Optimering af detektionen til diagnosticering. ved anvendelse af antistofferne HMB45 og Melan A

Transkript

1 Optimering af detektionen til diagnosticering af maligne melanomer ved anvendelse af antistofferne HMB45 og Melan A Optimization of the detection to the diagnosis of malignant melanoma by use of antibodies HMB45 and Melan A Figur 1: billedet viser en antigen-antistof reaktion i aktive og inaktive melanocytter på et hud væv med antistoffet Melan A. 20x. Billedet er fra projektet. Holdnummer: Uddannelsessted: UC Syddanmark, Degnevej 16, 6705 Esbjerg Ø Klinisk afdeling: Patologisk afdeling på Sydvestjysk Sygehus Vejleder: Liselotte Olesen og Inge Marie Bayer Opgavens omfang: anslag

2 Forord Jeg vil takke Klinisk Patologisk Anatomi (KPA) på Sydvestjysk Sygehus (SVS) i Esbjerg for at have muligheden til at udføre projektet. En stor tak til mine vejledere Liselotte Olesen og Inge Marie Bayer for hjælpen og vejledningen under den praktiske del. En speciel tak til Bente Dammark Kristensen som er specialist i immunlaboratoriet, der har hjulpet med at udstanse, indstøbe og mikrotomer væv til vores projekt. Tak til sekretær Lisbeth Sørensen som har hjulpet med at finde frem til rekvisitions nummer til udvælgelse af patientvæv, og samtidig hjulpet med at scanne objektglassene ind på Nano Zoomer. Derudover tak til patolog Niels Korsgaard som har givet tilladelse til at anvende de udvalgte patientvæv. Til sidst vil jeg takke mine medstuderende Mia Schaadt Andersen og Marianne Worm Hovgaard for et godt samarbejde under udførslen af projektet. 1

3 Resumé Baggrund: Formålet med dette projekt er, at forbedre og optimere kvaliteten til detektionen af HMB45 og Melan A, ved at undersøge om det er en mulighed at afblege melanin pigmentet, og om det er muligt at udskifte hæmatoxylin med kationfarvestoffet Azur B til kernefarvningen og en blågrøn farvning af melanin pigmentet, således at melanin pigmentet ikke interfererer i billedet, da melanin pigmentet uden disse alternativer vil flyde sammen med reaktionsproduktet som fremstå brunt. Der vurderes om det nuværende UltraView Universal AP Red Detection Kit kan udskiftes med OptiView DAB IHC Detection Kit, da metoden er mindre selektiv, og hvor der ses uspecifik baggrundsfarvning. Metode: Inden selve undersøgelsen for bachelorprojektet, er der lavet 3 delforsøg, for at finde en optimal ph, inkubationstid samt en farvning af melanin pigmentet med farvestoffet Azur B og en optimal opløsning og tid for H2O2 til brug ved afblegning af melanin pigmentet. I bachelorprojektet afprøves metoderne, for at finde en metode, som kan erstattes med den nuværende metode, der anvender UltraView Detection Kit. Antistofferne HMB45 og Melan A anvendes. Der benyttes hud væv, der er kendt med MM, der er høj pigmenteret. OptiView DAB IHC Detection Kit og Ultra- View AP Red Detection Kit anvendes. Resultat: Der laves 3 delforsøg som danner baggrund for bachelorprojektet. Delforsøg 1 viser, at den optimale ph og inkubationstid for Azur B er ph 4 i 1 minut. I delforsøg 2 bliver melanin pigmentet farvet med en 0,1 % Azur B opløsning. Delforsøg 3 viser, at den optimale opløsning og inkubationstid for afblegning af melanin pigmentet, er en afblegning med 10 % H2O2 opløsning fortyndet i demineraliseret vand i 40 minutter. Resultaterne fra bachelorprojektet, viser at metoden med afblegning, er den metode, der har fået flest optimal score, hvor 90 % er scoret til at være optimal og 10 % er scoret til at være borderline. Konklusion: Ved at afprøve vores metoder, er vi kommet frem til, at det er muligt, at optimere og forbedre kvaliteten af detektionen for Melan A og HMB45 til diagnosticering af MM, således at UltraView AP Red Detektionskit kan udskiftes med OptiView DAB IHC Detection Kit. Ud fra vores resultater kan metoden med afblegning af melanin pigmentet med en 0,1 % H2O2 opløsning i 40 minutter udskiftes med den nuværende metode som anvender UltraView Detection Kit. 2

4 Indhold Forord... 1 Resumé... 2 Introduktion... 5 Baggrund... 5 Formål... 6 Problemformulering... 6 Teori... 6 Hudens opbygning... 7 Diagnosticering af MM... 8 Immunhistokemi... 8 Fiksering... 9 Præparering... 9 Mikrotomering... 9 Tørring, afparaffinering og rehydrering Demaskering Blokering af endogen aktivitet Antistoffer Anvendte antistoffer Melan A og HMB Analyseprincipper på apparaturet Ventana BenchMark UTLRA UltraView Universal AP Red Detection Kit Amplifikationskit kit OptiView DAB IHC Detection Kit Kernefarvning Afblegning Kvalitetssikring Materiale og metode Design Materialer Metode Dataindsamling Databehandling Litteratursøgning Etik

5 Resultater Diskussion Forventninger Pilotprojekt Delforsøg Delforsøg Delforsøg Bachelorprojekt Metoden med afblegning - OptiView DAB IHC Detection Kit Metoden med Azur B - OptiView DAB IHC Detection Kit Metoden med afblegning og Azur B - OptiView DAB IHC Detection Kit Nuværende metode - UltraView AP Red Detection Kit Antistoffer HMB45 og Melan A Opsamling af resultater for projektet Ekstern validering Metodekritik Konklusion Perspektivering Referenceliste Bilag

6 Introduktion Baggrund På Klinisk Patologisk Anatomi (KPA) på Sydvestjysk Sygehus (SVS) modtages der dagligt forskellige slags vævsprøver. I de seneste årtier har der været størst stigning i incidens for cancertypen Malignt melanom (MM). I Danmark er det den 5 hyppigste cancerform med 2200 nye tilfælde årligt. (1,2) Dette betyder at der modtages flere hudbiopsier på afdelingen, som skal analyseres og derefter kan der stilles en diagnose. Diagnosen for MM stilles ved en mikroskopisk undersøgelse, hvor der foretages en Hæmatoxylin-Eosin farvning (He-farvning) samt en immunhistokemisk farvning til påvisning af MM med antistofferne anti-melanosome (HMB45) og anti-mart-1/melan A (Melan A) hvor detektionskittet UltraView Universal Alkalisk Phosphatase Red Detection Kit (UltraView Universal AP Red Detection Kit) benyttes til detektionen af antigen-antistof reaktionen. (3 5) På et brugermøde gør firmaet Roche sine kunder opmærksom på, at der er flere laboratorier, hvor der er observeret problemet med uspecifik farvning af bindevævet som skyldes kromogenet Fast Red i detektionskittet UltraView Universal AP Red Detection Kit. Detektionskittet har en holdbarhed på 3 måneder. Der ses en uspecifik baggrundfarvning fordi kromogenet fælder ud på præparaterne. Jo ældre kittet er jo værre bliver det med baggrundsfarvningen som forværres. Hermed er metoden mindre selektiv og det er derfor interessant at finde en løsning på dette, ved at optimere kvaliteten af detektionen af HMB45 og Melan A til diagnosticering af MM, da der anvendes UltraView Universal AP Red Detection Kit til begge analyser. Ca. 80 % af analyserne på afdelingen analyseres med OptiView DAB IHC Detection Kit. Grunden til at man ikke benytter OptiView DAB IHC Detection kit til HMB45 og Melan A, er fordi reaktionsproduktet interfererer med melanin pigmentet i vævet som fremstår brunt. Det er derfor interessant at finde en løsning på dette, ved at undersøge om der er andre alternativer. Nogle studier viser, at det er muligt at optimere kvaliteten af detektionen af antigen/antistof reaktionen ved, at anvende Azur B som en kontrastfarve til reaktionsproduktet som fremstår brunt. Azur B farver kernerne blå og melanin pigmentet blågrøn. Derfor kan der skelnes mellem reaktionsproduktet og melanin pigmentet. (6,7) Et andet alternativ der beskrives i artiklerne, er afblegning af melanin pigmentet som kan afbleges med hydrogenperoxid (H2O2) og kaliumpermanganat (KMnO4). Ved at melanin pigmentet afbleges, er det kun reaktionsproduktet der fremstår brunt. (6,8,9) 5

7 Vores gruppe har udført et pilotprojekt, hvor alternativerne, Azur B og afblegning af melanin pigmentet, fra artiklerne bliver afprøvet. Gennem pilotprojektet er der fundet frem til en optimal ph samt inkubationstid for farvestoffet Azur B og en optimal opløsning og tid for H2O2 til brug ved afblegning af melanin pigmentet. Pilotprojektet danner grundlæggende baggrund for valg af metoder til bachelorprojektet. Gruppen er inspireret af problemerne på afdelingen til at udføre bachelorprojektet som har til formål at finde en metode, som kan forbedre og optimere kvaliteten til detektionen af HMB45 og Melan A til diagnosticering af MM. Formål Formålet med dette projekt er, at forbedre og optimere kvaliteten til detektionen af HMB45 og Melan A, ved at undersøge om det er en mulighed at afblege melanin pigmentet, og om det er muligt at udskifte hæmatoxylin med kationfarvestoffet Azur B til kernefarvningen og en blågrøn farvning af melanin pigmentet, således at melanin pigmentet ikke interfererer i billedet, da melanin pigmentet uden disse alternativer vil flyde sammen med reaktionsproduktet og fremstå brunt. Ydermere vurderes om det nuværende UltraView Universal AP Red Detection Kit kan udskiftes med OptiView DAB IHC Detection Kit, da metoden er mindre selektiv, og hvor der ses uspecifik baggrundsfarvning. Problemformulering Hvordan er det muligt, at optimere kvaliteten af detektionen af Melan A og HMB45 til diagnosticering af maligne melanomer, ved afblegning af melanin samt anvendelse af kationfarvestoffet Azur B, således at UltraView Universal Alkalisk Phosphatase Red Detection Kit kan udskiftes med Opti- View DAB IHC Detection Kit? Kvaliteten af detektionen undersøges ved at vurdere specificiteten og sensitiviteten ud fra et eget bestemt scoringssystem (optimal, good, borderline og poor) efter NordiQC s anbefalinger. Ved sensitivitet og specificitet forstås, at antistoffet skal være specifik til, at farve kun de ønskede celler og sensitiv nok til, at der kun ses en positiv reaktion, hvis HMB45 og Melan A er tilstede. Teori I teoriafsnittet beskrives først om hudens opbygning, diagnosticering af MM og de præanalytikse forhold. Dernæst beskrives den anvendte immunhistokemiske metode: demaskering, blokering af 6

8 endogen peroxidase, antistofferne HMB45 og Melan A, apparaturet, analyseprincippet og amplifikationskittet. Afblegningen af melanin pigmentet og kernefarvningen Azur B der anvendes som alternativer bliver belyst. Til sidst beskrives kort om kvalitetssikring. Hudens opbygning Det største organ hos mennesket er cutis, huden, bestående af to lag, epidermis, overhuden, og dermis, læderhuden, som begge hviler på det fedtholdigt- og løst bindevæv tela subcutana, underhuden. (10,11) Dermis er opbygget af bindevæv, og er det midterste lag, hvortil epidermis er hæftet til. Epidermis består af et flerlaget pladeepitel, som yderst danner en cellelag kaldet stratum corneum, hornlaget. Det er i stratum corneum, de affladede døde celler befinder sig, som med tiden afstødes og hermed gendannes ved proliferation i epitellaget. Keratinocytter er de pladeepitelceller som udgør flertallet af cellerne i epidermis, hvor en lille del er pigmentceller, som kaldes melanocytter. Ved keratinisering forskydes cellerne op mod stratum corneum, herunder prolifereres keratinocytter til kerneholdige affladede celler. I den epidermale side af basalmembranen i stratum basale fremtræder hver tiende celle som en melanocyt, som ligger iblandt keratinocytter. Se figur 2. (10 13) Figur 2: billedet viser en oversigt over hud. Stratum corneum, epidermis og dermis ses: Der er foretaget en HE-farvning. 20x Melanocytternes funktion er, at producere melanin, der fremstår som hudens brune pigment, som er med til at beskytte cellerne mod UV-stråling. Hudens farve er ikke afhængig af antallet af melanocytter, men tværtimod hastigheden af nedbrydelsen af melanin pigmentet (antallet af melonosomer i epitelcellerne). (14) UV-stråling øger antallet af melanocytter hermed også aktiviteten af melanocytterne. Melanocytterne er afrunde med en ikke så kraftig farve i cellelegemet, og har en del forgrenede cytoplasmatiske udløbere. Melanin pigmentet ses i melanocytternes udløbere som fremstår gulligbrune korn og kaldes melaningranula. Melanin dannes ved hjælp af enzymet tyrosinase, da melanin pigmentet er et polymerisationsprodukt af tyrosin, som er en essentiel aminosyre. Celleorganellen, melanosomet, indeholder enzymet tyrosinase, hvori dannelsen af melanin pigmentet sker. Melanosomer er membranbegrænset og ses som ovale organeller. (10,15) 7

9 Diagnosticering af MM MM opstår ved proliferation af melanocytterne i epidermis, og er en alvorlig cancer, som forekommer i alle aldre, derimod sjældent hos børn og hyppigst hos ældre personer i års alderen. Personer med mange nævi samt dem der i sin barndom har været udsat for meget sol, og ofte dem som er solariebruger, er i risiko for at udvikle MM. Ved mistanke af MM foretages der en excisionsbiopsi af modermærket til histologisk undersøgelse, hvorefter det er muligt at stille en diagnose. En HE-farvning kan afgøre om der er tegn på cancer, og giver et overblik over vævets morfologi, derfor mikroskoperes HE-snittet som det første. Hvis det viser sig, at vævet er malignt, foretages der en immunhistokemisk farvning. (2,10,11) Immunhistokemi Immunhistokemi er en metode til påvisning af antigenerne i vævet via antistoffer der er rettet mod de pågældende antigener. Ved immunhistokemi kan celledelingsaktiviteten samt cellelinjer bestemmes, og på den måde kan der udføres en bedre udredning af tumoren. Der vil altid være en kombination af en HE-farvning samt en immunhistokemisk farvning fra den samme vævsblok, når der skal stilles en diagnose. (5,10,14) Figur 3 viser arbejdsgangen og den anvendte immunhistokemiske metode. Figur 3: viser et flowdiagram over arbejdsgangen og den anvendte immunhistokemiske metode. 8

10 Fiksering Væv der modtages er fikseret i 4 % neutral buffer formaldehyd (NBF). Fikserings arten har en stor betydning for den efterfølgende analyse, der foretages på afdelingen, da antigenerne skal bevares for senere at kunne stille en korrekt diagnose. Der benyttes gelerende fiksativ, der virker således, at det etablere tværbindingerne mellem reaktive aminogrupper i antigenerne, hvormed antigenerne i vævet bliver maskeret. Fikseringstiden afhænger af vævstørrelsen. Den normale tidsramme for fiksering er imellem timer. Fikseringstiden skal normaliseres, for at antigenisiteten ikke påvirkes af fikseringen. Ved en kort fikseringstid er der en risiko for at antigenerne bliver fikseret i ethanol under præparering, hvor den tertiære struktur åbnes og dermed blotlægges de reaktive samt hydrofobe grupper. Dette har en betydning for den efterfølgende immunhistokemiske farvning, da de koagulerede antigener ikke kan påvises. Ved langvarig fiksering maskeres mange flere antigener og dette kræver at demaskeringstiden skal forlænges. (5,16) Præparering Efter fiksering infiltreres og indstøbes vævet i paraffin for at stabilisere vævet, når det skal mikrotomers. Processen består af en dehydrering med ethanol i en stigende koncentration. Ethanol i vævet udskiftes med klaringsmidlerne JFC og isopropanol. Der sker en paraffininfiltration i vævet og vævet indstøbes til sidst i paraffin. (5,17 19) Mikrotomering Ved mikrotomering skæres der vævssnitte ved 4 µm fra en vævsblok. Der anvendes en rotationsmikrotom. Vævsblokken grovtrimmes µm vævsnit til alt vævsoverfladen ses. Herefter fintrimmes vævsblokken, hvor den endelige vævssnit skæres ved 4 µm. Fra vandbadet samles vævssnittet op på et objektglas. Se figur 4 for mikrotomering (5,19 21) Figur 4: billedet viser mikrotomering af en vævsblok. Specialisten på KPA mikrotomer. 9

11 Tørring, afparaffinering og rehydrering Efter mikrotomering tørres vævssnittene en time ved 60 C i et varmeskab. Formålet er, at vævsnittet adhærer sig til objektglasset, så vævet under analysering ikke risikere at falde af. Der bruges forskellige objektglas til de forskellige farvninger. Objektglas der anvendes til almindelige farvninger er Klinipath. Hvortil immunfarvning benyttes TOMO Adhesion Microscope Slide. (5,16,22) Efter vævsinfiltrering og vævsindstøbning er der paraffin i og hermed også omkring vævssnittet, det kræver derfor en afparaffineringen. Afparaffineringen for de almindelige farvninger sker ved at anvende organiske opløsningsmidler såsom Tissue Clear, xylen, JFC og isopropanol, således at alt paraffin fjernes i og omkring vævssnittet. Derefter foretages en rehydrering i faldende koncentrationer af ethanol, hvor vævssnittet går fra at være hydrofob til hydrofil, således at der efterfølgende kan foretages en ønsket farvning af vævssnittet. Ved immunfarvningerne sker afparaffineringen og rehydrering på Ventana BenchMark ULTRA, hvor afparaffineringsmidlet er (EZ prep). Ved en kombination af varme og EZ prep fjernes paraffinen fra vævet, således at paraffinen smelter ved en høj temperatur og den smeltede paraffin fjernes herefter fra glasoverfladen af EZ prep. (5,16,18,23) Demaskering Ved fiksering er vævsantigernernes epitoper maskeret, derfor kan epitoperne ikke påvises i paraffinsnit af NBF-fikseret materiale. For at genskabe og immunaktivere de maskerede epitoper, bruges den varmebaserede teknik som kaldes Heat Induced epitop retrieval (HIER). Ved at demaskere med HIER ophæves methenbroerne mellem antigenerne ved at anvende en høj ph (CC1). CC1 en tris-baseret buffer, som kan gå ind i vævet og hydrolysere de kovalente bindinger, der dannes på baggrund af formalin. Hvis ikke demaskeringen sker tilstrækkeligt, kan det have en betydning for reaktionen og bindingsevnen for epitoperne til antistoffet. (5,16,24) Blokering af endogen aktivitet Efter demaskering er den efterfølgende trin blokering af endogen aktivitet i vævet. Alkalisk phosphatase og peroxidase er de to enzymer, der benyttes ved detektionen af de bundne antistoffer, hvor der sker en udfældning via en enzymatisk reaktion. Disse to enzymer findes naturligt i vævet, og derfor er det nødvendt at blokere enzymerne for endogen aktivitet inden detektionen, så disse enzymer ikke giver falsk positivt resultat. Enzymet peroxidase blokeres med H2O2 inden det primære 10

12 antistof tilsættes, således at enzymet spalter H2O2 til H2O og O2, hvor peroxidase forbruges. Enzymet alkalisk phosphatase blokeres med levamisol, som tilsættes til substratopløsning som består af Naptholphosphat og kromogenet Fast Red (5,16,25) Antistoffer Under inkubationen ved en immunhistokemisk farvning har det primær antistof flere væsentlige faktorer såsom koncentrationen, temperaturen, inkubationstiden og typen af antistoffet. Ved immunhistokemisk farvning, er det nødvendigt med en tilstrækkelig koncentration af antistoffet, således at der kan ses en positiv reaktion ved tilstedeværelse af antigenet i vævet. Hermed skal koncentrationen heller ikke være så højt, at der ses en uspecifik baggrundsfarvning. (3,4,16) Temperaturen under inkubationen af det primære antistof afhænger af antistoffet der benyttes. Ved at anvende en temperatur på 37 C forløber antigen-antistof reaktionen hurtigere. Dette betyder, at inkubationstiden af det primære antistof kan mindskes ved at hæve temperaturen. Inkubationstiden har ligeså en vigtig betydning for antigen-antistof reaktionen som temperaturen har. En lang inkubationstid af det primære antistof kan resultere en uspecifik baggrundsfarvning, hvorimod en kort inkubationstid kan resultere en svag reaktion, da antistoffet ikke kan binde sig tilstrækkelig til antigenet i vævet. (3,4,16) Typen af antistoffet der anvendes, har en betydning i forhold til specificiteten og sensitiviteten af antigen-antistof reaktionen. Der findes to slags antistoffer, monoklonale- og polyklonale antistoffer. Monoklonale antistoffer er mere specifikke, da de er fra samme klon og binder hermed til samme epitop på antigenet, hvorimod polyklonale antistoffer er fra forskellige kloner der binder sig til forskellige epitoper på det samme antigen. (16) Anvendte antistoffer Melan A og HMB45 Antistofferne der anvendes i immunhistokemi til diagnosticering af MM, er antistofferne Melan A og HMB45. Melan A og HMB45 er begge et monoklonalt mus antistof (IgG) og en melanocytmarkør, hvor Melan A påvises i aktive og inaktive melanocytter i cytoplasmaet. Derimod reagere HMB45 kun med aktive melanocytter, som findes i melanomer. Melan A og HMB45 analyseres sammen, da de ikke er lige specifikke og sensitive. (3,4) Se figur 5 og figur 6. 11

13 Figur 5: billedet viser en antigen-antistof reaktion i aktive og inaktive melanocytter på et hud væv med antistoffet Melan A. Melanin pigmentet fremstår brunt, 200x. Billedet er fra projektet. Figur 6: billedet viser en antigen-antistof reaktion i aktive melanocytter på et hud væv med antistoffet HMB45. Melanin pigmentet fremstår brunt, 200x. Billedet er fra projektet. Analyseprincipper på apparaturet Ventana BenchMark UTLRA De immunhistokemiske farvninger udføres på apparaturet Ventana BenchMark ULTRA. Apparaturet er opbygget således, at der kan påsættes 35 dispenser, 8 forskellige flasker reagenser, 2 store affaldsdunke forneden samt er der 30 individuelle varmeplader, hvor hvert objektglas kan ligge. Se figur 7. Varmekamrene er uafhængig af hinanden, og derfor kan de hver især have en protokol og temperatur, de analyseres efter. Se figur 8. For at vævssnittet på objektglasset ikke tørre ud og samtidig for ikke at risikere en fordampning af reagenserne, og for at sikre et stabilt vandholdigt miljø, tilføjes et ULTRA Liquid Coverslip (olielag). Uden problem er der mulighed for, at andre vandholdige reagenser kan passere olielaget fra oven og ned på objektglasset, således at det bliver blandet og hermed fordelt på hele objektglasset, hvor vævsnittet er. Dette foregår ved hjælp af en Figur 7: billedet viser opbygning af apparaturet Ventana BenchMark ULTRA. Billedet er taget på KPA på SVS 12

14 luftstrøm på vævssnittet. Se figur 9. Der pådryppes automatisk 100 µl antistof på hvert objektglas. Objektglassene skylles mellem hvert step med Reaction buffer, som fjerner alt det overskydende reagens. (26,27) Figur 8: billedet viser påsættelsen af et objektglas på en af varmekamrene. Billedet er taget på KPA på SVS Figur 9: viser en oversigt over olielag teknikken på apparaturen Ventana BenchMark ULTRA. Lavet i PowerPoint. 13

15 UltraView Universal AP Red Detection Kit For at detektere antigen-antistof reaktionen benyttes en indirekte teknik. Til visualiseringen kan der benyttes UltraView Universal AP Red Detection Kit. Analyseprincippet er beskrevet i trinvis i tabel 1 og på figur 10 ses en skitse over analyseprincippet. (28) Tabel 1: viser analyseprincippet for UltraView AP Red Detection Kit som er beskrevet i trinvis. Trin 1 Et primært antistof tilsættes og binder til antigenet i vævet. Trin 2 Der tilsættes et sekundært antistof (AP Red Multimer), der er Alkalisk Phosphatasemærket (AP), som bindes til det primære antistof. Trin 3 Visualisering sker ved at anvende en substratopløsning som består af Naptholphosfat og kromogenet Fast Red. Trin 4 Enhancer tilsættes inden substratopløsningen, som forstærker reaktionen. Trin 5 Substratopløsningen der tilsættes reagerer med AP Red Multimer, så der sker en enzymkatalyseret reaktion, hvor der fraspaltes en phospatgruppe fra Napthol, så der dannes et produkt. Produktet Napthol binder til kromogenet Fast Red, der danner et rødt udfældningsprodukt, hvor antigenet samt reaktionen er. Trin 6 Til sidst dannes et tungtopløseligt rødt udfældningsprodukt Figur 10: viser en skitse over analyseprincippet for UltraView AP Red Detection Kit 14

16 Amplifikationskit kit Amplifikationskit består af kanin-antistof (Amplifier A) og muse-antistof (Amplifier B) der anvendes til antistoffet Melan A som øger farvningsintensiteten for de muse-antistoffer som er svag farvet. Ved at benytte amplifikationskit forstærkes reaktionen og gøre farvningen mere sensitiv ved at Amplifier A (mærket med AP) binder primære antistoffet (Melan A), hvorefter Amplifier B binder til Amplifier A. På den måde kommer der flere lag på, og jo flere lag jo mere sensitiv bliver reaktionen. Det giver også en større udfældning. Amplifikationskit anvendes til antistoffet Melan A, som analyseres med UltraView Universal AP Red Detection Kit. (29) OptiView DAB IHC Detection Kit For at detektere antigen-antistof reaktionen benyttes en indirekte tre-lags teknik. Til visualiseringen kan der benyttes OptiView DAB IHC Detection Kit. Figur 11 viser en skitse over analyseprincippet, hvor analyseprincippet er beskrevet i trinvis i tabel 2. (30) Tabel 2: viser analyseprincippet for OptiView DAB IHC Detection kit som er beskrevet i trinvis. Trin 1 Et primært antistof tilsættes og binder til antigenet i vævet. Trin 2 Der tilsættes et sekundært antistof (HQ Universal Linker), der er Hydrox-Quinoxalinemærket (HQ), som bindes til det primære antistof. Trin 3 Herefter tilsættes et tertiært antistof (HRP Multimer), der er Horse Radish Peroxidasemærket (HRP). HRP Multimer binder til HQ-haptener på det sekundære antistof. Antigen-antistof reaktionen skal synliggøres/visualiseres, da HRP er usynligt. Trin 4 Visualisering sker ved at anvende et substrat H2O2 og kromogenet 3,3-diaminobenzidin (DAB). Trin 5 Ved hjælp af enzymet HRP sker der en reaktion mellem H2O2 og DAB. Dette sker ved en enzymkatalyseret proces, hvor der overføres en elektron fra DAB til H2O2, så DAB oxideres og H2O2 reduceres så der dannes 2H2O og DAB. Herefter dannes et tungtopløseligt brunt udfældningsprodukt, hvor antigenet samt reaktionen er. Trin 6 Til sidst tilsættes Copper, som forstærker og gør reaktionen mere sensitiv. 15

17 Figur 11: viser en skitse over analyseprincippet for OptiView DAB IHC Detection Kit 16

18 Kernefarvning Det sidste fase i proceduren for de immunhistokemiske farvninger er kernefarvning og blåning. Formålet med kernefarvningen er, at få et overblik over celler samt vævsmorfologi. Til kernefarvning for de immunhistokemiske analyser anvendes en metalkompleksfarvestof Aluminium-Hæmatein (Al-hæmatein). Al-hæmatein er positiv ladet og binder derfor til de negative ladet phosphatgrupper i DNA og farver hermed kernerne røde. Ved en kernefarvning med farvestoffet Al-hæmatein efterfølges der hver gang en blåning. Blåning kan enten ske med vand eller en buffer som har en ph, der er over 7. Ved blåning skifter kernerne farve fra rød til blå. Udover Al-hæmatein kan Azur B også benyttes til kernefarvning. Azur B er et kationfarvestof, der er positiv ladet, og reagerer med de negativ ladet phosphatgrupper i DNA og farver kernerne blå, der anvendes derfor ikke en blåning. Se figur 12 som viser strukturen for Azur B. (5,16,31) Figur 12: viser strukturformlen for kationfarvestoffet Azur B. (31) Kationfarvestoffer farver forskellige makromolekyler i vævet ved forskellige ph værdier. ph værdien afhænger alt efter, hvad der ønskes at blive farvet. Det er vigtigt at kende til gruppernes ladninger og pks (syrestyrkekonstant) værdier, for at benytte en korrekt ph til farvning af de forskellige makromolekyler. Farveopløsningen som anvendes til kernefarvning for kationfarvestoffer skal have en ph mellem ph 3 ph 5. pks værdien fortæller, hvornår de forskellige negative grupper er ioniseret, de negative grupper er ikke ioniseret under pks værdi, og hvor de er ioniseret over pks værdien. Tabel 3 viser en oversigt over de forskellige grupper, og deres pks værdi, samt hvilket ph de farves ved. (5,19) Tabel 3: viser en oversigt over de forskellige grupper (makromolekyler), deres pks værdi og hvilket ph de farves ved som er mærket med (+) ved farvning med kationfarvestoffer ph Sulfat (pks 0-1) 1,0 + Phoshatgrupper i DNA (pks ca.3) 2,5-3,0 + + Carboxylgrupper i carbohydrater og sure (pks 3-5) 4,0-5, Phenolgrupper (pks 8-10) Over 8,

19 Forskellen mellem Azur B og Al-hæmatein, er at Azur B har en ph på 4 og Al-hæmatein har en ph på 2,7. Al-hæmatein har en større affinitet overfor phosfatgrupper, end det har overfor carboxylsyre. Azur B farver heller ikke carboxylsyre ved en ph 2,7, men ved at anvende en Azur B opløsning på ph 4 farves både phosphatgrupper og carboxylsyre. Udover at kationfarvestoffet Azur B farver kernerne blå, farver Azur B også tilstedeværende melanin pigmenter blågrønne ved en ph over 3. Melanin pigmentet er et oxidationsprodukt af tyrasin. En forklaring på at melanin pigmentet farves er fordi der under dannelsen sidder carboxylsyre på melanin pigmentet, som er de negative grupper, der kan tiltrække kationfarvestoffet Azur B og hermed farves. (6,7) Se figur 13 som viser en udsnit af strukturen for melanin, hvorpå der sidder carboxylsyre som kan binde farvestoffet Azur B.(32) Figur 13: viser strukturformlen for melanin. (32) Der er en anden vigtig ting, som der skal tages højde for ved anvendelse af farvestofferne. De forskellige farvestoffer kan differentieres med forskellige væsker under eller efter farvningen, og derfor er det vigtigt, at kende til det farvestof, der anvendes. Se tabel 5 for en oversigt over de forskellige farvestoffer og hvad de differentieres med. (5,19) Tabel 4: viser et skema over farvestoffer og hvad de differentieres med. Syre Ethanol Base Vand Metalkompleksfarvestoffer Differentieres Kationfarvestoffer Differentieres Differentieres Afblegning Der laves en afblegning, hvis HE-farvningen viser, at være højt pigmenteret. Højt pigmenteret væv, kan forstyr og gøre det svært ved at skelne mellem melanin pigmenter og kromogenet DAB, hvis der anvendes OptiView DAB IHC Detection kit. Formålet med at afblege melanin pigmentet, er at gøre det nemmere at visualisere reaktionsproduktet. Afblegningen kan enten ske med H2O2 eller kaliumpermanganat (KMNO4). H2O2 kan enten fortyndes i demineraliseret vand eller Phosphate Buffered Saline (PBS) buffer. Det kræver sjældent en afblegning ved anvendelse af UltraView Universal AP Red Detection Kit, da der kan skelnes mellem melanin pigmentet og kromogenet Fast Red. (8,9) 18

20 Kvalitetssikring Eftersom farvningerne bliver færdige foretages der en intern kvalitetssikring af vævene i mikroskoperet. For almindelig farvninger medtages der en kontrolvæv hverdag, som mikroskoperes og vurderes. For de immunhistokemiske farvninger medtages et kontrolsnit på alle objektglas sammen med patientvævet. Kontrolsnittet skal være bestående af kendt negativt og positivt væv. Disse er medtaget for at sikre, at der for de positive kontroller ikke ses en falsk positiv reaktion og for de negative kontroller ikke ses en falsk negativ reaktion. Der sikres under mikroskoperingen, at alle kontroller med kontrolvæv, reagerer som de bør. Der noteres, hvis en af kontrollerne ikke har reageret som den skal. (16,33) Ekstern kvalitetssikring har til formål at optimere afdelingens protokoller/procedurer for immunhistokemiske farvninger. NordiQC sender prøvematerialer til laboratorier i landet, hvor hvert laboratorie laver en immunhistokemiske farvning på det tilsendte materiale. Metoden der benyttes til immunfarvningen beskrives og sendes tilbage til firmaet NordiQC sammen med resultaterne. NordiQC sammenligner og vurdere alle laboratoriernes resultater og finder den optimale anvendte metode. (16,34) Materiale og metode I dette afsnit ses der på projektets standardiserede fremgangsmåder og de anvendte materialer til projektet samt beskrives pilotprojektet. Derefter forklares hvorledes data er indsamlet og vurderet ud fra eget bestemt scoringssystem. Der beskrives hvordan litteratursøgningen er foretaget og til sidst beskrives etik. Design Der er udarbejdet en semikvalitativ undersøgelse baseret på et naturvidenskabeligt sammenligningsstudie på KPA på SVS, hvor der er lavet et pilotprojekt, som danner baggrund for bachelorprojektet. Inden selve undersøgelsen for bachelorprojektet, er der lavet 3 delforsøg. Delforsøg 1, delforsøg 2 og delforsøg 3 er lavet med formål, at finde en optimal ph, inkubationstid samt en farvning af melanin pigmentet med farvestoffet Azur B og en optimal opløsning og tid for H2O2 til brug ved afblegning af melanin pigmentet. Hertil er der farvet et He-snit for at se om melanin pigmentet er afbleget. 19

21 Disse snit sammenlignes. Resultaterne fra pilotprojektet er brugt til at udvikle samt udføre bachelorprojektet. Der er undersøgt hvilken metode, der kan anvendes for at forbedre og optimere kvaliteten til detektionen af antistofferne ved at: Fremstille to multiblokke A og B fra forskellige patienter med kendt MM samt højpigmenteret væv, som udvælges indenfor tidsrammen til samt to væv fra 2007 Fremstille en kontrolblok bestående af: MM, appendix, binyre og nyre Afprøve protokollerne: Protokol 31: Melan A med UltraView Universal AP Red Detection Kit Protokol 43: HMB45 med UltraView Universal AP Red Detection Kit Protokol 395: Melan A (afblegning) med OptiView DAB IHC Detection Kit Protokol 396: HMB45 (afblegning) med OptiView DAB IHC Detection Kit Protokol 394: Melan A (Azur B) med OptiView DAB IHC Detection Kit Protokol 393: HMB45 (Azur B) med OptiView DAB IHC Detection Kit som laves på baggrund af de videnskabelige artikler (6 9), fra firmaet datablad for antistofferne HMB45 og Melan A samt resultaterne gruppen har vurderet optimal fra pilotprojektet. Resultaterne er efterfølgende vurderet ud fra et eget bestemt scoringssystem som er udarbejdet efter NordiQC s anbefalinger. Materialer Apparatur Tabel 5: viser en oversigt over de anvendte apparatur til projektet Apparatur Thermo Scientific Microm Rotationsmikrotom Ventana BenchMark Ultra 0 Mikroskop Nikon Eclipse CI Tissue Tek Prisma Tissue Tek Film NanoZoomer 2,0 HT Testo 108 termometer Varmeplade Meterlab PHM 201 ph-meter Memmert Vandbad Indstøbnings maskine 20

22 Reagenser Tabel 6: viser en oversigt over de anvendte antistoffer samt Lot nummer til projektet Antistoffer Lot nummer Monoklonalt antistof Melan A A103 Monoklonalt antistof melanosom HMB45 G02344 G02367 Tabel 7: viser en oversigt over de anvendte detektionskit samt Lot nummer til projektet Detektionskit Lot nummer UltraView Universal AP Red Detection Kit* UltraView Universal AP Red MULTIMER G01030-G01032 UltraView Universal AP Red FAST RED A G01030-G01035 UltraView Universal AP Red FAST RED B G01030-G01036 UltraView Universal AP Red NAPHTHOL G01030-G01034 UltraView Universal AP Red ENHANCER G01030-G01031 OptiView DAB IHC Detection Kit* OptiView PEROXIDASE INHIBITOR OptiView HQ LINLER OptiView HRP MULTIMER OptiView H2O2 OptiView DAB OptiView COPPER G03904-G03906 G03904-G03908 G03904-G03909 G03904-G03912 G03904-G03911 G03904-G03913 Amplifier Amplifier A Amplifier B G01269-G01270 G01269-G01271 Tabel 8: viser en oversigt over de øvrige anvendte reagenser samt Lot nummer til projektet Øvrige reagenser Lot nummer Hæmatoxylin* G02647 Blåningsreagens G03169 Ethanol 99 %*

23 Ethanol 96 %* Ethanol 70 % Azur B 1 B 489 Pertex* Xylin* Demineraliseret vand Clear line håndopvask Hydrogenperoxid 30 % PBS buffer Natriumklorid (NaCL) Kaliumklorid (KCL) Natriumhydrogenfosfat (Na2HPO4) Kaliumdihydrogenphospat (KH2PO4) Bulk væsker EZ prep ULTRA LCS* F07090 SSC Reaction buffer ULTRA CC1 F09608 ULTRA CC2 F08166 Utensilier Tabel 9: viser en oversigt over de anvendte utensilier til projektet Utensilier TOMO objektglas Pipettespidser Tragt Plastik kar Magnet Copligsglas Varmeplade engangspipetter Dækglas Vugger Filterpapir Bægerglas 22

24 Kolber Nitrilhandsker Reagenser og sikkerhed Det er vigtigt, at have kendskab til de reagenser der anvendes til immunfarvningerne, så de forskellige reagenser kan håndteres korrekt. Piktogrammer, farebetegnelser samt sikkerhedssætningerne fortæller, hvordan de forskellige reagenser skal håndteres og opbevares. Piktogrammer anvendes på de farlige reagenser, som er en form for advarsel til anvenderen. Anvenderen bliver gjort opmærksom på reagensernes egenskaber, således at anvenderen kan beskytte sig. Sammen med piktogrammer medfølger der altid en eller flere risiko- og sikkerhedssætninger. Risikosætningerne fortæller anvenderen, hvilke risiko, der kan være ved at anvende reagenset. Derimod fortæller sikkerhedssætninger, hvordan anvenderen kan beskytte sig selv under anvendelsen af reagenset. Se tabel 10 som viser en oversigt over, de reagenser der anvendes til immunfarvningerne med piktogrammer, risikoog sikkerhedssætninger. (35 38) Tabel 10: reagenser der anvendes ved immunfarvninger med sikkerhedssætninger, risikosætninger og piktogrammer. (35,36) Reagenser UltraView Universal AP Red Detection Kit OptiView DAB IHC Detection Kit Sikkerhedssætninger Risikosætninger H315: Forårsager hudirritation. H318: Forårsager alvorlig øjenskade H350: Kan fremkalde kræft. P202: Anvend ikke produktet, før alle advarsler er læst og forstået. P264: Vask eksponerede områder grundigt efter brug. P201:Indhent særlige anvisninger før brug. P305/351/338: Ved kontakt med øjnene: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. P308/313: Ved eksponering eller mistanke om eksponering: Søg lægehjælp. Piktogrammer 23

25 Hæmatoxylin II Ethanol 99 % Ethanol 96 % Xylin og Pertex H302: Farlig ved indtagelse. H315: Forårsager hudirritation. H319: Forårsager alvorlig øjen irritation. H335: Kan forårsage irritation af luftvejene. P261: Undgå indånding af damp P280: Bær beskyttelseshandsker P305/351/338: Ved kontakt med øjnene: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. P308/313: Ved eksponering eller mistanke om eksponering: Søg lægehjælp. R11: Meget brandfarlig S7: Emballagen skal holdes tæt lukket S16: Holdes væk fra antændelseskilder-rygning forbudt. R10: Brandfarlig R20/21: Farlig ved indånding og ved hudkontakt R38: Irriterer huden S25: Undgå kontakt med øjnene S36/37: Brug særligt arbejdstøj og egnede beskyttelseshandsker. ULTRA LCS H412: Skadelig for vandlevende organismer, med langvarig virkninger. P501: Indholdet/beholderen bortskaffes i overensstemmelse med lokale regler. P273: Undgå udledning til miljøet. 24

26 Sikkerhed og miljø En anden vigtig ting, er at kende til hvordan affald bortskaffes. Dette har til formål at affald behandles og sorteres korrekt. Tabel 11 viser en oversigt over hvordan de forskellige reagenser, der anvendes til immunfarvningerne skal bortskaffes. (38) Tabel 11: viser en oversigt over hvordan affald skal bortskaffes. (38) Affald Tomme dispensere på apparaturet Bortskaffelse Kan smides i skaldepanden 2 affaldsdunke på apparaturet Kan tømmes i gulvafløbet på afdelingen Ethanol Xylen Affald til rensningsanlæg C C-affald 10 % H2O2 Kan hældes i vasken Azur B Hældes i kemikalieafløb Prøvemateriale Prøvemateriale der anvendes til projektet er to multiblokke, multiblok A og multiblok B, som er to paraffinblokke med 5 forskellige patientvæv, der er høj pigmenteret samt kendt MM. Som kontrol til immunfarvningerne laves der en multikontrolblok bestående af MM, appendix, binyre og nyre. Der anvendes MM og binyre som positiv kontrol og appendix og nyre som negative kontrolvæv for Melan A og MM som positiv kontrol, og appendix, binyre og nyre som negativ kontrol for HMB45, se tabel 12. Tabel 12: viser en oversigt over multikontrolblokket, der anvendes som positiv og negativ kontrol ved immunfarvningerne. Der vises hvilket slags væv HMB45 og Melan A er positiv og negativ for. Multikontrolblok Antistoffer Positiv/negativ reaktion Væv HMB45 og Melan A Positiv MM med melanin pigment HMB45 og Melan A Negativ Appendix Melan A Positiv Binyre HMB45 og Melan A Negativ Nyre 25

27 Metode Fremstilling af reagenser 0,1 % Azur B opløsning 0,1% Azur B opløsningen fremstilles som vist på figur 14. Opløsning anvendes både til pilot- og bachelorprojektet. Til pilotprojektet fremstilles tre 0,1 % Azur B opløsning ved ph 4, 6 og 8.Til bachelorprojektet anvendes en 0,1 % Azur B opløsning ved ph 4. Koncentrationen af opløsningen er lavet efter forskriften for farveøvelse Azur A og Eosin Y som ses i bilag 1. Figur 14: viser hvordan der fremstilles en 0,1 % opløsning Azur B. 26

28 10 % H2O2 opløsning Der fremstilles to 10 % H2O2 opløsning. Den første opløsning 1 er fortyndet i demineraliseret vand, hvor den anden opløsning 2 er fortyndet i PBS buffer. Opløsning 1: 30 % H2O2 fortyndet i 100 ml demineraliseret vand 10 % H2O2 opløsning fremstilles som vist på figur 15. Denne opløsning anvendes både til pilot- og bachelorprojektet. Opløsningen er lavet efter den anbefalede koncentration i artiklen Melanin bleaching with dilute hydrogen peroxide: a simple and rapid method. (9) Figur 15: viser hvordan 10 % H 2O 2 opløsning fortyndet i demineraliseret vand fremstilles. Opløsning 1 Opløsning 2: 30 % H2O2 fortyndet i 100 ml PBS buffer 10 % H2O2 opløsning fremstilles som vist på figur 16. Denne opløsning anvendes kun til pilotprojektet. Opløsningen for PBS er lavet efter en protokol fundet på nettet. (39) Figur 16: viser hvordan 10 % H2O2 opløsning fortyndet i PBS buffer er fremstilles. Opløsning 2 27

29 Pilotprojekt Pilotprojektet er udført den 25, 26 og 27 oktober i uge 43. Delforsøg 1 (Første kørsel udført den 25 oktober Anden kørsel udført den 26 oktober 2016) Delforsøg 1 er lavet for at finde en optimal ph samt inkubationstid for Azur B. Fremgangsmåden for delforsøg 1 ses på figur 17. Til delforsøget er der anvendt 6 x colon væv, der på afdelingen bruges som HE-kontrol. Dette er er medtaget for at påvise kernefarvningen. 0,1 % Azur B opløsning som anvendes ses i figur 14. Objektglassene er nummeret med ph og tid. Figur 17: viser et flowdiagram over delforsøg 1 første kørsel. Det optimale ph markeret med lyseblå. Det er lavet i PowerPoint. 28

30 ph 4 er det optimale ph for Azur B ved første kørsel. Inkubationstiden er ikke valgt, da det viser, at der er meget baggrundfarvning samt en stærk kernefarvning i vævet. Derfor er der lavet en anden kørsel med ph 4 i 1, 2 og 3 minutter. Figur 18 viser fremgangsmåden for anden kørsel. Figur 18: viser et flowdiagram over delforsøg 1 anden kørsel. Det optimale ph samt inkubationstid er markeret med lyseblå. Det er lavet i PowerPoint. 29

31 Delforsøg 2 (udført den 27 oktober 2016) Delforsøg 2 er lavet for at afprøve om melanin pigmentet farves med farvestoffet Azur B. Azur B opløsningen der anvendes er ved ph 4 i 1 minut. Til delforsøget er der anvendt hud væv, der er højt pigmenteret. Dette er medtaget for at påvise at melanin pigmentet farves blågrøn. Objektglassene er nummeret med farvestoffet, ph og tid. Fremgangsmåden for delforsøg 2 ses på figur 19. Figur 19 viser et flowdiagram over delforsøg 2. 30

32 Delforsøg 3 (udført den 25 oktober 2016) Delforsøg 3 er lavet for at finde en optimal opløsning og tid for H2O2 til brug ved afblegning af melanin pigmentet. Fremgangsmåden for delforsøg 3 ses på figur 20. Til delforsøget er der anvendt hud væv med melanin pigment. Dette er er medtaget for at påvise at melanin pigmentet afbleges. Objektglassene er nummeret med type af opløsning og tid. Figur 20: viser et flowdiagram over delforsøg 3. Den optimale opløsning er 10 % H 2O 2 opløsning 1 i 40 minutter som er markeret med lyseblå. Det er lavet i PowerPoint 31

33 Bachelorprojektet (udført i uge 44 og 45) Udvælgelse af væv Der er valgt at benytte patientmateriale til projektet, for at få et virkelighedsnært billede og for at bevise den biologiske variation mellem patienterne. Udvælgelseskriterier af prøvemateriale til projektet er patienter med kendt MM og væv der er høj pigmenteret. Ydermere stilles der kriterie for, at det skal være patienter i alderen 40 og derover, da det er disse patienter, der hyppigt udvikler MM. I samarbejde med lægesekretæren er der fundet rekvisitionsnumre på patienter med diagnosen MM i perioden til Gruppen har gennem patologisystemet (CGI) søgt på rekvisitionsnumrene, hvor hver anamnese er læst igennem og derefter er udvalgt 10 patientmaterialer efter de kriterier, der er stillet. HE-snittet er fundet frem og herefter vurderet for alle 10 patientprøver. Der er udvalgt 8 patientmateriale i perioden til og to patientmateriale fra Mens en fra gruppen er i gang med at mikroskopere He-snittet for at finde og markere det sted, der skal udstanses, finder de andre to i gruppen paraffinblokkene, hvorfra væv skal udstanses til at fremstille multiblok A og multiblok B. Inden vævet kan anvendes til projektet skal der indhentes tilladelse fra patologen Niels Korsgaard. Patologen tjekker de markerede steder på He-snittet for at se om der er væv nok, til at det kan udstanses og anvendes til projektet. Der indhentes tilladelse den Ved udvælgelsen af kontrolprøvematerialet til immunfarvningerne er der taget højde for, at det er væv som både reagere positivt og negativt for antistofferne HMB45 og Melan A. Der er medtaget MM med melanin pigment og binyre som positiv kontrol og som negativ kontrol er der medtaget appendix og nyre. MM med melanin pigment er valgt for at sikre, at der sker er en positiv reaktion, da der er melanocytter tilstede i vævet som reagerer med HMB45 og Melan A. For at afprøve metoden med afblegning af melanin pigmentet, er det medtaget MM væv som er højtpigmenteret, for at se om det kan være et alternativ til at optimere kvaliteten af antigen-antistof reaktionen. Binyre er medtaget som en positiv kontrol for antistoffet Melan A klon A103. Der findes en epitop i binyre som kun reagere med antistoffet Melan A som har klon A103. Appendix og nyre er valgt som negativ kontrol for antistofferne, da der ikke findes melanocytter i vævet som antistofferne kan reagere med. 32

34 Fremstilling af multikontrolblok, multiblok A og multiblok B De multiblokke der anvendes til projektet fremstilles d af specialisten på afdelingen. Se figur 21 som viser et flowdiagram for fremstillingen af multiblokkene. Se figur 22 for rækkefølgen over placeringen af de forskellige patientvæv samt kontrolvæv fordelt på multiblok A, multiblok B og kontrolmultiblok. P står for patient. K står for kontrol. Figur 21: viser en oversigt over, hvordan multiblok A, multiblok B og multikontrolblok er fremstillet. Billederne er fra projektet. Lavet i PowerPoint Figur 22: viser en oversigt over nummerering af prøverne, deres placering og hvad det er for en slags væv 33

35 Der er lavet forskellige protokoller på baggrund af de videnskabelige artikler (6 9), fra firmaet datablad for antistofferne HMB45 og Melan A samt de resultater gruppen har vurderet optimal fra pilotprojektet se tabel 13. Tabel 13 viser en oversigt over protokolnummer, protokol navn samt hvilke detektionskit der anvendes. Der ses yderligere hvilke glas nummer der analyseres ved de forskellige protokoller. Alle immunfarvningerne analyseres efter de forskellige protokoller. Tabel 13: viser en oversigt over de protokoller der anvendes til projektet. Protokol Protokol Detektionskit Glas nummer nummer navn Protokol 31 Melan A UltraView Universal AP Red Detection Kit Protokol 43 HMB45 UltraView Universal AP Red Detection Kit Glas 1: BLOK A Glas 2: BLOK B Glas 3: BLOK A Glas 4: BLOK B Protokol 395 Melan A OptiView DAB IHC Glas 5: BLOK A (Afblegning) Detection Kit Glas 6: BLOK B Protokol 396 HMB45 OptiView DAB IHC Glas 7: BLOK A (Afblegning) Detection Kit Glas 8: BLOK B Protokol 394 Melan A OptiView DAB IHC Glas 9: BLOK A (Azur B) Detection Kit Glas 10: BLOK B Glas 11: BLOK A K Glas 12: BLOK B K Protokol 393 HMB45 OptiView DAB IHC Glas 13: BLOK A (Azur B) Detection Kit Glas 14: BLOK B Glas 15: BLOK A K Glas 16: BLOK B K 34

36 Dataindsamling For at opnå data til bachelorprojektet er der d mikrotomeret 9 vævsnit fra multiblok A og 9 vævsnit fra multiblok B. Disse vævsnit er fordelt på 18 TOMO Adhesion Microscope glas, hvortil der på alle glas er påsat et kontrolsnit, som er mikrotomeret fra multikontrolblokket. To af glassene er der foretaget en HE-farvning for hver multiblok. Alle snit er mikrotomeret ved 4 µm. På figur 23 ses fordelingen. Figur 23: viser en oversigt over fordelingen af de snit der er mikrotomeret. Øverst ses alle de glas som består af et multikontrol snit samt vævsnit fra multiblok A. Nederst ses alle de glas som består af et multikontrol snit samt vævsnit fra multiblok B. Er lavet i PowerPoint. 35

37 I tabel 14 ses en detaljeret beskrivelse af de anvendte protokoller med tid, temperatur og rækkefølge for hvert glas. Tabellen viser rækkefølgen for de anvendte detektionskit. Tabel 14: viser en oversigt over de anvendte protokoller med tid, temperatur og rækkefølge. UltraView Universal AP Red Afparaffinering Demaskering Peroxidase Inhibitor Primær antistof Melan A Primær antistof HMB45 Sekundær antistof Tertiær antistof Forstærker Substrat-kromogen opløsning Detection Kit Glassene 1-4 afparaffineres på apparaturet Ventana BenchMark ULTRA Glassene 1-4 demaskeres ved 64 min. ved 100 C og ved ph 8,5 (CC1) Der tilsættes primær antistof Melan A til glas 1 og glas 2 og inkuberes i 32 min. Der tilsættes primær antistof HMB45 til glas 3 og glas 4 og inkuberes i 28 min. Der tilsættes Amplifier A til glas 1 og glas 2 og inkuberes i 8 min. Der tilsættes Amplifier B til glas 1 og glas 2 og inkuberes i 8 min. Der tilsættes UV Red MULTIMER til glassene 1-4 og inkuberes i 12 min. Der tilsættes UV Red ENHANCER til glassene 1-4 og inkuberes i 4 min. Der tilsættes UV Fast Red A og UV Red Naphthol til glassene 1-4 og inkuberes i 8 min. Der tilsættes UV Fast Red B til glassene og inkuberes i 8 min. OptiView DAB IHC Detection Kit Glassene 9, 10, 13 og 14 afparaffineres på apparaturet Ventana Bench- Mark ULTRA Glassene 5-8, 11, 12, 15 og 16 afparaffineres på Tissue-Tek Prisma Glassene 5-16 demaskeres i 48 min. ved 100 C og ved ph 8,5 (CC1) Der tilsættes OV PEROXIDASE IN- HIBITOR til glassene 5-16 Der tilsættes primær antistof Melan A til glassene 5, 6, 9-12 og inkuberes i 16 min. Der tilsættes primær antistof HMB45 til glassene 7, 8, og inkuberes i 16 min. Der tilsættes OV HQ linker til glassene 5-16 og inkuberes i 8 min. Der tilsættes OV HRP MULTIMER til glassene 5-16 og inkuberes i 4 min. Der tilsættes OV H2O2 og OV DAB til glassene 5-16 og inkuberes i 8min. 36

38 Forstærker Kernefarvning Blåningsreagens Der tilsættes hæmatoxylin til kernefarvning til glassene 1-4 og inkuberes i 8 min. Der tilsættes blåningsreagens til glassene glas og inkuberes i 8 min. Der tilsættes OV Copper til glassene 5-16 og inkuberes i 4 min. Glassene 9-16 kernefarves manuelt i coplingsglas med Azur ved ph 4 i 1 min. Der fortages en rehydrering med glassene 5-8, 11, 12, 15 og 16 inden afblegning med H2O2 og en dehydrering af alle 16 glas efter kernefarvning. Rehydrering foretages i faldende koncentrationer af ethanol og dehydrering foretages i stigende koncentrationer af ethanol. Denne form for rehydrering og dehydrering anvendes på KPA til alle almindelige farvning samt immunhistokemiske farvninger. Se figur 24. Figur 24: viser en oversigt over rehydrering og dehydrering. Lavet i powerpoint 37

39 Fremgangsmåden for hver glas er beskrevet i step som ses i tabellerne 15,16,17 og 18 Tabel 15: Fremgangsmåden for Melan A og HMB45, hvor der anvendes UltraView Universal AP Red Detection Kit. Til Melan A (glas 1 og glas 2) anvendes der amplifikationskit. Glas 1 og glas 2 analyseres efter protokol 31 hvor glas 3 og glas 4 analyseres efter protokol 43. Step Melan A HMB45 Glas 1 og glas 2 Glas 3 og glas 4 1 Alle 4 glas mærkes med identifikation 2 Indsættes i varmeskab ved 60 C i en time. 3 Påsættes Ventana Benchmark ULTRA på varmepladerne 4 Reagenser og antistoffet påsættes på apparaturet (UltraView Universal AP Red Detection Kit, Amplifikationskit, hæmatoxylin, blåningsreagens, Melan A og HMB45) 5 Der varmes op til 75 C i 4 min. og der sker en afparaffinering 6 Demaskering i 64 min. ved 100 C og ved ph 8,5 (CC1) 7 Der tilsættes primær antistof Melan A til glas 1 og glas 2 og inkuberes i 32 min. Der tilsættes primær antistof HMB45 til glas 3 og glas 4 og inkuberes i 28 min. 8 Der tilsættes Amplifier A til glas 1 og glas 2 og inkuberes i 8 min. 9 Der tilsættes Amplifier B til glas 1 og glas 2 og inkuberes i 8 min. 10 Der tilsættes UV Red MULTIMER til alle 4 glas og inkuberes i 12 min. 11 Der tilsættes UV Red ENHANCER til alle 4 glas og inkuberes i 4 min. 12 Der tilsættes UV Fast Red A og UV Red Naphthol til alle 4 glas og inkuberes i 8 min. 13 Der tilsættes UV Fast Red B til alle 4 glas og inkuberes i 8 min. 14 Der tilsættes hæmatoxylin til kernefarvning til alle 4 glas og inkuberes i 8 min. 15 Der tilsættes blåningsreagens til alle 4 glas og inkuberes i 8 min. 16 Tages af fra Ventana Benchmark ULTRA 17 Vaskes i sæbevand 18 Dryppes 10 gange i 70 % ethanol 19 Dryppes 10 gange i 2 x 96 % ethanol 20 Dryppes 10 gange i 4 x 99 % ethanol og henstår i 5 min 21 Ved Tissue-Tek Film maskinen påsættes film og alle 4 glas henstår i 20 min. i stinkskabet 38

40 Tabel 16: Fremgangsmåden for Melan A og HMB45 (afblegning af melanin pigmentet), hvor der anvendes OptiView DAB IHC Detection Kit. Glas 5 og glas 5 analyseres efter protokol 395 hvor glas 7 og glas 8 analyseres efter protokol 396. STEP Melan A (afblegning) HMB45 (afblegning) Glas 5 og glas 6 Glas 7 og glas 8 1 Alle 4 glas mærkes med identifikation 2 Indsættes i varmeskab ved 60 C i en time 3 Afparaffineres på Tissue-Tek Prisma 4 Dryppes 10 gange i 4 x 99 % ethanol 5 Dryppes 10 gange i 2 x 96 % ethanol 6 Dryppes 10 gange i 70 % ethanol og henstår i 5 min. 7 Står i rindende vand i 2 min. 8 Nedsænkes i 10 % H2O2 opløsning på vandbadet ved 65 C i 40 min. 9 Tages op af 10 % H2O2 opløsning og står i rindende vand i 5 min. 10 Påsættes Ventana Benchmark ULTRA på varmepladerne 11 Reagenser og antistoffet påsættes på apparaturet (OptiView DAB IHC Detection Kit, hæmatoxylin, blåningsreagens, Melan A og HMB45) 12 Demaskering i 48 min. ved 100 C og ved ph 8,5 (CC1) 13 Der tilsættes OptiView PEROXIDASE INHIBITOR til alle 4 glas 14 Der tilsættes primær antistof Melan A til glas 5 og glas 6 og der tilsættes primær antistof HMB45 til glas 7 og glas 8 hvor alle 4 glas inkuberes i 16 min. 15 Der tilsættes OV HQ linker til alle 4 glas og inkuberes i 8 min. 16 Der tilsættes OV HRP MULTIMER til alle 4 glas og inkuberes i 4 min. 17 Der tilsættes OV H2O2 og en dråbe OV DAB til alle 4 glas og inkuberes i 8min. 18 Der tilsættes OV Copper til alle 4 glas og inkuberes i 4 min. 19 Der tilsættes hæmatoxylin til kernefarvning til alle 4 glas og inkuberes i 8 min. 20 Der tilsættes blåningsreagens til alle 4 glas og inkubation i 8 min. 21 Tages af fra Ventana Benchmark ULTRA 22 Vaskes i sæbevand 23 Dryppes 10 gange i 70 % ethanol 24 Dryppes 10 gange i 2 x 96 % ethanol 25 Dryppes 10 gange i 2 x 99 % ethanol og henstår i 5 min. 26 Ved Tissue-Tek Film maskinen påsættes film og alle 4 glas henstår i 20 min. 39

41 Tabel 17: Fremgangsmåden for Melan A og HMB45 (Kernefarvning med Azur B), hvor der anvendes OptiView DAB IHC Detection Kit. Glas 9 og glas 10 analyseres efter protokol 394 hvor glas 13 og glas 14 analyseres efter protokol 393. STEP Melan A (Azur B) HMB45 (Azur B) Glas 9 og glas 10 Glas 13 og glas 14 1 Alle 4 glas mærkes med identifikation 2 Indsættes i varmeskab ved 60 C i en time 3 Påsættes Ventana Benchmark ULTRA på varmepladerne 4 Reagenser og antistoffet påsættes på apparaturet (OptiView DAB IHC Detection Kit, Melan A og HMB45) 5 Der varmes op til 75 C i 4 min. og der sker en afparaffinering 6 Demaskering i 48 min. ved 100 C og ved ph 8,5 (CC1) 7 Der tilsættes OptiView PEROXIDASE INHIBITOR til alle 4 glas 8 Der tilsættes primær antistof Melan A til glas 9 og glas 10 og der tilsættes primær antistof HMB45 til glas 13 og glas 14 hvor alle 4 glas inkuberes i 16 min. 9 Der tilsættes OV HQ linker til alle 4 glas og inkuberes i 8 min. 10 Der tilsættes OV HRP MULTIMER til alle 4 glas og inkuberes i 4 min. 11 Der tilsættes OV H2O2 og en dråbe OV DAB til alle 4 glas og inkuberes i 8min. 12 Der tilsættes OV Copper til alle 4 glas og inkuberes i 8 min. 13 Når apparaturet alarmere tages alle 4 glas af fra Ventana Benchmark ULTRA 14 Vaskes i sæbevand 15 Står i rindende vand i 2 min. 16 Kernefarves manuelt i coplingsglas med Azur ved ph 4 i 1 min. 17 Står i rindende vand i 2 min. 18 Dryppes 10 gange i 70 % ethanol 19 Dryppes 10 gange i 2 x 96 % ethanol 20 Dryppes 10 gange i 2 x 99 % ethanol og henstår i 5 min 21 Ved Tissue-Tek Film maskinen påsættes film og alle 4 glas henstår i 20 min. 40

42 Tabel 18: Fremgangsmåden for Melan A og HMB45 (afblegning af melanin pigmentet og en kernefarvning med Azur B), hvor der anvendes OptiView DAB IHC Detection Kit. Glas 11 og glas 12 analyseres efter protokol 394 hvor glas 15 og glas 16 analyseres efter protokol 393. STEP Melan A (afblegning + Azur B) HMB45 (afblegning + Azur B) Glas 11 og glas 12 Glas 15 og glas 16 1 Alle 4 glas mærkes med identifikation 2 Indsættes i varmeskab ved 60 C i en time 3 Afparaffineres på Tissue-Tek Prisma 4 Dryppes 10 gange i 4 x 99 % ethanol 5 Dryppes 10 gange i 2 x 96 % ethanol 6 Dryppes 10 gange i 70 % ethanol og henstår i 5 min. 7 Står i rindende vand i 2 min. 8 Nedsænkes i 10 % H2O2 opløsning på vandbadet ved 65 C i 40 min. 9 Tages op af 10 % H2O2 opløsning og står i rindende vand i 5 min. 10 Påsættes Ventana Benchmark ULTRA på varmepladerne 11 Reagenser og antistoffet påsættes på apparaturet (OptiView DAB IHC Detection Kit, Melan A og HMB45) 12 Demaskering i 48 min. ved 100 C og ved ph 8,5 (CC1) 13 Der tilsættes OptiView PEROXIDASE INHIBITOR til alle 4 glas 14 Der tilsættes primær antistof Melan A til glas 11 og glas 12 og der tilsættes primær antistof HMB45 til glas 15 og glas 16 hvor alle 4 glas inkuberes i 16 min. 15 Der tilsættes OV HQ linker til alle 4 glas og inkuberes i 8 min. 16 Der tilsættes OV HRP MULTIMER til alle 4 glas og inkuberes i 4 min. 17 Der tilsættes OV H2O2 og en dråbe OV DAB til alle 4 glas og inkuberes i 8min. 18 Der tilsættes OV Copper til alle 4 glas og inkuberes i 4 min. 19 Når apparaturet alarmere tages alle 4 glas af fra Ventana Benchmark ULTRA 20 Vaskes i sæbevand 21 Står i rindende vand i 2 min. 22 Kernefarvning manuelt i coplingsglas med Azur ved ph 4 i 1 min. 23 Står i rindende vand i 2 min. 24 Dryppes 10 gange i 70 % ethanol 25 Dryppes 10 gange i 2 x 96 % ethanol 26 Dryppes 10 gange i 2 x 99 % ethanol og henstår i 5 min 41

43 27 Ved Tissue-Tek Film maskinen påsættes film og alle 4 glas henstår i 20 min. Scoringssystem Resultaterne af immunfarvningerne klassificeres og vurderes af gruppen i forhold til specificiteten og sensitiviteten af detektionen af HMB45 og Melan A på et multiblok A og et multiblok B ud fra et eget bestemt scoringssystem efter NordiQC s anbefalinger, hvor der klassificeres ved fire forskellige score (optimal, good, borderline og poor). Se tabel 19, 20, 21, 22, 23 og 24 for de kriterier der er opstillet for scoringssystemet ved de forskellige immunfarvninger. Disse scoringer bliver indført i et scoringsskema som ses under resultat afsnittet. (3,4,16) Tabel 19: viser et skema over klassificering for Melan A, hvor der anvendes UltraView Universal AP Red Detection Kit. Klassificering for Melan A på UltraView Universal AP Red Detection Kit Optimal Good Borderline Poor Moderat til stærk distinkt granulær cytoplasmisk farvereaktion - rødt. Den kromogene farve er afgrænset til cytoplasma i melanocytterne samt udløbere. Der ses ingen uspecifik farvning af bindevæv. Moderat til svag distinkt granulær cytoplasmisk farvereaktion - rødt. Den kromogene farve er afgrænset til cytoplasma i melanocytterne samt udløbere. Der ses svag uspecifik farvning af bindevæv. Moderat til svag cytoplasmisk farvereaktion - rødt. Den kromogene farve ses spredt i reaktive celler. Der ses svag uspecifik farvning af bindevæv svag rød. Kernerne fremstår blå. Kernerne fremstår blå. Kernerne fremstår blå. Farven er ikke distinkt, og diffunderer ud i omkringliggende væv. Tabel 20: viser et skema over klassificering for HMB45, hvor der anvendes UltraView Universal AP Red Detection Kit. Klassificering for HMB45 på UltraView Universal AP Red Detection Kit Optimal Good Borderline Poor Moderat til stærk cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske celler- rødt. Den kromogene farve er afgrænset til områder med malignt melanom. Moderat til svag cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske celler - rødt. Den kromogene farve er afgrænset til områder med malignt melanom. Moderat til svag cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske celler - rødt. Den kromogene farve ses spredt i reaktive celler. Farven er ikke distinkt, og diffunderer ud i omkringliggende væv. 42

44 Der ses ingen uspecifik farvning af bindevæv. Der ses svag uspecifik farvning af bindevæv. Der ses svag uspecifik farvning af bindevæv svag rød. Kernerne fremstår blå. Kernerne fremstår blå. Kernerne fremstår blå. Tabel 21: viser et skema over klassificering for Melan A, hvor der anvendes OptiView DAB IHC Detection Kit med afblegning. Klassificering for Melan A på OptiView DAB IHC Detection Kit med afblegning Optimal Good Borderline Poor Moderat til stærk distinkt granulær cytoplasmisk farvereaktion - brunt. Den kromogene farve er afgrænset til cytoplasma i melanocytterne og udløbere fremstår lysebrune. Der ses ingen uspecifik farvning af bindevæv. Moderat til svag distinkt granulær cytoplasmisk farvereaktion - brunt. Den kromogene farve er afgrænset til cytoplasma i melanocytterne samt udløbere. Der ses svag uspecifik farvning af bindevæv. Moderat til svag cytoplasmisk farvereaktion - brunt. Den kromogene farve ses spredt i reaktive celler. Der ses svag uspecifik farvning af bindevæv Farven er ikke distinkt, og diffunderer ud i omkringliggende væv. Der ses ingen reaktion i melanocytter. Der er stadig melanin pigment i præparatet. Der ses intet melanin pigment. Kernerne fremstår blå. Der ses intet melanin pigment. Kernerne fremstår blå. Kernerne fremstår svagt blå. Tabel 22: viser et skema over klassificering for HMB45, hvor der anvendes OptiView DAB IHC Detection Kit med afblegning. Klassificering for HMB45 på OptiView DAB IHC Detection Kit med afblegning Optimal Good Borderline Poor Moderat til stærk cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske celler- brunt. Moderat til svag cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske celler - brunt. Moderat til svag cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske celler - brunt. Den kromogene farve Den kromogene farve Den kromogene farve er afgrænset til områder er afgrænset til områder ses spredt i reaktive med malignt melanom. med malignt melanom. celler. Der ses ingen uspecifik Der ses ingen uspecifik Der ses svag uspecifik farvning af bindevæv. farvning af bindevæv. farvning af bindevæv Kernerne fremstår blå. Kernerne fremstår blå. Kernerne fremstår blå. Der ses intet melanin pigment. Der ses intet melanin pigment. Farven er ikke distinkt, da der stadig ses melanin pigment. Der ses ingen reaktion i malign melanom og neoplastiske melanocytter. 43

45 Tabel 23: viser et skema over klassificering for Melan A, hvor der anvendes OptiView DAB IHC Detection Kit med Azur B. Klassificering for Melan A på OptiView DAB IHC Detection Kit med Azur B Optimal Good Borderline Poor Moderat til stærk distinkt granulær cytoplasmisk farvereaktion - brunt. Den kromogene farve er afgrænset til cytoplasma i melanocytterne og udløbere fremstår lysebrune. Der ses ingen uspecifik farvning af bindevæv. Moderat til svag distinkt granulær cytoplasmisk farvereaktion - brunt. Den kromogene farve er afgrænset til cytoplasma i melanocytterne samt udløbere. Der ses ingen uspecifik farvning af bindevæv. Moderat til svag cytoplasmisk farvereaktion - brunt. Den kromogene farve ses spredt i reaktive celler. Der ses svag uspecifik farvning af bindevæv Melanin pigmentet fremstår blågrøn Melanin pigmentet fremstår blågrøn. Melanin pigmentet fremstår blågrøn. Kernerne fremstår blå. Kernerne fremstår blå. Kernerne fremstår svagt blå. Farven er ikke distinkt, kontrasten mellem elementerne er ikke tydelig nok. Der ses ingen reaktion i melanocytter. Tabel 24: viser et skema over klassificering for HMB45, hvor der anvendes OptiView DAB IHC Detection Kit med Azur B. Klassificering for HMB45 på OptiView DAB IHC Detection Kit med Azur B Optimal Good Borderline Poor Moderat til stærk cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske celler- brunt. Moderat til svag cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske celler - brunt. Moderat til svag cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske celler - brunt. Den kromogene farve Den kromogene farve Den kromogene farve er afgrænset til områder er afgrænset til områder ses spredt i reaktive med malignt melanom. med malignt melanom. celler. Der ses ingen uspecifik Der ses ingen uspecifik Der ses svag uspecifik farvning af bindevæv. farvning af bindevæv. farvning af bindevæv Kernerne fremstår blå. Kernerne fremstår blå. Kernerne fremstår blå. Melanin pigmentet fremstå blågrøn. Melanin pigmentet fremstår blågrøn. Melanin pigmentet fremstår blågrøn. Farven er ikke distinkt, kontrasten mellem elementerne er ikke tydelig nok. Der ses ingen reaktion i malign melanom og neoplastiske melanocytter. 44

46 Databehandling Der foretages en visuel vurdering af de opnåede data fra projektet. Data fremvises med beskrivende statistik i form af cirkeldiagrammer samt søjlediagrammer. Score der er opnået for hver metode fremvises i procent med cirkeldiagrammer, hvorimod score fordeling for hver patient fremvises med søjlediagrammer. Udregningerne samt databehandlingen er lavet i Microsoft Excel For at finde frem til hvilke metode der er bedst, mikroskoperes alle vævssnit. Der fremvises først billeder af HE-farvningen, fra pilotprojektet, og derefter fremvises billeder fra selve bachelorprojektet. Litteratursøgning Litteratur som anvendes til bachelorprojektet er fremsøgt i google, som har ført videre til databasen Pubmed, bibliotek.dk, kræftens bekæmpelse, sundhedsstyrelsen og der er samt søgt i lærebøger som er opgivet til bioanalytikeruddannelsen. Der er yderlige søgt efter de anvendte antistoffer, hvor det førte frem til firmaets (ROCHE) hjemmeside og NordiQC hjemmeside. Der er under litteratursøgningen kigget kildekritisk på de fundne litteratur til projektet. Der er primært søgt efter videnskabelige artikler i databasen Pubmed for at besvare problemformuleringen. Søgningen på Pubmed er indskrænket således at artiklerne er inden for de sidste 25 år og det kun er artikler på engelsk. Der er fundet 4 videnskabelige artikler som anvendes til projektet. Disse er: 1. Melanin Bleaching With Dilute Hydrogen Peroxide: A simple And Rapid Method. 2. Immunoperoxidase technigue modified by counterstain with azure B as a diagnostic aid in evaluating heavily pigmented melanocytic neoplasms. 3. Azure B as a Counterstain in the Immunohistological Evaluation of Heavily Pigmented Nevomelanocytic Lesions. 4. A Comparison of Melanin Bleaching and Azure Blue Counterstaing in the Immunhistochenical Diagnosis of Malignant Melanoma. I Pubmed er søgt på følgende nøgleord som ses i tabel 25. Når der søges på mere end et ord sættes der komma (,) imellem søgeordene. Søgningen omhandler antistofferne HMB45, Melan A og de alternativer der anvendes til projektet såsom melanin bleaching og Azure B. 45

47 Tabel 25: ses en oversigt over litteratursøgning med nøgleord (Pubmed) Hits Søgeord 218 Melan A, HMB Melan A, HMB45, immunohistochemistry 2 Melan A, Azure B 2 Azure, counterstain 39 Azure B 160 Melanin bleaching 7 Melan A, melanin bleaching 88 Melanin bleachind, diagnostic 10 Melanin bleaching, diagnostic, melanocytic Etik Til projektet er der anvendt patientmateriale som bruges til forskning, derfor indhentes der ikke en tilladelse fra patienten, da dette er lovligt, som det fremgår af vejledningen nummer 83 se bilag 2. Diagnosen på disse patienter er stillet, derfor vil resultaterne fra bachelorprojektet ikke have en betydning for disse patienter, men tværtimod vil det bruges til de kommende patienter i fremtiden, da formålet er at forbedre og optimere kvaliteten af immunhistokemiske farvninger til at kunne stille en diagnose for MM. Der sikres af gruppen at de anvendte patientmaterialer anonymiseres ved at alle patientmaterialer får tildelt et internt rekvisitions nummer. Resultater I følgende afsnit vises billeder fra pilotprojektet, derefter ses scoringsskemaerne for hver metode, hvor der efterfølgende er lavet cirkeldiagrammer som viser score fordeling for hver metode, og søjlediagrammer som viser score fordelingen for hver enkelt patient. Billeder fra selve bachelorprojektet vises efterfølgende. Billederne vises i en bestemt rækkefølge, således at der først fremvises multikontrolvæv fra hver metode og efterfølgende et billede, som fx er scoret til at være optimal, good og borderline. Der er scoret i alt 10 patientvæv ud fra multiblok A og B. HE- snittet vises som det første, hvor alle 10 patientvæv er medtaget. Dette er medtaget at vise, at vævet er MM med melanin pigment. 46

48 Pilotprojekt d Delforsøg 1 første kørsel: Afprøvning af kernefarvning med Azur B med ph 4, 6 og 8 i 4 og 8 minutter. Kernefarvningen laves på et colon væv. Alle vævssnit som kernefarves i delførsøg 1 er overfarvet. 1 2 Figur 25: billederne viser en oversigt over en kernefarvning med Azur B ved ph 4 i 4 minutter (1) og en kernefarvning med Azur B ved ph 4 i 8 minutter (2) billederne er taget i en forstørrelse 200x. 1 2 Figur 26: billederne viser en oversigt over en kernefarvning med Azur B ved ph 6 i 4 minutter (1) og en kernefarvning med Azur B ved ph 8 i 4 minutter (2) billederne er taget i en forstørrelse 200 X. 47

49 Delforsøg 1 anden kørsel: Afprøvning af kernefarvning med Azur B med ph 4 i 1, 2 og 3 minutter. Kernefarvningen laves på et colon væv. Vævssnittene som kernefarves i delførsøg 1 viser at ph 4 i 1 minut er den optimale Figur 27: billederne viser en oversigt over en kernefarvning med Azur B ved ph 4 i 1 minut (1), en kernefarvning med Azur B ved ph 4 i 2 minutter (2) og en kernefarvning med Azur B ved ph 4 i 3 minutter (3). Billederne er taget i en forstørrelse 100 X Delforsøg 2: Afprøvning med Azur B til farvning af melanin pigmentet. Væv der anvendes er hud kendt med MM der er højpigmenteret. Figur 28: billederne viser en farvning af melanin pigmentet med Azur B ved ph 4 i 1 minut. Melanin pigmentet er farvet blågrøn og kernerne er farvet blå. Billedet er taget i en forstørrelse 100X 48

50 Delforsøg 3: Afprøvning af H2O2 til brug ved afblegning af melanin pigmentet. Ved at afprøve 10 % H2O2 opløsning fortyndet med ionbyttevand og PBS buffer i 30 og 40 minutter. Væv der anvendes er hud kendt med MM der er højpigmenteret. Vævet som er afbleget med 10 % H2O2 opløsning fortyndet i demineraliseret vand viser at melanin pigmentet er afbleget både ved 30 og 40 minutter. 10 % H2O2 opløsning fortyndet i PBS viser at vævet er sprængt. Figur 29: billedet viser en oversigt over en HE-farvning, hvor melanin pigmentet fremstår brunt. Billedet er taget i en forstørrelse 100X 1 2 Figur 30: billederne viser en oversigt over en He-farvning, hvor der er foretaget en afblegning af melanin pigmentet med H 2O 2 fortyndet i demineraliseret vand i 30 minutter (1) og en afblegning af melanin pigmentet med H 2O 2 fortyndet i PBS buffer i 30 minutter (2). På billede 1 er melanin pigmentet afbleget og vævet er velbevaret, hvorimod på billede 2 ses at melanin pigmentet er afbleget og vævet er sprængt. Billederne er taget i en forstørrelse 100 X 49

51 1 2 Figur 31: billederne viser en oversigt over en He-farvning, hvor der er foretaget en afblegning af melanin pigmentet med H 2O 2 fortyndet i demineraliseret vand i 40 minutter (1) og en afblegning af melanin pigmentet med H 2O 2 fortyndet i PBS buffer i 40 minutter (2). På billede 1 er melanin pigmentet afbleget og vævet er velbevaret, hvorimod på billede 2 ses at melanin pigmentet er afbleget og vævet er sprængt. Billedet er taget i en forstørrelse 100 X Resultater fra mikroskopiering Tabellerne viser vores scoringer fra projektet. Vi var tre til at vurdere vævene. De steder der står 1 betyder, der er en i gruppen der har vurderet patient vævet i dette katogeori. Hvis der derimod står 3, har vi alle vurderet det samme. Tabel 26: viser en oversigt over scorerne for Melan A Fast Red, hvor der er anvendt UltraView Universal AP Red Detection Kit. Analyseret efter protokol 31 Tabel 27: viser en oversigt over scorerne for HMB45 Fast Red, hvor der er anvendt UltraView Universal AP Red Detection Kit. Analyseret efter protokol 43 50

52 Tabel 28 viser en oversigt over scorerne for Melan A - DAB med afblegning, hvor der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit. Analyseret efter protokol 395. Tabel 29: viser en oversigt over scorerne for HMB45 - DAB med afblegning, hvor der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit. Analyseret efter protokol 396 Analyseret efter protokol 396 Tabel 30: viser en oversigt over scoring for Melan A - DAB med Azur B, hvor der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit. Analyseret efter protokol 394. Tabel 31: viser en oversigt over scorerne for HMB45 - DAB med Azur B, hvor der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit. Analyseret efter protokol

53 Tabel 33: viser en oversigt over scorerne for Melan A - DAB med afblegning og Azur B, hvor der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit. Analyseret efter protokol 393. Tabel 32: viser en oversigt over scorerne for HMB45 - DAB med afblegning og Azur B, hvor der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit. Analyseret efter protokol 393. Cirkeldiagrammer over score fordeling for hver metode. Score fordeling for Melan A DAB med afblegning Score fordeling for HMB45 DAB med afblegning 13% 7% 10% 80% 90% Optimal Good Borderline Poor Figur 32: viser et cirkeldiagram over score fordeling for Melan A, hvor der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit med afblegning. Optimal Good Borderline Poor Figur 33: viser en et cirkeldiagram over score fordeling for HMB45, hvor der er anvendt UltraView OptiView DAB Universal IHC Detection AP Red Detection Kit med afblegning. Kit. 52

54 Score fordeling for Melan A DAB med Azur B Score fordeling for HMB45 DAB med Azur B 17% 23% 3% 83% 74% Optimal Good Borderline Poor Figur 34: viser et cirkeldiagram over score fordeling for Melan A, hvor der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit med Azur B. Optimal Good Borderline Poor Figur 35: viser et cirkeldiagram over score fordeling for HMB45, hvor der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit med Azur B. Score fordeling for Melan A Fast Red Score fordeling for HMB45 Fast Red 7% 20% 3% 17% 73% 80% Optimal Good Borderline Poor Figur 36: viser et cirkeldiagram over score fordeling for Melan A, hvor der er anvendt UltraView Universal AP Red Detection Kit. Optimal Good Borderline Poor Figur 37: viser et cirkeldiagram over score fordeling for HMB45, hvor der er anvendt UltraView Universal AP Red Detection Kit. 53

55 Score Score Meral Kiyak Score fordeling for Melan A DAB med afblegning og Azur B Score fordeling for HMB45 DAB med afblegning og Azur B 17% 10% 73% 40% 10% 50% Optimal Good Borderline Poor Figur 38: viser et cirkeldiagram over score fordeling for Melan A, hvor der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit med en kombination af afblegning og Azur B. Optimal Good Borderline Poor Figur 39: viser et cirkeldiagram over score fordeling for HMB45, hvor der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit med en kombination af afblegning og Azur B Score fordeling for Melan A over hver patient Patienter Optimal Good Borderline Poor Figur 40: viser et søjlediagram over score fordeling for Melan A over hver patient. På X-aksen ses de 10 patienter som er anvendt i projektet og på y-aksen ses antal score. Farverne indikerer hvor mange der er scoret optimal, good, borderline eller poor Score fordeling for HMB45 over hver patient Patienter Optimal Good Borderline Poor Figur 41: viser et søjlediagram over score fordeling for HMB45 over hver patient. På X-aksen ses de 10 patienter som er anvendt i projektet og på y-aksen ses antal score. Farverne indikerer hvor mange der er scoret optimal, good, borderline eller poor. 54

56 Score Meral Kiyak Score fordeling for både Melan A og HMB45 over hver patient Patienter Optimal Good Borderline Poor Figur 42: viser et søjlediagram over en samlet score fordeling for Melan A og HMB45 over hver patient. På X-aksen ses de 10 patienter som er anvendt i projektet og på y-aksen ses antal score. Farverne indikerer hvor mange der er scoret optimal, good, borderline eller poor. Billede resultater Billeder af HE-farvning fra multikontrolblok, multiblok a og multiblok B Figur 43 viser billeder fra HE-farvning på et multikontrol væv. K står for kontrol. K1 K2 K3 K4 Figur 43: Billederne viser en HE farvning på multikontrol væv fra multikontrolblok B. K1: MM, K2: appendix, K3: binyre og K4: nyre. Billederne er taget ved en forstørrelse 200x 55

57 Figur 44 viser billeder fra HE-farvning på et multiblok A og multiblok B væv. P står for patient P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 Figur 44: Billederne viser HE farvningerne på multiblok A og multiblok B. P1-P10: Der ses at alle væv er MM og der er melanin pigment tilstede som fremstår brunt. Billederne er taget ved en forstørrelse 200x 56

58 Figur 45 viser billeder fra en immunfarvning analyseret efter protokol 31 med antistoffet Melan A på et multikontrol væv. Der er anvendt UltraView Universal AP Red Detection Kit. K1 K2 K3 K4 Figur 45: K1: MM, K2: appendix, K3: binyre og K4: nyre. K1 og K3 ses en positiv reaktion. K2 og K4 falsk negativ reaktion. Billederne er taget ved en forstørrelse 100x På figur 46 ses et eksempel på 3 patientvæv som er scoret optimal, good og borderline. Ingen patientvæv er scoret poor. Farveresultater for Melan A med Fast Red Optimal Good Borderline MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 200x P4 P8 P10 MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 200x MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 100x Figur 46: viser 3 eksempler på vævssnit som er scoret optimal (P4), good (P8) og borderline (P10). Der er foretaget en immunfarvning analyseret efter protokol 31 med antistoffet Melan A, hvor der er anvendt UltraView Universal AP Red Detection Kit. 57

59 Figur 47 viser billeder fra en immunfarvning analyseret efter protokol 43 med antistoffet HMB45 på et multikontrol væv. Der er anvendt UltraView Universal AP Red Detection Kit. K1 K2 K3 K4 Figur 47: K1: MM, K2: appendix, K3: binyre og K4: nyre. K1 ses en positiv reaktion. K2, K3 og K4 ses en negativ reaktion. Billederne er taget ved en forstørrelse 100x På figur 48 ses et eksempel på 2 patientvæv som er scoret optimal og borderline. Ingen patientvæv er scoret poor. Farveresultater for HMB45 Optimal Borderline P4 P10 MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 200x MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 200x Figur 48: viser 2 eksempler på vævssnit som er scoret optimal (P4) og borderline (P10). Der er foretaget en immunfarvning analyseret efter protokol 43 med antistoffet HMB45, hvor der er anvendt UltraView Universal AP Red Detection Kit. 58

60 Figur 49 viser billeder fra en immunfarvning analyseret efter protokol 395 med antistoffet Melan A (afblegning) på et multikontrol væv. Der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit. K1 K2 K3 K4 Figur 49: K1: MM, K2: appendix, K3: binyre og K4: nyre. K1 ses en positiv reaktion. K3 ses en falsk positiv reaktion. K2 og K4 ses en negativ reaktion. Billederne er taget ved en forstørrelse 100x På figur 50 ses et eksempel på 2 patientvæv som er scoret optimal, good og borderline. Ingen patientvæv er scoret poor. Farveresultater for Melan A med afblegning Optimal Good Borderline P4 P9 P10 MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 200x MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 200x MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 200x Figur 50: viser 3 eksempler på vævssnit som er scoret optimal (P4), good (P9) og borderline (P10). Der er foretaget en immunfarvning analyseret efter protokol 395 med antistoffet Melan A, hvor der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit. 59

61 Figur 51 viser billeder fra en immunfarvning analyseret efter protokol 396 med antistoffet HMB45 (afblegning) på et multikontrol væv. Der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit. K1 K2 K3 K4 Figur 51 : K1: MM, K2: appendix, K3: binyre og K4: nyre. K1 og K2 ses en positiv reaktion. K3 og K4 ses en falsk positiv reaktion. Billederne er taget ved en forstørrelse 100x. På figur 52 ses et eksempel på 2 patientvæv som er scoret optimal og borderline. Ingen patientvæv er scoret good og poor. Farveresultater for HMB45 med afblegning Optimal Borderline P4 P10 MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 200x MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 200x Figur 52: viser 2 eksempler på vævssnit som er scoret optimal (P4) og borderline (P10). Der er foretaget en immunfarvning analyseret efter protokol 396 med antistoffet HMB45, hvor der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit. 60

62 Figur 53 viser billeder fra en immunfarvning analyseret efter protokol 394 med antistoffet Melan A (Azur B) på et multikontrol væv. Der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit. K1 K2 K3 K4 Figur 53: K1: MM, K2: appendix, K3: binyre og K4: nyre. K1 og K3 ses en positiv reaktion. K2 og K4 ses en negativ reaktion. Billederne er taget ved en forstørrelse 100x På figur 54 ses et eksempel på 2 patientvæv som er scoret optimal og borderline. Ingen patientvæv er scoret poor. Farveresultater for Melan A med Azur B Optimal Borderline P6 P10 MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 200x MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 100x Figur 54: viser 2 eksempler på vævssnit som er scoret optimal (P6) og borderline (P10). Der er foretaget en immunfarvning analyseret efter protokol 394 med antistoffet Melan A, hvor der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit. 61

63 Figur 55 viser billeder fra en immunfarvning analyseret efter protokol 393 med antistoffet HMB45 (Azur B) på et multikontrol væv. Der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit. K1 K2 K3 K4 Figur 55: K1: MM, K2: appendix, K3: binyre og K4: nyre. K1 og K2 ses en positiv reaktion. K2 og K4 ses en falsk positiv reaktion. Billederne er taget ved en forstørrelse 100x På figur 56 ses et eksempel på 3 patientvæv som er scoret optimal, good og borderline. Ingen patientvæv er scoret poor. Farveresultater for HMB45 med Azur B Optimal Good Borderline MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 200x P4 P3 P10 MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 200x MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 100x Figur 56: viser 3 eksempler på vævssnit som er scoret optimal (P4), good (P3) og borderline (P10). Der er foretaget en immunfarvning analyseret efter protokol 393 med antistoffet HMB45, hvor der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit. 62

64 Figur 57 viser billeder fra en immunfarvning analyseret efter protokol 394 med antistoffet Melan A (afblegning + Azur B) på et multikontrol væv. Der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit. K1 K2 K3 K4 Figur 57: K1: MM, K2: appendix, K3: binyre og K4: nyre. K1 ses en positiv reaktion. K2 ses en falsk positiv reaktion og vævet er sprængt. K3 og K4 ses en negativ reaktion. Billederne er taget ved en forstørrelse 100x På figur 58 ses et eksempel på 3 patientvæv som er scoret optimal, good og borderline. Ingen patientvæv er scoret poor. Farveresultater for Melan A med Afblegning + Azur B Optimal Good Borderline MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 200x P1 P7 P10 MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 200x Figur 58: viser 3 eksempler på vævssnit som er scoret optimal (P1), good (P7) og borderline (P10). Der er foretaget en immunfarvning analyserer efter protokol 394 med antistoffet HMB45, hvor der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit. 63 MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 100x

65 Figur 59 viser billeder fra en immunfarvning analyseret efter protokol 393 med antistoffet HMB45 (afblegning + Azur B) på et multikontrol væv. Der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit. K1 K2 K3 K4 Figur 59: K1: MM, K2: appendix, K3: binyre og K4: nyre. K1 og K2 ses en positiv reaktion. K3 og K4 ses en falsk reaktion. Billederne er taget ved en forstørrelse 100x På figur 60 ses et eksempel på 3 patientvæv som er scoret optimal, good og borderline. Ingen patientvæv er scoret poor. Farveresultater for HMB45 med Afblegning + Azur B Optimal Good Borderline MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 200x P1 P3 P10 MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 200x 64 MM med melanin pigment hud væv i en forstørrelse 100x Figur 60: viser 3 eksempler på vævssnit som er scoret optimal (P1), good (P3) og borderline (P10). Der er foretaget en immunfarvning analyseret efter protokol 393 med antistoffet HMB45, hvor der er anvendt OptiView DAB IHC Detection Kit.

66 Diskussion Dette afsnit vil omhandle en diskussion af resultater fra pilotprojektet og fra bachelorprojektet, herunder fejlkilder. Der vil være en opsummering af resultaterne, herefter kigges der på den eksterne validering på nogle lignende studier og til sidst metodekritik. Forventninger Mine forventninger til bachelorprojektet havde været, på baggrund af de videnskabelige artikler jeg havde læst, at tilstedeværende melanin pigment ville afbleges med H2O2 og ved at anvende kationfarvestoffet Azur B ville melanin pigmentet farves blågrøn og hermed ville kernerne farves blå. Jeg havde i forbindelse med projektet ønsket at kunne se et mere optimalt resultat af kernefarvningen og farvningen af melanin pigmentet. Flere faktorer kan have en indflydelse i forhold til farvningen af kerner og melanin pigmentet i vævet. Pilotprojekt Ved at udføre pilotprojektet er der fundet frem til en optimal ph, inkubationstid samt en farvning af melanin pigmentet med farvestoffet Azur B og en optimal opløsning og tid for H2O2 til brug ved afblegning af melanin pigmentet. Delforsøg 1 Resultaterne fra delforsøg 1 viser, at en 0,1 % Azur B opløsning ved ph 4 er det optimale ph for kernefarvningen. Det lykkedes os ikke at finde en koncentration for Azur B i de videnskabelige artikler, derfor anvender vi en forskrift, som førhen er anvendt på KDA (bilag 1). Det viser sig, at en kernefarvning ved ph 6 og 8 giver meget baggrundsfarvning samt en kraftig kernefarvning. Grunden til at der ses en kraftigere farvning kan skyldes, at der i vævet bliver farvet flere ioniseret grupper, da der anvendes en højere ph. I delforsøg 1 første kørsel er der afprøvet inkubationstiderne 4 og 8 minutter. Tiderne er valgt i forhold til tiderne for kernefarvningen på Ventana BenchMark ULTRA. Resultaterne viser, at vævet er overfarvet ved 8 minutter. Da der også ses meget baggrundsfarvning ved en kernefarvning i 4 minutter, vælger vi at afprøve inkubationstiderne i 1, 2 og 3 minutter ved delforsøg 1 anden kørsel (figur 27). Resultaterne fra anden kørsel viser, at inkubationstiden i 1 minut giver den optimale resultat. Grunden til at vi vurder inkubationstiden 1 minut til optimal, er fordi kernerne fremstår blå og 65

67 det er det væv som mindst baggrundsfarvning har i bindevævet. Der er valgt at anvende en kernefarvning med 0,1 % Azur B opløsning ved ph 4 i 1 minut i det endelige projekt. Kernefarvningen er foretaget på colon væv, hvorimod der i projektet anvendes hud væv. Delforsøg 2 Resultaterne viser, at det tilstedeværende melanin pigment farves blågrønne ved at anvende en 0,1 % Azur B opløsning ved ph 4 i 1 minut. Grunden til at vi vælger en 0,1% Azur B opløsning med en ph på 4, er fordi vi gerne vil anvende den samme opløsningen, som vi anvender til kernefarvningen i delforsøg 1, og for at sikre os at tilstedeværende melanin pigment farves, da melanin pigment kun farves ved en ph over 3. For at sikre os, at melanin pigmentet er farvet, anvendes der hud væv, der er høj pigmenteret. En anden grund til at have valgt væv, der er høj pigmenteret, er for at se den biologiske variation, da det jo er forskelligt fra person til person, hvor meget melanin pigment, der findes i huden. Derfor kan vi vurdere, at det er den korrekte koncentration, tid og ph, vi har anvendt, og vi sikre os, at alle hud væv med melanin pigment farves, uanset hvor meget pigment, der er tilstede i vævet. Delforsøg 3 Resultaterne fra delforsøg 3 viser, at den optimale opløsning og tid er H2O2 fortyndet i demineraliseret vand i 40 minutter ved 65 C. Koncentrationen for opløsningen er valgt på baggrund af en videnskabelig artikel Melanin Bleachin With Dilute Hydrogen Peroxide: A Simple and Rapid Method. I artiklen afprøves en afblegning af melanin pigmentet med H2O2 fortyndet i demineraliseret vand og i PBS buffer i 4 forskellige inkubationstider ved 65 C. Resultaterne viser, at en afblegning med H2O2 fortyndet i PBS buffer i 30 minutter ved 65 C giver det optimale resultat. Vi afprøver derfor, at afblege med H2O2 fortyndet i de to forskellige opløsninger i inkubationstiderne 30 og 40 minutter ved 65 C. Resultaterne viser, at afblegningen med H2O2 fortyndet i demineraliseret vand i 30 og 40 minutter er velbevaret, og der er ingen forskel mellem 30 og 40 minutter, hvorimod H2O2 fortyndet i PBS buffer er vævet sprængt ved både 30 og 40 minutter (figur 30 og 31). Melanin pigmentet ses ikke 66

68 ved begge afblegninger. Grunden til at vævet er sprængt ved at anvende H2O2 fortyndet i PBS buffer, kan skyldes, at vi selv har fremstillet PBS bufferen efter en opskrift, som vi fandt på nettet. Den PBS buffer der anvendes i artiklen, er en færdig fremstillet, hvorimod vi selv har fremstillet PBS bufferen vi anvender til delforsøget. Forskriften vi finder for PBS bufferen er 0,1 M koncentration, hvor de i artiklen anvender 0,05 M. Derfor omregner vi det så vi har en 0,05 M opløsning. Da resultaterne viser, at vævet er sprængt, kan det skyldes en forkert omregning, da det optimale resultat i artiklen, er vævet som er afbleget med H2O2 fortyndet i PBS buffer. Dette kan også skyldes, at det er den biologiske variation som spillede ind. Væv som anvendes til delforsøget er hud væv, der er høj pigmenteret. Det vælges for at sikre, at melanin pigmentet er afbleget selv ved væv, der er høj pigmenteret, da den biologiske variation kan have en betydning. HE-farvningen er medtaget for at få en oversigt over vævet morfologi samt for at se om der er melanin pigment tilstede i vævet (figur 29). HE-farvningen viser, at der er melanin pigment tilstede, så vi sikre os at metoden virker. Bachelorprojekt Bachelorprojektet er udført med det formål at forbedre og optimere kvaliteten af detektionen af HMB45 og Melan A til diagnosticering af MM, ved at afblege melanin og anvende kationfarvestoffet Azur B til kernefarvning samt en blågrønfarvning af melanin pigmentet, således at UltraView Universal AP Red Detection Kit kan udskiftes med OptiView DAB IHC Detection Kit Dette undersøges ved, at afprøve forskellige protokoller som laves på baggrund af de videnskabelige artikler, fra firmaet datablad for antistofferne samt de resultater gruppen vurdere optimal fra pilotprojektet. Disse protokoller afprøves på en multiblok A, en multiblok B og en multikontrolblok. Der medtages altid en HE-farvning inden immunfarvningerne, da immunfarvninger ikke kan stå alene, og for at få et overblik over morfologien. Vi har i vores projekt medtaget en HE-farvning på de fremstillede multiblokke samt multikontrolblokket i forbindelse med at se om metoderne virker. Med en HE-farvning sikre vi os, at det er MM, og at der er melanin pigment tilstede. 67

69 Metoden med afblegning - OptiView DAB IHC Detection Kit Ud fra vores vurdering er metoden med afblegning, hvor antistoffet HMB45 anvendes, den metode som har fået flest optimal score som ses i cirkeldiagrammet (figur 33) sammenlignet med de andre metoder som ses i de resterende cirkeldiagrammer. 90 % er scoret til at være optimal og 10 % er scoret til at være borderline. I gruppen har vi alle tre scoret alle patienter til at være optimal, bortset fra patient 10 som er scoret borderline. Grunden til dette, er fordi der ses en brunlig uspecifik baggrundsfarvning, og der ses yderlige artefakter i vævet, som kan skyldes de præanalytiske forhold. Hvorimod metoden med afblegning, hvor antistoffet Melan A anvendes, ses at 80 % er scoret til at være optimal, 13 % er scoret til at være good, og 3 % er scoret til at være borderline (figur 32). De 13 % som er placeret i good, skyldes at der i patient 9 og 10 ses en moderat til svag cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske celler. Farvereaktionen er ikke så optimal som metoden med afblegning, hvor HMB45 anvendes. Der ses for metoden, at det kun er patient 10 som falder udenfor. Dette kan skyldes samme årsager som beskrevet for oven, da det er den samme patient, der er placeret i borderline. Metoden med Azur B - OptiView DAB IHC Detection Kit På figur 34 ses at metoden med Azur B, hvor antistoffet Melan A anvendes, har fået anden højeste optimal score i blandt metoderne. 83 % er scoret til at være optimal og 17 % er scoret til at være good. Det er den eneste metode, hvor ingen patientvæv er scoret til at være borderline. Grunden til at patient 5 og 10 er de placeret i good, er fordi der ses en svag cytoplasmisk farvning i forhold til de andre patienter. Det er den eneste metode, hvor der ikke ses uspecifik baggrundsfarvning i vævet for patient 10. Dette kan skyldes, at den biologiske variation ikke har en betydning for metoden. Det viser, at samme metode, hvor der i stedet anvendes antistoffet HMB45, har fået lavere optimal scores i forhold til metoden, hvor Melan A anvendes. 73 % er scoret til at være optimal, 23 % er scoret til at være good og 3 % er scoret til at være borderline. For begge metoder ses der en svagere cytoplasmisk farvereaktion af de neoplastiske celler, og det er den primær årsag til at der er flere patienter, der er placeret i kategorien good. 68

70 Metoden med afblegning og Azur B - OptiView DAB IHC Detection Kit Metoden med afblegning og Azur B (kombination), hvor antistoffet HMB45 anvendes, har fået mindst optimal score sammenlignet med de andre metoder. 50 % er scoret til at være optimal, 40 % er scoret til at være good og 10 % er scoret til at være borderline. I metoden ses næsten en ligelig fordeling af score mellem optimal og good. Grunden til den lave optimal score, skyldes at metoden er hårdt ved vævet, som medfører at vævet ødelægges. Vi oplever, at vævet er svær at vurdere, og at vi i gruppen er meget uenige, hvad det angår scoringen. Hvis man ser fordelingen af score for samme metode, hvorimod der anvendes antistoffet Melan A, ser man at denne metode har fået flere optimal score, hvor 70 % er scoret til at være optimal, 20 % er scoret til at være good og 10 % er scoret til at være borderline. Grunden til at flere patienter har fået flere optimal score for denne metode, kan skyldes antistoffet, som giver en kraftigere cytoplasmisk farvning af cellerne, ved at anvende Melan A. Nuværende metode - UltraView AP Red Detection Kit I den nuværende metode, hvor antistoffet HMB45 anvendes, er 80 % scoret til at være optimal, 3 % er scoret til at være good, og 17 % er scoret til at være borderline (figur 37). Hvis vi kigger på den nuværende metode, hvorimod Melan A anvendes, ser vi at 73 % er scoret til at være optimal, 7 % er scoret til at være good, og 20 % er scoret til at være borderline (figur 36). Det ses at patient 9 og 10 falder udenfor i begge metoder, som kan skyldes den biologiske variation. Der ses også artefakter i vævet som sandsynligvis kan tillægges noget præanalytisk. Det er kromogenet i detektionskittet, der er grunden til at der ses meget rødlig uspecifik baggrundsfarvning i disse patientvæv, hvor der anvendes UltraView Universal AP Red Detection Kit. Dette er gældende for både HMB45 og Melan a, som sammenlagt har fået de fleste score i kategorien borderline i forhold til alle de andre metoder. På afdelingen er der både dag- og natkørsler, hvor der kun anvendes en ultraview Universal AP Red Detection Kit. Dette betyder, at detektionskittet ikke kommer på køl og det konstant står ved stuetemperatur. Derfor er det ikke stabil, og kan være årsagen til baggrundsfarvningen. Antistoffer HMB45 og Melan A Ud fra søjlediagrammerne på figur 40 og figur 41 ses at flere patienter, hvor antistoffet Melan A anvendes, er scoret i kategorien optimal i forhold til patienter, hvor antistoffet HMB45 anvendes. Årsagen kan være at antistoffet Melan A er mere specifik og sensitiv end HMB45. Dette giver en god 69

71 sammenhæng, når man kigger på kontrolsnittene, for hver metode, hvor disse to antistoffer anvendes. Der ses ved de fleste metoder, hvor antistoffet HMB45 anvendes, en falsk positiv reaktion i appendix, binyre og nyre, som normalvis burde være negativ. Det eneste kontrolsnit for HMB45, hvor der ikke ses en falsk positiv reaktion, er i den nuværende metode med UltraView AP Red Detection Kit. I alle kontrolsnit for Melan A ses der en positiv reaktion i MM og i binyre, og en negativ reaktion i appendix og nyre. En anden årsag kan være at Melan A og HMB45 er begge temperatur følsomme, derfor er det vigtigt at antistofferne kommer på køl hurtigst muligt, så antistofferne kan være stabile. Det ses i søjlediagrammen på figur 42 at alle patienter, på nær patient 9 og 10, er scoret i kategorien optimal. Patient 9 og 10 er de to som næsten falder udenfor ved hver metode. Reaktionen bliver dårligere for disse to patienter, og dette kan skyldes den biologiske variation, de præanalytisk forhold, eller måske fordi vævet er meget malignt og er højt pigmenteret. I princippet kan disse to patienter undlades, men hvis man gør det, kan man ikke vise den biologiske variation. Derfor er begge patienter medtaget. En af årsagerne til at patient 9 og 10 er placeret i borderline, er fordi der ses ud fra resultaterne at reaktionen bliver dårligere, som måske kan skyldes fikseringstiden. I og med at begge patienter er fra 2007, kan det være at fikseringstiden har været anderledes. Det kan være at tidsrammen for fikseringen i 2007 har været længere eller kortere, end hvad vi anvender i dag. Så hvis vævet har haft en længere fikserigstid, kræver det en længere demaskering, for at immunaktivere antigenerne, så antistoffet kan binde og hermed give en kraftigere reaktion. I projektet er demaskeringen foretaget efter, hvad producenten anbefaler for hvert antistof. Opsamling af resultater for projektet Når man skal udskifte den nuværende metode, som anvender UltraView Detection Kit til diagnosticering af MM, med en anden metode, skal den nye metode være mere eller ligeså sensitiv og specifik, som den nuværende metode. Resultaterne for det endelige projekt viser, at metoden med afblegning eller metoden med Azur B, er at foretrække frem for metoden, hvor der anvendes UltraView Detection Kit eller metoden med en kombination med afblegning og Azur B, for at optimere og forbedre detektionen af antigen-antistof reaktionerne. Ved at finde en metode, der er bedre end den nuværende metode, kan vi godt implementere dette på KPA. Det ses, at metoden med afblegning er 70

72 den optimale metode for antistoffet HMB45, hvorimod metoden med Azur B er den optimal for antistoffet Melan A, men for at kan udskifte den nuværende metode, skal vi finde en metode, der er god for begge antistoffer. Formålet har været at anvende metoden med afblegning og Azur B, til væv der er højt pigmenteret som fx patient 9 og 10. Resultaterne viser, at kombinationen overhovedet ikke virker, da metoden ødelægger vævet. Årsagen kan være, at vævet ikke kan klare en kombination med afblegning og Azur B, da metoden er hård ved vævet. Og derfor er det også sværere at vurdere vævet, og det er en af grundende til at denne metode, har fået lave score. Der er ovenikøbet foretaget to gange afparaffinering på alle prøver i metoden, som vi opdager senere. Da der foretages en manuel afblegning, kræver det en afparaffinering på Tissue-Tek Prisma, og fordi denne metode analyseres efter Azur B protokollen, foretages der endnu en afparaffinering, når prøverne kommer på apparaturet Ventana BenchMark ULTRA. Dette kan måske have haft en indflydelse på vævet, på grund af temperaturen og reagenserne, der anvendes ved afparaffineringen. Alle disse fejlkilder er med til at metoden har fået lave score, hvor man ud fra resultaterne kan se, at den nuværende metode som anvender Ultra- View Detection Kit har fået højere score end metoden med afblegning og Azur B. Derfor er det oplagt, at det ikke bliver den metode man foretrækker. Metoden som anvender UltraView Detection Kit har fået høje optimal score, men derimod også de højeste score i borderline. UltraView Detection Kit er mindre sensitiv en OptiView DAB IHC Detection Kit, derfor skal metoden med UltraView Detection Kit ophæve tiderne, for at kan opnå samme reaktion som metoderne, der anvender OptiView DAB IHC Detection Kit. Ovenikøbet anvender metoden med UltraView Detection Kit, hvor antistoffet Melan A anvendes, amplifikationskit, som forstærker reaktionen, da reaktionen ikke er kraftig nok. Det gør, at metoden bliver mere sensitiv, men hvorimod analysetiden forlænges. Da både metoden med afblegning og metoden med Azur B, har givet nogle gode resultater, sammenlignes de, for at vurdere hvilke metode, der er bedst at udskifte med den nuværende metode. I forhold til rutinearbejde er metoden med Azur B, nok det man foretrækker fremfor metoden med afblegning. Dette er fordi, det kræver mindre tid og nemmere ved at holde fokus, da metoden med Azur B ikke indeholder så mange step som metoden med afblegning, inden prøverne påsættes på apparaturet Ventana BenchMark ULTRA. Hermed kan en mulig fejlkilde opstå. 71

73 For metoden med Azur B foretages kernefavningen manuelt, og hvis prøverne ikke står tilstrækkelig i Azur B opløsningen, kan det differentieres ved den efterfølgende dehydrering, da Azur B er et kationfarvestof. Grunden til at Azur B ikke står længere end 1 minut i Azur B opløsningen, er fordi såsom kollagen farves ved en inkubationstid i mere end 1 minut, som vi også påviste i pilotprojektet. Hvorimod hvis man anvender metoden med afblegning, farves kun det man ønsker. Fordelen ved metoden med Azur B er, at melanin pigmentet farves blågrøn ved udskiftning af hæmatoxylin, som giver en differentiering mellem cellerne. Fordelen ved metoden med afblegning er, at melanin pigmentet forsvinder, så det ikke forstyr, når prøven skal vurderes. Økonomisk er det billigere at anvende metoden med afblegning end metoden med Azur B, da 1 gram Azur B koster 500 kr. Økonomien, kvaliteten og svar tiden er lige vigtige. Derfor skal vi tage det for øje, når vi vælger, hvilken metode der kan foretrækkes. Selvom analyseringstiden er mindre for metoden med Azur B, viser resultaterne fra projektet, at metoden med afblegning har sammenlagt fået flest optimal score, og tyder på at kvaliteten er bedst i denne metode. Grunden til at kvaliteten ikke er optimal for Azur B, skyldes at vi i vores pilotprojekt har afprøvet kernefarvningen på colon væv, men derimod anvender hud væv til vores endelige projekt. Det viser, at kernefarvningen ikke er optimal, da kernerne nærmest fremstår lyseblå, der hvor antigen-antistof reaktionen er. Derimod fremstår kernerne blå for metoden med afblegning, hvor hæmatoxylin anvendes. Vi burde, derfor afprøve kernefarvningen på hud væv, for at sikre at få samme resultat. Koncentrationen kan også være årsagen til at kernefarvningen ikke var optimal. En anden årsag kan være ph værdien for opløsningen, da det har været svært at indstille ph værdien. Det kan være vi ikke har anvendt den korrekte ph, da ph meteren konstant ændrede ph værdien, hver gang, der blev foretaget en ph måling. Ekstern validering Der søges og findes flere videnskabelige artikler, som afprøver en farvning af melanin pigmentet med farvestoffet Azur B, for at undgå at reaktionsproduktet interferer med tilstedeværende melanin pigment i vævet. I artiklerne Immunoperoxidase technique modified by counterstain with azure B as a diagnostic aid in evaluating heavily pigmented melanocytic fra 2 april 1991 og Azure B as a 72

74 Counterstain in the Immunohistological Evaluation of Heavily Pigmented Nevomelanocytic Lesions fra juli 1995, afprøver de om Azur B kan bruges som en kontrastfarve til reaktionsproduktet som fremstår brunt. De finder frem til, at man godt kan anvende Azur B som en kontrastfarve til reaktionsproduktet, da kernerne fremstår blå og melanin pigmentet fremstår blågrøn, så det er nemmere at skelne mellem tilstedeværende melanin pigment og reaktionsproduktet. I begge artikler er der ikke oplyst, den anvendte koncentration for Azur B opløsningen og fremgangsmåden beskrives heller ikke detaljeret. Fremgangsmåden for metoden i artiklerne og metoden vi anvender er ikke ens, derfor kan metoderne ikke sammenligne. Derimod får vi samme resultater, selv om fremgangsmåden er anderledes, ved at afprøve Azur B, som farver både kerner blå og melanin pigmentet blågrøn. I begge artikler anvendes et polyklonalt anti-s100 protein antistof og et monoklonalt antistof HMB45, hvor vi i vores projekt anvender antistofferne Melan A og HMB45, som begge er monoklonale antistoffer. I begge artikler nævnes kort omkring de udfordringer, der fremkommer ved, at anvende kromogenet Fast Red. Dette tyder på, at problemet med Fast Red er bemærket tilbage i 1990 erne. Problem med Fast Red er også observeret på Patologisk Afdeling på Sønderborg Sygehus. De opdager at farveintensiteten aftager, når UltraView AP Red Detection Kit står for længe på apparaturet Ventana BenchMark ULTRA ved stuetemperatur. Detektionskittet når ikke at opbruges inden for de tre måneder, på grund af der ikke er så mange prøver, som anvender detektionskittet. Samme problem er gældende på KPA på SVS. På Patologisk Afdeling i Vejle oplever man ikke problemer med Fast Red, da detektionskittet opbruges inden de tre måneder. Mange patologiske afdelinger i Danmark, anvender ikke UltraView AP Red Detection Kit, både fordi det ikke er stabilt og fordi det kan differentieres i ethanol. Der findes heller ikke videnskabelige artikler og litteratur på Fast Red. I en anden artikel A comparison of Melanin Bleaching and Azur Blue Counterstainin in the Immunohistochemical Diagnosis of malignant Melanoma fra 1999, afprøves der både en kernefarvning samt farvning af melanin pigmentet med farvestoffet Azur B og en afblegning af melanin pigmentet med KMnO4, for at melanin pigmentet enten farves blågrøn med Azur B eller afbleges med KMnO4, så tilstedeværende melanin pigment i vævet ikke interferer med reaktionsproduktet. I artiklerne finder man frem til, at man får en fin differentiering mellem cellerne i og med at melanin pigmentet farves blågrøn. Ved at der foretages en afblegning forsvinder melanin pigmentet i vævet, så 73

75 det ikke forstyr, når man skal stille en diagnose. Ved at sammenligne disse to metoder, er de kommet frem til at brugen af Azur B som kontrastfarvning er overlegen i forhold til metoden med afblegning. Der afprøves forskellige slags væv og antistoffet HMB45 samt S100 proteinet, for at afprøve metoderne med Azur B og KMnO4. I metoden afprøver de KMnO4 ved flere forskellige koncentrationer og finder frem til at antigenisiteten bibeholdes ved en lav koncentration for HMB45, og vævet var velbevaret. Azur B afprøves på ubleget væv med begge antistoffer, og der ses en differentiering mellem reaktionsproduktet og melanin pigmentet. Forskelle mellem deres metode og vores metodes er, at de anvender S100 og HMB45, hvorimod vi anvender Melan A og HMB45. Immunfarvningerne i artiklen foretages på apparaturet Ventana Medical System, Tucson, AZ, hvor vi anvender apparaturet Ventana BenchMark ULTRA. Lighederne er, at vi afprøver de samme alternativer, hvorimod vi bruger H2O2, og de anvender KMnO4 i artiklen. Grunden til at vi ikke anvender KMnO4 i vores projekt, er fordi artiklen Melanin Bleaching With Dilute Hydrogen Peroxide: A Simple and Rapid Method fra 2013, finde frem til, at det er bedre at anvende H2O2 til at afblege melanin pigmentet fremfor KMnO4, som ødelægger vævet. Det er denne artikel, vi benyttet til at fremføre vores pilotprojekt. NordiQC er et eksternt firma som undersøge forskellige antistoffer ved en valideringsundersøgelse. Der er lavet flere valideringsundersøgelser på antistofferne Melan A og HMB45. Resultaterne viser, at 74 % er blevet vurderet som optimal for antistoffet Melan A fra Dako, hvorimod 17 % er vurderet til at være optimal for antistoffet Melan A fra Ventana. Resultaterne for antistoffet HMB45 viser, at 81 % blev vurderet til at være optimal for antistoffet HBM45 fra Dako, hvorimod 57 % blev vurderet til at være optimal for antistoffet HMB45 fra Ventana. Dette viser, at antistofferne Melan A og HMB45 fra Dako, er bedre at anvende, da det er disse antistoffer som har en højere optimal score. Fordelen er, at det er RTU antistoffer vi anvender, så vi ikke risikere en fortyndingsfejl. (40,41) Metodekritik På baggrund af tidsrammen er der ikke medtaget dobbeltbestemmelser i projektet. Det er altid en god ide, når man skal afprøve noget nyt at medtage dobbeltbestemmelser, for at se om der er en tilfældige fejl og også for at øge resultaternes reliabilitet. Ved en dobbeltbestemmelse kan man være 74

76 sikker på, at ens resultater er sand positiv ved de positive resultater og hermed sand negativ ved de negative resultater. I vores projekt er der medtages enkeltbestemmelse. Dette er fordi alle prøverne analyseres på den fuldautomatiske apparatur Ventana BenchMark ULTRA. Det er en standardiseret metode, hvor immunfarvningen er ens hver gang, og på den måde risiker man ikke tilfældige fejl. Men derimod kan der opstå systematisk fejl, som generelt hurtig opdages ved på kontrollerne, der medtages på hvert objektglas ved immunfarvningerne. Der anvendes samme multikontrolblok med kontrolvæv til alle prøver. Analysering af alle prøver foretages samme dag, hvor der anvendes samme apparatur Ventana BenchMark ULTRA og de samme reagenser. Mikrotomering foretages af specialisten, som er en erfaren bioanalytiker, for at snittykkelsen er standardiseret, og for at øge reliabiliteten samt reproducerbarheden af de kommende resultater. Immunfarvningerne kan tolkes og scores på forskellige måder. Mikroskoperingen udføres af tre bioanalytikerstuderende, som har en mindre erfaring i forhold til at vurdere og hermed score reaktionen ved de immunhistokemiske farvninger. Derfor ville det være bedst at en erfarende bioanalytiker, det kan være specialisten indenfor immunhistokemi, der foretager mikroskoperingen. En anden gang skal man som det første afprøve de forskellige væv, man har tænkt sig at anvende til projektet. Dette har vi ikke gjort, og har oplevet at, de ikke reagere som vi havde forventet/forestillet os. Konklusion Ved at afprøve vores metoder, er vi kommet frem til, at det er muligt, at optimere og forbedre kvaliteten af detektionen for Melan A og HMB45 til diagnosticering af MM, således at UltraView AP Red Detektionskit kan udskiftes med OptiView DAB IHC Detection Kit. Ud fra vores resultater kan metoden med afblegning af melanin pigmentet hvor en 0,1 % H2O2 opløsning i 40 minutter anvendes, udskiftes med den nuværende metode som anvender UltraView Detection Kit. Ved at anvende metoden med afblegning, vil tilstedeværende melanin pigment afbleges, således at det ikke interferer med reaktionsproduktet, ved anvendelse af OptiView DAB IHC Detection Kit. 75

77 Perspektivering Fremadrettet kunne man undersøge metoden med Azur B, ved at anvende andre koncentrationer og eventuel forskellige inkubationstider for at optimere metoden. Det ville være smart, at afprøve kernefarvningen på Ventana BenchMark ULTRA, således at det hele foregik fuldautomatisk, for at undgå fejlkilder samt ville det være tidsbesparende. I projektet er afblegning af melanin pigmentet foretaget med en 10 % H2O2 opløsning fortyndet i demineraliseret vand, selvom det er KMNO4, der i dag anvendes på KPA til afblegning af melanin pigmentet. Den metode vi anvender i projektet kræver, at melanin pigmentet inkuberes i 40 minutter ved 65 C for at kunne opnå en tilstrækkelig afblegning, hvorimod en afblegning med KMNO4 kun kræver 2 minutter. Grunden til at vi fravalgte, at afprøve en afblegning med KMNO4 var fordi, de i artiklen Melanin Bleaching With Dilute Hydrogen Peroxide: A Simple and Rapid Method fra 2013, havde fundet frem til at KMNO4 ødelagde vævet. Man kunne igen afprøve, at afblege melanin pigmentet med H2O2 fortyndet i PBS buffer, da det var den der gav optimalt resultat i artiklen. Man skal derimod anvende en færdigfremstillet PBS buffer, som de også anvender i artiklen. Der er kommet et nyt antistof SOX10 på markedet, som reagerer med de samme celler, men hvorimod det er en kernemarkør, som reagere i kernerne. Melan A og HMB45 er derimod begge en cytoplasmisk markør, der reagere i cytoplasmaet. Melanin pigmentet i cytoplasmaet, er grunden til at man anvender ultraview AP Red Detection Kit, som ikke er stabil. Ved at anvende SOX10, kan OptiView Detection Kit anvendes, da antigen-antistof reaktionen foregår i kernerne, og hermed ikke interferer med melanin pigmentet i vævet. 76

78 Referenceliste 1. Hvor mange får kræft? [Internet]. Kræftens Bekæmpelse. [cited 2016 Nov 15]. Available from: 2. Baandrup U. Klinisk patologi. Kbh.: FADL; CONFIRM anti-mart-1/melan A (A103) Mouse Monoclonal Primary Antibody [Internet]. [cited 2016 Nov 21]. Available from: 4. CONFIRM anti-melanosome (HMB45) Mouse Monoclonal Primary Antibody [Internet]. [cited 2016 Nov 21]. Available from: 5. Jensbak V, Hallager K. Farvning af celler celler og væv. VIA University College ; Kligora CJ, Fair KP, Clem MS, Patterson JW. A comparison of melanin bleaching and azure blue counterstaining in the immunohistochemical diagnosis of malignant melanoma. Mod Pathol Off J U S Can Acad Pathol Inc Dec;12(12): Sayadi H, Fitzgibbon JF, Ritter JH, Swanson PE, Wick MR. Azure B as a counterstain in the immunohistological evaluation of heavily pigmented nevomelanocytic lesions. Appl Immunohistochem. 1995;3(4): Kamino H, Tam ST. Immunoperoxidase technique modified by counterstain with azure B as a diagnostic aid in evaluating heavily pigmented melanocytic neoplasms. J Cutan Pathol Dec;18(6): Liu C-H, Lin C-H, Tsai M-J, Chen W-T, Chai C-Y, Huang Y-C, et al. Melanin bleaching with dilute hydrogen peroxide: a simple and rapid method. Appl Immunohistochem Mol Morphol AIMM May;21(3): Gude MF. Histologi - tekst & atlas. Kbh.: FADL; Brüel A. Genesers histologi. Kbh.: Munksgaard; Sand O, Sjaastad ØV, Haug E, Bjålie JG. Menneskets anatomi og fysiologi. Kbh.: Gad; Marcussen N. Patologi. Kbh.: FADL; Borup VD. Biokemi. Kbh.: FADL; tyrosin Gyldendal - Den Store Danske [Internet]. [cited 2016 Nov 18]. Available from: Vyberg M. Anvendt immunhistokemi. Kbh.: København; JAPE. Arbejdsfunktioner i præpatering DokumentID

79 18. JAPE. Beskrivelse - Vævspræparatinsmaskine - Pathos Delta. DokumentID Kompendium i kemiske og biokemiske analyseprincipper. Kbh.: i København; Klargøring til mikrotomering af paraffinblokke [Internet]. [cited 2016 Nov 23]. Available from: Mikrotomering af paraffinblokke [Internet]. [cited 2016 Nov 23]. Available from: TOMO Adhesion Microscope Slides [Internet]. Matsunami. [cited 2016 Nov 23]. Available from: EZ Prep (10x) [Internet]. [cited 2016 Nov 23]. Available from: GetDocument.pdf [Internet]. [cited 2016 Nov 23]. Available from: ISH Peroxidase Inhibitor [Internet]. [cited 2016 Dec 2]. Available from: BenchMark Ultra IHC Products - Roche. 27. VENTANA BenchMark ULTRA fully automated IHC/ISH staining instrument: Ventana Medical Systems, Inc. [Internet]. [cited 2016 Nov 24]. Available from: ultraview Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit [Internet]. [cited 2016 Dec 9]. Available from: Amplification Kit [Internet]. [cited 2016 Dec 2]. Available from: OptiView DAB IHC Detection Kit [Internet]. [cited 2016 Dec 9]. Available from: AZURE B - CAS ( ) - MP Biomedicals [Internet]. [cited 2016 Dec 8]. Available from: makeup.nowblogg.com, makeup.nowblogg.com. Chemical Makeup Of Melanin [Internet]. Makeup Now. [cited 2016 Dec 9]. Available from: C95EE7DCBAAA43BB9236D42B33836DFB.pdf [Internet]. [cited 2016 Nov 27]. Available from: 78

80 34. Bendsen T. Noter i statistik [Internet] [cited 2016 Nov 27]. Available from: kemikalier-nu-maerkning-og-klassificering_pdf.pdf [Internet]. [cited 2016 Dec 9]. Available from: Ny faremærkning (CLP) - styrpaastofferne.dk [Internet]. [cited 2016 Dec 9]. Available from: Kristensen BD. Reagenser/utensilier og sikkerhed - BenchMark ULTRA. DokumentID MAMA. Affaldshåndtering reagenser. DokumentID Phosphate-buffered saline (PBS) [Internet]. [cited 2016 Dec 15]. Available from: _54.pdf [Internet]. [cited 2016 Dec 20]. Available from: _53.pdf [Internet]. [cited 2016 Dec 20]. Available from: 79

81 Bilag Bilag 1 viser forskriften for Azur B 80

82 81

83 82

84 Bilag 2 Bilag 2 viser vejledningen nummer 83 83