldt nøglehulskiggeri, se afsnittet - implementering I tabel 7-15 ses der fuldstændig enighed i angivelsen af hvilken score de enkelte snit for EA1 og EA2 skulle have, og de resterende antistoffer der ikke er blevet omtalt i dette afsnit, blev scoret som værende(-). Resultaterne stemmer hermed overens, med hvad der blev fortalt til teoriundervisningen fra DS[7]. EA3 Som ved EA1 og EA2 så skal antistofferne CK7 og VIM altid være positive ved denne type-ii cancer, ifølge teoriundervisning fra DS[7] samt enkelte positive tilfælde for ER. I figur 21, CK7, for patienten EA3(4) er det da også tydeligt at se, at der er tale om en positiv reaktion. Modsat type-i Side 60 af 105

61 cancere adskiller EA3 sig ved at der vil være >50 solid vækst i vævet og derfor ikke så meget glandulært væv tilstede. En diffus og intens reaktion vil derfor ikke altid ses, men nogle gang blot som fokal intens. At subtypen, på trods af den solide vækst, skal være positiv for CK7, var der ingen tvivl om, hverken for DS eller observatørerne, og alle var enige om scoren (+) for alle EA3 patienterne. Ovenstående observationer gælder ligeledes for VIM. I figur 22 er der tydeligt tale om en intens positiv reaktion ved patient EA3(2), men denne reaktion er blot fokal grundet den solide vækst. Heller ikke ved dette antistof var der tvivl om scoren(+). For ER var der uenighed ved patient EA3(2). I tabel 9 ses det at DS og observatør 1 har scoret denne som (-), mens de resterende tre observatører har givet scoren (+). I figur 23 kan der dog ses et lille område i vævet der er svagt positivt, og dette er grunden til at observatør 2-4, har givet en positiv score. Af grunde til at scoren (-) er givet, kan det tænkes at vedkommende, har vurderet at den fokale reaktion ikke involverede nok celler, til at kunne give scoren (+). De resterende EA3 patienter blev dog scoret ens, da der her var tale om vævssnit med en diffus og intens positiv reaktion. Ifølge artiklen Mhawech-Fauceglia et.al[23] der har 151 patienter med i deres studie, der har subtypen EA3, så stemmer deres resultater godt overens med hvad der blev undervist i til teoriundervisningen med DS[7]. Det er dog svært at sammenligne med vores resultater grundet at vores TMA-blok ikke indeholdt særlig mange patienter. I artiklen er 98 ud af de 151 EA3 patienter negative for antistoffet ER svarende til 65%. Størstedelen af EA3 patienter for antistoffet ER var positive i bachelorprojektet, og stemmer dermed ikke helt overens med artiklen. Hvis TMA-blokken indeholdt flere patienter, er der dog stor sandsynlighed for at størstedelen af patienterne ville være negative, da den generelle erfaring med antistoffet ER er, at den oftest er negativ ved EA3-patienter. På AKP er ER dog ikke det mest foretrukne antistof se afsnittet opsummering af resultater Ifølge Mhawech-Fauceglia et.al [23] så bør TFF3 hovedsageligt fremstå som værende negativ, men kan også i visse tilfælde have en svag fokal reaktion for EA3 patienter. I studiet er 110 ud af 151 EA3 patienter negative svarende til 73%.Et godt eksempel på en sparsom positive reaktion kan ses i vores resultater i figur 29 for patient EA3(2). Igen er scoren afhængig af hvor erfaren bioanalytikeren er, da vævet hovedsageligt kan fremstå negativ, og der kan dermed ske den fejl at vævet bliver scoret som (-), hvor det efter en grundigere gennemgang burde have været (+). I forbindelse med observationerne i TMA-blokken for TFF3 var alle observatører dog opmærksomme, og alle gav scoren (+). Som ved ER så stemmer vores resultater ikke overens med artiklen, men igen så kan dette være grundet at der i bachelorprojektet, kun er inkluderet fire Side 61 af 105

62 patienter med EA3. Ved antistoffet P53 var der også visse uenigheder i angivelse af scoren. Dette kan skyldes at, det har været svært for den enkelte observatør at vurdere om, hvorvidt der var tale om en positiv reaktion i >50% af cellerne, som der ifølge teoriundervisning fra DS[7] skal være, før den kan være positiv. Der kan også være tale om, som det er tilfældet ved EA3(2) i tabel 10, at den ene observatør ingen positiv reaktion har observeret og derfor har givet scoren(+), og at en anden har observeret et meget lille fokalt område og givet scoren (-). Ved EA3(1) var der også en afvigelse i observatørernes score. Dette snit kan ses i figur 24, hvor der ses en klar og tydelig diffus og intens reaktion i >50% af cellerne. Grunden til at observatør 2 har scoret (-) kan være at den øgede mængde solide væv, har gjort det sværere at skelne mellem, hvad der er solidt og ikke solidt. Solidt væv vil ikke kunne få en positiv reaktion, og områderne vil derfor fremstå helt blanke. En anden grund kan være, at observatøren er blevet desorienteret i TMA-blokken. Netop for at dette problem ikke skulle opstå, blev der i TMA-blokken indstøbt fixpunkter. Uerfarenhed i at mikroskopere kan dog lægge til grund for afvigelsen. Ovenstående tanker om hvad der kan være gået galt angående korrekt scoreangivning gælder ligeledes for P16, hvor der er enighed om scoren undtagen for patient EA3(2). I tabel 11 kan det ses at, observatør 4 har givet denne patient scoren (-). I figur 25 hvor denne patients snit kan ses mikroskopisk, er det dog tydeligt at der er tale om en diffus og intens positiv reaktion. Også antistoffet PAX8 var der en enkelt uenighed omkring ved patient EA3(2). I figur 26 kan et eksempel på den positive reaktion dog ses. Igen kan grunden være at, observatørerne der har givet scoren (-) negativ, enten har overset det lille område, eller ikke har følt at der var nok celler der var positive for antistoffet. Til undervisningen fra DS[7] blev instruktionerne i hvordan de enkelte antistoffer skulle scores, misforstået en smule af de studerende. Mere om dette kan ses i afsnittetimplementering SAC For denne subtype var den generelle opfattelse blandt de studerende, at det var den mest vanskelige at gradere. Dette skyldes mest af alt at den mindede utroligt meget om EA3 i udseendet, samt at patient SAC(1) og SAC(4) havde blandingstumorer, og hermed var heterogene i udseendet mikroskopisk. Et godt eksempel på dette kan ses i figur 28 for patient SAC(4), hvor øverste højre halvdel er positivt for HNF1β, mens den anden halvdel er negativ. Dette gav problemer især for antistoffet P53 hvor der ifølge den endnu ikke færdigudgivede bog af DS[5], skal være en alt eller intet reaktion, før denne kan angives som væres positiv. De studerende skulle dermed være Side 62 af 105

63 opmærksomme på, at i nogle af snittene kunne den ene halvdel være diffus og intens, mens den anden blank til fokal svag. I sådanne tilfælde skulle der scores efter det område, hvor der var mest diffus reaktion. For CK7 og PAX8 var der enighed blandt observatørerne om, at de var positive og dette stemmer også overens med teoriundervisningen fra DS[7] som kan ses i afsnittet serøst adenokarcinom. Et andet antistof der også kan anvendes til diagnosticering af SAC, er P53. I artiklen Han, G et.al[30] beskriver de, at i deres studie havde 116 patienter, hvilket er mere end tilstrækkeligt, hvor fem observatører skulle scoreangive hvilke antistoffer der havde positive reaktion, så der efterfølgende kunne udregnes en kappa koefficient. I studiet havde patienter subtypen SAC. Grunden til tallet varierer skyldes at, i enkelte tilfælde faldt snittene ud af TMA-blokken. For antistoffet P53, i artiklen omtalt TP53, var 15 ud af de 16 patienter positive, hvilket svarer til 94%. I vores bachelorprojekt var der enighed, som det kan ses i tabel 10, omkring patient SAC(4). For patient SAC(1) var observatør 1 uenig i, at vævet var diffust og dette skyldes sandsynligvis, at der er tale om en patient med blandingstumor. For SAC(2) var DS og observatør 3 uenige med flertallet om, at vævet skulle have scoren (+). I figur 24 er det tydeligt at se, at der er en positiv reaktion, og eksemplet viser da også at den burde have haft scoren (+). Men akkurat som at der ved en TMAblok kun er tale om nøglehulskiggeri se mere i afsnittet implementering, så viser billederne i figurerne kun et lille område, i forhold til hvad der egentlig er observeret mikroskopisk. For i dele af vævet var det tydeligt, at der var en hel del atypiske kerner, som var blanke og derfor scorede jeg, som observatør 3, dette væv som (-), da der dermed ikke var tale om en diffus men fokal reaktion. Denne patient var dog svær at score, da et (+) skal gives når >50% af cellerne er positive, og procentgraden af positive celler, var her svær at vurdere. Dette er et godt eksempel på hvorfor der anvendes flere antistoffer samtidig til at diagnosticere en patient, da det er det samlede billede fra både HE- og IHC-snittene, der giver indikationer om hvilken subtype, der er tale om. For patient SAC(3) var der også uenighed, denne gang ikke om vævet var diffust men helt blankt. De små plamager af positiv reaktion der blev observeret syntes dog at være cytoplasmatisk og ikke kerne, og derfor har størstedelen af observatørerne tildelt dette væv som værende blankt. Patient SAC(3) er dermed et bevis på, at det også er vigtigt for patologen at vide hvilken positiv reaktion der forventes at se i vævet. De store uenigheder gør det vanskeligt at sammenligne vores resultater med dem i artiklen Han,G et.al[30], samt at vores TMA-blok ikke indeholdt ligeså mange patienter. For hver af patienterne er der dog altid mindst tre observatører, der har givet en positiv score, og kigges der kun på DS Side 63 af 105

64 observationer, da hun er den med mest erfaring, er der tale om at 75% af patienterne med SAC, er positive for P53. Vores resultater stemmer dermed nogenlunde overens med resultaterne beskrevet i artiklen. For VIM(tabel 8), P16(tabel 11), NAPSA(tabel 13) og TFF3(tabel 15) var der også enkelte uenigheder men disse skyldes muligvis de samme fejlkilder, som er omtalt i P53 i afsnittet EA3. For VIM var der uoverenstemmelse med vores resultater i forhold til, hvad der er beskrevet i artiklen. Her var blot 27% af SAC patienterne positive for antistoffet, hvilket betyder at mindst én af de patienter inkluderet i vores TMA-blok, burde have været negative. Jeg, som observatør 3, har desuden ændret mening omkring scoregivning ved patient SAC(3) i NAPSA og TFF3. Denne ændring er sket på baggrund af et diskussionsmøde som vi studerende havde med DS, hvor visse af snittene blev gennemgået. Ved NAPSA, der kan ses i figur 27, er det tydeligt at, der er tale om en positiv reaktion, og at dette snit ikke burde have fået scoren (-). I figur 29 ses det i eksemplet at der er tale om at vævet er helt blankt for TFF3, og derfor ikke burde have fået scoren (+). Disse eksempler er et godt billede af, hvor vigtigt det kan være at få en second opinion på sin scoreangivning, når der er tale om at det er en uerfaren bioanalytikerstuderende, der har foretaget mikroskoperingen. Var dette projekt udarbejdet et stykke tid efter færdiggørrelsen af vores uddannelse, så ville nogle af resultaterne fra bacheloropgaven muligvis være ændret, da observatørerne ville have haft mere erfaring og dermed yderligere udviklet kerneværdierne for en bioanalytiker. Studerende vil altid have en vis form for faglighed men denne faglige viden og erfaring, vil hele tiden blive opdateret løbende, så vi alle bliver bedre og mere kompetente. Denne udvikling vil ske naturligt, således at det ikke kun er fagligheden der højnes, men også de resterende kerneværdier som ansvarlighed, kvalitetsbevidsthed, professionalisme og fælleskabsfølelse. Ved ER, kan det ses i tabel 9, at der var en del uenigheder. For SAC(1) og SAC(4) er det mest sandsynligt at der igen er tale om førnævnte fejlkilder angående desorientering i TMA-blokken, eller at disse patienter er blandingstumorer, og evt har forvirret observatør 2. Igen er der dog størst uenighed omkring SAC(3), hvor alle var enige om at der var sket en positiv reaktion, men var uenige i om hvorvidt der var tale om >5% - mere om dette i afsnittet implementering. Det sidste antistof der var positivt i forbindelse med SAC var HNF1β, men også her var der meget store uenigheder. Grunden til dette er at, ved SAC blev vævet ikke farvet lige så intenst som tidligere, og da en positiv score kun gives ved væv der er diffust og intenst, gjorde dette opgaven sværere. Et godt eksempel kan ses i figur 28 ved patient SAC(4). Den sorte pil på billedet viser et område, hvor der er sket en diffust og intens positiv reaktion, men i resten af snittet er det som om Side 64 af 105

65 den positive intensitet forsvinder en smule. Mikroskopet der er blevet anvendt til at tage billederne med, har dog en meget høj hvidbalance, da billederne er blevet overført til en PC, hvilket gør at mange af billederne kan virke helt blanke, selvom der er sket en positiv reaktion. Derfor er der anvendt de sorte pile til at markere en positiv reaktion. Denne hvidbalance er ikke helt så fremtrædende når der blot mikroskoperes, og ved SAC(4) var der tale om at intensiteten blev svagere, men ikke helt så svag, som billedet antyder. Denne svækkelse i intensiteten kan dog forklare uenighederne omkring lige netop denne patient. CCC De antistoffer der særligt ønskes udtrykt som positive i denne subtype er ifølge teoriundervisning fra DS[7] især NAPSA, der er specifik for CCC samt CK7, VIM og HNF1β. Ved CK7 var alle observatører, ifølge tabel 7, enige om at antistoffet blev udtrykt positivt. For VIM, PAX8 og NAPSA var der næsten enighed i afgivning af score. Ved VIM, kan det ses i tabel 8, afveg observatør 2 i forbindelse med patient CCC(1). I figur 22 er der dog afbilledet vævet mikroskopisk, hvor der er tydelig positiv diffus og intens reaktion. I observationsskemaet for PAX8, tabel 12, kan det ses at her afviger CCC(2), men igen ifølge figur 26, er denne klart positiv. For NAPSA, der var den CCC specifikke, var det min observation i forbindelse med patient CCC(1) som afveg. I figur 27 er det dog, igen vist med sort pil, at der er en lille men klar positiv reaktion i vævet, og at jeg derfor burde have givet denne patient scoren (+). Den generelle grund til at der var disse afvigelser i VIM, PAX8 og NAPSA, skyldes igen højest sandsynligt at der har været desorientering i vævet, eller som i mit tilfælde ved NAPSA, var tale om at jeg ikke syntes det lignede en cytoplasmatisk reaktion, men mere uspecifik udfældning. Det at NAPSA specifikt anvendes til subtypen CCC beskrives også i artiklen Fadare, O et.al[21]. Her blev der blandt andet testet 49 CCC patienter af tre observatører, for hvilken reaktion de ville få i forbindelse med antistoffet. 43 patienter (88%) var positive for antistoffet, og stemmer dermed godt overens med vores resultater. Som nævnt tidligere så indeholder vores bachelorprojekt dog blot fire patienter med hver subtype. For at resultaterne kan sammenlignes, kan det være en idé fra AKP at lave en TMA-blok for hver af de fem subtyper- se afsnittet perspektivering. Endnu en gang var det ved ER, tabel 9, at de største afvigelser lå. De sorte pile i figur 23 viser de steder hvor jeg så en positiv reaktion, som argument for min score (+). Den generelle grund til at der blev scoret (-) af nogle af observatørerne, skyldes især, som det kan ses ved patient CCC(4), at Side 65 af 105

66 der ofte var tale om en meget sparsom fokal reaktion. Igen viser det at der endnu ikke er fastlagt et egentlig regelsæt. Dette vil være uddybt i afsnittet implementering. Det sidste antistof hvor der var uoverensstemmelser, var TFF3. Her er der tale om patient CCC(2) og CCC(4), der overordnet er blevet scoret (-) undtagen af observatør 4, der har givet scoren (+). I figur 29 på de respektive billeder kan det da også ses, via den brune farve, at der er sket en reaktion i vævet. Dette minder dog igen blot om uspecifik udfældning. For subtypen CCC var antistofferne CK7, VIM, ER, PAX8, NAPSA, HNF1β og TFF3 positive, og teorien stemmer dermed overens med de antistoffer, der anvendes specifikt til at diagnosticere CCC. For NAPSA, der var den helt specifikke CCC markør, var alle patienter positive, mens en anden, ikke lige så specifik markør HNF1β, var overvejende positiv undtagen patient CCC(2). Dette viser endnu en gang at der er patientvariation, og hvor vigtigt det er at anvende et helt panel af antistofmarkører, for at kunne identificere den korrekte subtype. Opsummering af resultater Ifølge justrandolph.com[29] så ligger en godkendt kappa koefficient på 0,70 eller derover. I resultatafsnittet ligger næsten alle antistoffer over denne grænse med undtagelse af ER som lå på 0,60. Præcis dette antistof blev vi, de studerende, dog gjort opmærksom på af DS, at denne var meget vanskelig at konkludere på, og at der som regel ikke bliver lagt al for stor vægt på resultaterne i forbindelse med ER. Grunden til at antistoffet ikke er blevet ekskluderet fra AKP, skyldes at hvis der er tvivl om subtypen EA eller SAC, kan antistoffet være med til at give indikationer om EA, hvis der er tale om en positiv reaktion i vævet. For det nye antistof TFF3 var den samlede kappa koefficient på 0,80, hvilket er mere end godkendt. Scoregivning for dette antistof var (+), hvis der var tale om den mindste synlige positive reaktion i vævet. Ifølge Mhawech-Fauceglia et.al[23] så vil antistoffet primært blive anvendt til type-i, og det er derfor værd at overveje om antistoffet skal scores som antistofferne P16 og HNF1β, hvor scoren (+) gives ved en diffus og intens reaktion. Grunden til at dette skal overvejes skyldes resultaterne i figur 29, hvor det er tydeligt at se at næsten alle EA1 og EA2, har en diffus og intens positiv reaktion. Uenighederne blandt DS og observatørerne skete ved scoregivning af SAC og CCC grundet uoverenstemmelser, om hvor mange af cellerne der skulle være positive før (+) kunne gives. Dette problem vil muligvis kunne løses ved at ændre TFF3 til, at skulle scores som P16 og HNF1β. Hvis denne ændring i scoreangivningen implementeres på AKP vil det være med til at højne antistoffets sensitivitet og specificitet, da den vil blive mere specifik for type-i cancerne, da Side 66 af 105

67 en positiv score vil gives ved en diffus og intens reaktion. For patologen vil dette forbedre svarafgivelsen da der ikke længere skal mikroskoperes efter små fokale områder, og vurdere om der er >5% af cellerne, som er positive. Generelt så var der mest uenighed om patient SAC(3). På et møde som vi studerende havde med DS og overlæge på AKP Iben Johnsen(IJ) efter mikroskoperingen, så blev det nævnt at der var store overvejelser om den var fejldiagnosticeret, da den havde tegn på både CCC og SAC samtidig. Derfor kunne det overvejes at der var tale om et helt nyt udtryk, hybrid tumor. Ifølge DS og IJ så betyder dette begreb at tumoren ser ud på én måde histologisk men en anden immunhistokemisk. Implementering For at TMA-blokken kan indføres med det formål at kunne implementere nye antistoffer på AKP, er der fortsat nogle enkelte ting, der skal ændres før blokken kan valideres som gyldig at indføre på afdelingen. Først og fremmest drejer dette sig om reliabilitet. Som det kan læses i afsnittet TMAblok, så er der ingen faste tider på hvor længe f.eks at TMA-blokken skal lægge i varmeskuffen, men her bliver der lagt vægt på hvordan den føles i stedet. På en professionel arbejdsplads hvor alle er forskellige, skal ting ikke afhænge af fornemmelser, men af konkrete tider. En fejl på dette vigtige tidspunkt kan resultere i at snittene falder ud under skæring på mikrotom, og at det hele skal tages om, eller i værste fald går tabt. Et andet fokuspunkt der er fremkommet under resultatbehandlingen, er antallet af anvendte patienter i TMA-blokken. Da dette kun er et bachelorprojekt, og der var sparsomt med tid til rådighed, støbeformens størrelse samt at der ikke findes ret mange der har SAC og CCC subtyperne, blev det besluttet kun at anvende 20 patienter. Hvis AKP i fremtiden ønsker at anvende TMA-blokke til implementering af nye antistoffer, er det nødvendigt at overveje patientvariationen angående disse nye antistoffer. I projektet blev der blot anvendt fire patienter pr. subtype, og et større tal er nødvendigt for at gøre det muligt at se hvordan patienter varierer forskelligt på de enkelte antistoffer se afsnittet perspektivering. I den nuværende TMA-blok er snittene blot på 4mm, grundet pladsmangel, og det kan derfor desuden overvejes at anvende en lidt større støbeform, således at der kan fremstilles en TMA-blok med snit på 5mm. Grunden til at denne ændring skal overvejes, skyldes at der ved en TMA-blok, kun er tale om nøglehulskiggeri. Dette begreb skal forstås på den måde at når der mikroskoperes, så kigges der på områder der repræsenterer en meget lille procentdel, af den samlede patientparaffinblok. Dette stiller store krav til f.eks DS at afmærke det helt korrekte område på det tilhørende HE-snit, samt at bioanalytikeren der står for udstansningen, udfører dette med stor nøjagtighed. Er dette ikke tilfældet, er der risiko Side 67 af 105

68 for at der udstanses et område der ikke repræsenterer den pågældende subtypetumor, og dette kan resultere i at lægerne bliver misinformeret om, hvordan de enkelte subtyper reagerer på de nye antistoffer, der ønskes implementeret. For at TMA-blokken yderligere kan blive valideret, er det nødvendigt for AKP at fremstille et regelsæt, der repræsenterer hvordan de enkelte antistoffer skal mikroskoperes, med henblik på hvornår der er tale om en positiv eller negativ reaktion. Dette regelsæt vil samtidig være med til at forhøje reliabiliteten. Ifølge teoriundervisning fra DS[7] så skal HNF1β vurderes ved at er der den mindste positive reaktion, så er der tale om en positiv score. På AKP er der dog vedtaget egne mere specifikke regler, og at de gennem erfaring har lært at antistoffet fremstår moderat/diffus intens i CCC, og kan derfor anvendes til denne subtype. Dette står dog ikke skrevet ned i nogen protokol, men er noget der bliver undervist i internt. Det at der ikke er nogen protokol gav de studerende problemer i forbindelse med observationerne i tabel 7-15 i forhold til DS. Til teoriundervisningen blev det fortalt at scoren (+) skulle gives, ved f.eks TFF3, hvis bare der var den mindste reaktion til stede i vævet. Dette blev dog misforstået og denne mindste reaktion betød at, der skulle være tale om en positiv reaktion i >5% af cellerne. Enkelte af kappa koefficienterne kunne dermed have været endnu højere, hvis der blev fremstillet det omtalte regelsæt. Side 68 af 105

69 Konklusion På baggrund af resultaterne så viser kappa koefficienterne, at en uddannet læge og fire bioanalytikerstuderende var i stand til at anvende TMA-blokken, med henblik på at kunne scoreangive ni forskellige antistoffer på 20 forskellige patienter med fem forskellige subtyper af EC uden de store afvigelser. Patientvariationen er dog problematisk i TMA-blokken da fire patienter for hver subtype, ikke er tilstrækkeligt til at kunne implementere nye antistoffer på AKP. TMAblokken kan derfor på nuværende tidspunkt ikke anvendes til at forbedre subtypebestemmelsen af patienter med EC, da den ikke er i stand til at give et grundigt overblik over hvordan den enkelte patient reagerer, er patientens antigen tændt eller slukket, på nye antistoffer. Den fremstillede TMA-blok er dog umiddelbart det bedste redskab AKP får til rådighed på nuværende tidspunkt, da det vil være meget tidskrævende at fremsøge og undersøge flere patienter til en evt. ny og større TMA-blok. Ud fra ovenstående kan den fremstillede TMA-blok anvendes til pilotforsøg, der kan være med til at give indikationer om, hvordan et nyt antistof vil se ud på de forskellige subtyper, men blokken kan ikke anvendes til implementering, da den er for lille og der ikke på nuværende tidspunkt, er tilstrækkelig reliabilitet og udførlige protokoller i hvordan blokken fremstilles. Med henblik på fremtidig diagnostik er en TMA-blok dog et brugbart redskab, da det er muligt at samle patienter i én blok, og dermed få overblik hvordan patienter vil reagere på nye antistoffer Perspektivering For at en TMA-blok kan anvendes til implementering af nye antistoffer, er det værd at overveje om vi studerende skulle have, hvis der ikke var et tidspres, øget antallet af patienter til f.eks 25, hvis der var plads, for hver af subtyperne. Dette ville have været med til at give et meget bedre overblik over hvordan de enkelte patienter reagerede på antistofferne og samtidig se patientvariationen endnu bedre. En samlet TMA-blok med 125 patienter er dog på nuværende tidspunkt ikke muligt at fremstille. I stedet kunne vi have fremstillet fem forskellige TMA-blokke, én for hver subtype, og på den måde inkludere 100 patienter, med 20 patienter i hver blok. Dette ville have højnet troværdigheden bag vores resultater, da det ville inkludere en meget større patientgruppe. Desuden burde alle patienternes tumor helst have været homogen og ikke indeholdt blandingstumorer. Det at finde 20 Side 69 af 105

70 homogene patienter med f.eks den sjældne subtype CCC ville være vanskeligt, og en TMA-blok af denne størrelsesorden ville tage højde for ikke kun patientvariationen men også heterogenisiteten. Et yderligere aspekt der kunne have været interessant at inkludere, var at observatørerne mikroskoperede de samme snit igen, blot et stykke tid senere, f.eks seks måneder efter en fastansættelse på AKP. Erfaring kommer med tiden og på det tidspunkt hvor udarbejdelsen af resultaterne skete, var vi studerende. Det interessante ville være om kappakoefficienterne, ville have forbedret sig, som der ville forventes, således at der var en endnu større overensstemmelse mellem scoreangivningerne. På det tidspunkt hvor de nye observationer ville finde sted, kunne det også være at, der var forsket yderligere omkring antistoffet TFF3, således at der ville være et bedre overblik over dets forventede reaktioner i de forskellige subtyper. Side 70 af 105

71 Litteraturliste 1. Mescher, A. 2010, Junqueira s Basic histology, 12th edition. Mcgraw hill, s Plataniotis G & Castglione M. 2010, Endometrial cancer: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up, Annals of Oncology Dansk gynækologisk cancer gruppe, Landsdækkende klinisk database for kræft i æggestokke, livmoder og livmoderhals. årsrapport 2012, s Johnsen I. Teoriundervisning, fortalt generelt om operationsprocedurer samt, FIGO-stadier og komplikationer ved operationerne 5. Endnu ikke udgivet bog fra Schledermann, D. 2014, DGCG guidelines. Kapitel 7- patologisk anatomisk procedure. 6. Dansk gynækologisk cancer gruppe, Retningslinier for visitation, diagnostik, behandling og kontrol af cancer corporis uteri. Version 2: 12.08,.2009, s.6 7. Schledermann D. Teoriundervisning, fortalt om udseende af subtyperne samt brugen af de udvalgte antistoffer 8. FIGO committee on gynecologic oncology. 2014, FIGO staging for carcinoma of the vulva, cervix, and corpus uteri International journal of gynecology and obstetrics, vol. 125, s Indlægsseddel fra Biocare Cytokeratin 7: Concentrated and prediluted monoclonal antibody. PDF lokaliseret 6/11, 2014 på biocare.net/wp-content/uploads/061.pdf 10. Ventana. 2014, Confirm anti-cytokeratin 7 (SP52) Rabbit monoclonal primary antibody, Ventana. Lokaliseret 6/11, 2014 på Dabbs, J. 2014, Diagnostic immunohistochemistry, 4th edition. Elsevier Sanders, s Dako. 2014, Monoclonal mouse anti-vimentin clone V9, Dako. Lokaliseret 6/11, 2014 på Indlægsseddel fra Biocare Estrogen receptor (ER) [SP1]. PDF lokaliseret 6/11,2014 på biocare.net/wp-content/uploads/301.pdf 14. Ventana. 2014, Confirm anti-estrogen receptor (ER) (SP1) rabbit monoclonal primary antibody, Ventana. Lokaliseret 6/11, 2014 på Dako. 2014, Monoclonal mouse anti-human p53 protein clone DO-7, Dako. PDF Lokaliseret 6/ på Side 71 af 105

72 16. NordiQC. 2009, P16, Nordic immunohistochemical quality control. Lokaliseret 6/11, 2014 på Cellmarque. 2014, PAX-8(polyclonal), Cellmarque. Lokaliseret 6/11, 2014 på Visabl. 2014, Napsin A clone IP64, Visabl. Lokaliseret 6/11, 2014 på Indlægsseddel fra Novacastra Liquid mouse monoclonal antibody napsin a. PDF lokaliseret 6/11, 2014 på atasheets/napsina-l.pdf 20. The human protein atlas. 2014, HNF1β, The human protein atlas. Lokaliseret 6/11, 2014 på Fadare, O et al. 2013, Frequent expression of napsin a in clear cell carcinoma of the endometrium, American Journal of Surgical Pathology vol. 00, nr Abnova datasheet TFF3 monoclonal antibody (MO1) clone 3D9. PDF lokaliseret 6/11,2014 på Mhawech-Fauceglia, P et al. 2013, ER+/PR+/TFF3+/IMP3- immunoprofile distinguishes endometrioid from serous and clear cell carcinomas of the endometrium: a study of 401 cases. Histopathology 2013, 62 s Hallager K, Jelsbak V & Meyer,T. 2013, Farvning af celler og væv, 3.Udg. VIA University College Bioanalytikeruddannelsen, s Nielsen, O &Vyberg, M. 2005, Immunhistokemisk teknik, PDF Lokaliseret 8/11, 2014 på Ventana. 2011, Optiview Detection chemistry, PDF lokaliseret 8/11, 2014 på Udleveret videoklip fra Nielsen, O Optiview DAB IHC detection and amplification kits 28. Statnoter. 2014, Cohens kappa-koefficient, Statnoter. Lokaliseret 7/11, 2014 på Randolph, J. 2008, Online Kappa Calculator, Justrandolph. Lokaliseret 7/11,2014 på Han, G et al. 2013, Reproducibility of histological cell type in high-grade endometrial carcinoma. Modern pathology vol. 26, s Side 72 af 105

73 Bilag 1: Overblik over kontrolglas K2 Side 73 af 105

74 Bilag 2: Overblik over kontrolglas K5 Side 74 af 105

75 Bilag 3: Overblik over kontrolglas K8 Side 75 af 105

76 Bilag 4: Oversigt over opstilling af reagenser i HE-farvemaskinen Tissue Tek Prisma Farvemaskine: Carazzi Carazzi 96% ethanol Vand Vand Vand Vand Dry NH3 Eosin Dry 99% ethanol 99% ethanol 96% ethanol 99% ethanol 99% ethanol Histoclear Histoclear E 1 99% ethanol E 2 99% ethanol PE S 3 S 2 S 1 2 stk. Histoclear: 680 ml (10, separat affaldsdunk, ikke metaldunk) 2 stk. 96 % ethanol. a 680 ml 6 stk. 99 % ethanol a 680 ml inkl. E 1 og E 2. 2 stk. Hæmatoxalin Carazzi a 680 ml (Affaldsdunk 2) 1 stk. Eosin arbejdsopløsning: (Affaldsdunk 4) 340 ml dest. vand 340 ml Eosinopløsning blandet 2,1% 200 µl konc. Eddikesyre 100% t.a. 1 stk. NH3-vand arbejdsopløsning: (vask) 680 ml postevand 1,25 ml konc. ammoniakopløsning massefylde 0,9354 Side 76 af 105

77 Bilag 5: Immunprotokol for antistoffet CK7 Side 77 af 105

78 Side 78 af 105

79 Side 79 af 105

80 Bilag 6: Immunprotokol for antistoffet VIM Side 80 af 105

81 Side 81 af 105

82 Side 82 af 105

83 Bilag 7: Immunprotokol for antistoffet ER Side 83 af 105

84 Side 84 af 105

85 Side 85 af 105

86 Bilag 8: Immunprotokol for antistoffet P53 Side 86 af 105

87 Side 87 af 105

88 Side 88 af 105

89 Bilag 9: Immunprotokol for antistoffet P16 Side 89 af 105

90 Side 90 af 105

91 Side 91 af 105

92 Bilag 10: Immunprotokol for antistoffet PAX8 Side 92 af 105

93 Side 93 af 105

94 Side 94 af 105

95 Bilag 11: Immunprotokol for antistoffet NAPSA Side 95 af 105

96 Side 96 af 105

97 Side 97 af 105