(19) DANMARK (11) DK B1 ( 1 2) PATENTSKRIFT. Patent- og Varemærkestyrelsen

Transkript

1 (19) DANMARK (11) DK B1 ( 1 2) PATENTSKRIFT Patent- og Varemærkestyrelsen (51) Int.C1 7.: A 61 K 39/295 A 61 K 39/205 A 61 K 39/285 A 61 K 39/42 C 12 N 15/00 (21) Patentansøgning nr: PA (22) Indleveringsdag: (24) Løbedag: (41) Alm. tilgængelig: (45) Patentets meddelelse bkg. den: (86) International ansøgning nr: PCT/FR85/00096 (86) International indleveringsdag: (85) Videreførelsesdag: (30) Prioritet: FR (73) Patenthaver: TRANSGENE S.A., 95, rue Saint-Lazare, Paris, Frankrig (72) Opfinder: Richard Lathe, Rue des Bouvreils, Strasbourg, Frankrig Marie-Paule Kieny, 11, Rue de Gascogne, Strasbourg, Frankrig Robert Drillien, 10 Boulevard Paul Deroulede, Strasbourg, Frankrig Jean-Pierre Lecocq, 6, rue du Champ du Feu, Reichstett, Frankrig (74) Fuldmægtig: Plougmann & Vingtoft A/S, Sundkrogsgade 9, 2100 København Ø, Danmark (54) Benævnelse: Vaccine mod rabies samt fremgangsmåde til fremstilling deraf (56) Fremdragne publikationer: Ingen (57) Sammendrag: Et vacciniavirus indeholder hele eller en del af en DNA-sekvens I, som koder for et antigen-glycoprotein for rabies. Viruset kan anvendes til rabiesvaccine. A Pst (Pst Aha III Aha til

2 1 Rabies er en meget gammel sygdom, men den fulds tændige bekæmpelse deraf har indtil nu ikke kunnet gennemføres. Selv om der findes effektive vacciner mod rabies, er sådanne vacciner for kostbare til at kunne anvendes som forebyggende middel. Desuden er rabiesvirus meget udbredt hos vilde dyr, og derfor har kun 5 øriger såsom Storbritannien og Japan kunnet opnå udryddelse af denne sygdom. Det stof, som forårsager denne sygdom, er et Rhabdovirus. Overførsel af rabies omfatter sædvanligvis, at et modtagerindivid bides af et inficeret dyr; den ændring i adfærd, som er forbundet med kronisk infektion, spiller en stor rolle i 10 sygdommens etiologi. Hos mennesker følges infektionen af en latensperiode, hvor viruset vandrer gennem nervesystemet op til hjernen. I begyndelsen kan denne sygdom behandles effektivt ved intensiv vaccination; når der opstår adfærdsmæssige symptomer, 15 er døden imidlertid næsten uundgåelig. Viruset omfatter 5 virusproteiner, hvoraf kun et, glycoproteinet (G, hæmagglutinin), trænger igennem det lipide dobbeltlag, som omslutter viruset. Således er glycoproteinet den eneste virusbestanddel, som er i stand til at reagere med 20 antistoffer, som neutraliserer viruset, og ligeledes at fremkalde dannelse deraf. 25 Anilionis et al. (1981) har beskrevet isolering af en kodende sekvens, som svarer til mrna for rabies-glycoproteinet, stamme ERA, og Lathe et al. (1984) har beskrevet ekspressionen af denne sekvens i en bakterie. Lignende resultater er beskrevet af Yelverton et al. (1983), idet der blev anvendt en anden rabiesstamme, CVS. Der er imidlertid endnu ikke blevet opnået en effektiv immunisering mod rabies- 30 virus under anvendelse af det materiale, der er syntetiseret af bakterier. 35 Foreløbige resultater antyder, at modifikationer efter translationen og/eller glycoproteinets præsentation er vigtige parametre ved anvendelsen af dette antigen, for at det giver beskyttelse mod rabiesvirus.

3 2 Den foreliggende opfindelse beskriver ekspressionen af en sekvens, som koder for rabies-glycoproteinet G i et miljø, således at en korrekt modifikation og præsentation af produkterne fra den primære translation kan foreligge. 5 To grupper har for nylig påvist anvendelsen af levende rekombinanter af vacciniavirus til ekspression af antigenet for influenza eller hepatitis B og immunisering mod disse sygdomme (Smith et al., 1983 og Panicali et al., 1983). Ekspression af en sekvens, som koder for et exogent protein i vacciniavirus (VV), 10 omfatter nødvendigvis to trin: 1) Den kodende sekvens skal være i læseramme med en promotor for W og indsættes i et ikke-essentielt DNA-segment fra VV klonet i et hensigtsmæssigt bakterieplasmid; 15 2) DNA-sekvenserne fra VV, som findes på begge sider, skal muliggøre homologe rekombinationer in vivo mellem plasmidet og virusgenomet. En dobbelt reciprok rekombination fører til en overførsel af DNA-indsætningen fra plasmidet til virusgenomet, i hvilket den formeres og udtrykkes (Panicali og Paoletti, 1982; Mackett et al., 1982; Smith et al., 1983; Panicali et al., ). Den foreliggende opfindelse angår et vacciniavirus, som er ejendommeligt ved, at det omfatter hele eller en del af en DNA-sekvens, som koder for et antigen-glycoprotein for rabies, i det følgende betegnet DNA-sekvens (I). Udtrykket "vacciniavirus" betegner hele eller en del af et virus af arten Poxvirus, især af underarten vaccinia, som foruden selve vaccinia omfatter andre vira såsom "Cowpox". 30 Udtrykket "antigen-glycoprotein for rabies" betegner et glycoprotein, som in vitro, men fortrinsvis in vivo, har immunogene karakteristika, som er identiske eller beslægtede med glycoproteinet for naturlig rabies, dvs. for vild virus. Selv om det til DNA-sekvensen I foretrækkes at anvende den DNA- sekvens; som 35 koder for det komplette modne protein, er det muligt kun at anvende en del af

4 3 denne DNA-sekvens eller en sådan sekvens med punktmutationer, men som fører til produkter med næsten identisk aktivitet. Dette virus omfatter fortrinsvis alle de segmenter, der sikrer ekspression af ovennævnte glycoprotein, især en promotor for et vacciniagen såsom promotoren for genet 7,5K med betegnelsen P7,5K, som 5 befinder sig oven for DNA-sekvensen I. Denne promotor/dna-sekvens I-enhed indsættes i et gen for vacciniavirus, fx genet TK, hvilket giver en mulighed for selektion, hvilket beskrives nedenfor. 10 Det således vundne hybridvirus kan anvendes som sådan, levende eller inaktiveret ved kemisk eller fysisk behandling, som vaccinemiddel eller kan anvendes til at inficere en cellekultur, hvorfra man ved kendte teknikker kan ekstrahere antigen-glycoproteinet ud fra de sprængte celler. 15 For at reducere risikoen for uheld ved vaccinationer med et levende virus mest muligt kan man også påtænke at anvende en varmefølsom mutant af vaccinia (F. Keller et al., 1978, og F. Keller og R. Drillien, 1980). Desuden kan denne type temutation findes på selve vacciniavektoren eller indføres ved mutation i de rekombinante vira ifølge opfindelsen. Især kan man i det rekombinante virus indføre 20 forskellige varmeførsomheder for at bibeholde fænotypen, selv i tilfælde af delvis tilbagefald. Desuden kan man påtænke anvendelsen af et virus, der er en mutant af vaccinia og har en værtsspecificitet, som ikke vokser eller kun vokser lidt på humane cel- 25 ler, og hvis patogenicitet er endnu svagere end vaccinias. Den foreliggende opfindelse angår vacciner beregnet til behandling eller forebyggelse af rabies, hvilke vacciner er ejendommelige ved, at de består af et rekombinant vacciniavirus, som omfatter en DNA-sekvens, der koder for 30 glycoprotein G fra rabiesvirus. Til disse vacciner kan administrationsvejene varieres, og især kan der anvendes intradermal eller oral administration. Vaccinerne kan administreres med kendte farmaceutiske bærere og desuden indeholde adjuvanser, som gør det muligt at 35 forøge deres vaccinestyrke.

5 Nedenstående eksempler tjener til at belyse andre karakteristika og fordele ved den foreliggende opfindelse. 5 Fremstillingen af viruset ifølge opfindelsen omfatter især følgende trin: 1) restrukturering af en ende af cdna for rabies, vist i fig. 1, ved den i fig. 2 viste fremgangsmåde, til dannelse af ptg155, 2) mutation af en af sekvenserne fra dette cdna for i glycoproteinet at 10 retablere prolin ved den 8. aminosyre, fig. 3, til dannelse af ptg155-pro, 3) syntese af et miniplasmid, ptg1h, ud fra pbr322 (fig: 4), 4) indsætning i dette miniplasmid af Hin-J-fragmentet, som bærer TK-genet fra VV, 5) indsætning i TK-genet af promotoren for proteinet 7,5K (fig. 5), 15 6) indsætning nedenfor promotoren for P7,5K af rabiesgenet, som bæres af ptg155-pro (fig. 5), og 7) kloning af de essentielle segmenter af sidstnævnte plasmid i vacciniavirus (fig. 6). 20 Nedenstående eksempler belyser egenskaberne af de forskellige vundne bestanddele. De forskellige materialer, der blev anvendt, er identificeret i eksemplerne. 25 Medmindre andet er angivet, er enzymerne anvendt under de af fabrikanten anbefalede betingelser, og de anvendte teknikker er kendte for fagfolk. De i figurerne viste aminosyresekvenser og nucleotidsekvenser er ikke vist i beskrivelsesteksten for ikke at gøre den for tung, men de udgør en integreret del 30 deraf. Restrukturering af cdna'et for rabies-glycoproteinet

6 5 Den sekvens, der koder for rabies-glycoproteinet, og som er beskrevet af Anilionis et al., er vist i fig. 1 og omfatter segmenter, som kan forstyrre dens translation og ekspression som antigen. 5 cdna for rabies-glycoproteinet, som stammer fra plasmidet prg beskrevet af Anilionis et al. (1981) og bæres på et Bg/II/Bg/II-fragment af forskellige plasmider såsom ptg147, ptg171 og ptg150, er beskrevet i fransk patentansøgning nr (WO-A-85/1516). 10 ATG'et svarende til initeringskodonen for mrna for det modne protein befinder sig græn-sende umiddelbart op til en polyg-sekvens, som indføres ved cdnaklonings-processen. Denne sekvens er i stand til at frembringe ustabilitet ved in vivo rekombination mellem G/C-segmenterne ved hver af enderne af cdna'et og kan desuden forstyrre translationen af proteinet. 15 Desuden svarer sekvenserne af cdna'et for glycoproteinet ikke fuldstændig til den sekvens, som koder for den N-terminale del af det modne glycoprotein. Derfor blev det besluttet at eliminere disse to forhindringer, før kloningen af den tilsvarende kodende sekvens blev udført. 20 Kozak (1981, 1983) har påvist, at initieringskodonerne for translationen i eukaryote celler normalt befinder sig i en sekvens, som kan vises på følgende måde: A * * ATG (A eller G), og ændringer af denne sekvens kan føre til en formindsket translation. Selv om vigtigheden af disse ende-nucleotider ikke er 25 fuldstændig erkendt, synes c:it at være foretrukket at eliminere den tilstødende G/C-sekvens og at bevare essensen af den ovenfor nævnte overensstemmende sekvens. Desuden er det nødvendigt at have en Bg/II-genkendelsessekvens oven for for at lette efterfølgende bearbejdning. 30 Under rekonstruktionen af 5'-enden af cdna, hvilket er vist i fig. 2, blev eksistensen af et unikt MstII-sted udnyttet, hvilket sted dækker de kodoner, som koder for aminosyrerne 2, 3 og 4 af det primære translationsprodukt.

7 cdna'et for rabies-glycoproteinet ifølge Anilionis blev indsat i plasmidet ptg150 under anvendelse af adaptoroligonucleotiderne Pstl/Bg111 (Lathe et al., 1982) i et unikt 8g/II-sted indsat i HindIII-stedet i plasmidet pbr327 (Soberon et al., 1980). 5 Dette plasrnid, som er angivet med A i fig. 2, blev spaltet delvis med 8g/II og fuldstændigt med MstII, og de derved dannede lineære fragmenter blev isoleret ved elektroforese på agarosegel ved lav geleringstemperatur. Oligonucleotiderne (5'-dGATCTAATATGGTTCC-3') og (5'-dTGAGGAACCATATTA-3') blev syntetiseret i henhold til en tidligere beskrevet teknik (Kohli et al., 1982). Oligonucleotiderne 10 hybridireres til dannelse af en delvis dobbeltstreng (B i fig. 2) og indsættes mellem Bg111- og MstII-enderne i det oprensede lineære plasmid, hvilket muliggør recirkularisering og frembringer plasmidet ptg155 (C i fig. 2). Den 8. aminosyre i det modne glycoprotein (som ikke har nogen signalsekvens) 15 fra virusstammerne ERA og CVS for rabies er prolin, medens man i det cdna, der er isoleret af Anilionis et al., i denne stilling finder en triplet, som koder for leucin: I ptg155, som er vist i fig. 3, er det muterende sted omgivet af et EcoRI-sted oven for i vektoren og af et HindIII-sted på sekvenserne svarende til 20 aminosyrerne 10 og 11 i den sekvens, som koder for det modne glycoprotein. Dette lille EcoRI/HindIII-fragment klones i bakteriophagen M13tg131 (Kieny et al., 1983) i omvendt orientering. Der udføres en lokaliseret mutagenese dirigeret af et oligonucleotid i henhold til den af Zoller og Smith (1983) beskrevne teknik under anvendelse af oligonucleotidet (5'-dATCACGATCCCAGACAAGC-3'), som er 25 syntetiseret som beskrevet ovenfor. Kodonen for den 8. aminosyre i cdna-sekvensen udskiftes for at erstatte CTA med CCA. 30 Oligonucleotidet (19mer) indeholder to modifikationer i forhold til den oprindelige sekvens: et T i stedet for C, hvilket ændrer tripletten for leucin, CTA, til prolin, CCA, og et A i stedet for C, hvilket svarer til en transversion i sekvensen GATA. Dette giver en sekvens GATC for dam-methylering, hvilket fremmer inkorporering af oligonucleotidsekvensen ved korrigering af de selektive sammenkoblingsfejl 35 in vivo.

8 7 Det bør bemærkes, at EcoRI/HindlII-fragmentet, som blev klonet i omvendt orientering af den, som præsenteres her, således at den nederste streng, som er komplementær til oligonucleotidet, er til stede i den enkeltstrengede rekombi- 5 nante bakteriophag M13. Phagområder undersøges for hybridisering under hensigtsmæssige betingelser med et oligonucleotid, der ved sin 5'-ende er mærket med 32 P. Der udtages et vist antal positive områder, og de tilsvarende indsætninger sekventeres. Indsæt- 10 vingen af &I af de korrekt modificerede kloner klones igen i ptg155 ved at udskifte EcoRI/HindIII- fragmenterne for sluttelig at fremstille det omstrukturerede plasmid ptg155-pro. Analyse af de i dette trin forekommende kloner lettes ved tilstedeværelsen af et nyt sted for restriktionsenzymet Sau3A, som falder sammen med dam-methyleringssekvensen, der blev indført under den af 15 oligonucleotidet dirigerede mutagenese. I plasmidet ptg155-pro er cdna'et for det omstrukturerede rabies- glycoprotein på hver af enderne omgivet af 8g/II-steder. Ved enden nedenfor stammer BgIIIstedet fra anvendelsen af det octamere adaptoroligonucleotid BgIII/PstI, der 20 anvendes for at klone cdna-fragmentet PstI/Pstl i 8g/II-stedet, og stedet ovenfor stammer fra anvendelsen af et lille dobbeltstrenget oligonucleotid, der skal eliminere G/C-enden. Konstruktion af hybridplasmider 25 Den samlede størrelse af de forskellige segmenter, der er nødvendige til overførslen af den sekvens, som koder for rabies-glycoproteinet i VV-genomet, og den efterfølgende ekspression, er i størrelsesordenen flere kb. Det er således blev anset for nødvendigt at minimere størrelsen af plasmidet til replikation i E. coli, 30 som anvendes til konstruktionsarbejdet, for at lette de nødvendige manipulationer. HindlII-fragmentet (Hin-3) fra VV-genomet indeholder det komplette gen for thymidin-kinase (TK), som allerede er blevet anvendt tidligere for at muliggøre 35 udskiftning og rekombination af DNA indsat i VV-genomet (Mackett et al., 1982).

9 Det er vigtigt at bemærke, at overførslen af en indsætning i TK-genet til VVgenomet danner et mangelfuldt TK-virus, som kan genkendes ved simpel selektion. Det har først været nødvendigt at producere et plasmid med lille størrelse, som havde et unikt HindIII-sted, der kunne anvendes til integrering af 5 Hin-3 VV-fragmentet. Desuden var det nødvendigt at eliminere de restriktionssekvens'er i plasmidet, der ikke var nødvendige, for at muliggøre følgende manipulationer. Konstruktionen blev påbegyndt ved at gå ud fra plasmidet pml2 (Lusky og 10 Botchan, 1981), som er en vektor, der er afledt af plasmidet pbr322 ved spontan sletning, og i hvilket segmentet mellem nucleotiderne 1089 og 2491 er gået tabt (fig. 4). Først blev Pst-I-sekvensen elimineret ved indsætning af fragmentet AhaIII/AhaIII fra puc8 (Vieirs og Messing, 1982) mellem to AhaIII-steder i pml2 og eliminering af 19 basepar. Man anvendte "linker-tailing"-metoden (Lathe et al., ) til at indsætte en HindIII-linker mellem NruI- og EcoRI- stederne, der var behandlet med 51 fra dette plasmid, idet BamHI- stedet blev elimineret. Dette giver et plasmid på 2049 basepar, som har det funktionelle B-lactamase-gen (som meddeler ampicillinresistens og desuden omfatter et aktivt replikationsinitieringssted i E. coli og et unikt HindIII-restriktionssted). 20 Denne konstruktion blev betegnet ptg1h. Hin-J-fragmentet fra VV-DNA bærende TK-genet er i forvejen blevet klonet i en vektor, der var afledt af pbr327 (Drillien og Spehner, 1983). Dette fragment på 25 4,6 kb blev klonet igen i HindIII-stedet i ptg1h. Der blev selekteret en klon, i hvilken TK-genet befinder sig distaft i forhold til det gen, som koder for ampicillinresistens. Denne konstruktion, ptg1h-tk, blev anvendt som bærer i følgende forsøg. 30 Næste trin bestod i at isolere en promotor fra VV, der kunne anvendes til at styre ekspressionen af den sekvens, som koder for det indsatte rabies-glycoprotein. Promotoren for et tidligt gen, der koder for et protein på dalton (7,5K) er allerede blevet anvendt med held til et identisk formål (Smith et al., 1983), og 35 man gik derfor videre til isolering af dette segment.

10 9 Genet 7,5K er beliggende på et af de mindste Sa/I-fragmenter (Sal- S- fragmentet) på W-genomet af WR-type (Venkatasan et al., 1981). Da man fortrinsvis kloner de små fragmenter, bærer en stor del af de kloner, som opnås ved direkte kloning 5 af DNA fra VV af WR-type, som er skåret med San i plasmidet pbr322, Sal-Sfragmentet. Dette fragment overføres til bakteriophag-vektoren M13mp701 (se Kieny et al., 1983) ved Sa/I-spaltning og religering, hvilket fører til phagen Ml3tgSal-S. 10 I denne klon findes der et Scal-sted umiddelbart i nærheden af initierings-atg'et i genet 7,5K. Neden for genet 7,5K findes unikke BamHI- og EcoRI-steder, der stammer fra vektoren. BamHI - og ScaI - stederne fusioneres ved hjælp af en Bg/II-linker 5'-CAGATCTG-3' ved "linker"-teknikker, efter at de ved BamHIspaltning genererede ender er kompletteret med Klenow-polymerasefragmentet. 15 Denne fremgangsmåde eliminerer Scal-stedet, men rekonstituerer BamHI-stedet og flytter det unikke EcoRI-sted nedad. Samtidig elimineres Sa/I-stedet (AccI) nedenfor, og stedet ovenfor bliver således unikt. Denne konstruktion blev betegnet M13tg7,5K. 20 Inden for Hind-J-fragmentet fra DNA fra VV befinder sig ClaI - og EcoRI-steder, som er adskilt med ca. 30 basepar (Weir og Moss, 1983). Promotorfragmentet 7,5K, som er til stede i M13tg7,5K, udskæres med AccI og EcoRI og klones mellem CIaI - og EcoRI-stederne i ptg1h-tk til dannelse af ptg1h-tk-p7,5k, hvis 25 syntese er vist skematisk i fig Denne konstruktion fører til overførsel af det unikke BamHI-sted i vektoren M13 umiddelbart neden for sekvensen af promotoren 7,5K. Dette unikke BamHI -sted anvendes i de følgende konstruktioner. ptg1h-tk-p7,5k spaltes med BamHI og ligeres med ptg155-pro, der er spaltet med BglII (fig. 5).

11 10 Efter transformation i E. coli selekteres et af de ved denne fremgangsmåde isolerede rekombinante plasmider, pvvgrab, da det bærer cdna'et for rabies-glycoproteinet i den korrekte orientering for ekspressionen ud fra promotoren 7,5K. 5 pvvgrab betegnes undertiden ptg1h-tk-p7,5k-grab. Kloning i vacciniaviruset (fig. 6) Den af Smith et al. (1983) beskrevne strategi bygger på in vivo ombytning af et 10 plasmid, som har en indsætning i genet VV TK, og vildtypevirusgenomet, således af TK-genet, som bæres af viruset, inaktiveres. TK-vira kan selekteres ved udpladning på en TK-negativ cellelinje i nærværelse af 5-bromdeoxyuridin (5BUDR) (Mackett et al., 1982). Thymidin-kinase phosphorylerer 5BUDR til 5'-monophosphat, som derefter omdannes tit triphosphat. Denne forbindelse er en dttp- 15 analog, og indsætning deraf i DNA blokerer den korrekte udvikling af viruset. Et TK-virus kan ikke desto mindre replikere sit DNA normalt, hvilket fører til synlige virusplaque i et ligeledes TK cellelag. Vacciniaviruset formerer sig i inficerede cellers cytoplasma snarere end i deres 20 kerne. Derfor er det ikke muligt at drage fordel af replikations- og transkriptionsmaskineriet for DNA fra værten, og det er nødvendigt, at virionet har bestanddele til ekspression af virusgenet. Oprenset DNA fra VV er ikke smitsomt. Til dannelse af rekombinanter er det nødvendigt samtidigt at udføre celleinfektion 25 med et VV og transficering med det interessante klonede DNA-segment. Dannelsen af rekombinanter er imidlertid begrænset til en lille del af de celler, som er kompetente for transfektion med DNA. Derfor var det nødvendigt at iværksætte en indirekte "kongruens"- strategi for at reducere baggrundsstøj fra ikkerekornbinante stamvira. Dette blev foretaget, idet der som levende infek- 30 tionsvirus blev anvendt en varmefølsom (ts) mutant af vaccinia, hvilken mutant ikke er i stand til at formere sig ved en utilladelig temperatur på 39,5 C (Drillien og Spehner, 1983). Når cellerne inficeres med en ts-mutant under utilladelige betingelser og transficeres med DNA fra et vildtype-virus, sker der kun virusmultiplikation i de celler, som er kompetente for transfektion, og i hvilke en

12 11 rekombination mellem det vilde virus-dna og genomet fra ts-virus har fundet sted; der opnås intet resultat i de andre celler på trods af, at de er blevet inficerede. Hvis et rekombinant plasmid indeholdende et DNA-fragment fra vaccinia såsom pvvgrab er indeholdt i transfektionsblandingen i en passende koncen- 5 tration med vildtype-dna, er det ligeledes muligt at opnå, at det deltager i den homologe rekombination med DNA'et fra vaccinia i de kompetente celler. Enkeltlag af primære fibroblast-celler fra kyllingefostre (CEF) inficeres ved 33 C med VV-Copenhague ts 26 (0,1 pfu/celle) og transficeres med et copræcipitat af 10 calciumphosphat fra vildtype-dna VV-Copenhague (0,5 pg/10 6 celler) og fra det rekombinante plasmid ptg1h-tk-p7,5-grab (3,0 pg/10 6 celler). Det skal bemærkes, at svagere koncentrationer (0,1 pg/10 6 celler) i nedenstående forsøg gav betydeligt forbedrede udbytter af rekombinanter. 15 Efter 2 timers inkubation ved en temperatur, som ikke tillader udvikling af ts-virus (39,5 C), skylles cellerne og inkuberes i 48 timer ved 39,5 C. Fortyndinger af ts + - virus anvendes til at geninficere et enkeltlag af museceller L-TK ved 37 C og inkuberes i nærværelse af 5BUDR (100 pg/ml). Der fås forskellige TK-plaques ud fra disse celler, som har modtaget det rekombinante plasmid, medens 20 kontrolkulturer uden plasmid ikke udviser synlige plaques. En korrekt, reciprok dobbelt rekombination mellem hybridplasmidet for rabies/- vaccine og VV-genomet udskifter TK-virusgenet med det TK-gen, der bæres af den indsætning, som er til stede i plasmidet. I VV-genomet er TK-genet til stede 25 på et unikt HindIII/Hin-3-fragment. De rekombinanter, som har overført ekspressionsblokken fra rabies- glycoproteinet, synes at have integreret et internt HindIII-sted, som stammer fra cdna'et for glycoproteinet. Derfor spaltes DNA'erne, som er oprenset ud fra TK-virus, med Hind111 og underkastes elektroforese på agarosegel. Som det var forudsagt, er Hin-J-fragmentet på 4,6 kb ikke 30 til stede, hvorimod to nye fragmenter på 1,1 og 5,5 kb afslører tilstedeværelsen af en indsætning indeholdende et internt HindIII-sted. Efter subkloning af TK-vira bevares &I af rekombinanterne VVgRAB-26D3. Ekspression af rabies-glycoproteinet ud fra rekombinante vacciniavira

13 Enkeltlag fra semikonfluente L-Tie-celler inficeres med VVgRAB-26D3 (50 pfu/celle) i 1 time ved omgivelsestemperatur, hvorefter der tilsættes et methionin-frit dyrkningsmiljø, og efter 30 minutter beriges hver dyrkningsskål med 5 35 L-methionin (1265 Ci/mmol), og inkubationen fortsættes ved 37 C i 4 timer. 51 Cellerne høstes og resuspenderes i en immunudfældningspuffer inde-holdende protease-inhibitorer, og efter sprængning ved hjælp af ultralyd og klaring isoleres de proteiner, som er fikseret af anti-rabies-antiserium, ved affi-nitetschromatografi på en harpiks af A-protein/Sepharose og påføres på en elektroforesegel og 10 fluorograferes i henhold til den af Lathe et al. (1980) beskrevne teknik. Et polyklonalt antiserium 3554-R215, som er rettet mod det på Wistar Institute oprensede glycoprotein, blev anvendt ved de i fig. 7, A (a) og B viste forsøg; identiske resultater (b,c) opnås med to monoklonale antistoffer, som neutraliserer 15 viruset (509-6 og fra Wistar), og som identificerer forskellige epitoper på rabies-glycoproteinet. Ved A er det cellulære enkeltlag inficeret med 1) rekombinanten VVgRAB-26D3, 2) vildtype-vacciniavirus, og 20 3) intet virus. Ved B er et cellulært enkeltlag inficeret med VVgRAB-26D3 og mærket i nærværelse (1) eller fraværelse (2) af tunicamycin (2 pg/ml). 25 I (A) og (B) er standard-molekylvægtene anført i kilodalton. Som det fremgår af fig. 7A, neutraliseres viruset af et polyklonalt rabies-antiserum samt to monoklonale antistoffer, og de udfælder et protein, som vandrer i form af et diffust bånd med en tilsyneladende molekylvægt på ca dalton. 30 Denne molekylvægt svarer præcist til molekylvægten, dalton, af et autentisk rabies-glycoprotein. Eftersom molekylvægten af det naturlige glycoprotein og rekombinanten stemmer overens, er det blevet bekræftet, at det rekombinante glycoprotein blev glyco-

14 13 syleret in vivo. Et cellulært enkeltlag blev inficeret med VVgRAB-26D3 som ovenfor, og til miljøet blev der før mærkningen tilsat en kraftig glycosyleringsinhibitor, tunicamycin (2 pg/ml). De inficerede celleekstrakter immunudfældes under anvendelse af et polyklonalt antistof, og produktet anbringes på en elek- 5 troforesegel som beskrevet ovenfor. Som det fremgår af fig. 7B, fører tilsætning af tunicamycin til miljøet til en reduktion af molekylvægten af det rekombinante protein på dalton, hvilket svarer til eliminering af proteinets glycosylerede grupper. Det kan således konkluderes, at det rekom-binante rabies-glycoprotein glycosyleres i de med VVgRAB inficerede celler. For-skellige andre bånd i linje (1) 10 antages at være produkter fra nedbrydningen af det ikke-glycosylerede rabiesantigen. I et andet forsøg inficeres et enkeltlag af L-TK-celler med VVgRAB- 26D3 (10 5 pfu pr. plaque indeholdende 10 6 celler) og inkuberes i 8 timer ved 37 C. Cellerne fik- 15 seres og behandles med monoklonale og polyklonale antistoffer, og efter grundig vask detekteres det fikserede antistof ved anvendelse af et andet antistof (gedeantimus), som er mærket med fluorescein. Størstedelen af de med rekombinanten VVgRAB-26D3 inficerede celler (A) udviser signifikant fluorescens, medens de ikke-inficerede celler (C) og cellerne inficeret med ikke- rekombinante vira (B) 20 ikke udviser fluorescens. Som det fremgår af fig. 8, er fluorescensen fortrinsvis forbundet med cytoplasmamembranen, hvilket man kunne forvente af et transmembran-protein. 25 Immunologiske egenskaber in vivo af det levende vaccinia/rabies-hybridvirus Kaniner immuniseres intradermalt med 3 x 10 7 pfu VVgRAB-26D3, og der udtages serumprøver efter 0, 11 og 14 dage. Der iagttages en tydelig hævelse på infektionsstedet, som bliver mindre efter 8-9 dage. En rabies-virusstamme ERA, som 30 er inaktiveret med P-propiolacton og mærket med i henhold til standardfremgangsmåden, testes for sin reaktion med serum fra de immuniserede dyr. De fikserede proteiner anbringes på elektroforesegel og autoradiograferes.

15 Serummet fra kontroldag 11 og 14, men ikke serummet fra kontroldag 0, viser sig at genkende og effektivt fiksere det radiomærkede virus- glycoprotein. Serum fra kontroldyrene, som er immuniseret med den ikke-rekombinante vacciniavirus af Copenhague-typen giver ikke sådanne reaktioner. Serum fra dyr, der er immuni- 5 seret som beskrevet ovenfor, testes derefter for inaktivering af rabies-viruset in vitro. Fortyndinger af rabiesstammen ERA præinkuberes i 1 time med forskellige mængder kanin-antiserum og udplades på celler fra nyrer fra nyfødte hamstere (BHK) på mikrotiterplader (10 3 celler/brønd). Efter inkubation ved 37 C i 22 timer farves de producerende inficerede celler under anvendelse af en teknik til 10 direkte immunofluorescens. Tabel I viser, at der selv med de højeste fortyndinger af antiserummet fra kontroldag 11 og 14 opnås fuldstændig inaktivering af viruset. De præimmune og ikke-rekombinante sera giver ingen detekterbar neutralisering. Tallene er angivet 15 som den stærkeste fortynding, ved hvilken der iagttages inhibering af infektionen. TABEL I Antal dage ef- VVgRAB-26D3 Vildtype- 20 ter vaccination Kanin I Kanin II Kanin III Kanin IV vaccine >30000 >30000 >30000 > Disse resultater viser, at rekombinanten VVgRAB-26D3 ikke blot inducerer dannelse af antistoffer, som reagerer med rabiesviruset, men også at antiserum fra immuniserede dyr er i stand til at inaktivere rabiesvirus in vitro. Induktion af 30 neutraliserende antistof hænger ikke altid sammen med en beskyttelse mod udvikling af sygdommen. Derfor blev der udført et direkte studium af en beskyttelsestest under anvendelse af det rekombinante virus. Mus immuniseres ved injektion i poten eller indgnidning på halen med 10 7 pfu levende VVgRAB-26D3. Dyrene inokuleres derefter med en letal dosis (1000 enheder, DL50) af en vild 35 rabiesvirus, der indføres ved intracerebral injektion. Efter 10 dage har kontrol-

16 15 dyrene, som er immuniseret med den ikke-rekombinante vaccinia, en terminal rabiesinfektion, hvorimod 15 ud af de 15 dyr, der blev immuniseret med VVgRAB-26D3, ikke viser nogen tegn på sygdom. 5 Det kan således konkluderes, at immunisering med den levende rekombinante vaccinia/rabiesvirus fører til beskyttelse mod rabies. Immunologiske egenskaber in vivo af inaktiveret vaccinia/rabies-hybridvirus 10 Der kan fremstilles tre typer inaktiveret vaccine ud fra celler inficeret med den rekombinante vaccinia/rabiesvirus: 1) en råekstrakt fra inficerede celler, 2) det intakte oprensede virus og 3) det oprensede glycoprotein G. De tre præparater inaktiveres med 3-propiolacton BHK-celler, som er inficeret med VVgRAB-26D3, homogeniseres i en Dounce-formaler, og supernatanten fra centrifugeringen udgør den rå celleekstrakt. For at få dræbt oprenset virus inaktiveres dette præparat med (3-propiolacton 1/4000 og centrifugeres på en saccharosegradient i henhold til 20 kendte teknikker. Det oprensede glycoprotein G fås ved solubilisering af råekstrakten i nærværelse af 2% Triton@ X-100. Efter 1 times centrifugering ved x g isoleres G fra supernatanten ved passage på en affinitetssøjle, der er fremstillet med et anti-g monoklonalt antistof.. Dette 25 oprensede glycoprotein g inaktiveres også med 13-propiolacton. Mus immuniseres ved 2 intraperitoneale injektioner med 0,5 ml af disse inaktiverede præparater med 1 uges mellemrum og underkastes prøven 1 uge senere (240 enheder DL50) ad intracerebral vej. 30

17 DK Bi 16 Tabel II viser anti-rabies-antistof målt på dag 7 og 14. TABEL II Mængde proteiner injiceret i pg/mus Anti-rabiesantistof-titer Dag 7 Dag VVgRAB-26D3 råekstrakt VVgRAB-26D3 oprenset virus VVgRAB-26D G oprenset Vaccine af Copenhaguetypen, råekstrakt Alle de dyr, som er vaccineret med de forskellige vaccinepræparater, der er inaktiveret og afledt af VVgRAB-26D3, overlever intracerebral injektion af rabiesvirus, medens dyr fra kontrolgruppen dør inden for det forventede tidsrum. 25 Det er vigtigt at bemærke, at hybridviruset VVgRAB-26D3, selv når det er inaktiveret, giver effektiv beskyttelse mod rabiesinfektion ved forsøgene. Dette viser, at rabies-glycoproteinet i det intakte rekombinante virus forekommer på overfladen af virionet og er i stand til at inducere et immunologisk respons, som ligner 30 det, der induceres af det inaktiverede rabiesvirus. Vaccination af ræve og oral vaccination

18 17 I Vesteuropa er ræve hovedårsagen til udbredelsen af rabies. Det er derfor altafgørende at kunne kontrollere vaccinationen af ræve. Dette sker fortrinsvis oralt for at minimere berøring af dyrene. 5 Røde ræve (Vulpes vulpes) med en alder på under 1 år immuniseres ad forskellige veje med 10 8 pfu levende VVgRAB-26D3. Kontrollerne udgøres af 2 ræve, der er vaccineret med kendt dræbt antirabiesvaccine, og af 4 ræve, der er vaccineret med vildtype-vaccinia. 10 I tabel III anføres anti-rabies-antistoftiteret målt på dag 7, 14 og 28. Tabellen viser, at det rekombinante vaccinia/rabiesvirus hos ræve ligesom hos mus inducerer dannelse af antistof, som kan sammenlignes med det, der induceres af den kendte vaccine. 15 De vaccinerede dyr underkastes på dag 28 en test med injektion af virulent rabiesvirus. De ræve, der er vaccineret med vildtype-virus, dør inden for det forventede tidsrum. Alle de ræve, der er vaccineret med den kendte dræbte vaccine eller med 20 VVgRAB-26D3 (selv ræv 2), som er inokuleret subkutant, og som ikke havde serumneutraliserende antistoffer) er levende 2 måneder efter forsøget.

19 18 Anvendt vaccine Antistoftiter* Inokulationsvej Dag 6 Dag 14 Dag 28 5 Kendt dræbt subkutant 1) 0,33 0,64 0,24 2) 0,07 0,05 0,07 Vildtype-vaccine intradermalt 10 VVgRAB-26D3 intradermalt 1) 0,64 6,1 4,4 2) 0,05 0,6 1,67 WgRAB-26D3 subkutant 1) 0,46 2,32 4,3 15 VVgRAB-26D3 2) oralt med skarifikation af mucosa 1) 0,33 0,88 1,67 2) 0,24 0,88 2,31 20 *) Antistoftiterne er udtrykt i internationale enheder (referenceserum - 65 IU - neutraliserende ved 10-4'2). Følgende stamme er den 30. september 1983, under deponeringsnummeret , deponeret hos Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28, rue du Docteur Roux, Paris Cedex 15: E. coli TGE1106 transformeret med ptg171.

20 19 REFERENCER A. Aniiionis, W.H. Wunner & P.J. Curtis, Nature 294, 1981, s R. Drillien & D. Spehner, Virology 131, 1983, s M.P. Kieny, R. Lathe & J.P. Lecocq, Gene 26, 1983, s V. Kohli, A. Balland, M. Wintzerith, R. Sauerwald, A. Staub & J.P. Lecocq, Nucleic Acids Res. 10, 1982, s M. Kozak, Nucleic Acids Res. 9, 1981, s M. Kozak, Microbiol. Rev. 47, 1983, s R. Lathe, P. Hirth, M. Dewilde, N. Harford & J.P. Lecocq, Nature 284, 1980, s R. Lathe, A. Bailand, V. Kohli & J.P. Lecocq, Gene 20, 1982, s R. Lathe, M.P. Kieny, D. Schmitt, P. Curtis & J.P. Lecocq, J. Mol. Appl. Genet., 1984a, under trykning. 15 R. Lathe, M.P. Kieny, S. Skory & J.P. Lecocq, DNA, 1984a, under trykning. M. Lusky & M. Botchan, Nature 293, 1981, s M. Mackett, J.L. Smith & B. Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1982, s D. Panicali & E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1982, s D. Panicali, S.W. Davis, R.L. Weinberg & E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1983, s G.L. Smith, M. Mackett & V. Moss, Nature 302, 1983, s Soberon et al., Gene 9, 1980, s S. Venkatesan, B.M. Baroudy & B. Moss, Ce11125, 1981, s Vieira & J. Messing, Gene 19, 1982, s J.P. Weir & B. Moss, J. Virol. 46, 1983, s T.J. Wiktor, Develop. Biol. Standard 40, 1978, s Wiktor, i Rhabdoviruses III, 1980, s , red. D.H.L. Bishop, CRC Press, Inc. 30 W.H. Wunner, B. Dietzschold, P.J. Curtis & T.J. Wiktor, J. Gen. Virol. 64, 1983, s E. Yelverton, S. Norton, J.F. Obijeski & D.V. Doeddel, Science 219, 1983, s M.J. Zoller & M. Smith, i Methods in Enzymology 100, 1983, s , red. R. 35 Wu, L. Grossman, K. Moldave, Academic Press, London.

21 DK Bi F. Keller, R. Drillien & A. Kim, Thermosensibilite du clveloppement des poxvirus et virulence. Utilisation de souches thermosensibles comme vaccin. Rencontre Biologique, 1978 (L. Hartmann), s , red. Varia, Paris. F. Keller & R. Drillien, Un mutant thermosensible attenue du virus vaccinal. Ann. 5 Virol. (INSTITUT PASTEUR), 1980, 131 E, s

22 20 PATENTKRAV Vaccine til behandling eller forebyggelse af rabies, k en d et e g n et ved, at den består af et rekombinant vacciniavirus, som omfatter en DNA-sekvens I, som koder for et glycoprotein G fra rabiesvirus. 2. Vaccine ifølge krav 1, 15 k e n d et e g n et ved, at den DNA-sekvens, som koder for rabies-glycoprotein G, er den DNA-sekvens, som koder for det komplette modne glycoprotein. 3. Vaccine ifølge krav 1, k end e t e g n et ved, at DNA-sekvensen I er under kontrol af en promotor fra 20 vaccinia Vaccine ifølge krav 3, k end et e g n et ved, at promotoren fra vaccinia er promotoren for genet fra proteinet 7,5K fra vaccinia. 5. Vaccine ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, k en d et e g net ved, at sekvensen, som koder for rabies-glycoprotein G, er indsat i et ikke-essentielt gen fra vaccinia Vaccine ifølge krav 5, k en d et eg net ved, at sekvensen, som koder for rabies-glycoprotein G, er klonet i TK-genet fra vaccinia. 7. Vaccine ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, 35 k en d et egn et ved, at vacciniaviruset er varmefølsomt.

23 8. Vaccine ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, kendetegnet ved, at viruset er levende Vaccine ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, kendetegnet ved, at viruset er inaktiveret.

24 GRABPST.DAT fod. Pst GOG GOG OGG OGA GOA AAG ATG GTT CCT CAG GCT CTC CTG TTT GTA CCC CTT CTG GTT TTT CCA TTG TGT TTT GGG AAA TTC Met Val Pro Gln Ala Leu Lou Phe Val Pro Leu Lou Val Phe Pro Leu Cya Phe Stejl-es Phe 8 91 H 4d. r i 121 H9tJ I Pv II. CCT Ali TAC ACG ATA CTA GAC r G ett GOT CCC TGG GC G ATT GAC ATA CAT CAC C1 A C CCA AAC AAT TTO GIA OTG GAG GAC Pro Ile Tyr Thr Ile Leu ASP VS Leu Gly Pro Irp Ser Fro lle ASP Ile His His Leu er ite; Pro Asn Asn Leu Val Val Olu ASP 181 GAA OGA TOC ACC Glu Gly Cwa Thr GOG TTC TCC TAC ATS GAA CTT AAA OTT GOA TAC ATC TTA GCC ATA AAA ATG AAC OGO TTC ACT TOC ACA Gly Phe Ser Tyr Met Glu Leu Lys Val Gly Tyr Ile Leu Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe Thr Cys Thy GOC GTT GTO ACG GAG OCT GAA ACC TAC ACT AAC TTC GIT GGT TAT GTC ACA ACC ACG TTC AAA AGA AAG CAT TTC COC CCA A CA CCA GA1 Gly Val Val Thr Olu Als Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Glw Tyr Val Thr Thr Thr Phe Les Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Arg AvaIII. HD- s tril, sic,) 161 AGA GCC GCG TAC AAC TGO AAG G GCC 31 GAC CCC AGA TAT GAA GAG TCT CTA CAC AAT CCG TAC CCT GAC TAC CGC TGO CTT =tys Arg Ala Ala Tyr Asn Tre Lys Met A a y ise ro Arg Tyr Glu 15T7,--Ter Lou His Asn Pro Tyr Pro ASP Tyr Arg Tre Leu b Atuli XhOIAval :13A ACr GTA AAA ACC ACC AAG GAG TCT CTC GTT ATC ATA TCT CCA AGT GTA GC A GAT TTO GAC.CCA TAT GAC AGA TCC CTT CA rd hr Val Lys Thr Thr Lys Olu Ser Lou Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala AsP Lou ASP Pro ler ASP Arg Ser Leu His A a I GTC TTC CCT AOC GGO AAO TGC ICA GOA GTA GCO GTO TCT TCT ACC TAC TOC T C C ACT AAC CAC GAT TAC ACC ATT TOG ATG AG AAT. Val Phe Pro Ser Ole Les 'Ces Ser Giv Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cvs Ser ThrlAsn His Ase Tyr Thr Ile Tre Met ro u Asn G er r CCO AGA CIA 000 ATG TCT TOT GAC ATT TTT ACC AAT AGT AGA OGO AAO ADA GCA TCC AAA 006 AGT GAG ACT TGC OGC TTT GTA GAT GAA 'Pro Ars Leu 01w Met Ser Ces Asp Ile Phe Thi' Agn Ser Ard 01; Les Arg Ala Ser Les Ole Ser Glu Thr Ces Ole, Phe Val ASP Glu 72 StU IHael AhaIll Sehi 781. Nr I _ AnauLLIA TAT AAO TC14ja...gA OGA AriGW-Lau Ter Les Ser eu as Ole : ir. AAA CTC AAO TTA TGT OGA GTT CTA OGA CTT AGA CTT ATG GAT GOA ACA TOO GTC a Lys Les Leu Les Lou Ces Ble Val Leu Gly Leu Ard Lau Met Asp Ole Thr Tre Va FIGla L8 EESSLL Na

25 811 hyo CAA ACA TCA Met Gin Thr Ser C AAA TOG TOC CCT CCC GAT CAO TTG GTO AAC CTO CAC GAC TTT CGC TCA GAC GAA ATT GAG CAC CTT GIT Lus Tre Cws Pro Pro W Uln Leu Val Asn Leu His, Asp Phe Arg Ser ASP Glu Ile GIu His Leu'Val I 961 A yi GTA GAG GAG TTO GTC AGO AAG AGA GAG GAG TOT CTG GAT OCA CTA GAG TCC ATC ifu A A ACC AAG TCA GTG AGT TIC AG t. I CTC AGT Vel Olu Glu Lou Val Arg Lws Ard Olu Olu Cys Lou Ase Als Lou Olu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Ar- r9 eu Sir CAT TTA AGA AAA CTT. GTC CCT GGO TTT GGA AAA GCA TAT ACC ATA TTC His Leu Arg Lvs Lou Val Pro Glv Phe Giv Lws Ala Tyr Thr Ile Phe 1051 TTO ATG GAA GCC GAT OCT CAC TAC AAO TCA GTC Leu Met Glu Ala A4p Ala His Tyr Lys Ser Val AGA ACT TBO AAT GAG ATC CTC C.CT TCA AAA 000 TOT TTA AGA GTT A00 TOT CAT CCT CAT GTG AAC GGG GTO TTT TTC AAT GGT Ard Thr Tre Asn 01.7= Leu Pro Ser Lvs Giv Cys Lou Arg Val Glv Glv Arg Cws His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Glv ATA ATA TTA GGA CCT GAC 00C AAT GTC TTA ATC CCA GAG ATO CAA TCA TCC CTC CTC CAG CAA CAT ATO GAD TTO TTG OAA TCC TCG.GTT Ile Ile Lou Glv' Pro Ase Olv Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gin Ser Ser Leu Lou Gin Gin His Met G)u Leu Lou Glu Ser Ser Val 1261., A ci 1321 ATC CCC CTT GTO CAC CCC CTG OCA GAC CCO t - T ACC BIT TTC AAG GAC GOT GAC GAG OCT GAG GAT TTT GU* GAA BIT CAC Cl? CCC GAT Ile Pro Lou Val His Pro Leu Ala ASP Pro ser lhr Val Phe Lys Ase Glv ASP Glu Als Glu ASP Phe Val Glu Val His Leu Pro ASP 1351 Hi dila., 1411 Ap a / riff. GTO CAC AAT CAG GTC TCA GGA GTT GAC TTG OGT CTC CCO AAC TOG OGG AAO TAT GTA TTA CTG AGT GCA OG ACT GCC TIG ATO Val His Asn Oln Val Ser Gly a LP Leu Oly Leu Pro Asn Tre Glv LYsITyr Val Leu Leu Ser Ale G d a eu Thr Als Leu Ret TTO ATA ATT TTC CTO ATO ACA TOT TOT AGA AGA GTC CGA A OAA CCT ACO CAA CAC AAT CTC AGA 000 ACA BOG AGO 0A0 GTO TCA Leu lle Ile Phe Leu Met Thr Cvs Cvsl Ard Arg Val Glu Pro Thr Gin His Asn Lou Ard Glv Thr Olw Ard Glu Val Ser GTC ACT CCC CAA AOC 000 AAO ATC ATA TCT TCA TOO GAA TCA CAC AAG AGT 000 OOT DAG ACC AGA eig 10A GGA CTG GCC GTC CTT TCA Val Thr Pro Oln Ser 01w 1.87 Tr; Ile Ser Ser Tre Glu Ser His Lys Ser Gly Glv Glu Thr Ard Leu *$* PstI ACO ATC CAA GTC CTO Aitp ATC ACC TCC CCT TOG GOD OTT CTT TTT AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA ACC CCC CCC CCC CCC ;TG FIG_lb 505 L8 E 55LL M CI

26 CTGCAG PstI Met Val Pro Gln,41a AG GA A AG ATGGTT CCT CAG GCT finls t II 5' 3) GATCTAATATGGTTCC 3,AT TATACCAAGGAGT 5, B A AG AT C TA AT ATG GTT CCT CAG GCT BglIl Ivlstli plg 155 FIG_2 LE1 EESSL L Na

27 EcoRI B91II Hind III Met TyrThrIleLEUAspLysLeu GAATTC---AGATCT---ATG TACACGATACTAGACAAGCTT---- * * 5/-TACACGATCCCAGACAAGC-3' ***: EcoRI BglII Met GAATTC---AGATCT---ATG HindIII TyrThrIlePROAsptysLeu---- TACACGATCCCAGACAAGCTT----

28 Eco RI Ps t (st i Aha III Aha III Nrui FIG_4

29 f( 5811 Sca I Sca I Sal I Pst Eco R1 P C. 7,5K M 13t9 Sal- 5 Sca 1, BamHI Klenow Barn Hl B91111inker tailing" ( Acc I ) Sal I B9I H Pst! I Eco RI I P C' I M 13 t9 7,5K Bam H1 Cla I Eco RI Hind ill pt91h-tk I P TK Hind III ti Acc I Eco RI v Cia ligase Eco RI Cla I B9111 Hind Ilt Acc l e EcoRI Hind III P P t ptg 1H-TK- P7,5K BamHI BamHi Mst I Hind III B9/11 j I Eco R F 1 B91 II pt9155- PRO ligase Ms1'11 Hind III Hind Ill Eco RI pvv9rab -2-1 PC)' I Barn HI 891 II RA B TK Barn Hl 891» Il Hind III t F1G_5

30 IN VITRO IN VIVO DNA vaccine Isolering af "bæreren" Isolering af prorotoren l( Indsætning af P i bæreren P E) cona VVVVIV Vaccinegenom P C=1=11111"/W\-= /Dobbelt reciprok rekombination F10_6

31 A a b c F1G_7

32