Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD

Transkript

1 1 Producent Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC systemer Læs venligst denne brugsanvisning grundigt igennem, før dette produkt anvendes. Gem denne brugsanvisning til senere brug.

2 Denne side er blank med vilje

3 Indhold 1 Producent SURVEYOR Scan KRAS kit Exon 2 CE IVD Tilsigtet brug Brugsindikationer Principper for SURVEYOR Scan KRAS mutationsdetektion-analyse KRAS og NRAS Analyse af patientprøver med SURVEYOR Scan Kits SURVEYOR Nuclease Sporbarhed af kitkontroller Komponenter Antal prøver, der kan testes med et Kit DNA-sekventering Yderligere påkrævet udstyr og reagenser Reagenspræparation Opbevaring og holdbarhed Advarsler og forholdsregler Primær prøvetagning, håndtering og opbevaring Analyseprocedure Somatisk mutationsdetektion med SURVEYOR Scan kits - En oversigt Trin-for-trin vejledning DHPLC INDLEDENDE opsætning/kalibrering Overvejelser inden KRAS prøveanalyse Templateovervejelser Arbejdsflowovervejelser Amplifikationsprotokol Termocyklerprogram for Amplifikationsprotokol Kvalitetskontrol af PCR-produkter SURVEYOR Nuclease fordøjelse Kontrolprocedurer Kvalitetskontrol af SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD Sådan anvendes Kontrol Plasmid DNAer Fortolkning af resultater Analyse af KRAS exon 2 med SURVEYOR Nuclease Dataevaluering af SURVEYOR Scan resultater Eksempler på resultater Ydelseskarakteristika Detektionsniveau af mutationer for SURVEYOR Scan kits Sekvensbekræftelse Analyseprocedurebegrænsninger Appendiks A A.1 Pladelayout-plan for SURVEYOR Scan kits A.2 Kontrol DNA stempler A.3 Denaturering HPLC (DHPLC) systemkrav A.4 Laboratorieopstilling for PCR-analyser A.5 Litteraturhenvisninger Appendiks B Problemløsningsguide Bestillingsoplysninger Kontaktoplysninger oversættelse Disclaimer Licenser, varemærker & copyright... 33

4 1 Producent Producent EU repræsentant M P Transgenomic Inc Emmet Street, Omaha, NE 68164, USA Tlf Transgenomic Limited 40 Watt Road, Hillington Park, Glasgow G52 4RY, UK Tlf Producent 2 SURVEYOR Scan KRAS kit Exon 2 CE IVD 2.1 Tilsigtet brug Kun til professional brug. Transgenomic s SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD er en in vitro diagnostisk analyse, der påviser somatiske mutationer i exon 2 af KRAS genet. Disse mutationer indikeres ved SURVEYOR Nuclease kløvningspeaks og inkluderer de mutationer, der har et kendt potentiale for klinisk signifikans. Dette kit er designet til at blive brugt i et klinisk diagnostisk laboratorium med passende uddannet personale, der tester DNA, som er ekstraheret fra formalinfikseret, paraffinindlejret væv. Dette kit, katalognummer , leveres som en enkelt æske, der indeholder de komponenter, der er anført nedenfor. Denne brugsanvisning er tilgængelig som en download på Brugsindikationer Klinikere kan bruge SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD med DHPLC systemer som hjælp til at bestemme, om patienters colorectale cancertumorer måske eller måske ikke vil respondere på en anti-egfr (epidermal growth factor receptor) behandling, som fx panitumumab. SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD skal anvendes sammen med SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 & 4 CE IVD og SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD. SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD må ikke anvendes til diagnose af colorectal eller nogen anden cancer. SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD er en analyse, der detekterer tilstedeværelse af potentielle somatiske mutationer i exon 2 af KRAS genet, men som ikke bekræfter mutationens sekvensidentitet. For at bekræfte den præcise, detekterede mutation vil yderligere analyse, som fx DNA-sekventering, være påkrævet. Skønt de analysesresultater, der opnås med dette kit, vil indikere en patients mutationsstatus, skal andre kliniske faktorer, herunder mutationer i KRAS exon 3 & 4 og NRAS exon 2, 3 & 4, tages i betragtning. De resultater, der opnås med SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD må ikke bruges som den eneste anvendte metode for at træffe afgørelse om eventuel behandling for patienter med colorectal cancer. Det er vigtigt at bemærke, at brugen af DHPLC til at identificere prøver, der tester positive for en KRAS mutation med dette kit, må kun anvendes som en retningslinje og alle mutationer skal bekræftes med yderligere analyse, som fx DNA-sekventering. Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 3

5 3 Principper for SURVEYOR Scan KRAS mutationsdetektion-analyse 3 Principper for SURVEYOR Scan KRAS mutationsdetektion-analyse 3.1 KRAS og NRAS Terapeutiske agenser, der er målrettet mod den epidermal growth factor receptor (EGFR), har vist sig at være effektive mod colorectal cancer. Forskning har indikeret, at omkring 40% af colorectale tumorer bærer somatiske KRAS genmutationer og kliniske studier har demonstreret, at mutationer i KRAS exon 2 (codon 12 og 13) forudsiger manglende respons på anti-egfr behandlinger. Nyere eksplorative studier har demonstreret, at patientpopulationen kan blive yderligere forfinet, da patienter, hvis mcrc tumorer har en ekstra mutation i KRAS exon 3 og 4 og NRAS exon 2, 3 og 4 også havde tendens til ikke at respondere på anti-egfr-indeholdende behandling 1-7. Dette kit er designet til brug i diagnostisk analyse af somatiske KRAS exon 2 mutationer. SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD er en analyse til detektering af alle sekvens og små insertion/deletion ændringer i Exon 2 af KRAS genet. Mutationer i KRAS codon 12 og 13 er blevet associeret med manglende effektivitet af panitumumab. Positive Controls medleveres i dette kit for mutationer i codon 12 og 13. Dette kit anvender Transgenomic s proprietære SURVEYOR Nuclease teknologi og sammen med DHPLC giver det enkelt og sensitiv detektion af potentielle mutationer. Det er i stand til at detektere en blanding af 2-5% mutant i en baggrund af non-mutant DNA. Valideringsstudier har vist ekstremt høj konkordans med sekventering i velkarakteriserede colorectal cancer-prøver. Brug af SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD vil både reducere brugerens sekventeringsbyrde og bistå sekvensidentifikation, hvis automatiseret sekventeringssoftware ikke løser tilstedeværelsen af en lavniveau-mutation. På grund af denne analyses høje sensitivitet i forhold til Sanger sekventering anbefales det, at laboratorieopstillingen optimeres for at undgå krydskontaminering af prøve eller kontrol. For et eksempel på en ideel laboratorieopstilling se Appendiks A.4 Laboratorieopstilling for PCRanalyser. 3.2 Analyse af patientprøver med SURVEYOR Scan Kits SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD må kun anvendes i forbindelse med et af de arbejdsflow, der er anført nedenfor. Arbejdsflow B Arbejdsflow A Patientprøve Test KRAS exon 2, 3 & 4 og NRAS exon 2, 3 & 4 Patientprøve Test KRAS exon 2 Resultat KRAS Codon 12 eller 13 wild-type Resultat KRAS Codon 12 eller 13 mutation Rapport resultat Rapport resultat Test KRAS exon 2, 3 & 4 og NRAS exon 2, 3 & 4 Rapport resultat Figur 1 SURVEYOR Scan mutationsdetektion kit arbejdsflow for screening af KRAS og NRAS Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 4

6 3 Principper for SURVEYOR Scan KRAS mutationsdetektion-analyse For et forslag til opstilling af 96-brønds plader til analyse af alle KRAS og NRAS exon 2-4 se Appendiks A.1 Pladelayout-plan for SURVEYOR Scan kits. 3.3 SURVEYOR Nuclease Transgenomic s SURVEYOR Nuclease er en mismatch-specific plante DNA endonuclease, der kan scanne for kendte og ukendte mutationer og polymorfismer i heteroduplex DNA 8. Enzymet kløver DNA med høj specificitet på steder med base-substitution mismatch og andre forandringer. Denne DNA endonuclease klipper begge strenge på et DNA heteroduplex på 3 -enden af mismatch positionen. Insertion/deletion-mismatches og alle base-substitution mismatches genkendes, men effektiviteten af kløvningen varierer med mismatch sekvensen. Figur 2. Virkningsmekanisme for SURVEYOR Nuclease. Endonucleasen genkender en mismatch og kløver 3 -enden af hver base i mismatchen. Dette kløver DNA-dobbeltstrengen og efterlader et enkelt base 3 -overhæng. SURVEYOR Nuclease har været brugt i en lang række sammenhænge for nøjagtigt at kunne detektere forskellige mutationer og polymorfier i gener. SURVEYOR Nuclease er især blevet brugt til at verificere tilstedeværelse af kendte mutationer i en række gener, der er associeret med nyrecancer, lungecancer, hoved- og halscancer, leukæmi, endometrial cancer og til forudsigelse af respons på strålebehandling 9,10,11. SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2 CE IVD er blevet designet til at kløve mismatches i KRAS exon 2 for efterfølgende DHPLC-analyse. Bemærk: hvis en prøve er 100% mutant DNA, kan der ikke dannes heteroduplexer og prøven vil blive vist som Wild-Type. Tumor-biopsiprøver vil imidlertid indeholde Wild- Type celler på grund af tumor heterogeneitet og/eller kontaminerende normalt væv; bemærk at 5% Wild-Type er detekterbart med dette kit med spor identisk med 5% mutant DNA. Bemærk: Kun den DNA Polymerase, der leveres med dette kit, må bruges til denne analyse. Bemærk: Følg den specifikke vejledning i DHPLC systemets manual. For at bruge dette kit korrekt anbefaler vi stærkt, at denne manual læses grundigt igennem og at vejledninger og retningslinjer heri følges nøje. Førstegangsbrugere skal udføre de kontroleksperimenter, der er beskrevet i afsnittet Sådan anvendes Kontrol Plasmid DNAer. Hvis du skulle have yderligere spørgsmål eller brug for hjælp, bedes du ringe til (888) (kun Nordamerika), +1 (402) eller +44 (0) (Europa) og bede om KRAS support. Du kan også sende os en på: SURVEYORscan@Transgenomic.com Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 5

7 4 Sporbarhed af kitkontroller 4 Sporbarhed af kitkontroller De kontroller, der leveres med dette kit, er plasmid-kloner af KRAS exon 2 sekvenser. Alle kloner er blevet sekventeret for at kontrollere sekvensens nøjagtighed ved sammenligning med NCBI Reference Sequence: NG_ Kontrollerne har et genetisk stempel. Se Appendiks A.2 Kontrol DNA Stempler; disse variationer fra KRAS Wild-Type sekvensen i en region, der ikke forventes at have mutationer, kan bruges til at problemløse prøvekontaminering med Positive Controls. Se Appendiks B - Problemløsningsguide, Problem 8, for et eksempel på et SURVEYOR Scan spor af sådan kontaminering. KRAS Control Wild-Type blev konstrueret ved syntese og cloning af KRAS Exon 2 ved brug af ovenstående NCBI referencesekvens. KRAS Positive Control Exon 2 blev konstrueret ved syntese af KRAS exon 2 ved brug af ovenstående referencesekvens, men indeholdende G12D mutationen. DNA-sekventering bekræftede, at den eneste ændring i sekvensen er i codon 12 med en G12D, GGT>GAT ændring. Denne clon blandes derefter med KRAS Control Wild-Type DNA for at danne en heterozygot blanding. 5 Komponenter SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD består af (1) en SURVEYOR æske med fordøjelseskomponenter med 10 reagensrør uden nogen tomme huller og (2) en ydre rørholder med PCR-komponenter og -kontroller, der indeholder 11 reagensrør og 9 tomme huller. Katalog nummer Komponent Rørhætte farve 100-Reaktion kit Volumen leveret SURVEYOR æske med fordøjelseskomponenter SURVEYOR Nuclease W Lilla 2 x 105 µl SURVEYOR Enhancer W2 Sort 105 µl SURVEYOR Enhancer Cofactor Pink 105 µl ,15 M MgCl 2 Solution Brun 105 µl SURVEYOR Stop Solution Rød 250 µl F Universal Sequencing Primer 1 (10 µm) Orange 2 x 125 µl R Universal Sequencing Primer 2 (10 µm) Orange 2 x 125 µl Æske med PCR-komponenter og -kontroller DNA Polymerase Rød 100 µl DNA Polymerase 10X PCR-buffer Gennemsigtig 1 ml dntps (10 mm) Gennemsigtig 500 µl F KRAS Primer Exon 2 Forward (10 µm) Blå 3 x 90 µl R KRAS Primer Exon 2 Reverse (10 µm) Blå 3 x 90 µl KRAS Control Wild-Type Gul 120 µl KRAS Positive Control Exon 2 Grøn 40 µl Brugsanvisning Download fra websitet* Antal prøver, der kan testes med et Kit SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD er designet til at kunne teste 100 reaktioner. Det totale antal prøver, der kan testes med dette kit, afhænger af den gennemsnitlige prøvebatchstørrelse, der testes på et enkelt tidspunkt, fordi ét sæt kontrolreaktioner (Wild-Type Control, Positive Control og uden template-kontrol) skal inkluderes i hver enkel reaktionsplade. Tabellen nedenfor viser antallet af prøver, der kan analyseres med KRAS kittet, alt afhængig af den gennemsnitlige prøvebatchstørrelse. Dette tager hensyn til (a) de 3 kontroller (Wild-Type, Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 6

8 5 Komponenter Positive Control, uden template-kontrol), der er påkrævet for hver prøvekørsel og (b) grænsen på 100 reaktioner pr. kit. Bemærk: Hvis der køres flere plader, skal et sæt af de 3 kontroller, der er anført ovenfor, køres på hver enkelt plade. To plader vil derfor kræve i alt 6 kontrolreaktioner, 3 plader vil kræve 9 kontrolreaktioner etc. Hvis prøvebatchstørrelsen forøges, vil antallet af prøver, der kan testet med et kit ligeledes blive forøget, hvilket vil reducere den gennemsnitlige reagenspris pr. prøve. Tabellen nedenfor er vejledning til antallet af prøver, der kan testes med et enkelt kit. Den giver en estimeret værdi for sandsynlige pipetteringstab. Prøvebatchstørrelse Antal kontrolreaktioner + Antal prøveamplikoner Antal reaktioner påkrævet pr. kørsel Samlet antal prøvebatchkørsler pr. kit Samlet antal prøver testet pr. kit DNA-sekventering Universal Sequencing Primers (PN F og R) leveres til brug for DNA-sekventering af alle de testede prøver. De PCR-amplikoner, der dannes inden SURVEYOR Nuclease fordøjelse, skal anvendes til sekventering. 6 Yderligere påkrævet udstyr og reagenser Yderligere komponenter og udstyr, der er påkrævet til brug af SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC inkluderer følgende: DHPLC system, kolonne, buffere, DNA størrelsesstandard - se Appendiks A.3.1 DHPLC Specifikationer for SURVEYOR Scan applikationer for karakteristika for et passende DHPLC system til brug med dette kit Vand af molekylærbiologisk kvalitet 0,2 ml PCR-rør, strimler eller 96-brønds plade Mikropipetter Pipettespidser Isbad Vortexer Mikrocentrifuge Termocykler Agarosegeler og elektroforeseudstyr til agarosegel 10% blegemiddel eller lignende rengøringsmiddel Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 7

9 7 Reagenspræparation 7 Reagenspræparation Alle reagenser, der medleveres med dette kit, er parat til brug. Nogle komponenter skal optøs, vortexes eller centrifugeres i en mikrocentrifuge før brug; tjek detaljer i Analyseprocedure nedenfor. Reagenser skal kombineres for at producere Masterblandinger og reaktionsblandinger; detaljer er anført under Analyseprocedure nedenfor. 8 Opbevaring og holdbarhed Kittet skal opbevares mellem -18 ºC og -25 C i en fryser med konstant temperatur, indtil det skal bruges. Bemærk Udløbsdatoen for hvert enkelt kit, der modtages. Kittet må ikke anvendes efter udløbsdatoen er overskredet. SURVEYOR Nuclease -blandingen, der forberedes i Trin 7 af SURVEYOR Nuclease fordøjelse skal anvendes omgående da SURVEYOR Nuclease W inaktiveres over tid ved tilstedeværelse af de andre SURVEYOR Nuclease reaktionsblandingskomponenter. 9 Advarsler og forholdsregler Ingen af reagenserne i dette kit udgør en sundhedsfare i de kvantiteter, der leveres. Transgenomic s dokument nummer MSD kan downloades fra Ingen substanser i dette kit er af animalsk eller human oprindelse, som kan udgøre en infektionsrisiko. Dette kit bør kun anvendes af personer, der er blevet uddannet i de behørige laboratorieteknikker. Ved arbejde med komponenterne i dette kit skal der altid bruges en egnet laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller. Efter brug skal kitkomponenterne bortskaffes som klinisk affald og i overensstemmelse med lokale regler og forordninger. Alikvoter af reagenser, der pipetteres fra rørene i dette kit, er kun beregnet til engangsbrug. Dette kits komponenter er blevet valideret som stabil efter 25 nedfrysnings-/optøningscyklusser. Dette kit må ikke anvendes, hvis dette antal af nedfrysnings-/optøningscyklusser overstiges. 10 Primær prøvetagning, håndtering og opbevaring SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC system er blevet valideret til brug med DNA, som er ekstraheret fra formalinfikseret, paraffinindlejrede (FFPE) colorectale cancertumorprøver. For optimal DNA-ekstraktion skal vævet fikseres i formalin i timer, før det indlejres i paraffin. Tumor-biopsier er en heterogen blanding af tumorceller og non-tumorceller. Herudover er selve tumoren en heterogen blanding af tumorceller med mutationer og tumorceller uden mutationer. Da disse somatiske mutationer måske ikke er jævnt distribueret i hele tumoren, kan den resulterende mutationsanalyse af forskellige sektioner fra den samme tumor være forskellige. For at forøge sandsynligheden for at dektere en mutation, skal DNA fra vævenes tumorregion isoleres ved kun at skrabe tumorområdet af objektglasset med en ny, steril skalpel for hvert nyt objektglas. For korrekt brug af dette kit skal det ekstraherede DNA opfylde de kriterier, der er anført under Templateovervejelser. BEMÆRK: Ekstraherede DNA-prøver, der ikke er tiltænkt til øjeblikkelig analyse med dette kit, skal opbevares ved -20 ºC til -80 ºC. Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 8

10 11 Analyseprocedure 11 Analyseprocedure 11.1 Somatisk mutationsdetektion med SURVEYOR Scan kits - En oversigt Mutationsdetektion og bekræftelse med SURVEYOR Nuclease involverer tre trin: Trin 1 - Forbered PCR-amplikoner fra mutant (test) og normal (reference) DNA, fortsæt fra den endelige PCR-amplifikationscyklus for at smelte alle dobbeltstrenge og afkøl derefter langsomt for optimal dannelse af hetero- og homoduplexer (heteroduplexer opstår, når en streng af en Wild-Type sekvens annealer med en streng fra en mutant sekvens). Trin 2 - Behandl en portion af den annealede heteroduplex-/homoduplexblanding med SURVEYOR Nuclease. SURVEYOR Nuclease vil klippe begge strenge på DNA heteroduplexen og forårsage DNA-fragmenter. Control Wild-Type DNA, der behandles på samme måde, anvendes som en baggrundskontrol. Trin 3 - Analysér DNA-fragmenterne på et DHPLC system. Dannelsen af nye kløvningsprodukter, der skyldes tilstedeværelsen af en eller flere mismatches, indikeres ved tilstedeværelse af yderligere chromatografiske peaks. Kløvningsprodukternes migrationstider indikerer fragmenternes størrelse og dermed mismatchens eller mismatchernes omtrentlige placering. Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 9

11 12 Trin-for-trin vejledning 12 Trin-for-trin vejledning 12.1 DHPLC INDLEDENDE opsætning/kalibrering Ved opsætning af SURVEYOR Nuclease pladen for analyse med DHPLC, se Appendiks A.3 Denaturering HPLC (DHPLC) systemkrav Overvejelser inden KRAS prøveanalyse Inden prøver køres på et DHPLC system, skal en passende DNA størrelsesstandard køres for at sikre, at systemet fungerer korrekt. Laboratoriepersonale, der bruger instrumentet, skal kontrollere kvaliteten af DNA størrelsesstandardens opløsning, før der fortsættes til analyse Templateovervejelser 1. For FFPE-isoleret template-dna skal der bruges normale laboratorieprocedurer til at vurdere den ekstraherede DNA's kvalitet og kvantitet for at sikre, at der er tilstrækkelig template for PCR /280 absorbansforholdet skal være større end >1, For at fremskynde PCR-opsætning skal den anvendte template-koncentration justeres til ca. 12,5 ng/µl. Fortynd template-dnaet med vand af molekylærbiologisk kvalitet, hvis det påkræves. Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 10

12 12 Trin-for-trin vejledning 12.4 Arbejdsflowovervejelser Kittet er designet til at tillade analyse af 100 reaktioner. Mindre prøvebatches kan køres, men kitkontrollerne og en uden template-kontrol skal inkluderes med hver enkel prøvebatch. Der er tilstrækkelige kontrolmaterialer i kittet til, at 100 reaktioner af alle kombinationer af prøvebatchstørrelser kan bruges. Generelt set skal bearbejdning af prøver udføres fra start til slut, som beskrevet i denne Brugsanvisning. Hvis bearbejdning af en prøve skal stoppes, før alle trin er fuldført, skal DNA'et opbevares ved -20 C ved de anførte punkter. Det skal imidlertid undgås, at frosne prøver bliver udsat for gentagne nedfrysnings-/optøningscyklusser og opbevaring af PCR-amplificeret DNA eller SURVEYOR Nuclease fordøjelsesprodukter i fryser (-18 to -25 C) i længere perioder (>1 uge) skal undgås. Analyse af prøver skal følge det arbejdsflow, der er vist nedenfor: Afskrabet væv 1 DNA Isolering & PCR 2 Gelelektroforese 3 5 SURVEYOR Scan Mislykket Score Robust/Faint (svag)pcr 4 SURVEYOR Nuclease & DHPLC Analyse SURVEYOR Scan Positiv SURVEYOR Scan Negativ 7 6 Sekvensbekræftelse NVD 8 Sekvenskvalitet Mislykket Sekvenskvalitet Bestået 9 Mutationer i codon G12 eller G13 NVD Figur 3: Arbejdsflow for SURVEYOR Scan KRAS Kit analyse Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 11

13 12 Trin-for-trin vejledning Bemærkninger til Figur 3 1. Isolér DNA fra FFPE ved at følge normale laboratorieprocedurer. 2. Udfør PCR og kontroller kvalitet af DNA med gelelektroforese. 3. Registrer om PCR-bånd er Robust ( 20 ng/µl) eller Faint (svag) (<20 ng/µl). Hvis der er flere PCR-bånd, skal der forberedes nyt genomisk DNA fra FFPE. 4. For prøver, der scores som enten Robust PCR eller Faint PCR efter PCR-amplifikation, fortsættes der med SURVEYOR Nuclease behandling og DHPLC systemanalyse. Bemærk, at med en Faint PCR-identifikation kan der være utilstrækkeligt DNA til generering af meningsfyldte resultater med DHPLC, men der kan være nok DNA til sekventering. 5. Se Appendiks B Problemløsningsguide for eksempler på mislykkede SURVEYOR Scan resultater. Alle prøver med et mislykket SURVEYOR Scan resultat skal ombearbejdes ved enten at: a. gentage PCR, hvis der er nok genomisk DNA tilbage b. re-ekstrahere DNA fra FFPE; dette bør være det sekundære valg, da det normalt er uønskværdigt at skære endnu en FFPE blok. c. hvis en anden sektion eller blok anvendes, skal hele analysen gentages, da uoverensstemmelse i fordøjelse kan skyldes tumor heterogeneitet. 6. Hvis der ikke er nogen synlige kløvningspeaks, skal der registreres et negativt SURVEYOR Scan resultat, dvs. NVD = Ingen variant detekteret. 7. Hvis en prøve viser SURVEYOR Nuclease kløvningsprodukter (matcher ikke den relevante Wild-Type Control) skal den sendes til sekvensbekræftelse. 8. Hvis sekvensbekræftelse-analyse er uacceptabel, skal man enten: a. gentage PCR, hvis der er nok genomisk DNA tilbage b. re-ekstrahere DNA fra FFPE; dette bør være det sekundære valg, da det normalt er uønskværdigt at skære yderligere snit fra en FFPE blok. 9. Hvis sekvensbekræftelse-analyse er acceptabel, skulle resultaterne indikere enten: a. Wild-Type sekvens, det vil sige Ingen variant detekteret (NVD); eller b. Variant detekteret. Hvis sekvensbekræftelse indikerer en base-ændring, der resulterer i en aminosyre-ændring i: i. codon 12; eller ii. codon 13 scores det som KRAS mutation positiv. Bemærk: det er muligt at have en positiv SURVEYOR Scan identifikation, der ligeledes resulterer i Ingen variant detekteret fra en sekvensbekræftelse-test. Detektionsniveauet (LOD) for SURVEYOR Nuclease på et DHPLC system er så lavt som 2% mutant i 98% Wild-Type DNA for nogle mutationer, hvorimod LOD for sekventering er omkring 10-25% mutant i 90-75% Wild-Type DNA. Bemærk: hvis en prøve er 100% mutant DNA, kan der ikke dannes heteroduplexer og prøven vil blive vist som Wild-Type. Tumor-biopsiprøver vil imidlertid indeholde Wild-Type celler på grund af tumor heterogeneitet og/eller kontaminerende normalt væv; 5% Wild-Type er detekterbart med dette kit med spor identisk med 5% mutant DNA. Bemærk: positive SURVEYOR Scan resultater kan skyldes andre base-ændringer end de, der er blevet fundet at være KRAS-aktiverende. Skønt disse mutationer er sjældne, vil bekræftelse med en anden metode, som fx DNA-sekventering være påkrævet for at bestemme, hvorvidt eller ej et positivt SURVEYOR Scan resultat er en KRAS-aktiverende mutation. Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 12

14 12 Trin-for-trin vejledning Bemærk: formalin-fikseringsprocessen, der anvendes ved tilberedning af FFPE tumorbiopsiprøver kan resultere i deaminering af cytosiner. Denne deaminering omdanner cytosin til uracil. Polymerasen vil læse denne uracil som en thymin og inkorporere en adenin i de kopierede strenge. Dette vil så forekomme at være en mutation, hvor det normale G nu er udskiftet med et A og forårsager en GC til AT mutation, hvilket er en kunstig mutation, der resulterer fra fikseringsprocessen og ikke en ægte somatisk mutation. Disse er sjældne begivenheder, men hvis de kopieres tidligt i PCR-cyklusserne, vil de ligne mutationer. De vil ikke blive gentaget ved reanalyse. Eksempler på potentielle cytosin deaminering-mutationer, der ville blive overvejet for at bestemme patientbehandling, er: - Codon 12: AGT (G12S) og GAT (G12D) - Codon 13: AGC (G13S), GAC (G13D) og GGT (G13G, en tavs mutation) Det anbefales derfor, at enhver sådan mutation bekræftes med dobbeltanalyse af det samme genomiske DNA, eller at alle prøver underkastes dobbeltanalyse fra analysens start Amplifikationsprotokol 1. Transgenomic forblandet dntp opløsning (PN ) leveres som arbejdskoncentration på 10 mm total deoxynukleotid (2,5 mm af hver af de fire deoxynukleotider). 2. KRAS Exon 2 Forward og Reverse PCR-primere (PN F/R) leveres som 10 µm. 3. Tag 10 µm primere, 10 mm dntps og DNA Polymerase 10X PCR Buffer (PN ) ud af fryser og optø dem på is. 4. Efter optøning vortex alle kitkomponenter (~10 sekunder), så de blandes grundigt og centrifugér dem kortvarigt (~10 sekunder) for at sikre, at der ikke er noget væske tilbage på rørlågene og placér dem på is. 5. Forbered Masterblandingen på is. 6. Brug den følgende tabel som en vejledning til tilberedning af Masterblanding for KRAS exon 2 reaktioner: Antal reaktioner: 10 Volumenberegning: Vandvolumen (µl) 330** DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µl) 50 dntps (µl) 40 KRAS Primer Exon 2 Forward (µl) 25 KRAS Primer Exon 2 Reverse (µl) 25 DNA Polymerase (µl) 10 Total volumen af Masterblanding 48.0 **Bemærk: Brugeren skal sigte efter at have minimum 25 ng DNA pr. 50 µl reaktion. Hvis ekstraherede DNA-koncentrationer er mindre end 12,5 ng/µl, skal volumen af ekstraheret DNA forøges proportionelt for at sikre 25 ng pr. reaktion. Volumen af vand i Masterblandingen skal ligeledes reduceres med den samme mængde for at resultere i 50 µl pr. reaktion. Alle prøver, der forberedes med denne Masterblanding, skal have den ekstraherede DNA fortyndet til ca. det samme laveste koncentrationsniveau. Brug af ekstraherede DNA-koncentrationer på mindre end 5 ng/µl anbefales ikke. 7. Beregn de påkrævede volumener for enhver given Masterblanding i henhold til ovenstående diagram; bemærk at: For denne Masterblanding vil tre yderligere reaktioner være påkrævet for KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 2 og KRAS Exon 2 No Template Control (uden template-kontrol) (NTC1). Bemærk: tag i betragtning, at en Masterblanding-volumen, der er lidt større end denne beregning, vil være påkrævet for at tage hensyn til tab under pipettering. Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 13

15 12 Trin-for-trin vejledning 8. Afmærk 0,2 ml PCR-rør eller brønde i en 96-brønds plade med behørig prøveinformation. 9. Afmærk et 2,0 ml-centrifugerør til Masterblanding-præparation. 10. Tilsæt det påkrævne volumen af vand af molekylærbiologisk kvalitet til de 2,0 mlcentrifugerør afmærket Masterblanding. 11. Tilsæt den påkrævne mængde DNA Polymerase 10X PCR Buffer til Masterblanding-røret. 12. Tilsæt det påkrævne volumen af 10 mm dntps til Masterblanding-røret. 13. Tilsæt det påkrævne volumen af KRAS Forward primer til Masterblanding-røret. 14. Tilsæt det påkrævne volumen af KRAS Reverse primer til Masterblanding-røret. 15. Tag DNA Polymerase (PN ) ud af fryseren. 16. Centrifugér DNA Polymerase i ~10 sekunder. 17. Vortex DNA Polymerase i ~10 sekunder. 18. Tilsæt den påkrævne mængde DNA Polymerase til Masterblanding-røret. 19. Sæt hætte på Masterblanding-røret. 20. Vortex Masterblanding-røret før brug i ~30 sekunder og centrifugér derefter kortvarigt i ~10 sekunder. 21. Opbevar på is indtil brug. 22. Afpipettér 48,0 µl (se bemærkning ovenfor i Trin 6) Masterblanding i de behørige brønde, idet der skiftes pipettespids ind imellem, hvis der anvendes en enkeltkanalpipette. Hvis der bruges en repeatpipette, skal det sikres, at der ikke er spild eller stænk fra brønd til brønd. Pladen skal opbevares på is. 23. De behørige brønde tilsættes 2,0 µl (se bemærkning ovenfor i Trin 6) af hver enkelt prøve-template-dna, eller vand (uden template-kontrol, NTC). Brug separat pipettespids for hver enkelt prøve og undgå krydskontaminering af prøverne med stænk. Luk brøndene, der indeholder prøve-dnaer og uden template-kontrol (NTC) meed 8-hætte strimlerne (hvis der bruges en 96-brønds plade) eller sæt hætter på 0,2 ml PCR-rørene. Tjek at hætterne er forseglet korrekt. 24. Først nu må kitkontrol-template-dnaernes (PN , ) rør åbnes, et ad gangen. Afpipettér 2,0 µl af hver af kontrol-templaterne til sidst for at formindske chancen for at kontaminere prøve-dna. Luk igen hver enkelt brønd med 8-hætte strimlerne (hvis der bruges en 96-brønds plade) eller sæt hætte på 0,2 ml PCR-rørene. Tjek at hætterne er forseglet korrekt. BEMÆRK: Det er god prakis at placere uden template-kontrollerne (NTC) i brønde, der ikke er tilstødende til Positive Control eller prøver. BEMÆRK:For et forslag til opstilling af 96-brønds plader til analyse af alle KRAS og NRAS exon 2-4 se Appendiks A.1 Pladelayout-plan for SURVEYOR Scan kits. 25. Vortex (~1/2 hastighed) i 10 sekunder. 26. Centrifugér i 1-2 minutter for at sikre, at alle opløsninger er samlet i bunden af brøndene eller rørene. Kontrollér at opløsningen er i bunden af hver brønd eller rør. Hvis ikke, skal centrifugeringen gentages. Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 14

16 12 Trin-for-trin vejledning 12.7 Termocyklerprogram for Amplifikationsprotokol 1. Brug den følgende termocyklerprotokol for PCR-amplifikation og heteroduplex-dannelse: 15 cyklusser 30 cyklusser Initial denaturering 95 C 5 minutter Touchdown amplifikation 95 C 30 sekunder 62 C, -0,5 ºC/cyklus 30 sekunder 72 C 25 sekunder Amplifikation 95 C 30 sekunder 55 C 30 sekunder 72 C 25 sekunder Endelig forlængelse 1 cyklus 72 C 2 minutter Heteroduplex-dannelse 95 ºC 2 minutter 12 C 12.8 Kvalitetskontrol af PCR-produkter 1. Det anbefales, at amplikon kvalitet og kvantitet kontrolleres med gelelektroforese (eller tilsvarende metode), før der fortsættes med SURVEYOR Nuclease fordøjelse. 2. Analysér en alikvot af PCR-produktet sammen med flere forskellige mængder af en 100- bp DNA mass ladder. Hold 3. Brug ladderen til at estimere koncentrationen af den amplificerede DNA. 4. Kun et enkelt bånd større end 20 ng/µl, der korresponderer med hoved-pcr-produktet, skulle observeres. 5. Hvis der er flere bånd tilstede, skal det sikres, at kvaliteten af input-template-dna var tilstrækkelig (se Appendiks B Problemløsningsguide). 6. Hvis der ikke observeres noget produkt, skal det sikres, at kvaliteten af input-template- DNA var tilstrækkelig (se Appendiks B Problemløsningsguide). Hvis kvaliteten opfylder specifikationerne, skal template-volumen forøges til 4,0 µl pr. 50 µl reaktion (reducér vand pr. reaktion til 31,0 µl). 7. Ingen PCR-produkter skulle være synlige i uden-template-kontrolprøven. Hvis DNAprodukter er synlige med denne kontrol, skyldes det sandsynligvis kontaminering; se Appendiks B - Problemløsningsguide. 8. Scor PCR som Robust PCR eller Faint PCR. a. Robust PCR skulle have et enkelt bånd større end eller lig 20 ng/µl. b. Faint PCR skulle have et enkelt bånd mindre end 20 ng/µl. c. Fortsæt med SURVEYOR Nuclease fordøjelse med både Robust og Faint PCR score. ET TIP: på dette trin kan PCR-produkter opbevares ved -20 ºC eller herunder i op til en uge SURVEYOR Nuclease fordøjelse 1. Når prøve-pcr'en anses for at være af tilstrækkelig kvalitet og kvantitet, skal SURVEYOR Nuclease fordøjelsesreaktionen udføres, som beskrevet nedenfor. 2. Optø rørene med 0,15 M MgCl 2 Solution og SURVEYOR Enhancer Cofactor på is. Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 15

17 12 Trin-for-trin vejledning 3. Tilsæt 10,0 µl af hver PCR-amplificeret prøve fra ovenstående til et nyt 0,2 ml PCR-rør eller brønd i en 96-brønds plade. 4. Forbered en ny blanding af 0,15 M MgCl 2 Solution, SURVEYOR Enhancer Cofactor, SURVEYOR Enhancer W2 og SURVEYOR Nuclease W (SURVEYOR Nucleaseblanding). Brug den følgende tabel som en vejledning til tilberedning af SURVEYOR Nuclease fordøjelse Masterblanding til analyse af flere prøver. Nedenstående eksempel har volumenerne for en 10 prøve-masterblanding. Tag i betragtning, at en Masterblanding-volumen, der er lidt større end denne beregning, vil være påkrævet for at tage hensyn til tab under pipettering. Antal SURVEYOR Nuclease fordøjelsesreaktioner: 10 Volumenberegning: 0,15 M MgCl 2 Solution (µl) 10.0 SURVEYOR Enhancer Cofactor (µl) 10.0 SURVEYOR Enhancer W2 (µl) 10.0 SURVEYOR Nuclease W (µl) 20.0 Total volumen af Masterblanding: 50.0 Tilsæt 5 µl SURVEYOR Nuclease Masterblanding til hver PCR-amplificeret prøve (µl) 10.0 Total volumen af SURVEYOR Nuclease fordøjelsesreaktion: 15.0 a. Centrifugér hver enkelt reagens før brug. b. Vortex forsigtigt hver enkelt reagens før afpipettering; centrifugér kortvarigt i ~10 sekunder efter hvert vortex-trin. c. For hver enkelt fordøjelse skal de følgende komponenter tilsættes til et 0,2 ml PCR- (eller større) mikrocentrifugerør. 1,0 µl 0,15 M MgCl 2 Solution (PN ) 1,0 µl SURVEYOR Enhancer Cofactor (PN ) 1,0 µl SURVEYOR Enhancer W2 (PN ) 2,0 µl SURVEYOR Nuclease W (PN ) Eller tilsæt 5 µl Masterblanding forberedt i henhold til ovenstående tabel. 5. Vortex forsigtigt SURVEYOR Nuclease fordøjelse Masterblanding i 10 sekunder ved lav hastighed. 6. Centrifugér SURVEYOR Nuclease fordøjelse Masterblanding i 10 sekunder ved lav hastighed 7. Placér SURVEYOR Nuclease fordøjelse Masterblanding på is indtil brug. Bemærk: SURVEYOR Nuclease fordøjelse Masterblandingen, der forberedes i Trin 7, skal anvendes omgående, da SURVEYOR Nuclease W inaktiveres over tid ved tilstedeværelse af de andre SURVEYOR Nuclease fordøjelse Masterblandingkomponenter. 8. Afpipettér 5,0 µl-alikvot af SURVEYOR Nuclease fordøjelse Masterblandingen i hvert rør eller brønd, der indeholder 10,0 µl alikvot af amplificeret PCR-produkt (se Trin 3 ovenfor). 9. Når afpipettering er fuldført skal 0,2 ml PCR-rørene eller 96-brønds pladen centrifugeres i 10 sekunder. 10. Vortex forsigtigt prøve- 0,2 ml PCR-rørene eller 96-brønds pladen i 10 sek. 11. Centrifugér i 10 sekunder ved lav hastighed (dette trin er særligt vigtigt, hvis fordøjelsen udføres i et instrument uden et opvarmet låg). 12. Inkubér ved 42 C i 30 minutter. Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 16

18 12 Trin-for-trin vejledning 13. Tilsæt 1,0 µl SURVEYOR Stop Solution (PN ) til hvert enkelt rør eller brønd og vortex forsigtigt (total SURVEYOR Nuclease reaktionsvolumen er 16,0 µl). ET TIP: SURVEYOR fordøjelsesprodukter kan opbevares ved -20 ºC i op til en uge. 14. Sæt prøvefordøjelserne på et DHPLC system. Bemærk: For foreslåede DHPLC systemgradientindstillinger til analysering af SURVEYOR Nuclease fordøjelser, se venligst 13 Kontrolprocedurer 13.1 Kvalitetskontrol af SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD Kontrol Plasmid DNA'er er inkluderet i kittet for kvalitetskontroltjek ved specifikke trin i analyseproceduren. For Amplifikationsprotokollen er disse kontroller en metode til at sikre, at Masterblandingen er forberedt rigtigt og at amplifikationen fungerer korrekt. Uden templatekontroller (hvor vand tilsættes i stedet for template-dna) er ligeledes påkrævet for at tjekke for mulig kontamination af kitkomponenter med en fremmed DNA-template. På SURVEYOR Nuclease fordøjelse-trinnet giver amplikonen fra Kontrol Plasmid DNA et effektivt tjek på, hvorvidt kløvningsreaktionsbetingelserne (SURVEYOR Nuclease fordøjelse Masterblandingspræparation og inkubationbetingelser) var tilfredsstillende. På analysetrinnet giver DHPLC system kromatogrammerne af de SURVEYOR Nuclease fordøjede kontrolamplikoner vejledning om, hvor de kløvningsproduktpeaks, der korresponderer med denne mutation i KRAS exon 2, selv ved lave niveauer, vil eluere (se Figur 4). Kløvningsproduktpeaks, der korresponderer til andre mutationer i KRAS exon 2 kan eluere i lidt forskellige positioner. Hvis PCR-amplikonerne ikke matcher de resultater, der er anført i Kvalitetskontrol af PCRprodukter, skal Appendiks B - Problemløsningsguide konsulteres eller Transgenomic Technical Support kontaktes, før der fortsættes med yderligere trin i analysen af prøverne Sådan anvendes Kontrol Plasmid DNAer Kittet leveres med to kontrol DNAer: KRAS Control Wild-Type; PN KRAS Positive Control Exon 2; PN Disse kontrol DNAer er plasmider med inserts. Den Positive Control indeholder to plasmider: en blanding af KRAS Control Wild-Type og en mutationsklon, der er forskellig fra Wild-Type på et enkelt basepar. Kontrollerne leveres i separate hætteglas, hver i en koncentration på 10 5 kopier/µl. KRAS Exon 2 Forward og Reverse PCR-primere, der er nødvendige for PCR-amplifikation, leveres separat i kittet. Følg vejledningen i Amplifikationsprotokollen, SURVEYOR Nuclease fordøjelse og Analyse af KRAS exon 2 for brug af SURVEYOR Nuclease for disse kontroller. VI ANBEFALER STÆRKT, AT FØRSTEGANGSBRUGERE UDFØRER EKSPERIMENTER MED KONTROLLERNE ALENE, FØR DE TESTER GENOMISKE PRØVER Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 17

19 14 Fortolkning af resultater 14 Fortolkning af resultater 14.1 Analyse af KRAS exon 2 med SURVEYOR Nuclease For sammenlignings- og kontrolformål skal der ALTID udføres SURVEYOR Nuclease fordøjelse på hver af kontrollerne (Wild-Type og Positive Controls), en uden template-kontrol, såvel som prøve-dnaerne og køres i samme DHPLC system prøveplade. På SURVEYOR Nuclease fordøjelse-trinnet giver amplikonerne fra disse Kontrol Plasmid DNAer et effektivt tjek på, hvorvidt kløvningsreaktionsbetingelserne (SURVEYOR Nuclease blandingspræparation og inkubationbetingelser) var tilfredsstillende. På analysetrinnet giver DHPLC systemets spor af disse SURVEYOR Nuclease fordøjede kontrolamplikoner vejledning om, hvor DNA-fragmenterne, der resulterer fra kløvning ved disse specifikke mutationers mismatch positioner, selv ved lave niveauer, vil eluere (se Figur 4). Hvis enten PCR-amplikonerne eller SURVEYOR Nuclease kløvningsfragmenterne, der er afledt fra Kontrol DNAerne, ikke matcher de resultater, der er anført, skal Appendiks B - Problemløsningsguide konsulteres eller Transgenomic Technical Support kontaktes, før der fortsættes med yderligere trin i analysen af prøverne. De eksempler, der er givet nedenfor, er kun til illustrationsformål og kan IKKE anvendes til at bestemme en given mutations identitet. Bekræftelse af en mutations identitet er påkrævet for entydigt at bestemme tilstedeværelsen af en specifik base-ændring i exon 2 af KRAS genet. SURVEYOR Nuclease kløver ved alle mismatches, der resulterer fra heteroduplex-dannelse mellem Wild-Type og mutante DNAer og ikke blot mutationer i exon 2. SURVEYOR Nuclease bekræfter, at en mismatch er tilstede. Mutationens specifikke base-ændring identitet er påkrævet for bestemmelse af KRAS-aktiverende status og den skal bekræftes med en anden metode, som fx sekventering Dataevaluering af SURVEYOR Scan resultater Inspicér kromatogrammerne og sammenlign dem for Wild-Type og de Positive Controls med det for prøven. Bestem om prøvens kromatogram ligner eller er forskellig fra Wild-Type mønsteret. Hvis den er forskellig, skal prøven anses for at være SURVEYOR Scan Positiv og sendes til DNA-sekvensanalyse. Se Figur 4 for eksempler og Appendiks B Problemløsningsguide, Problem 7 & 8 for eksempler på sådanne prøver. Enhver prøve med et SURVEYOR Nuclease mønster, som er forskelligt fra Wild-Type, skal sendes til sekvensbekræftelse, selv hvis den ikke er identisk med kontrollen. Se Appendiks B Problemløsningsguide, Problem 7 for et eksempel på en sådan prøve. Når det påkræves, zoom ind i regionen af interesse og overlay prøve-kromatogrammet med Wild- Type Control for dette amplikon. Bemærk alle forskelle mellem Wild-Type control og den analyserede prøve. Vigtigt! Efter en grundig evaluering af hver prøve skal datarevieweren undersøge, hvorvidt tilstødende prøver i analysepladen har identiske positive SURVEYOR Scan resultater. Hvis identiske positive resultater forekommer, kan de være et resultat af prøve- eller kontrolkrydskontaminering og analysen skal gentages. Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 18

20 14 Fortolkning af resultater 14.3 Eksempler på resultater Eksempler på resultater opnået med SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC er vist i Figur 4 nedenfor. I disse eksempler, hvor der blev brugt WAVE 4500 Systemer med både UV- og fluorescerende detektorer, blev processen, der er beskrevet i afsnittet Trin-for-trin vejledning, fulgt præcist. For vejledning om foreslåede DHPLC systemgradientindstillinger til analysering af SURVEYOR Nuclease fordøjelser, se venligt Figur 4A DHPLC gennemstrømning G12D danner 74 og 116-bp fragmenter KRAS Control Wild-Type KRAS Positive Control Exon 2 Ukløvet Prøve 1, KRAS Exon bp Prøve 2, KRAS Exon 2 amplikon Prøve 3, KRAS Exon 2 DNA Sizing Standard Ukløvet 190-bp amplikon DHPLC Afvaskning Figur 4B G12D danner 74 og 116-bp fragmenter KRAS Control Wild-Type KRAS Positive Control Exon 2 Ukløvet Prøve 1, KRAS Exon bp Prøve 2, KRAS Exon 2 amplikon Prøve 3, KRAS Exon 2 DNA Sizing Standard Ukløvet 190-bp amplikon Figur 4A og 4B: WAVE DHPLC analyse med UV- (Figur 4A) og fluorescerende (Figur 4B) detektion af SURVEYOR Nuclease fordøjelser af KRAS Positive Control Exon 2 og KRAS Control Wild-Type og CRC DNA isoleret fra FFPE-sektioner. Når kromatogrammerne evalueres visuelt, skal de fordøjede prøver sammenlignes med Wild-Type Control (brun linje). KRAS Positive Control Exon 2 (blå linje) er en blanding af Wild-Type og mutant G12D plasmider, der resulterer i fordøjelsespeaks på 74 og 116 bp; denne kontrol indikerer, at SURVEYOR Nuclease fordøjelsestrinnet fungerer og viser regionen af kromatogrammet, der skal inspiceres visuelt for at bestemme, om en prøve skal sendes til DNA-sekvensanalyse. Ved sammenligning af fordøjelsesmønstre for Prøve 1-3 med Wild-Type ufordøjet elektroferogram, fremgår det, at Prøve 1 og 2 (rød & turkis linje) har sandsynlige mutationer og skal sekventeres for at bekræfte tilstedeværelse eller fravær af en mutation på den relevante codon. Prøve 3 (grøn linje) har lignende kromatogrammer til de, der observeres for Wild-Type Control og behøver ikke at blive sendt til DNA-sekvensanalyse. Bemærk, at sekventeringsresultatet er det definitive resultat, da der kan være andre ikke-relevante mutationer, der kan resultere i de samme fragmentstørrelser. Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 19

21 15 Ydelseskarakteristika 15 Ydelseskarakteristika 15.1 Detektionsniveau af mutationer for SURVEYOR Scan kits Validering af SURVEYOR Scan kits for DHPLC platforme ved brug af plasmid kloner af alle indikerede mutationer har vist, at SURVEYOR Nuclease peaks kan detekteres i en blanding af 2-5% mutant i en Wild-Type baggrund. Automatiseret sekventeringsidentifikation af både forward og reverse strenge forfejler ofte at detektere mutationer ved niveauer under 10% i blandinger med Wild-Type DNA. Sammen med SURVEYOR Nuclease resultaterne er det muligt at fortolke de 5-10% mutant sekventeringelektroferogrammer med større sikkerhed. Hvis en prøveanalyse viser et SURVEYOR Scan positivt resultat, men der ikke er nogen detekterbar KRAS eller NRAS mutation med DNA-sekventering, anbefaler vi, at der registreres et Ingen variant detekteret resultat. Se Arbejdsflowovervejelser for yderligere information Sekvensbekræftelse Fortsæt med sekvensbekræftelse for alle SURVEYOR Scan positive resultater for at bestemme KRAS Exon 2 mutationens sekvensidentitet. Gå ikke videre til sekvensbekræftelse, hvis SURVEYOR Scan havde et negativt resultat. Prøven kan rapporteres som Wild-Type eller Ingen variant detekteret. De Universal Sequencing Primers, der er inkluderet i dette kit, er beregnet til at blive anvendt til sekvensbekræftelse. Forward primeren er PN F (Universal Sequencing Primer 1) og reverse primeren er PN R (Universal Sequencing Primer 2) Analyseprocedurebegrænsninger Kontaminerende substanser, der overføres fra ektraktion af formalin-fikserede, paraffinindlejrede prøver, kan interferere med PCR-amplifikationen og SURVEYOR Nuclease fordøjelsesprocedurerne. De kvalitetskontrolprocedurer, der er beskrevet i Kvalitetskontrol af PCR-produkter, vil sikre, at det ekstraherede DNA er egnet til brug i dette kit. Dette kit er blevet valideret til analyse af formalinfikserede, paraffinindlejrede colorectale cancertumor-prøver. Det er ikke blevet valideret til diagnostisk brug for andre cancer-typer eller med friske eller frosne biopsiprøver. For problemløsning af ikke-standard resultater og faktordetaljer, som kan påvirke denne analyse, henvises der til Appendiks B - Problemløsningsguide nedenfor. Man skal være omhyggelig med at undgå overførsel og krydskontaminering med dette kit. Analysemetodens ekstreme sensitivitet kræver, at der træffes forholdsregler ved de følgende punkter: Sørg for, at alle prøver håndteres således, at der ikke kan ske krydskontaminering prøver imellem. Der skal arbejdes i en PCR-arbejdsstation eller et andet passende sted, hvor arbejdsområdet kan blive udsat for UV-lys før opstilling af PCR-amplifikationsreaktionerne. Brug en separat PCR-arbejdsstation eller et separat rum til åbning af prøverne efter PCRamplifikationen for kvalitetskontrol med gelelektroforese. SURVEYOR Nuclease fordøjelsesopstilling skal udføres i et separat rum eller en anden PCR-arbejdsstation end den, hvor den initiale PCR blev opstillet. Sørg for, at kittets plasmid-kontroller håndteres separat fra testprøverne på alle analysens trin. o Sørg for, at alle opløsninger, uden template-kontrol og prøve-dna brønde er påført hætter, før rørene, der indeholder kontrol plasmid DNA'er åbnes. Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 20

22 15 Ydelseskarakteristika o o HÅNDTER KONTROLLER TIL SIDST. Tilsæt først kontrol plasmid-dnaerne til de behørige rør, NÅR ALLE uden template-kontrol og prøvebrønde er blevet påsat hætte. Efter påsætning af hætter på kontrol DNA-rørene skal ALLE rør og hætter aftørres med et DNA-dekontamineringsmiddel (som fx 10% blegemiddel) før overførsel til et andet område. Sørg for, at der ved pipettering af prøver i 96-brønds plader ikke tillades prøvekontaminering af tilstødende brønde pga. enten stænkning under blanding eller ved ikke at skifte pipettespidser. Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 21

23 Appendiks A Appendiks A A.1 Pladelayout-plan for SURVEYOR Scan kits Den pladelayout-plan, der er foreslået nedenfor, er til udførelse af SURVEYOR Scan analyse af alle syv KRAS og NRAS exons samtidigt på 10 prøver. Nøgle: Ex = Exon; WT = Wild-Type; Mut = Mutation; NTC = Uden template-kontrol. A.2 Kontrol DNA stempler Sekvenser med et Stempel er anført nedenfor. Nøgle: De mest almindelige mutationsregioner er fremhævet med Lilla. Sekvens med STORE bogstaver er kodende base; sekvens med små bogstaver er ikke-kodende base. Kontrollerne har genetisk stempel fremhævet med Gult; denne variation fra KRAS Wild-Type sekvensen, i en region, der ikke forventes at have mutationer, kan bruges til at problemløse prøvekontaminering med Positive Controls. Se Appendiks B - Problemløsningsguide, Problem 8, for et eksempel på et SURVEYOR Scan spor af sådan kontaminering. KRAS Exon 2 Stempel Amplikonstørrelse: 190 bp. For dannelse af KRAS Exon 2 kontrol plasmids genetiske stempel ændres TAT til ATA. Codon 12 og 13 er ligeledes fremhævet nedenfor. GCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAAATAGAT A.3 Denaturering HPLC (DHPLC) systemkrav A.3.1 DHPLC specifikationer for SURVEYOR Scan applikationer De følgende specifikationer er minimumskravene for DHPLC systemspecifikationer for udførelse af SURVEYOR Scan KRAS & NRAS kit analyser. Højtydende gradientsolvens-leveringssystem (High Performance Gradient Solvent Delivery System) Binær gradient-kapabilitet; højt tryk eller lavt tryk Flowhastighedskontrol, minimumsområde: 0,7 1,6 ml/min Flowhastighedsnøjagtighed: ± 2% (H 2 O ved 20 ºC) Solvensafgasser Autosampler Temperaturkontrol til kølige plader, indstillelig: 4 til 14 ºC Injektionsvolumen: 5 50 µl Separationscartridge Designet til dsdna fragmentstørrelse-separation, fragmentstørrelser 50 bp til 250 bp Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 22

24 Appendiks A Ovn med højpræcision-temperaturkontrol Temperaturområde: 40 til 70 ºC Temperaturpræcision: ± 0,2 ºC Temperaturreproducerbarhed: ± 0,2 ºC Linearitet over det samlede temperaturområde: ± 2,0 ºC Detektionsalternativ 1 UV/VIS-detektor Bølgelængdeområde: nm UV-kilde: Deuterium-lampe Detektionsalternativ 2 Fluorescerende detektor Bølgelængdeområde: excitation: nm; emission: nm Fluorescens-kilde: 150W Xenon-lampe Fluorescerende farvestof-pumpe Fast flowhastighed på 0,1 ml/min 20%/+50% Lavt pulserende flow A.3.2 Systemdrift For opsætning og drift af DHPLC system, se og følg producentens anbefalinger for analyse af dsdna fragmenter, der er i størrelsesområdet 50 bp til 250 bp, med tilsigtet størrelsesdiskrimination på 10 bp eller bedre. Dette er størrelsesområdet for fragmenter efter SURVEYOR Nuclease fordøjelse ved brug af dette kit. For vejledning om foreslåede DHPLC systemgradientindstillinger til analysering af SURVEYOR Nuclease fordøjelser, se venligst A.3.3 Vedligeholdelse af DHPLC Cartridges For vedligeholdelse af DHPLC cartridges følg producentens anbefalinger. Bemærk: analyse af SURVEYOR Nuclease reaktioner vil kræve mere hyppige og strengere rengøringsprotokoller end dem for standard PCR-prøveanalyse. Der henvises til DHPLC systemets retningslinjer for yderligere information. A.4 Laboratorieopstilling for PCR-analyser For at producere pålidelige og kontamineringsfri PCR-resultater skal god laboratoriepraksis følges når PCR-laboratorielayoutet designes. Ved planlægning af laboratoriearrangement skal behovet for spatial separation af PCRamplifikationsopstilling og postamplifikation-aktiviteter tages i betragtning. Det er vigtigt at separere (i) DNA isolering: (ii) PCR-amplifikation; og (iii) Post-PCR-aktiviteter såsom åbning af rør, der indeholder amplificerede prøver som forberedelse på kørsel af geler og opstilling af andre analyser som fx SURVEYOR Nuclease fordøjelser og DNA-sekventering. Det er også vigtigt, at have laboratoriematerialer og -udstyr, der er dedikeret til hvert enkelt område og kun må anvendes i det pågældende område. Aftørring af overflader med 10% (v/v) blegemiddel, der friskfremstilles en gang om ugen, vil hjælpe med til at eliminere DNA-fragmenter 500 bp som templates for PCR. Det kan ydermere være nyttigt at behandle plastikudstyr og opløsninger ved at udsætte det i 7 10 minutter med kortbølge-uv-lys med en UV-crosslinker. Bemærk: enzymer og DNA, der skal amplificeres må ikke behandles med UV-lys. Ved at bruge behørigt beskyttelsestøj, skifte handsker hyppigt og aftørre sine behandskede hænder med 10% (v/v) blegemiddelopløsning, før man går til en arbejdsstation, vil man bistå meget til at reducere kontaminering. Som minimum skal der være en opstilling, der ligner To-rums arrangementet i diagrammet nedenfor, der er designet specifikt for PCR og analyse med SURVEYOR Nuclease. Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 23

25 Appendiks A Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 24

26 Appendiks A A.5 Litteraturhenvisninger 1. Amgen News Release (2013) New analyses identify predictive biomarkers for Vectibix (panitumumab) in patients with metastatic colorectal cancer Peeters M et al (2013) Massively parallel tumor multigene sequencing to evaluate response to panitumumab in a randomized phase III study of metastatic colorectal cancer. Clin Cancer Res De Roock W et al (2010) Association of KRAS p.g13d mutation with outcome in patients with chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. JAMA Peeters M et al (2013) Mutant KRAS codon 12 and 13 alleles in patients with metastatic colorectal cancer: assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to panitumumab. J Clin Oncol Andre T et al (2013) Panitumumab combined with irinotecan for patients with KRAS wildtype metastatic colorectal cancer refractory to standard chemotherapy: a GERCOR efficacy, tolerance, and translational molecular study. Ann Oncol Loupakis F et al (2009) KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer. Br J Cancer De Roock W et al (2010) Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol Qiu P et al (2004) Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques Kuang Y et al (2009) Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res Mitani N et al (2007) Surveyor nuclease-based detection of p53 gene mutations in haematological malignancy. Ann. Clin. Biochem Engelman JA et al (2006) Allelic dilution obscures detection of a biologically significant resistance mutation in EGFR-amplified lung cancer. J. Clin. Invest Se ligeledes for henvisninger til SURVEYOR Nuclease og dets applikationer. Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 25

27 Apppendiks B Appendiks B Problemløsningsguide Effektiv brug af SURVEYOR Scan kits til DHPLC afhænger af korrekt fuldførelse af en række trin. Et af det mest kritiske er PCR-amplifikation, der skal resultere i produktionen af specifikke DNA'er af ensartet størrelse i tilstrækkelig kvantitet til at blive detekteret efter hybridisering og kløvning. Dette er igen afhængig af kvaliteten af den oprindelige prøve. Udførelse af analysen med DNA, der ikke opfylder kvalitets- og kvantitetskriterierne, anbefales ikke. Bemærk: Hvis det er første gang, du bruger SURVEYOR Nuclease, skal du udføre de eksperimenter, der er beskrevet i afsnittet Sådan anvendes Kontrol Plasmid DNAer, efter du har læst og forstået afsnittet Trin-for-trin vejledning. Sørg for at have resultaterne fra Kontrol Plasmid DNA'erne ved hånden, før du kontakter Transgenomic Technical Support. Denne Problemløsningsguide dækker en række spørgsmål, som du kan komme ud for ved brug af SURVEYOR Scan kits for DHPLC og forslag til, hvordan de kan løses. Konsultér DHPLC systemets instrumentmanual for detaljeret information om instrumentets drift og vedligehold. Manualen indeholder specifikke procedurer for tjek og opretholdelse af kolonneydelse og inkluderer problemløsningsinformation. Problem 1 Lavt PCR udbytte eller intet PCR produkt ved analyse på agarosegel LAVT PCR UDBYTTE Godt PCR udbytte Ringe PCR udbytte MULIG ÅRSAG Ringe kvalitet af DNA template For meget RNA i prøven vil overestimere DNAkoncentrationen Termocykler ikke kalibreret Ikke nok template LØSNING Gentag rensning af DNA; evaluér den anvendte rensningsmetode. Hvis FFPEekstraheret DNA er for fragmenteret, kan andre FFPE-blokke være påkrævet. Gentag RNase-behandling af DNA-prøven og gentag rensning af DNA. Udfør kalibrering af termocykler. Forøg mængden af template. RNA bånd Bemærk: Højkvalitets DNA fra FFPE skal anvendes. DNAet skal have en koncentration på 25 ng/µl, som bestemt ved absorbans ved 260 nm, have et absorbansforhold 260/280 nm på over 1,8 og være større end 90% DNA (dvs. fri for de fleste trna- og rrna-kontamineringer som bedømt ved udseende på en agarosegel). DNA prøver skal opbevares ved mellem -20 C og -80 C. Analyse af DNA-template ekstraheret fra paraffinindlejret væv kræver, at der træffes adskillige forholdsregler. Det ekstraherede DNA kan behandles med uracil DNA glycosylase for at forhindre amplifikation af DNA fragmenter, der indeholder deamineret C-rester. Ofte vil en høj procentdel af det A 260 adsorberende materiale, der ekstraheres fra paraffinindlejret væv, ikke blive amplificeret særlig godt under PCR. Brug af en større mængde starting DNA vil ofte hjælpe til at producere et passende amplifikationsprodukt. En anden overvejelse ville være at vælge FFPE-tumorsektioner med en høj procentdel af tumorceller. Mikrodissektion kan også anvendes, men dette er en tidskrævende mulighed og ville ikke blive anbefalet til generel laboratorietestning. Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC Side 26