PNA ISH Detection Kit Kodenr. K5201

Transkript

1 PNA ISH Detection Kit Kodenr. K udgave Til in situ hybridisering ved brug af fluoresceinkonjugerede PNA-prober. Sættet indeholder reagenser til mindst 40 tests*. * Antallet af tests er baseret på anvendelse af 25 µl prober og 150 µl andre reagenser pr. objektglas. ( ) P04101EFG_01_K / s. 1/8

2 Indholdsfortegnelse Side Tilsigtet anvendelse... 2 Procedurens princip... 2 Reagenser A. Leverede materialer... 3 B. Krævede materialer som ikke medleveres... 4 C. Forberedelse af reagenser... 4 Forholdsregler... 4 Opbevaring... 5 En-dags in situ hybridiseringsprocedure til RNA detektion ved brug af PNAprober Rehydrering... 7 Forbehandling... 7 Hybridisering... 7 Stringent vask... 7 Detektion... 7 Kontrastfarvning og montering... 7 Proceduremæssige bemærkninger... 8 Tilsigtet anvendelse Anvendes til in vitro diagnostik. PNA ISH Detection Kit er beregnet til detektion af fluoresceinkonjungerede peptidnukleinsyre (PNA) -prober, der er hybridiserede til deres mål-rna i celle- og vævspræparater. Procedurens princip Dette sæt forsyner brugeren med alle nødvendige reagenser til udførelse af en in situ hybridisering til detektion af cellulært RNA, med undtagelse af den specifikke fluoresceinkonjugerede PNA-probe. På en vævsprøve eller celleudstrygning (leveret af brugeren) bliver en fluoresceinkonjugeret peptidnukleinsyre (PNA) -probe hybridiseret til sit RNA-mål i henhold til proceduren, som angives nedenfor. Hybridiseringen efterfølges af en post-hybridiseringsvask med en stringent vaskeopløsning ved 55 C i 25 minutter. Derefter tilføjes Alkaline Phosphatase-Conjugated Rabbit F(ab ) Anti-FITC, og prøven inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter efterfulgt af en vask. Brugen af antistof-fragmentet F(ab ) sikrer at ikke-specifikke bindinger til prøven holdes på et minimum. Substrat (enzymsubstrat, BCIP/NBT) tilføjes, og prøven inkuberes ved stuetemperatur i minutter efterfulgt af en vask. En let kontrastfarvning med hæmatoxylin er en valgmulighed. Til slut monteres prøven. Positiv farvning kan ses under mikroskop som en mørk, blåsort farve ved hybridiseringsstedet. ( ) P04101EFG_01_K / s. 2/8

3 Reagenser A. Leverede materialer Flaske 1 (2 ml) Flaske 2 (0,5 ml) Flaske 3 (0,5 ml) Flaske 4 (25 ml) Flaske 5 (6 ml) Flaske 6 (6 ml) Proteinase K (x 10) 10 x koncentreret proteinase K i 50 mmol/l Tris/HCl, 15 mmol/l natriumazid, ph 7,5. Da Proteinase K er selvnedbrydende, er det meget vigtigt, at flaske 1 opbevares ved 2-8 C. Negative Control PNA Probe/FITC (klar til brug) Tilfældigt valgte fluoresceinkonjugerede PNA-prober i hybridiseringsopløsning. Indeholder 30% formamid. Positive Control PNA Probe/FITC (klar til brug) Fluoresceinkonkugeret PNA-probe, rettet mod glyceraldehyd 3- phosphat dehydrogenase i hybridiseringsopløsning. Indeholder 30% formamid. Stringent Wash Solution (x 60) 60 x koncentreret stringent vaskeopløsning. Anti-FITC/AP (klar til brug) Alkalisk phosphatasekonjungeret antistof til fluorescein (affinitetsisoleret kanin F(ab )). I 50 mmol/l Tris-buffer, 5 mmol/l MgCl 2, 0,25 mmol/l ZnCl 2, 3% BSA, stabilisator, konserveringsmiddel, ph 7,5. Substrat (klar til brug) 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP) og nitroblåt tetrazolium (NBT). I 100 mmol/l Tris, 100 mmol/l NaCl, 50 mmol/l MgCl 2, konserveringsmiddel, ph 9,0. Indeholder 1,7% N,N-dimethylformamid. TBS (Tris-bufferjusteret saltvandsopløsning, ph 7,5) 3 foliepakker, hver til 1 L buffer, ph 7,5. Hver pakke indeholder Tris-Base 1,4 g ± 4%, Tris/HCl 6,0 g ± 4%. 8,75 g NaCl ± 4%. Opløs indholdet af hver foliepakke i 1 L rent vand. B. Krævede materialer som ikke medleveres 1. Almindeligt laboratorieudstyr til histologiske procedurer. 2. Udstyr og specifik fluoresceinkonjugeret PNA-probe til hybridiseringstrinnet. 3. Vandbad justeret til 55 C. Rystemulighed er påkrævet til stringent vask. 4. Dako silanerede objektglas, kodenr. S Dako pen, kodenr. S2002 (ekstraudstyr). ( ) P04101EFG_01_K / s. 3/8

4 6. Rent vand (f.eks. Milli-Q vand eller destilleret vand). 7. Monteringsmedium, Dako Faramount, kodenr. S3025 eller Dako Glycergel, kodenr. C0563. C. Forberedelse af reagenser TBS Buffer Opløs indholdet af en TBS foliepakke i 1 L rent vand. Stringent Wash Solution (brugsopløsning) Fortynd den krævede mængde Stringent Wash Solution, flaske 4, 60 gange i rent vand, og opvarm den til 55 C i et vandbad. Proteinase K (brugsopløsning) Lige inden brug fortyndes den krævede mængde Proteinase K, flaske 1, 1:10 i TBS. Straks efter brug skal flaske 1 sættes tilbage på køl ved 2-8 C. (Se proceduremæssige bemærkninger, 3). Forholdsregler 1. Anvendes af professionelle brugere. 2. Flaske 2 og 3, de positive og negative kontrol PNA-prober, indeholder 25-<50% formamid og 1-<3% Natriumchlorid. Flaske 2 og 3 er mærket: Farlig H319 H360 P201 P202 P281 P280 P264 P308 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 P405 P501 Forårsager alvorlig øjenirritation. Kan skade det ufødte barn. Indhent særlige anvisninger før brug. Anvend ikke produktet, før alle advarsler er læst og forstået. Anvend de påkrævede personlige værnemidler. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Brug særligt arbejdstøj. Vask hænderne grundigt efter brug. VED eksponering eller mistanke om eksponering: Søg lægehjælp. VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. Ved vedvarende øjenirritation: Søg lægehjælp. Opbevares under lås. Indholdet og beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regler. 3. Flaske 6, substratet, indeholder 1-<3% N,N-dimethylformamid og 1-<3% trometamol. Flaske 6 er mærket: H360 H373 P201 P202 P280 Farlig Kan skade det ufødte barn. Kan forårsage organskader ved længerevarende eller gentagen eksponering. Indhent særlige anvisninger før brug. Anvend ikke produktet, før alle advarsler er læst og forstået. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne ( ) P04101EFG_01_K / s. 4/8

5 P260 P314 P308 + P313 P405 P501 og ansigt. Brug særligt arbejdstøj. Indånd ikke damp. Søg lægehjælp ved ubehag. VED eksponering eller mistanke om eksponering: Søg lægehjælp. Opbevares under lås. Indholdet og beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regler. 4. Foliepakkerne med TBS (Tris-bufferjusteret saltvandsopløsning, ph 7,5) indeholder 25- <50% trometamol og 25-<50% 2-amino-2-(hydroxymethyl)propan-1,3-diol hydroklorid. Foliepakkerne er mærket: H319 H315 H335 P280 Advarsel P271 P261 P264 P304 + P340 + P312 P302 + P352 + P P363 P337 + P313 P405 P501 Forårsager alvorlig øjenirritation. Forårsager hudirritation. Kan forårsage irritation af luftvejene. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Brug særligt arbejdstøj. Brug kun udendørs eller i et rum med god udluftning. Undgå indånding af damp. Vask hænderne grundigt efter brug. VED INDÅNDING: Flyt personen til et sted med frisk luft og sørg for, at vedkommende hviler i en stilling, som letter vejrtrækningen. I tilfælde af ubehag, ring til en GIFTINFORMATION eller en læge. VED KONTAKT MED HUDEN: Vask forsigtigt med rigeligt sæbe og vand. Alt tilsmudset tøj tages af. Tilsmudset tøj skal vaskes, før det kan anvendes igen. Ved vedvarende øjenirritation: Søg lægehjælp. Opbevares under lås. Indholdet og beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regler. 5. Flaske 4, stringent vaskeopløsning, indeholder 3,6% trometamol. Ved de givne koncentrationer kræver trometamol ikke risikomærkning. Professionelle brugere kan få et sikkerhedsdatablad (SDS) efter anmodning. 6. Flaske 1 og 5, Proteinase K og Anti-FITC/AP, indeholder natriumazid som konserveringsmiddel. Natriumazid (NaN 3 ) er et kemikalie, som er meget giftigt i ren form. Selvom koncentrationen i produktet ikke er klassificeret som farlig, kan natriumazid reagere med bly og kobber og danne meget eksplosive ophobninger af metalazider. Ved bortskaffelse skylles med rigelige mængder vand for at hindre ophobning af metalazid i afløb. 7. Flaske 5, Anti-FITC/AP, indeholder materiale af animalsk oprindelse. Som med alle produkter afledt ud fra biologiske kilder bør der iagttages korrekte håndteringsprocedurer. Opbevaring Sættets reagenser skal opbevares ved 2-8 C. Flaske 2 og 3 skal opbevares mørkt. Må ikke anvendes efter udløbsdatoen, der er trykt på flasken. Hvis reagenserne opbevares under andre betingelser end de specificerede, skal disse betingelser verificeres af brugeren. Der er ingen synlige tegn på, at produktet kan være ustabilt. Der bør derfor udføres positive og negative kontroller samtidigt med patientprøver. Kontakt vores tekniske service, hvis der observeres uventet farvning, som ikke kan forklares med variationer i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et problem med produktet. ( ) P04101EFG_01_K / s. 5/8

6 Da Proteinase K er selvnedbrydende, er det meget vigtigt at flaske 1 opbevares ved 2-8 C, samt at udsættelse for stuetemperatur minimeres. En-dags in situ hybridiseringsprocedure til RNA-detektion ved brug af PNA-prober Proceduren er udviklet med henblik på formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. De reagenser, der ligger i dette sæt, samt hybridiserings- og vaskebetingelserne, er blevet justeret til at give optimale resultater når der anvendes Dako fluoresceinkonjungerede PNAprober. En positiv vævskontrol bør køres samtidig med prøver. BEMÆRK: Al inkubation foregår ved stuetemperatur, med mindre andet er angivet. ( ) P04101EFG_01_K / s. 6/8

7 Rehydrering Forbehandling Hybridisering Stringent vask Detektion Dyp objektglas med vævssnit i xylen Dyp i 99% ethanol Dyp i 96% ethanol Dyp i rent vand Glasset skal være RNase-fri (se proceduremæssige bemærkninger, 1) Afmærk prøverne med Dako Pen, kodenr. S2002 Dyp i rent vand Anbring objektglassene i et fugtighedskammer (brug rene handsker) Lige inden brug fortyndes den krævede mængde Proteinase K, flaske 1, 1:10 i TBS, f.eks. ved at bruge 11 dråber fra flaske 1 (eller 500 µl) i 4,5 ml TBS (se proceduremæssige bemærkninger, 2) Tilsæt 150 µl fortyndet Proteinase K til hver sektion (se proceduremæssige bemærkninger, 3). Straks efter brug skal flaske 1 sættes tilbage til 2-8 C. Inkubering Dyp objektglassene i rent vand Dyp objektglassene i 96% ethanol Lad objektglassene lufttørre Tilsæt 1-2 dråber fluoresceinkonjungeret PNA-probe til vævssnittet. På separate snit tilsættes kontrolprober, flaske 2 og 3 Dæk snittene med dækglas Anbring objektglassene i et fugtighedskammer (for at undgå udtørring af snitteneektionerne) Anbring fugtighedskammeret i en inkubator (se proceduremæssige bemærkninger, 4) Forvarm den stringente brugsvaskeopløsning (flaske 4 fortyndet 1:60) til 55 C i et vandbad Fjern dækglassene Dyp objektglassene i den forvarmede stringente brugsvaskeopløsning Justér objektglassene til stuetemperatur ved en kortvarig neddypning i TBS Anbring objektglassene i et fugtighedskammer 2 x 5 min 3 min min ~ 10 s ~ 5 min 1½ time ved 55 C 25 min ved 55 C under rystning 10 s Kontrastfarvning og montering Tilsæt 2-3 dråber Anti-FITC/AP, flaske 5, til hvert snit Inkubering Fjern antistoffet Dyp objektglassene i TBS Dyp objektglassene i rent vand Anbring objektglassene i et fugtighedskammer Tilsæt 2-5 dråber Substrat, flaske 6, til hvert snit (se proceduremæssige bemærkninger, 5) Inkubering Fjern substratet Dyp objektglassene i postevand Kontrastfarv med hæmatoxylin hvis ønskeligt Monteres i Dako Faramount, kodenr. S3025 eller Glycergel, kodenr. C min 2 x 1 min min 5 min 5-10 s ( ) P04101EFG_01_K / s. 7/8

8 Proceduremæssige bemærkninger 1. Fra dette punkt i proceduren og indtil hybridiseringen er udført, er det vigtigt at undgå kontaminering af snittene med RNaser, og objektglassene bør kun berøres med rene, engangshandsker. Glasemner kan gøres RNase-fri gennem inkubering over natten ved 200 C. Andre metoder til inaktivering af RNase i o pløsninger er beskrevet i Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (se også under Forholdsregler). 2. Opløs indholdet af en TBS-foliepakke i 1 L rent vand (RNase-frit). 3. Da Proteinase K er selvnedbrydende, er det meget vigtigt at flaske 1 opbevares ved 2-8 C, samt at udsættelse for stuetemperatur minim eres. Optimal proteolytisk nedbrydning kan variere mellem forskellige vævsblokke. Til frosne snit og cytospins bør Proteinase K fortyndes mere end 1:10; som en rettesnor fortyndes 1:100-1:1000, afhængigt af fikseringen. 4. Vi mener at en inkubationstid på 1½ time giver optimal sensitivitet, men tilfredsstillende resultater kan opnås ved at formindske inkubationstiden til minutter, afhængigt af den tilstedeværende målmængde i prøven. 5. Vi mener, at Substrat (BCIP/NBT) som er inkluderet i PNA ISH Detection Kit, giver den højeste sensitivitet, men også Dako New Fuchsin (kodenr. K0625) giver meget tilfredsstillende resultater. 6. Ryst ikke flaske 6 inden brug. Substratet kan undertiden danne et bundfald som kan påvirke farvningsresultaterne hvis opløsningen rystes. Produceret af: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Tlf.: Fax: Symbolforklaringer Katalognummer Temperaturbegrænsning Lotnummer Producen t Medicin sk p rodu kt til in vitro diagnostik Holdes væk fra dir ekte sollys (se und er opbeva ring) Tilsæt va nd GHS-fa repiktogram (se afsnittet om forho ldsre gler) Se brugsanvisningen Indeh older tilstrækkeligt materia le til <n> tests An vendes sene st GHS-fa repiktogram (se afsnittet om forho ldsre gler) ( ) P04101EFG_01_K / s. 8/8