Opsætning af metode til påvisning af mutation W515L/K i MPL genet ved kroniske myeloproliferative sygdomme.

Størrelse: px
Starte visningen fra side:

Download "Opsætning af metode til påvisning af mutation W515L/K i MPL genet ved kroniske myeloproliferative sygdomme."

Transkript

1 Modul 14. Studienr.: Hold: SB509. University College Lillebælt. Antal anslag: Opsætning af metode til påvisning af mutation W515L/K i MPL genet ved kroniske myeloproliferative sygdomme. Method for detection of W515L/K mutation in chronic myeloproliferative disorders. Vejledere: Bioanalytiker og klinisk underviser/vejleder Kirsten Hartmann, Afdeling for klinisk patologi, Odense Universitetshospital. Adjunkt/molekylær- og cellebiolog samt teoretisk underviser/vejleder Tone Bonde- Poulsen, University College Lillebælt. Professionsbachelorprojekt

2 Resume: Baggrund: I dag tilbydes en mutationsanalyse for patienter med kronisk myeloproliferative sygdomme (KMPS), med henblik på at undersøge for mutation JAK2V617F i Janus Kinase 2 (JAK2) genet. Der er dog en mindre gruppe af disse patienter der har andre mutationer end JAK2V617F mutationen, herunder mutation W515K og W515L som sker i Myeloproliferative leukemia virus onkogene (MPL genet). I dag tilbydes der ikke en analyse til detektion af mutationer i MPL genet, da der ikke findes en sådan mutationsanalyse, og det er et vigtigt redskab for diagnosticering og monitorering. Formål: At opsætte en metode til detektering af mutation W515K og W515L vha. Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR). Derudover at sammenligne sensitiviteten af Pyro sekventering og Sanger sekventering med en 2- folds fortyndingsrække. Materialer og metoder: For at søge efter MPL mutationerne i KMPS-positive patienter, bruges Pyro sekventering. I udvælgelsen af assay til ny metode og til endelig opsætning, bruges Real Time PCR. Resultater: Vi fandt at Pyro sekventering er mere følsom end Sanger sekventering. Ved Pyro sekventering fandt vi en enkelt mutation W515K-positiv patient. Vi testede 11 forskellige assay til opsætning af metode til Real Time PCR og fandt af assay W515K_mut_F2 og W515_mut_F1 var de mest følsomme, til detektion af mutation W515K og W515L. Konklusion: Det har været muligt for os at opsætte en ny metode til detektering af mutationerne W515K og W515L i MPL genet ved Real Time PCR. 1

3 Forord: Jeg, Lene Sørensen bioanalytiker studerende på modul 14, har udarbejdet dette projekt med tanke på, at mine medstuderende vil kunne få glæde af det. Det praktiske arbejde er foregået på Afdeling for Klinisk patologi(akp), Odense Universitetshospital (OUH). I den forbindelse vil jeg gerne benytte lejligheden til at sige tak til: Molekylærbiolog Thomas Kristensen for støtte og vejledning, og for at give mig forståelse for projektet. Bioanalytiker Alice Jensen, for en utrolig stor støtte og hjælp i udførelsen af det praktiske arbejde. Medarbejderne på AKP, for at tage godt imod os og altid være klar med en hjælpende hånd. Bioanalytikerunderviser Kirsten Hartmann og Adjunkt/molekylær- og cellebiolog Tone Bonde Poulsen, for støtte og vejledning gennem hele projektperioden. Sidst men ikke mindst, tak til min medstuderende og projekt partner Jill Møller Hørdum, for fantastisk støtte og sparring gennem hele forløbet. 2

4 Indhold: Resume:... 1 Forord:... 2 Introduktion Problembaggrund:... 5 Indledning:... 5 Janus Kinase 2 genet:... 6 Myeloproliferative leukemia virus onkogene:... 7 Mutationsanalyse:... 9 Behandling:... 9 Afgrænsning: Problemformulering: Metodiske overvejelser: Materialer og metoder Forberedelse inden analyserne: Metodisk gennemgang: Nanodrop: PCR: Sangersekventering: Pyrosekventering Realtime PCR: Litteratur søgning: Søgeord: Resultater: PyroMark søgning efter mutation Fortyndingsrække Sanger sekventering

5 Fortyndingsrække Pyro sekventering Fortyndingsrække Real Time PCR: Endelige kørsler Real Time PCR: Del-resultater assay udvælgelse Diskussion: Resultater: Materialer og metoder: Konklusion: Perspektivering: Litteraturliste: Bilag: Bilag 1: Bilag 2: Bilag 3: Bilag 4:

6 Introduktion. Problembaggrund: Patienter med en kronisk myeloproliferativ sygdom (KMPS), tilbydes i dag en mutationsanalyse for mutation JAK2V617F i Janus Kinase 2 (JAK2) genet. Ved diagnostik af patienter med mutation i JAK2 genet, anvendes der i dag på Afdeling for Klinisk Patologi (AKP) Odense Universitetshospital (OUH) Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR) til påvisning mutationen. Patienter med mutation W515K og W515L i Myeloproliferative leukemia virus onkogene (MPL genet), tilbydes derimod ikke en mutationsanalyse, da der i dag ikke findes en analyse der kan detektere disse mutationer. Det vil derfor være gavnligt for AKP og i særdeleshed patienter med en MPL mutation, med henblik på at kunne følge behandlingen, at få indført en sådan mutationsanalyse. Yderligere vil den færdige mutationsanalyse kunne udbydes til eksterne rekvirenter hvilket er en økonomisk fordel for AKP. Påvisning af mutation i MPL genet vil desuden, som tidligere nævnt, være nyttigt til monitorering. Indledning: Myeloproliferative sygdomme (KMPS) er en fælles betegnelse for flere forskellige sygdomme, herunder polycythæmia (PV), essentiel trombocytose (ET) og primær myelofibrose (PMF). Sygdommene betegnes ofte under samme navn, da de har mange kliniske fællestræk. Her kan bl.a. næves hyppig forekomst af tromboser (blodpropper) i særlig grad i hjerte, hjerne og ben, grundet forhøjet hæmatokrit. Dette kan medføre lammelser og talebesvær. Derudover kan der forekomme blødninger (hæmorragier) i fx hud og slimhinder, grundet ændringen i trombocytter. I senstadiet udvikles KMPS ofte til akut leukæmi. Individuelle symptomer kan være: PV: Hovedpine, koncentrationsbesvær, hjertesymptomer, hudkløe pga. histamin i huden. Symptomerne skyldes bl.a. forhøjet hæmatokrit, der får blodet til at løbe langsommere. PMF: Træthed og vejrtrækningsbesvær ved små anstrengelser pga. anæmi, infektioner, blødninger, trykken i maven pga. forstørret milt, vægttab pga. øget celleomsætning, nattesved. 5

7 ET: Øget tendens til tromboser i ben, lunger, hjerte og hjerne(2). Ved alle tre sygdomme sker en unormal og accelereret dannelse af hhv. erytrocytter, leukocytter og trombocytter. Dette skyldes ofte mutationen JAK2V617V i JAK2 genet (3). Forløbet af sygdommene kan inddeles i flere faser: En kronisk stabil fase, accelererende fase og akut leukæmi. Den kronisk stabile fase har som regel mange års varighed. Den accelererende fase varer ofte få år. Patienter i denne fase har tendens til faldende blodprocent, stigende antal leukocytter, og måske aftagende trombocyttal, som led i en tiltagende vækst af milten. I den accelererende sygdomsfase vil der ofte være behov for blodtransfusioner. Fra denne fase vil nogle patienter, især patienter med PMF (ca. 20 %), udvikle akut leukæmi. Udviklingen fra den kroniske fase til akut leukæmi, er langt sjældnere for patienter med PV og ET. Dette kan måske skyldes at disse to sygdomme optræder i den ældre aldersgruppe, hvor andre sygdomme kommer ind over, og afslutter livsforløbet inden sygdommene udvikler sig til akut leukæmi(3). Janus Kinase 2 genet: Patienter med KMPS har i en årrække fået tilbudt en mutationsanalyse for mutation JAK2V617F i JAK2 genet, som et led i at kunne stille den rigtige diagnose. JAK2 genet er lokaliseret på kromosom 9p24 og indeholder 25 exons. JAK2 er en ud af fire nonreceptor protein tyrosin kinase i Janus familien, der består af JAK1, JAK2, JAK3 og TYK2. JAK2V617F mutationen er en hyppig mutation i forbindelse med KMPS, og ses i 95% af patienterne med PV, 55% af patienterne med ET og ved 65% af patienterne med PMF. JAK2V617F mutationen er en somatisk punkt mutation som sker på plads 1849, hvor G bliver skiftet ud med T på exon 14. Dette resulterer i en udskiftning af valin til phenylalanine i codon 617. Når sådan en mutation sker, bliver det til en såkaldt Gain of function mutation, hvor genets funktion i kroppen bliver ukontrolleret og konstant aktiveret. Dette sker gennem den såkaldte JAK/STAT 6

8 (signal transducers and activators of transcription) kaskade, hvor JAK/STAT bliver konstant aktiveret. JAK/STAT har bl.a. indflydelse på celle proliferationen. JAK2V617F positive ET og PMF patienter, er blevet kædet sammen med bl.a. en ældre alder på diagnosetidspunktet, højere hæmoglobin (Hb) niveau, højere leukocyt tal og lavt trombocyt tal (ved ET). Endvidere er et højt antal muterede alleler blevet kædet sammen med bl.a. kløe, højere Hb, højere leukocyt tal og en forstørret milt. Det ser dog ud til at et stort antal JAK2V617F muterede alleler, ikke har nogen sammenhæng på overlevelsesraten eller udviklingen til leukæmi. Tværtimod har man mistanke til at et lavt antal muterede alleler har sammenhæng med en ringere overlevelse i tilfælde med PMF(1). Myeloproliferative leukemia virus onkogene: Det er dog efterhånden blevet kendt at andre mutationer end mutation JAK2V617F, kan have forbindelse til sygdommene KMPS. Artikel (1) beskriver, at en mindre gruppe patienter har en mutation i MPL genet. Denne mutation finder ofte sted, i stedet for mutationen i JAK2 genet, men flere forskellige mutationer kan også optræde i samme patient. MPL genet er lokaliseret på kromosom 1p34. Det indeholder 12 exons og koder for trombopoietin recepterprotein. Dette protein fremmer proliferationen af megakaryocytter, der producerer trombocytter. Der kan være flere forskellige mutationer i MPL genet. De to hyppigste er W515L og W515K. MPL mutation W515L er en punktmutation hvor G udskiftes med T. MPL mutationen W515K, er ligeledes en punktmutation, hvor TG bliver skiftet ud med AA. Begge mutationer bliver, ligesom JAK2 mutationen, en Gain-of-function mutation(1). 7

9 En wildtype MPL exon 10 gensekvens vil se således ud(4): CCTGGATCTCCTTGGTGACCGCTCTGCATCTAGTGCTGGGCCTCAGCGCCGTCCT GGGCCTGCTGCTGCTGAGGTGGCAGTTTCCTGCAACTACAGGTACCGCCCCCGCC AGGCAGGAGACTGGCGGTGGACCAGGTGGAGCCGAAGGCCTGTAAACAGGCATT CTTGGTTCGCTCTGTGACCCCAGATCTCCGTCCACCGCCCGTGCGCACCTACGGC TTCGCCACTTCCTGCACGTCACCTCTGGGACTCGCCGCGGCTCCTTACACTCTAA Området markeret med gult, er der mutationerne vil ske: TGG TTG = W515L TGG AAG = W515K En mutation i MPL genet vil medføre, at aminosyren tryptophan udskiftes i trombopoietin receptorproteinet, med en anden aminosyre. Ved mutation W515L udskiftes tryptophan til leucine. Ved mutation W515K udskiftes tryptophan til lysine. Begge mutationer sker på plads 515 (5). I forbindelse med PMF og ET, vil en MPL mutationen medfører et konstant aktiveret trombopoitein receptorprotein, der vil resultere i en konstant aktiveret JAK/STAT signalering.. Dette vil bl.a. resultere i en overproduktion af abnorme megakaryocytter (6). Den hyppigste MPL mutation er W515L, som ses på exon 10 ved nukleotid Blandt andre mutationer på MPL, exon 10, ses også den før omtalte men mindre kendte punktmutation W515K. Nogle patienter med ET eller PMF, udviser dog flere forskellige MPL mutationer (1). W515L mutationen ses i cirka 9% af patienter med PMF og i 5% hos patienter med ET. Mutation W515K forekommer i cirka 5% af tilfældene hos patienter med PMF og i 1% hos patienter med ET(7). ET-patienter med en MPL mutation er blevet kædet sammen med en højere alder på diagnose tidspunktet, lavt Hb, højere trombocyt tal, mikro-vaskulære symptomer og en højere risiko for trombose. En MPL mutation i forbindelse med PMF er blevet kædet sammen med det kvindelige køn, højere alder, lavere Hb og en højere sandsynlighed for at blive afhængig af transfusion(1). 8

10 Noget tyder på at sygdommene opstår i en yngre alder, hvis man har både JAK2 mutationen og MPL mutationen, end hvis man kun har den ene af mutationerne(8). Mutationsanalyse: Ved hjælp af en mutationsanalyse, i dette tilfælde Real Time PCR, er det muligt at finde en evt. mutation ud fra en blodprøve. Real Time PCR er en utrolig følsom metode, hvilket betyder at selv små mængder mutation vil kunne blive detekteret. Da man kender baserækkefølgen, både på wildtype allel og muterede alleler, er det muligt at designe primere og probe, som bruges til Real Time PCR. Forward primer bliver designet så den kun kan hybridisere, hvis der er sket en mutation. Man vil altså med Real Time PCR kun få et signal hvis der er en mutation tilstede, samtidig med at man kan vurdere hvor mange muterede celler der er til stede, i hver enkelt patient. Det er vigtigt for patienten at kunne detektere en mulig mutation, både som en hjælp til at stille den rigtige diagnose, men i særlig grad for at kunne følge et behandlingsforløb. Man vil kunne afgøre om behandlingen har indvirkning på antallet af muterede alleler. Behandling: Ved detektion af mutation W515K/L vil det være muligt, som nævnt ovenfor, at følge patientens udvikling og respons på behandlingen. Sygdommene behandles en smule forskelligt, men målet er det samme: At nedsætte den øgede cellevækst og de forhøjede antal celler i blodet. Behandling med interferon-alpha2 (IFN-alpha2) er ofte det foretrukne valg i alle 3 sygdomstilfælde. IFN-alpha2 hæmmer virus replikation og cellevækst, samt stimulerer monocytter og makrofager. Patienter med diagnosen PV vil derudover typisk få tappet blod med jævne mellem, for at sænke den forhøjede hæmatokrit. Ofte vil patienterne endvidere blive behandlet med acetylsalicylsyre, for at nedsætte risikoen for tromboser. Det har vist sig at behandlingen med IFN-alpha2 i tilfælde med PV, kan nedsætte mængden af JAK2 V617F-mutationen i blodet og normalisere knoglemarven hos nogle patienter. Hos disse patienter vil man endda kunne stoppe behandlingen, og alligevel beholde en meget lav mængde JAK2 V617F mutation. 9

11 Ved ET behandles der alternativt med Anagrelid, der hæmmer trombopoietinreceptoren. Det vil medføre en nedsat proliferation og modning af megakaryocytter, således bliver megakaryocytterne både reduceret i størrelse og antal. Ved PMF behandles der med testosteron eller Prednisolon, der begge vil få blodprocenten til at stige. Alternativt kan der behandles med ugentlige indsprøjtninger af erytropoietin, der stimulere knoglemarven til en øget produktion af erytrocytter(9). Behandling med JAK2- hæmmere, som fx pacritinib der tages oralt, har vist sig at være effektiv i behandlingen ved JAK2-positive patienter, hvad enten det gælder PV, ET eller PMF. Det reducere JAK/STAT signalet og dermed den følgende kaskade, det har indflydelse på størrelsen af milten og endda også på antallet af muterede alleler(10). For patienter med PMF kan det være nyttigt at bruge New Prognostic Scoring System (NPSS), der kan være med til at give et statistisk bud på prognosen for den enkelte patient(11). Antal dårlige prognostiske Risiko gruppe Median overlevelse i mdr. Faktorer (se nedenfor) 0 Low risk Intermediate Intermediate 2 48 >3 High risk 27 Dårlige prognostiske faktorer: Alder > 65 år Tilstedeværelse af almensymptomer Hæmoglobin < 6,5 mmol/l Leukocytter > 25 mia/l Cirkulerende blaster > 1% 10

12 Afgrænsning: Der er mange forskellige gener hvor der kan være sket en mutation, i forbindelse med kronisk myeloproliferative sygdomme. Her kan udover JAK2 og MPL bl.a. nævnes TET oncogene family member 2 (TET2 ), Additional Sex Combs-Like 1 (ASXL1), Casitas B-lineage lymphoma protooncogene (CBL), Isocitrate dehydrogenase (IDH) og IKAROS family zinc finger 1 (IKZF1)(1). Endvidere er der forskellige mutationer i det samme gen. I MPL genet kan der, udover W515K og W515L, nævnes mutation W515A og S505N. Fokus vil dog ligge på mutation JAK2V617F i JAK2 genet og mutation W515K samt W515L i MPL genet, da det er langt de hyppigste mutationer hos patienter med PV, ET og PMF. Der findes forskellige analyser til detektering af disse mutationer, bl.a. Sanger sekventering og Pyro sekventering. Vi har dog valgt Real Time PCR, da den er hurtig at udføre, der kan sættes mange prøver op samtidig og klinikken bruger i forvejen Real Time PCR til detektering af JAK2V617F. Primært vil fokus ligge på det kliniske arbejde, herunder molekylærbiologiske teknikker. De tre forskellige sygdomme vil kort beskrives og adskilles, ligesom mulig behandlingsforløb vil blive berørt. Problemformulering: Hvilken sekventeringsmetode kan med størst fordel anvendes i forbindelse med detektion af mutationerne W515(L+K) i MPL genet, med henblik på opsætning af Real-time PCR med mutations-positive prøver. Metodiske overvejelser: Vi vil udføre Pyro sekventering af MPL exon 10, på 39 JAK2-negative patienter, med diagnoserne PMF og ET. Alt efter resultatet af Pyro sekventeringen, om der bliver fundet mutation eller ej, vil vi muligvis også udføre Pyro sekventering på de 38 JAK2-positive patienter jf. bilag 1. Ved hjælp af prøver fra allerede KMPS diagnosticerede patienter fra en biobank, vil vi prøve at detektere en W515K og en W515L mutation. Når en sådan mutation er fundet, vil vi afprøve forskellige assays til Real Time PCR, og til sidst udvælge det bedste assay til hhv. W515L og 11

13 W515K mutationen, med henblik på at kunne implementere en MPL mutationsanalyse på AKP OUH i fremtiden. Derudover vil vi sammenligne Pyro sekventering og Sanger sekventering med en funden mutation i en fortyndingsrække, og ud fra toppene vurdere hvornår signalet forsvinder, ved de to analyser. Finder vi ikke de omtalte mutationer, vil vi teste plasmider svarende til mutation W515K og W515L, og bruge dem som substitut for MPL-positive patientprøver, i det videre forløb med opsætning af Real Time. 12

14 Materialer og metoder. Forberedelse inden analyserne: I forsøgene med Sanger- og Pyro sekventering samt Real time PCR, er vores start-materiale oprenset DNA. Ved Pyro sekventeringen er det patienter diagnosticeret med en kronisk myeloproliferativ sygdom (enten PMF eller ET), som forinden er undersøgt for mutationen JAK2V617F vha. kvantitativ Real Time PCR med specifikke primere og probe. Processen fra fuldblod til oprenset DNA, der blev udført af bioanalytiker Alice Jensen, begynder med, at leukocytterne separeres fra fuldblodet vha. lyseringsbuffer indeholdende ammoniumchlorid samt Proteinase K, som medfører, at cellerne lyserer pga. osmotisk tryk,(3,6) og nucleinsyrerne frigives. Magnetic Glass Particles (MGPs) tilsættes, hvor nucleinsyrerne binder sig til pga. det kaotrofiske salt forhold, isopropanol og lyseringsbufferen. MGPs med tilbundne nucleinsyrer separeres magnetisk fra resten af prøven og vaskes herefter med vaskebuffer adskillelige gange for at fjerne ubundne, uønskede komponenter, som fx cellemembraner. Nucleinsyrerne elueres til slut fra MGPs ved 70 C (12). Både Sanger sekventering, Pyro sekventering og Real Time PCR starter med processen PCR. Ved Real Time PCR er, som navnet antyder, PCR inkorporeret i analysen. Ved Sanger- og Pyro sekventering, skal PCR køres inden selve analysen udføres, for at opformere prøve DNAet, så der er nok materiale at udføre analysen på. Metodisk gennemgang: Første trin i processen på at opsætte en metode til detektion af mutation W515K og W515L, var at analysere alle 39 JAK2-negative patienter, med ET eller PV vha. Pyro sekventering. I denne første kørsel fandt vi en enkelt W515K mutation, og besluttede at analysere alle de 38 JAK2-positive patienter også, desværre uden resultat. PyreMark var sat op med et assay til detektion af mutation W515L, da det er den hyppigste MPL mutation, hvilket resulterede i en fejlmelding af kørslen ved den W515K-positive patient, jf. figur 1 i resultatafsnit. For at være sikre på om der nu også var en mutation, kørte vi prøven med den W515K-positive patient igen, med samme resultat - der var en W515K mutation. 13

15 Da vi nu havde en W515K mutation, var vi klar til at teste forskellige primer/probe mix (assay) til Real Time PCR. Der var bestilt 11 forskellige assays hjem, hvor molekylærbiolog Thomas Kristensen i samarbejde med bioanalytiker Alice Jensen, på forhånd havde udvalgt 4 forskellige assays, som vi skulle arbejde videre med, 2 til W515K og 2 til W515L. Som en backup var der også blevet bestilt nogle plasmider hjem, hvis det skulle ske vi ikke fandt en eneste mutation i de KMPS-positive patientprøver vi havde til rådighed. Plasmiderne skulle fungere som alternativ til humant DNA, indeholdende mutation W515K og W515L. Disse plasmider skulle testes på Real Time PCR, med de forskellige assays. Koncentrationen af plasmiderne blev målt på Nanodrop (se Nanodrop samt bilag 4), og da plasmiderne havde en høj koncentration i forhold til en prøve med humant DNA, blev det fortyndet i H2O 100 gange. På den baggrund blev der sat et assay op for plasmid W515K med assay W515K_mut_F1 og W515K_mut_F2 (jf. figur 10), og for plasmid W515L med assay W515L_mut_F1 og W515L_mut_F2 (jf. figur 9). Ud fra disse kørsler kan man se, at plasmiderne registreres som forventet og der bliver fundet mutation. Samtidig kan man udvælge det bedste assay til de to mutationer, ved at se hvilken kurve der først kommer op over treshold, svarende til det assay der er mest følsomt jf. figur 10 og 11. Næste trin var nu at afprøve de udvalgte assaya fra plasmid kørslerne, på den W515K-positive patient ved Real Time PCR. Resultatet stemte overens med kørslen på plasmiderne, der blev fundet mutation, og det mest følsomme assay ved plasmiderne, viste sig også at være det mest følsomme ved den W515K-positive patient. Et assay til hver mutation kunne altså nu udvælges. Sidste trin inden den endelige Real Time PCR opsætning, var at der skulle testes for krydsreaktioner med de udvalgte assays jf. figur 6 og 7. Tilfældige donere, altså oprenset DNA fra raske personer uden KMPS, blev sat op i triplikater, med hhv. assay W515_wt_F, W515L_mut_F1 og W515_mut_F2. Der blev kørt to plader og begge kørsler viste, at der ikke var nogen krydsreaktioner jf. figur 7 og 8. Det vil betyde at enhver kurve der kommer frem i en rigtig patientkørsel, udover den positive kontrol, vil være positiv for mutation W515L eller W515K, alt efter hvilket assay der registrere mutationen. Sidste trin i Real Time PCR opsætningen, var at lave en opsætning, som den vil blive kørt fremover med patientprøver. Udover den W515K-positive patient som selvfølgelig repræsenterede en positiv patient, udvalgte vi prøver der var kørt på PyrMark, som havde høje procentværdier jf. bilag 1. (Se Procentværdier under Pyro sekventering), for at udelukke mutation i disse prøver. 14

16 Sideløbende med ovenstående Real Time PCR opsætning, ville vi gerne lave en opsætning, der gjorde det muligt at sammenligne Sanger sekventering, Pyro sekventering og Real Time PCR, for at bekræfte vores opfattelse af, hvilken analyse der er mest følsom, så vi er sikre på at få fat i alle patienter med en mutation. Vi lavede en 2-folds fortyndingsrække med den W515K-positive patient fortyndet i en tilfældig donor uden KMPS. Forinden havde vi målt koncentrationen på både donor og den W515K-positive patient, og fortyndet donor til samme koncentration som den W515Kpositive patient, for at de skulle indeholde samme mængde DNA. Fortyndingsrækken blev kørt både vha. Pyro sekventering og Sanger sekventering jf. figur 3 og 4. Nanodrop: Vi brugte NanoDrop til at måle koncentrationen i hhv. den W515K-positive patient, donor materiale og plasmiderne, for at opnå samme koncentration til opsætning af Real Time PCR samt fortyndingsrække. NanoDrop er et Spektrofotometer der hurtigt og nemt kan måle koncentrationen i mængder på 0,5-2 μl dråber med fx DNA. Den bruger overfladespændingen der skabes af dråben, og der er altså ikke brug for kuvetter eller kapillærer, da dråben former sig som en flydende kolonne/kuvette(13). For udførelse af Nanodrop, henvises til bilag 4. PCR: Med denne metode er det muligt at opformere DNA strenge til mange millioner kopier på blot et par timer. Teknikken efterligner det der normalt foregår inde i cellen, når DNA replikeres. I cellen vil det dog tage flere dage. Det dobbeltstrengede DNA skal først laves til to enkeltstrengede (denaturering). Dette gøres ved at varme materialet op til 94 i 30 sekunder. Næste trin i processen er annealing. Her vil to primere (oligonukleotider) binde sig til hver deres komplementere område på template, på hver sin side af target-dna. Denne proces vil foregå ved en temperatur på 60 i 45 sekunder. Sidste trin i PCR er forlængelse af primere. Polymerasen syntisere template-dna ved at tilføje nukleotider i forlængelse af primerne. Dette sker ved en temperatur på 72 i 60 sekunder. Temperaturen på 72 holdes kontant i 10 minutter, hvorefter der vil ske en afkøling. 15

17 Efter en enkelt omgang, er én dobbeltstrenget DNA blevet lavet til 2 dobbeltstrenget DNA. Processen vil køre 35 cyklus, så man ender op med flere tusinde DNA kopier. I en PCR reaktion indgår dermed: DNA template, primere, nukleotider, polymerase og buffer. Derudover en positiv og en negativ kontrol. Primer: Er det kritiske punkt i en PCR reaktion, da de er designet til at binde et helt bestemt sted på DNA template, og skal binde for at syntiseringen kan finde sted. For at designe en primer, skal man kende den præcise base rækkefølge på det DNA man vil analysere. Når rækkefølgen er kendt, kan der designes en komplimenter sekvens til et lille stykke af denne, typisk med en længde på baser. Der skal både bruges en forward og en revers primer. De skal binde på den syntiserede strengs 5 ende, altså på templates 3 ende, på hver deres enkeltstrenget DNA. Det er vigtigt at forward og revers primer bliver designet så de binder optimalt ved den samme temperatur. Dette kan ændres ved at gøre længden af primerne kortere eller længere, eller alternativt placere primerne så den binder til et sted med færre G og C baser på template(14). Nukleotider: Et mix af de fire deoxynukleotidtriphosfat (dntps), adenin, guanin, thymin og cytosin. Polymerase: Et termostabilt enzym, isoleret fra bakterien Thermus aquaticus. Syntiserer altid fra 5 mod 3. Positiv kontrol: Sikrer at enzymet er aktivt, bufferen er optimal, primerne binder de korrekte steder og at det hele kører som det skal. Negativ kontrol: Sikrer at reaktions mixet ikke er kontamineret. Sangersekventering: Sanger sekventering er en metode til at kortlægge baserækkefølgen af en given DNA sekvens. For at køre en sanger sekventering kræver det: template DNA, primer, DNA polymerase og de fire deoxynukleotidtriphosfater: dttp, datp, dctp og dgtp (dntp er). Derudover skal de fire dntp er også anvendes i en dideoxyudgave: ddttp, ddatp, ddctp og ddgtp (ddntp er). Reaktions mixet der skal anvendes, består af: template, primer, sekventeringsbuffer, DNA polymerase, dntp er og de 4 ddntp er. Primer vil binde til template og polymerasen vil forlænge primer med de fire dntp er. DNA syntesen vil stoppe når der inkorporeres et ddntp, idet 16

18 ddntp erne mangler en OH gruppe, hvorfor der ikke kan dannes en fosfordiesterbinding mellem den voksende DNA streng og nucleotiden. Vha. kapillær gelelektroforese, hvor DNA fragmenterne adskilles i et kapillærrør og detekteres vha. de fluorescerende farver der er tilsat. Resultatet kommer ud i et elektropherogram og baserækkefølgen kan nu aflæses(15). Resultaterne vurderes ud fra hvor tydeligt det er at adskille og bestemme hvilken top der repræsentere hvilken nukleotid. Derudover vil man tage hensyn til evt. baggrundstøj. Mutationen vil vise sig som to små ekstra grønne toppe, i det codon vi er interesseret i. Sanger sekventering er en analyse der strækker sig over flere dage og kan deles op i følgende trin: Kvalitativ PCR: Se beskrivelsen i PCR afsnit ovenfor. Mastermix indeholder (volumen angivet pr. brønd i µl): Sigma H2O 14 10xPCRbuffer med MgCl2 2,5 10 mm dntp 0,5 HotStarTaq (polymerase) 0,5 Primer: F3/R3 2,5 DNA 5 Brugte primere til Sanger sekventering i koncentration 3µM: MPL_Sanger_F3: 5' AGT AGG GGC TGG CTG GAT 3' MPL_Sanger_R3: 5' GGT TTA GGA GGT GGG ACC TG 3' Gelstøbning: For at visualisere PCR produkterne fremstilles geler til gelektroforese. Gelen fremstilles hovedsagligt af UltraPure Agarose, TBE buffer og ethidiumbromid. Der anbringes kamme i gelen, inden den stivner, hvilket resulterer i dannede brønde, når gelen er størknet og kammen tages op. Ethidiumbromid er et fluorescerende farvestof, som binder specifikt til DNA (14). Gelelektroforese: Ved gelelektroforese sættes PCR produktet på gelen sammen med en markør og der tilføres strøm. Idet DNA er negativt ladet, vil det vandre mod den positive pol. Jo større DNA fragmenterne er, jo langsommere vandrer de. Dvs. små fragmenter er 17

19 længst væk fra brøndene og store fragmenter tættest på brøndene (14). Efter endt kørsel flyttes gelen til UV-bord så båndende kan visualiseres. Fældning af PCR produkt: Det ønskede bånd udskæres fra gelen og oprenses vha. Spin-xkolonne. Båndet fældes med Na-acetat/96% ethanol og vaskes i 77% ethanol. Pellet reopløses efter centrifugering i Te buffer. Sekvens PCR: Ved sekvens PCR fremstilles sekvensprodukter vha. cycle sequencing med specifikke primere, ud fra de fældede PCR produkter. Sekvenspladen sættes i PCR apparat og programmet Sekventering vælges. Mix indeholder (volumen angivet pr. brønd i µl): H2O 7 5x buffer 4 Terminater RR mix 2 Primer 2 PCR produkt 5 Brugte Sekvens primere til Sanger sekventering i koncentration 1.6µM: MPL_Sanger_F3: 5' AGT AGG GGC TGG CTG GAT 3' MPL_Sanger_R3: 5' GGT TTA GGA GGT GGG ACC TG 3' Fældning af sekvens plade: Dette udføres for at fælde produktet og for at re-suspendere produktet i formamid. Kørsel på 3130XL: Programmet Run 3130xl Data Collection v 3.0 anvendes (15). Analysering efter endt kørsel: Programmet Sequencing Analysis anvendes. Vi brugte Sanger sekventering til at køre en fortyndingsrække med den W515K-positive patient, for at kunne sammenligne Sanger sekventering med Pyro sekventering. Materialer til Sanger sekventering: Gelstøbning: 18

20 Reagenser: UltraPure Agarose fra Invitrogen TBE buffer 0.5x Ionbyttet vand Ethidiumbromid 10 mg/ml Apparatur: Slæder og kamme til indstøning Vægt, bade til afmåling af agarose og til Kolbe inkl. opløsning Mikrobølgeovn Fældning af PCR produkt: Reagenser: 3M Sodium-Acetate Buffer Solution (Na-acatate) 96% V/V ethanol 77% V/V ethanol Te buffer 1x Water Molecular biology reagent Apparatur: Centrifuge: Mikro 22R Hettich Fældning af sekvens plade: Reagenser: 77% V/V ethanol 96% V/V ethanol Hi-Di Formamide 19

21 Water Molecular biology reagent Aparatur: Centrifuge: Eppendorf 5804 Sekventering: Reagenser: BigDye Terminater v1.1 Cy le Sequencing Kit Primere Water Molecular biology reagent 3130 POP-7T Performance Optimizid Polymer Qty Buffer (10x) With EDTA Hi-DiT Formamide BigDye Terminater v.1.1 Sequencing Standard Kit Utensilier: Eppendorf Safe-Lock Microtubes 1.5 ml. MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate MicroAmp Optical 8-Cap Diverse filtertips Aparatur: Centrifuge: Eppendorf 5415R Centrifuge: Eppendorf Mini Spin plus PCR app.: GeneAmp. PCR System XL: Applied Bio system 20

22 Pyrosekventering Ved Pyro sekventering bruges biotinyleret DNA, hvor vitaminet biotin bindes til DNAet for at kunne oprense dette vha. streptavidin- sepharose coatede kugler(15). Derefter sekventeres og kvantificeres det biotinylerede DNA. Pyro sekventeringsmix et består af enkeltstrenget template-dna, primer, sulfurylase, luciferase og to substrater: adenosine 5 phosphosulfate(aps) og luciferin. De fire forskellige nukleotider tilsættes reaktionen en ad gangen. Hvis den tilsatte nukleotide er komplementær til nukleotiden på template strengen, ved siden af 3 enden af primeren, forlænger polymerasen primeren. Når fosfordiesterbindingen opstår mellem den tilsatte nukleotid og primeren, udskilles pyrofosfat(ppi), som omdannes til ATP via sulfurylase og tilstedeværelsen af APS. Det dannede ATP anvendes til at udsende et lys-signal, ud fra en luciferase katalyseret omdannelse af luciferin til oxyluciferin. Denne proces gentages for hver af de fire nukleotider og på den måde fremkommer et diagram med toppe, hvor hver top tilhører en bestemt nukleotid og baserækkefølgen kan dermed bestemmes. Metoden er altså afhængig af det lys, som udsendes når nukleotiderne tilføjes til den voksende DNA streng. Der er på den måde ikke brug for geler, fluorescerende farve eller ddntp er(14). PCR opsætning: Vha. PyroMark PCR Kit(16) og specifikke primere, amplificeres target- DNA(14). Princippet er det samme som PCR ved Sanger sekventering, det er dog et andet PCR program og andre reagenser. Mix indeholder (volumen angivet pr. brønd i µl): PyroMark PCR mastermix, 2x 12,5 CoralLoad, koncentrat, 10x 2,5 Primer 2,5 H2O fra kit 2,5 DNA 5 Brugte primere til Pyro sekventering: MPL_Pyro_F1-biotin: 5' GGGCCGAAGTCTGACCCTTT 3' MPL_Pyro_R1: 5' TCACAGAGCGAACCAAGAATGC 3' 21

23 Immobilisering af PCR-produkt: PCR-produkterne immobiliseres på streptavidinsepharose coatede kugler. Immobiliserings mix indeholder (volumen opgivet til hver brønd i µl): Streptavidincoatede speharose-kugler 2 PyroMark binding buffer 40 Milli-Q vand ultrarent 28 PCR produkt 10 Sekvensopsætning: Sekvensprimerne fortyndes med PyroMark Annealing Buffer og afpipetteres til brønde på PyroMark Q24 Plate. Sekvens mix indeholder (volumen opgivet pr. brønd i µl): PyroMark Annealing buffer 24,2 Sekvensprimer 0,8 Brugt sekvens primer til Pyro sekventering: Sekv. MPL_Pyro_S1: AGTGTGCAGGAAACT Flytning af materiale til PyroMark Q24 Plate, annealing til sekvensprimer og kørsel på PyroMark Q24: Materialet vaskes adskillige gange for at fjerne uønskede komponenter og overføres til PyroMark Q24 Plate, som indeholder sekvensmix. Klargøring af PyroMark Gold Q24-reagenser: PyroMark Q24 Cartridgen klargøres med Milli-Q vand ultrarent. Nukleotiderne mixes og centrifugeres og enzym og substrat vendes let. PyroMark Q24 Gold reagenserne afpipetteres i PyroMark Q24 Cartridgen. PyroMark Q24 Plate placeres, ligesom PyroMark Q24 Cartridgen i PyroMark Q24 instrumentet og kørslen startes(15). Mængder til Cartridgen opgivet i µl: Enzym-mix 77 Substrat-mix 77 Nucleotide A 54 Nucleotide C 55 22

24 Nucleotide G 53 Nucleotide T 55 Opsættes i Cartridgen således: E A S T C G Analysering og kvalitetsvurdering af resultater: Hver analyseret prøve har en farvekode efter endt kørsel, blå (godkendt), gul (kontrollér) og rød (ikke-godkendt). Derudover er der opgivet en procentsats for det codon man ønsker at fokusere på, der fortæller noget om hvor klart hver nukleotid bliver regitreret, om der evt. er en smule mutation i prøven eller baggrundsstøj. Vi brugte Pyro sekventering til at lede efter mutation W515L/K i JAK2V517F negative og positive patienter. Derudover kørte vi samme fortyndingsrække som ved Sanger sekventering med den W515K-positive patient, for at kunne sammenligne de to metoder. Procentfordelingerne på toppene: Som tidligere nævnt, kommer resultatet af PyreMark ud med en procentfordeling, på de tre nukletotider i det markerede codon, TGG, jf. figur 1i resultat afsnit. Denne procentfordeling siger noget om hvor ren prøven er eller hvor mange alleler der er muteret. Procentsatsen skal dog forskydes relativt meget for at der kan skabes tvivl om et negativt resultat, da der også skal tages højde for usikkerhed i analysen. Materialer til Pyro sekventering: Reagenser: PyroMark PCR Kit (16) Streptavidin Sepharose HighPerformance Milli-Q Vand Ultrarent Ethanol 96%. Ph Eur,BP Utensilier: 23

25 Eppendorf Safe-Lock Microtubes 2 ml. PyroMark Q24 Cartridge PyroMark Q24 Vacuum Prep Troughs PyroMark Vacuum Prep Filter Probes PyroMark Q24 Plate PLATE 96W PCR NON-SKIRTED BLACK LETT 1 Millipore Millex-FG50 Filter Unit Apparatur: PyroMark Q24 MDx PyroMark Q24 MDx Vakuum-arbejdsstation PCR app.: GeneAmp. PCR System 9700 og 2720 Thermal Cycler Eppendorf Thermomixer Realtime PCR: Forskellen ved Realtime PCR og standard PCR, er at her mængdebestemmes target DNA. Metoden er altså kvantitativ. Til denne metode bruges der både en (evt. specifik) probe, (evt. specifikke) forward/revers primere, fluorescerende farve, nukleotider, taq-polymerase samt en positiv og en negativ kontrol. Probe designet er, lige som primer designet, vigtigt for en optimal Real Time PCR amplifikation. Det positive kontrol materiale vil i dette tilfælde være fundne positive W515L/K patienter. Proben vil binde sig til target sekvensen på template, og er mærket med to forskellige fluorescerende farvestoffer: reporter (R) i 5 enden og quencher (Q) i 3 enden. Så længe proben er intakt, ses ikke noget farvesignal. Primerne binder på hver sin side af target sekvensen, og proben binder mellem de to primer bindingssteder. Taq-polymerasen vil begynde at syntisere template og vil fjerne DNA som sidder i vejen for DNA syntesen, da den har exonuklease aktivitet. Dvs. når Taq-polymeresen møder proben under DNA syntesen, vil den klippe proben i sykker. Proben er dermed ikke længere intakt og der vil fremkomme et farvesignal(14). 24

26 Jo mere target DNA der oprindeligt er, jo mere farve vil der blive frigivet og desto hurtigere overstiger farvesignalet treshold jf. figur A. Treshold er den mængde baggrundsstøj som man har fastsat der kan være ved en Real Time PCR analyse. Maskinen tæller hvor mange PCR-cyclus der skal til, før at treshold nås og betegnelsen udtrykkes som Ct. Jo mere target DNA der oprindeligt er, jo hurtigere nås treshold og dermed et lavt Ct score. Omvendt giver en lav mængde DNA en høj Ct score. For at kvantificere DNA-indholdet bruges en standard kurve hvor Ct værdierne afbildes som funktion af DNA (antal kopier), figur A. Den kurve, som først når treshold indeholder mest target DNA. Bruges der et assay for fx mutation W515K, vil der komme en kurve hvis patienten er positiv. Man vil også kunne vurdere hvor mange muterede celler patienten har, ved at kigge på hvor langt ude af diagrammet kurven kommer op over treshold line(14). Figur A: Realtime PCR kurve(17). Viser threshold (den grønne linje) og Ct værdien (stiplede linje). Designet på de brugte primere samt probe, til detektion af MPL mutation ved Real Time PCR ser således ud: W515L_mut_F1: 5 CCTGCTGCTGCTGAGGCT 3 W515K_mut_F2: 5 CCTGCTGCTGCTGAGGAA 3 W515_wt_F: 5 GTCCTGGGCCTGCTGCT 3 W515_wt_R: 5 ACAGAGCGAACCAAGAATGC 3 25

27 W515_probe2: FAM- AGTTTCCTGCACACTACAGGTACCGC -TAMRA Materialer til Real Time PCR: Reagensmixet indeholder (volumen opgivet pr. brønd i µl): Water Molecular Biology Reagent 5 TaqMan 2xPCR Mastermix 12,5 Primer/Probe mix 2,5 DNA 5 Utensilier: Eppendorf Safe-Lock Microtubes. 1,5ml eller 2ml MicroAmp TM Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode MicroAmp TM Optical 8-Cap Sort Optical Cap lukker Apparatur: Centrifuge: Eppendorf Mini Spin plus Vortex mixer: MS2 Minishaker/MS3 basic Realtime: 7900HT Sequence Detection System Centrifuge: Eppendorf 5804 NB! For udførlig gennemgang af analyserne: Oprensning af DNA, Sanger sekventering (herunder Kvalitativ PCR, Gelstøbning, Fældning af PCR produkt, Sekventering, Fældning af sekvensplade), Pyro sekventering og Real Time PCR, henvises til diverse links i kilde afsnittet kilde (18) Litteratur søgning: Måden der er blevet søgt litteratur på, er gennem søgemaskinerne google.dk og pubmed.com. Ofte er google.dk blevet brugt forinden søgningen på pubmed.com, for at få inspiration til nye søgeord og indgangsvinkler på projektet. Jeg har erfaret at det var en del lettere at finde materiale 26

28 om JAK2 genet og den tilhørende mutation JAK2V517F, end det var tilfældet med mutation i MPL genet og tilhørende mutationer W515L og W515K. Udover artikel søgningen på google.dk og pubmed.com, har jeg brugt bøger fra tidligere moduler, forskrifter fra afdelingen samt brugt min erfaring og viden jeg har opnået gennem det praktiske arbejde i laboratoriet i samarbejde med molekylærbiolog Thomas Kristensen og bioanalytiker Alice Jensen. Endvidere har jeg støttet mig op ad forarbejdet som Jill Møller Hørdum og jeg, forinden havde udarbejdet i projektprotokollen. Søgeord: MPL JAK2 W515L W515L MPL W515 JAK2V617F Janus Kinase 2 Myeloproliferative leukemia virus onkogene Myeloproliferative sygdomme Myeloproliferative disease Myeloproliferative sygdomme behandling Myeloproliferative disease treatment JAK2 hæmmere JAK2 inhibitor MPL mutation JAK2 mutation Mutation W515 Mutation JAK2V617F 27

29 Resultater: PyroMark søgning efter mutation. På figur 1 og 2 ses billeder af de første kørsler på PyroMark, med JAK2 negative patienter. Figur 1 viser den fundne W515K mutation, da der er udslag i T, på 5. nuklotide plads. Figur 1: Detektering af mutation W515K. Øverst i billedet ses nummer på de enkelte prøver, samt om kørslen er godkendt. X-aksen = enzym, substrat samt de fire nukleotider. Y-aksen = værdier på hvor kraftigt signal der er registreret.den blå markering af C og A toppene, markere det codon vi er interesseret i ved mutation W515L. Figur 2: En normal PyreMark kørsel, uden detektion af mutation. Øverst i billedet ses nummer på de enkelte prøver, samt om kørslen er godkendt. X-aksen = enzym, substrat samt de fire nukleotider. Y- aksen = værdier på hvor kraftigt signal der er registreret.den blå markering af C og A toppene, markere der codon vi er interesseret i ved mutation W515L. 28

30 Fortyndingsrække Sanger sekventering. På figur 3 ses den W515K-positive patient i en 2-folds fortyndingsrække med donor. Det bedste resultat ses ved forward primeren, som vises herunder. Der vil allerede skabes tvivl om negativt eller positivt resultat ved 50% mutation. Den sorte markering indikere det codon vi er interesseret i. Figur 3: Hver top/farve repræsenterer en nukleotid. De to små grønne toppe, repræsenterer mutation W515K. 100% mutation. 50% mutation. 25% mutation. 12.5% mutation. 6.25% mutation. 3.1% mutation. 1.5% mutation. 0% mutation. 29

31 Fortyndingsrække Pyro sekventering. På figur 4 ses den W515K-positive patient i en 2-folds fortyndingsrække, svarende til fortyndingsrækken vist ved Sanger sekventering. Allerede ved 50% mutation vil der være tvivl om positivt eller negativt resultat. Figur 4: Fokus skal rettes mod T-toppen, der repræsentere mutation W515K. 100 % mutation 50 % mutation 25 % mutatiom 12.5 % mutation 6.25 % mutation 3.13 % mutation 30

32 1.5 % mutation 0 % mutation Fortyndingsrække Real Time PCR: På figur 5 ses en fortyndingsrække med plasmid W515L. På figur 6 ses fortyndingsrækken med plasmid W515K. Den er fortyndes i en 4-folds fortynding i triplikater, fortyndet ud til 1 million. Figur 5: Fortyndingsrække med plasmid W515L. X-aksen = antal PCR cyklus inden signalet overstiger treshold. Figur 6: Fortyndingsrække med plasmid W515K. X-aksen = antal PCR cyklus inden signalet overstiger treshold. 31

33 Endelige kørsler Real Time PCR: Nedenfor ses de 3 sidste og endelige kørsler på Real Time PCR. 2 plader er kørt med donor prøver, for at tjekke for krydsreaktioner. 1 plade er sat op til en rigtig patientundersøgelse, med udvalgte patienter inkl. den W515K-positive patient. Figur 7 viser resultatet for en donor kørsel med assay W515L. Figur 8 viser donor kørsel med assay W515K. Der ses ingen krydsreaktioner, da der ikke fremkommer kurver for donorerne. Kurverne der er fremkommet, viser triplikater for den positive kontrol. Figur 7: Donor plade for krydsreaktioner med assay for W515L. Figur 8: Donor plade for krydsreaktioner med assay for W515K. Figur 9 viser hvordan en endelig patientkørsel vil se ud. Indeholder positiv kontrol, negativ kontrol, donor kontrol og udvalgte patientprøver inkl. den W515K-positive patient. Der ses kurve for positiv kontrol samt den W515K-positive patient i assay W515K_mut_F2. Henviser til bilag 2 og 3 for billeder af denne kørsel, med assay W515_wt og W515L_mut_F1. Figur 9: En rigtig patientkørsel, der vil kunne detektere en mutation W515L eller W515K. Der ses signal for positiv kontrol samt den W515Kpositive patient. Endvidere ses en enkelt kontaminering længst ude på X- aksen. 32

34 Del-resultater assay udvælgelse. På figur 10 og 11 ses et led i assay udvælgelsen. På figur 10 ses plasmid W515L sat op med assay W515L_mut_F1 og W515L_mut_F2. På figur 11 ses plasmid W515K sat op med assay W515K_mut_F1 og W515K_mut_F2. Jo før kurven kommer op over treshole, desto mere følsom er assay. Figur 10: Plasmid W515L med hhv. assay W515L_mut_F1 og W515L_mut_F2. Første kurve svarer til assay W515L_mut_F1, og er derfor det bedste assay. Figur 11: Plasmid W515K med hhv. assay W515K_mut_F1 og W515K_mut_F2. Første kurve svarer til assay W515K_mut_F2, og er defor det bedste assay. 33

35 Diskussion: Resultater: Figur 1 i resultat afsnit viser en Pyro sekventering kørt med PyreMark, hvor den positive patient for mutation W515K blev fundet. Vi kan se at der er sket en mutation, da der er fremkommet en T top, hvor kurven ellers skulle have været lineær jf. figur 2 i resultat afsnit. Derudover melder PyroMark om fejl ved kørslen, da der ses en rød markering ved den W515K-positive patient. Dette skyldes at PyroMark var sat op til at detektere mutation W515L, da det er den hyppigste mutation af de to mutationer. Ved mutation W515L ville der ikke være kommet en T top, men derimod være sket en forskydning af den høje C top og den lille A top, der ses i det blåt markerede område. Forskydningen ville have gjort C toppen lavere og A toppen højere, som følge af en W515L mutation. Figur 3 i resultat afsnit viser fortyndingsrækken med den W515K-positive patient kørt på metoden Sanger sekventering. Fortyndingen er lavet som en 2-folds fortynding. Der vil allerede skabes tvivl om et positivt eller negativt resultat ved 50% mutation. Selvom kurven også sagtens kan ses ved en mindre mængde mutation i prøven, vil man ikke kalde den positiv, da der også er en tydelig kurve ved 0% mutation, som vi dermed må betegne som baggrundsstøj. Denne baggrundsstøj skal tages med i resultatvurderingen, og trækkes fra kurverne der ses med mutation. Der var flere forskellige assays vi kunne have kørt Sanger sekventering med, men valgte det aktuelle assay, da molekylærbiolog Thomas Kristensen vurderede at der her ville være mindst baggrundsstøj, i det codon vi var interesseret i. Havde vi haft mere tid og flere ressourcer, og havde det haft større relevans for opsætningen af Real Time PCR, kunne vi have afprøvet andre assays, og vurderet om de havde været mere følsomme overfor mutationen og med mindre baggrundsstøj. Figur 4 i resultat afsnit viser fortyndingsrækken med den W515K-positive patient kørt på metoden Pyro sekventering. Ligesom ved Sanger sekventering, er det en 2-foldsfortynding, så det har været muligt at sammenligne de to metoder. Der vil allerede skabes tvivl om et positivt eller negativt resultat ved 50% mutation. Toppene ved denne fortyndingsrække er lave. Havde det været en patient kørsel, ville man køre den om, indtil man fik et mere acceptabelt resultat. Vi kørte fortyndingsrækken fire gange, hvorefter vi valgte at bruge de lave resultater, som var de bedste af de fire kørsler. Beslutningen om at stoppe efter fire forsøg, blev taget i samarbejde med molekylærbiolog Thomas Kristensen, på baggrund af manglende relevans for implementeringen, af metode til detektering af W515L/K, samt overflødigt ressourceforbrug. Toppene skal normalt ligge 34

36 på minimum 30 op ad Y-aksen, for at PyroMark vil godkende kørslen og for at være sikker på resultatet. Vores resultater lå på lige under 15. Årsagerne kan være mange fx: Enzymet og substratet kan være gået til grunde, prøvematerialet kan være gået tabt under oprensningen eller cartridgen som de fire nukleotider skal dispenseres fra, kan have været tilstoppet. Sammenligningen af Pyro sekventering og Sanger sekventering, forløb altså ikke som man kunne have ønsket. Jeg vil dog stadig sige at Pyro sekventering er en bedre metode til detektion af punktmutationer, som var tilfældet med den W515K-positive patient. Jeg vurdere dette ud fra, at der ikke kan skabes tvivl om toppene ved Pyro sekventering, som der af og til kan ved Sanger sekventering. Derudover er baggrundsstøjen betydelig mindre, og nærmest ikke-eksisterende ved Pyro sekventering. Mindre baggrundsstøj vil gøre det lettere at vurdere et evt. positivt resultat, da der ikke i samme grad skal tages hensyn til dette i vurderingen om resultatet. Endeligt kan Pyro sekventering udføres på en enkelt dag, hvor Sanger sekventering strækker sig over 2-3 dage. Artikel (19) har beskrevet en sammenligning af bl.a. de to ovennævnte metoder og vurderer også at Pyro sekventering er mere sensitiv end Sanger sekventering. Undersøgelsen i artiklen bygger på oprenset materiale fra lunge cancer patienter, hvor der indgår 131 patientprøver. Først er der blevet kørt alle 131 prøver på hhv. Sanger sekventering og Pyro sekventering. Sanger sekventeringen fandt 6 prøver med mutation ud af de 131, mens Pyro sekventeringen fandt mutation i 10 af de 131 prøver. Forsøget blev gentaget med 116 af de 131 patientprøver. Her fandt Sanger sekventeringen mutation i 6 af de 116 prøver, men Pyro sekventeringen fandt mutation i 10 af de 116 prøver jf. figur B. Figur B Mutation/Prøver Procent % Mutation/prøver Procent % Sanger 6/ % 6/ % Pyro 10/ % 10/ % Ud fra figur B kan man se at Sanger sekventeringen fandt mutation i gennemsnitlig 4.8 % af patientprøverne, mens Pyro sekventeringen fandt mutation i 8.15 % af patientprøverne. I disse resultater skal der selvfølgelig tages højde for, om de resultater de to sekventeringsmetoder finder frem til, også er de rigtige. Er der rent faktisk mutation i de patientprøver 35

37 sekventeringsmetoderne har fundet frem til der skulle være muation i. Undersøgelsen i artikel (19) er nået frem til følgende sensitivitet og specificitet jf. figur C. Figur C Sanger Pyro Falsk positive 0/110 (0%) 0/110 (0%) Falsk negative 15/21 (71%) 11/21 (52%) Ud fra figur C kan vi se at ingen af de to sekventerings metoder finder falsk positive svar. Dvs. får man et positivt svar, er man altså helt sikker på, at man rent faktisk er positiv for mutationen. Det samme er ikke gældende ved falsk negative svar. Det betyder at en stor del af patienterne der rent faktisk har en mutation, ikke kan blive diagnosticeret ud fra disse sekventeringsmetoder. For Sanger sekventering gælder det i 71% af tilfældene, hvilket er en stor procentdel metoden ikke finder. Der er altså 15 ud af de 21 med en mutation, der ikke bliver detekteret positive ved Sanger sekventering. Lidt bedre ser det ud ved Pyro sekventering. Her er der 11 ud af 21 patienter med mutation, svarende til 52%, der får resultatet negativ, på trods af det ikke er tilfældet. Figur 5 og figur 6 viser en 4-folds fortyndingsrække af plasmider, der er fortyndet ud til 1 million, kørt ved Real Time PCR teknikken. Fortyndingen kan ikke direkte sammenlignes med fortyndingerne på Pyro- og Sanger sekventering, da det ikke er det samme materiale og koncentration. Det giver dog alligevel en klar fornemmelse af, hvor god Real Time PCR er, til at detektere selv små mængder mutation i en prøve. Som nævnt er plasmiderne fortyndet ud til 1 million, hvilket svarer til at der cirka er en kopi DNA tilbage i prøven. Som det ses på figur 6, og til dels også på figur 5, bliver der stadig registreret en mutation, på trods af at der kun er en enkelt DNA kopi tilbage, i den stærkeste fortynding. Artikel (20) har kørt 16 positive W515L patient prøver, ved Pyro sekventering. Disse 16 prøver blev forinden analyseret ved Real Time PCR, for at bestemme den muterede allel byrde. Resultaterne er blevet sat ind i et plot diagram, og giver en idé om hvor følsom Real Time PCR er, i forhold til Pyro sekventering. 36

38 Resultatet ses på figur C herunder: Figur C På grafens X-akse ses allel byrden angivet i procent, detekteret vha. Real Time PCR. På grafens Y-akse ses allel byrden angivet i procent, detekteret vha. Pyro sekventering. Ud fra plottene kan man se at både Real Time PCR og Pyro sekventering, er i stand til at detektere mutationen. Der er dog en forskel på, hvor mange procent mutation de detektere. Generelt resulterer en kørsel med Real Time PCR i en højere procentdel muterede alleler end ved Pyro sekventering. Ud fra dette kan man få en fornemmelse af, at Real Time PCR er en mere følsom metode end pyro sekventering, til detektering af mutation W515L. Figur 7 og 8 viser to kørsler på Real Time PCR med hhv. assay W515K_mut_F2 og W515L_mut_F1, med forskellige donor prøver. Disse kørsler var nødvendige for at tjekke, om de to assays ville reagere med patientprøver der ikke indeholder den type mutation vi ledte efter. Der skete ingen krydsreaktioner, hvilket kommer til at betyde, at kommer der en kurve, udover den positive kontrol, ligegyldigt hvor på x-aksen, vil der være en mutation tilstede. Havde der været en krydsreaktion med donor, skulle man fra gang til gang vurdere hvor kurven fra en mulig mutation kommer frem, i forhold til kurven med krydsreaktionen. Ligger kurven i området hvor der kunne have været en mulig krydsreaktion, ville det ikke være muligt af give et positivt svar ud fra den fremkomne kurve. 37

39 Figur 9 viser hvordan en endelig og fremtidig kørsel med patientprøver, vil blive sat op og kørt med Real Time PCR. I denne kørsel er der fremkommet en kurve for den positive kontrol og en kurve for den W515K-positive patient. Er der ikke patienter med mutation i en kørsel, vil der kun komme en enkelt kurve (i triplikat), svarende til den positive kontrol, der altid vil være med. På figur 9 ses også en enkelt kurve længst ude til højre på x-aksen, der skyldes en kontaminering i den ene af de tre triplikater med negativ kontrol materiale (H2O). Det vil dog ikke have nogen betydning i dette tilfælde, da kontamineringskurven ligger langt ude på x-aksen, samtidig med at det kun er den ene ud af tre brønde i den negative kontrol, der er kontamineret. Materialer og metoder: I afsnittet materialer og metoder, er der nævnt sekvenserne på den probe og de primere vi brugte til detektion af mutation W515L/K, samt til primere til wildtype assay i opsætningen af Real Time PCR. Revers primer samt probe er den samme i alle tre assays. Det vil altså sige, at i vores forsøg har vi valgt at tilpasse forward primer til detektion af mutationerne. I artikel (21) er der blevet lavet et lignende forsøg. Forsøget i artikel (21) adskiller sig dog netop på dette punkt med designet af primer/probe mix. I stedet for, som i vores forsøg hvor primeren er mutations specifik, har de gjort proben mutations specifik og primerne er dermed de samme ved begge mutationer. At proben er mutations specifik, er ofte det der bruges ved Real Time PCR. Slutresultatet bliver det samme, om det er proben eller primerne der er mutations specifikke. Er det primeren der mutations specifik, sker der ikke en syntisering af DNA strengen, idet primeren er nødvendig for polymerasen, og dermed opstår der ikke et farvesignal, da proben forbliver intakt. Er proben mutationsspecifik, sker der derimod en syntisreing af template, men idet der ikke er bundet en probe, sker der heller ikke her et farvesignal. 38

40 Konklusion: I vores forsøg på at opsætte en ny metode til detektering af mutationerne W515L og W515K i MPL genet, i forbindelse med kronisk myeloproliferative sygdomme, har vi testet 38 JAK2V617F positive patienter og 39 JAK2V617F negative patienter, vha. af Pyro sekventering. Pyro sekventeringen var sat op med et assay til detektion af mutation W515L, da det er den hyppigste af de to MPL mutationer. Det lykkedes os dog ikke at finde en W515L mutation, men derimod en W515K mutation. På forhånd havde molekylærbiolog Thomas Kristensen i samarbejde med bioanalytiker Alice Jensen, udvalgt fire forskellige ud af 11 assays, som vi skulle arbejde videre med. Vi testede de fire forskellige assays, både med plasmider og med den W515K-positive patient vha. Real Time PCR, og fandt frem til at assay W515K_mut_F2 og W515L_mut_F1 var de to mest følsomme assay, til detektion af de to mutationer. For at teste de to udvalgte assays for krydsreaktioner, satte vi dem op til Real Time PCR med en række raske donorer. Det viste sig at der ikke skete krydsreaktioner, hvilket gør vurderingen af resultaterne for muligt W515K/L positive patienter forholdsvis enkel. Som sidste trin satte vi en kørsel op, som den sandsynligvis vil blive kørt på Real Time PCR, når metoden bliver implementeret på AKP OUH. Denne kørsel indeholdt assay W515L_mut_F1, assay W515K_mut_F2 og wildtype assay W515_wt_F samt en negativ kontrol med H2O, en negativ kontrol med donor, en positiv kontrol indeholdende mutation W515K og W515L, den W515Kpositive patient og 4 mulige patienter. Kørslen kørte som forventet og vi fik udslag i de forventede brønde. Udover opsætningen til Real Time PCR, testede vi en fortyndingsrække med den W515K-positive patient fortyndet i donor. Fortyndingsrækken var en 2-folds fortynding og blev testet ved både Pyro sekventering og Sanger sekventering for at kunne sammenligne følsomheden af de to sekventeringsmetoder. Fortyndingsforsøget viste at Pyro sekventering er den mest følsomme metode til detektering af denne mutation, på trods af kørslen ikke kørte optimalt. 39

41 Perspektivering: Det har længe været kendt at der er en sammenhæng mellem KMPS og mutation JAK2V617F. Det er nyttig viden i forhold til at kunne stille den rigtige diagnose, og monitorere sygdommene. Det er imidlertid blevet kendt, at der er andre mutationer, dog mindre udbredte, der har sammenhæng med KMPS. Vi har i vores praktiske arbejde på AKP, været med til at udvikle en mulig måde hvorpå man kan detektere MPL mutationerne W515K og W515L. Vi var overraskede over hvor hurtigt det egentlig lykkedes os at finde de rigtige assays, finde en mutation blandt KMPS positive patientprøver og få sat en metode op, som meget muligt kan implementeres i den daglige praksis på AKP OUH. Vi har dog haft utrolig stor hjælp fra både molekylærbiolog Thomas Kristensen og bioanalytiker Alice Jensen, som har lavet alt forarbejdet for os, og hjulpet os igennem alt det praktiske på klinikken. For at denne metode kan implementeres som en fast analyse der kan tilbydes KMPS positive, men JAK2V617F negative, patienter, ville man nok have brug for at finde en W515L mutation i humant DNA, frem for at skulle bruge plasmider som positivt kontrolmateriale. Samtidig er det nødvendigt at finde flere patienter med både mutation W515L og W515K, der giver at klart udslag ved analysering på Real Time PCR, da man jo skal bruge en lille smule af denne DNA til hver kørsel der bliver kørt. Det fundne assay fungerer rigtig godt. Der er ingen krydsreaktioner med raske donorer, hvilket gør det nemt at tolke et resultat ud fra de fremkomne kurver ved Real Time PCR. I forbindelse med min research omkring behandling af KMPS, opstod der en undring omkring JAK2 hæmmerne. Ofte blev denne type behandling kun beskrevet i forbindelse med PMF, hvilket jeg undrer mig over, idet en mutation i JAK2 genet spiller ind i både ET, PMF og PV, ved en konstant aktivering af JAK/STAT signalvejen. Der er dog få artikler der omtaler behandlingen med JAK2 hæmmere i alle tre sygdomstilfælde, hvilket for mig også giver mening. Derudover undrer det mig at denne behandling ikke tilbydes patienter med andre mutationer end JAK2V617F mutationen, som fx patienter med mutation W515K eller W515L. Disse mutationer er ikke i direkte berøring med JAK2, men derimod i indirekte kontakt. Mutation i MPL genet vil også have indflydelse på JAK/STAT signalvejen, hvilket må betyde at disse patienter også kan have gavn af en behandling med JAK2 hæmmere. Årsagen til manglende behandlingstilbud med JAK2 hæmmere, kan 40

42 selvfølgelig skyldes at der på AKP på OUH, ikke har været mulighed for at teste for mutationer i MPL genet. Når muligheden for en mutationsanalyse for mutation W515L/K bliver en realitet, vil man kunne følge udviklingen af sygdommen i et behandlingsforløb. Jeg vil umiddelbart tro at patienter med en mutation i MPL genet, vil få tilbudt behandling med JAK2 hæmmere. Sammenhængen med mutation W515L/K og JAK2 hæmmere, er blevet undersøgt i forskellige studier, fx i artikel (22), hvor der er blevet udført forsøg på mus. Disse mus har fået forskellige doser af JAK2 hæmmeren INCB16562 der hæmmer JAK/STAT signal kaskaden, over en periode på 28 dage. Resultatet viste at musene generelt havde en markant bedre overlevelsesrate, end mus der ikke fik behandling med INCB Dette underbygger vigtigheden af, at en metode til detektering af mutation W515L og W515K i MPL genet, vil komme til stor gavn for patienter med disse mutationer, så en rigtig diagnose kan stilles og et behandlingsforløb kan følges og evt. ændres. 41

43 Litteraturliste: 1. Tefferi A. Novel mutations and their functional and clinical relevance in myeloproliferative neoplasms: JAK2, MPL, TET2, ASXL 1, CBL, IDH and IKZF1. Department of Hematology and Medicine. USA: Macmillan Publishers Limited; Hasselbalch H, Hansen NE. Kræftens bekæmpelse [ ]. Lokaliseret på: omme/myeloproliferativ+symptomer/ 3. Hasselbalch H, Larsen TS. De Philadelphia-Negative Kroniske Myeloproliferative Sygdomme. Dansk Studiegruppe for Kroniske Myeloide Sygdomme (DSKMS). [ ] Lokaliseret på: 4. Molekylærbiolog Thomas Kristensen, Afdeling for Klinisk Patologi, OUH Odense Universitetshospital. 5. Nguyen H, Gotlib J. Insights into the Molecular Genetics of Myeloproliferative Neoplasms. 6. Genetics Home Reference.MPL [ ]. Lokaliseret på: Ribeiro A, Silva N, Cerutti J, Silva M, Chauffaille M. Cytogenetics, JAK2 and MPL mutations in polycythemia vera, primary myelofibrosis and essential thrombocythemia. Rev Bras Hematol Hemoter. Brasilien: Pardanani A, Guglielmelli P, Lasho TL, Pancrazzi A, Finke CM, Vannucchi AM, Tefferi A. Primary myelofibrosis with or without mutant MPL: comparison of survival and clinical features involving 603 patients. Leukemia 25. Department of Medicine, Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, USA;

44 9. Hasselbalch H, Hansen NE. Kræftens bekæmpelse [ ]. Lokaliseret på: omme/myeloproliferativ+behandling 10. Novotny-Diermayr V, Hart S, Goh KC, Cheong A, Ong LC, Hentze H, et al. The oral HDAC inhibitor pracinostat (SB939) is efficacious and synergistic with the JAK2 inhibitor pacritinib (SB1518) in preclinical models of AML. Blood cancer journal, maj Hansen PG, Vestergaard H. Primær myelofibrose (PMF). UOH Odense Universitetshospital [ ]. Lokaliseret på: r%20myelofibrose[1].pdf Besøgt 6/ Desjardins P, Hansen JB, Allen M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. The Journal of Visualized Experiments (JoVE). [ ] Lokaliseret på: Buckingham L, Flaws ML. Molecular Diagnostics. Philadelphia, USA: F.A. Davis Company; PyroMark PCR Kit (Qiagen) 17. Life Technologies. Real Time PCR vs Traditional PCR vs Digital PCR [ ] Lokaliseret på: 43

45 18. Analyse forskrifter: Oprensning af DNA Ammoniumchlorid: Kvalitativ PCR: Gelstøbning: Fældning af PCR product: Sekventering: Fældning af sekvensplade: Pyro sekventering: Real Time PCR: Jancik S, Drabek J, Berkovcova J, Xu Y, Stankova M, Klein J, Kolek V. A comparison of Direct sequencing, Pyresequencing, High resolution melting analysis, TheraScreen DxS, and the K-ras StripAssay for detecting KRAS mutations in non small cell lung carcinomas. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. BioMed Central;

46 20. Alchalby H, Badbaran A, Bock O, Fehse B, Bacher U, Zander AR, Kröger N. Screening and monitoring of MPL W515L mutation with real-time PCR in patients with myelofibrosis undergoing allogeneic-sct. Bone Marrow Transplantation. Januar Pancrazzi A, Guglielmelli P, Ponziani V, Bergamaschi G, Bosi A, Barosi G, Vannucchi AM. A Sensitive Detection Method for MPLW515L or MPLW515K Mutation in Chronic Myeloproliferative Disorders with Locked Nucleic Acid-Modified Probes and Real-Time Polymerase Chain Reaction. The journal of molecular diagnostics, September Koppikar P, Abdel-Wahab O, Hedvat C, Marubayashi S, Patel J, Goel A, Et Al. Efficacy of the JAK2 inhibitor INCB16562 in a murine model of MPLW515L-induced thrombocytosis and myelofibrosis. Blood; April

47 Bilag: Bilag 1: Oversigt over alle patienter med en diagnosticeret KMPS, som blev analyseret ved Pyro sekventering. MPL Diagnose P-nr. JAK2 V617F W515K/L % fordelinger - Pyro ET Neg Neg A = 3%, C = 97% ET Neg Neg A = 2%, C = 98% ET Neg Neg A = 0%, C = 100% ET Neg Neg A = 1%, C = 99%? Neg Neg A = 3%, C = 97% PMF Neg Neg A = 0%, C = 100% ET Neg Neg A = 5%, C = 95% ET Neg Neg A = 1%, C = 99% ET Neg Neg A = 2%, C = 98% ET Neg Neg A = 0%, C = 100% ET Neg Neg A = 2%, C = 98% ET Neg Neg A = 0%, C = 100% ET Neg Neg A = 3%, C = 97% ET Neg Neg A = 0%, C = 100% PMF Neg Neg A = 5%, C = 95% ET Neg Neg A = 3%, C = 97% PMF Neg Neg A = 4%, C = 96% ET Neg Neg A = 3%, C = 97% ET Neg Neg A = 3%, C = 97% ET Neg Neg A = 3%, C = 97% ET Neg Neg A = 1%, C = 99% ET Neg Neg A = 4%, C = 96% ET Neg Neg A = 2%, C = 98% ET Neg Neg A = 8%, C = 92% 46

48 ET Neg Neg A = 1%, C = 99% ET Neg Neg A = 5%, C = 95% ET Neg W515K POSITIV A = 0%, C = 100% ET Neg Neg A = 5%, C = 95% ET Neg Neg A = 2%, C = 98% ET Neg Neg A = 5%, C = 95% ET Neg Neg A = 2%, C = 98% ET Neg Neg A = 4%, C = 96% ET Neg Neg A = 2%, C = 98% PMF Neg Neg A = 2%, C = 98% ET Neg Neg A = 0%, C = 100% ET Neg Neg A = 2%, C = 98% ET Neg Neg A = 2%, C = 98% ET Neg Neg A = 4%, C = 96% PMF Neg Neg A = 1%, C = 99% ET Pos Neg A = 4%, C = 96% ET Pos Neg A = 1%, C = 99% ET Pos Neg A = 5%, C = 95% D474B Pos Neg A = 1%, C = 99% ET Pos Neg A = 4%, C = 96% ET Pos Neg A = 4%, C = 96% ET Pos Neg A = 5%, C = 95% ET Pos Neg A = 1%, C = 99% ET Pos Neg A = 9%, C = 91% ET Pos Neg A = 1%, C = 99% ET Pos Neg A = 6%, C = 94% ET Pos Neg A = 3%, C = 97% PMF Pos Neg A = 6%, C = 94% ET Pos Neg A = 2%, C = 98% ET Pos Neg A = 5%, C = 95% 47

49 ET Pos Neg A = 4%, C = 96% ET Pos Neg A = 6%, C = 94% PMF Pos Neg A = 2%, C = 98% ET Pos Neg A = 4%, C = 96% ET Pos Neg A = 6%, C = 94% ET Pos Neg A = 1%, C = 99% ET Pos Neg A = 2%, C = 98% ET Pos Neg A = 0%, C = 100% ET Pos Neg A = 1%, C = 99% PMF Pos Neg A = 0%, C = 100% ET Pos Neg A = 4%, C = 96% PMF Pos Neg A = 3%, C = 97% ET Pos Neg A = 4%, C = 96% PMF Pos Neg A = 4%, C = 96% ET Pos Neg A = 4%, C = 96% PMF Pos Neg A = 3%, C = 97% ET Pos Neg A = 3%, C = 97% ET Pos Neg A = 1%, C = 99% ET Pos Neg A = 5%, C = 95% PMF Pos Neg A = 2%, C = 98% ET Pos Neg A = 4%, C = 96% ET Pos Neg A = 0%, C = 100% D474B Pos Neg A = 9%, C = 91% 48

50 Bilag 2: Den endelige Real Time PCR kørsel. Billedet er med Wildtype assay W515_wt. Bilag 3: Den endelige Real Time PCR kørsel. Billedet er med assay W515L_mut_F1. 49

Test dit eget DNA med PCR

Test dit eget DNA med PCR Test dit eget DNA med PCR Navn: Forsøgsvejledning Formål med forsøget Formålet med dette forsøg er at undersøge jeres arvemateriale (DNA) for et transposon kaldet Alu. Et transposon er en DNA sekvens,

Læs mere

Velkommen. Test dit eget DNA med PCR. Undervisningsdag på DTU Systembiologi. Undervisere:

Velkommen. Test dit eget DNA med PCR. Undervisningsdag på DTU Systembiologi. Undervisere: Velkommen Test dit eget DNA med PCR Undervisningsdag på DTU Systembiologi Undervisere: Hvem er I? 2 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet Hvilke baser indgår i DNA? A. Adenin, Guanin, Cytosin,

Læs mere

PCR (Polymerase Chain Reaction): Opkopiering af DNA

PCR (Polymerase Chain Reaction): Opkopiering af DNA PCR (Polymerase Chain Reaction): Opkopiering af DNA PCR til at opkopiere bestemte DNA-sekvenser i en prøve er nu en af genteknologiens absolut vigtigste værktøjer. Peter Rugbjerg, Biotech Academy PCR (Polymerase

Læs mere

Test dit eget DNA med PCR

Test dit eget DNA med PCR Test dit eget DNA med PCR Forsøgsvejledning Navn: Side 1 af 7 Formål med forsøget Formålet med dette forsøg er at undersøge jeres arvemateriale (DNA) for et transposon kaldet Alu. Et transposon er en DNA

Læs mere

Test dit eget DNA med PCR

Test dit eget DNA med PCR Test dit eget DNA med PCR Navn: Forsøgsvejledning Side 1 af 8 Formål med forsøget Formålet med dette forsøg er at undersøge jeres arvemateriale (DNA) for et transposon kaldet Alu. Et transposon er en DNA-sekvens,

Læs mere

En forsker har lavet et cdna insert vha PCR og har anvendt det følgende primer sæt, som producerer hele den åbne læseramme af cdna et:

En forsker har lavet et cdna insert vha PCR og har anvendt det følgende primer sæt, som producerer hele den åbne læseramme af cdna et: F2011-Opgave 1. En forsker har lavet et cdna insert vha PCR og har anvendt det følgende primer sæt, som producerer hele den åbne læseramme af cdna et: Forward primer: 5 CC ATG GGT ATG AAG CTT TGC AGC CTT

Læs mere

Test dit eget DNA med PCR

Test dit eget DNA med PCR Test dit eget DNA med PCR Navn: Forsøgsvejledning Side 1 af 8 Formål med forsøget Formålet med dette forsøg er at undersøge jeres arvemateriale (DNA) for et transposon kaldet Alu. Et transposon er en DNA

Læs mere

Test dit eget DNA med PCR

Test dit eget DNA med PCR Test dit eget DNA med PCR Navn: Forsøgsvejledning Side 1 af 8 Formål med forsøget Formålet med dette forsøg er at undersøge jeres arvemateriale (DNA) for et transposon kaldet Alu. Et transposon er en DNA-sekvens,

Læs mere

Velkommen. Test dit eget DNA med PCR. Undervisningsdag på DTU Systembiologi. Undervisere: Sebastian, Louise og Ana

Velkommen. Test dit eget DNA med PCR. Undervisningsdag på DTU Systembiologi. Undervisere: Sebastian, Louise og Ana Velkommen Test dit eget DNA med PCR Undervisningsdag på DTU Systembiologi Undervisere: Sebastian, Louise og Ana Hvem er I? 2 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet Dagens program 9:00 10:00 Introduktion

Læs mere

Protokol for genetisk bestemmelse af ABO blodtyper

Protokol for genetisk bestemmelse af ABO blodtyper Page1 Udarbejdet i samarbejde mellem: Kåre Lehmann, Annabeth Høgh Petersen, Anne Rusborg Nygaard og Jørn M. Clausen Page2 VIGTIGT: SKIFT PIPETTE SPIDSER/TIPS EFTER HVER GANG!! Så undgår du at forurene

Læs mere

Faktor V Leiden mutation

Faktor V Leiden mutation Faktor V Leiden mutation Formål: finde ud af om individ har mutation i faktor V Leiden gen (missense: arginin glutamin) Materiale: oprens DNA fra leukocytter Metode: PCR med specifikke primere, oprens,

Læs mere

DNA origami øvelse 2013. DNA origami øvelse

DNA origami øvelse 2013. DNA origami øvelse DNA origami øvelse Introduktion I denne øvelse bruger vi DNA origami teknikken til at samle en tavle af DNA med dimensioner på 70 nm x 100 nm. Tavlen dannes af et langt enkeltstrenget DNA molekyle, der

Læs mere

DNA origami øvelse DNA origami øvelse

DNA origami øvelse DNA origami øvelse DNA origami øvelse Introduktion I denne øvelse bruger vi DNA origami teknikken til at samle en tavle af DNA med dimensioner på 70 nm x 100 nm. Tavlen dannes af et langt enkeltstrenget DNA molekyle, der

Læs mere

DNA origami øvelse. Introduktion. DNA origami øvelse 3 timer 2018

DNA origami øvelse. Introduktion. DNA origami øvelse 3 timer 2018 DNA origami øvelse Introduktion I denne øvelse bruger vi DNA origami teknikken til at samle en tavle af DNA med dimensioner på 70 nm x 100 nm. Tavlen dannes af et langt enkeltstrenget DNA molekyle, der

Læs mere

DNA origami øvelse DNA origami øvelse

DNA origami øvelse DNA origami øvelse DNA origami øvelse Introduktion I denne øvelse bruger vi DNA origami teknikken til at samle en tavle af DNA med dimensioner på 70 nm x 100 nm. Tavlen dannes af et langt enkeltstrenget DNA molekyle, der

Læs mere

GAPDH PCR modul Manual

GAPDH PCR modul Manual GAPDH PCR modul Manual Katalog nr. 166-5010EDU explorer.bio-rad.com Kopiering kun tilladt til undervisningsbrug Bemærk: Kittet indeholder temperaturfølsomme dele. Åbn derfor straks kassen og læg de pågældende

Læs mere

Analyse af proteiner Øvelsesvejledning

Analyse af proteiner Øvelsesvejledning Center for Undervisningsmidler, afdeling København Analyse af proteiner Øvelsesvejledning Formål At separere og analysere proteiner i almindelige fødevarer ved brug af gelelektroforese. Teori Alle dele

Læs mere

Proteiner: en introduktion. Modul 1; F13 Rolf Andersen, 18/2-2013

Proteiner: en introduktion. Modul 1; F13 Rolf Andersen, 18/2-2013 Proteiner: en introduktion Modul 1; F13 Rolf Andersen, 18/2-2013 4 facts om proteiner Proteiner udgør én af de vigtigste stofgrupper i vores organisme; de varetager en lang række forskellige funktioner.

Læs mere

Opgave 1 Listeria. mørkviolette bakteriekolonier, se figur 1a. og b. 1. Angiv reaktionstypen for reaktion. 1 vist i figur 1b.

Opgave 1 Listeria. mørkviolette bakteriekolonier, se figur 1a. og b. 1. Angiv reaktionstypen for reaktion. 1 vist i figur 1b. Opgave 1 Listeria Bakterien Listeria monocytogenes kan være sygdomsfremkaldende for personer, der i forvejen er svækkede. For at identificere Listeria kan man anvende indikative agarplader. Her udnyttes

Læs mere

Deltagermateriale 43230 OGM. PCR-teknikker 1

Deltagermateriale 43230 OGM. PCR-teknikker 1 Deltagermateriale 43230 OGM PCR-teknikker 1 POLYMERASE KÆDE REAKTION (PCR) Indholdsfortegnelse 04/02 2 af 36 1. INDLEDNING... 4 DNA's opbygning... 5 DNA-replikation.... 7 2. PCR METODEN... 10 PCR en oversigt...

Læs mere

dobbelt strenget DNA hvor de enkelte nukleotider er komplementære. Tm: Smeltetemperaturen for en given DNA sekvensmængde hvoraf 50% er denatureret.

dobbelt strenget DNA hvor de enkelte nukleotider er komplementære. Tm: Smeltetemperaturen for en given DNA sekvensmængde hvoraf 50% er denatureret. Titel: Sporadiske DNA mutationer og sensitiviteten af målemetoder. Undertitel: Screening af DNA for sporadiske mutationer stiller store krav til sensitiviteten af de anvendte målemetoder. I en prøve der

Læs mere

Statusrapport for projektet: Afprøvning af den nye PCR teknik til test for virus i kartoffelknolde til erstatning for den gamle ELISA-teknik

Statusrapport for projektet: Afprøvning af den nye PCR teknik til test for virus i kartoffelknolde til erstatning for den gamle ELISA-teknik Bilag 2 Statusrapport for projektet: Afprøvning af den nye PCR teknik til test for virus i kartoffelknolde til erstatning for den gamle ELISA-teknik ved forsker Mogens Nicolaisen, Danmarks JordbrugsForskning,

Læs mere

Restriktionsenzymer findes Genkendelsessekvens

Restriktionsenzymer findes Genkendelsessekvens Restriktionsenzymer Skanning Restriktionsenzymer findes i bakterier (forsvarsmekanisme) IKKE i eukaryote celler 3-5 - 5-3 - Restriktionsenzyme Genkendelsessekvens Palindromisk Otto, Anna, radar Madam I

Læs mere

CML kronisk myeloid leukæmi. i Børnecancerfonden informerer

CML kronisk myeloid leukæmi. i Børnecancerfonden informerer CML kronisk myeloid leukæmi i kronisk myeloid leukæmi 3 Fra de danske børnekræftafdelinger i Aalborg, Aarhus, Odense og Rigshospi talet. Forår 2015 FOREKOMST Akut leukæmi (blodkræft) er den mest almindelige

Læs mere

Banan DNA 1/6. Formål: Formålet med øvelsen er at give eleverne mulighed for at se DNA strenge med det blotte øje.

Banan DNA 1/6. Formål: Formålet med øvelsen er at give eleverne mulighed for at se DNA strenge med det blotte øje. Banan DNA Formål: Formålet med øvelsen er at give eleverne mulighed for at se DNA strenge med det blotte øje. Baggrundsviden: Om vi er mennesker, dyr eller planter, så har alle organismer DNA i deres celler.

Læs mere

Trin 1: Oprensning af genomisk DNA (DeoxyriboNucleicAcid)

Trin 1: Oprensning af genomisk DNA (DeoxyriboNucleicAcid) Trin 1: Oprensning af genomisk DNA (DeoxyriboNucleicAcid) (Denne del tager ca. 3 timer, max 14 prøver) ELEVVEJLEDNING forsøgskasse nr. 1 AAU Oprensning af DNA-prøven foregår gennem fem trin, se figur 1:

Læs mere

Hvad er Myelodysplastisk syndrom (MDS)?

Hvad er Myelodysplastisk syndrom (MDS)? Hvad er Myelodysplastisk syndrom (MDS)? En information til patienter og pårørende Denne folder støttes af: Patientforeningen for Lymfekræft, Leukæmi og MDS Velkommen Dette hæfte er udviklet for at give

Læs mere

Den hæmatologiske fællesdatabase

Den hæmatologiske fællesdatabase Registreringsvejledning: Myeloproliferative sygdomme (MPN) og Myelodysplasi (MDS) Hvilke personer skal registreres?: Alle patienter som diagnosticeres med en myeloproliferativ sygdom eller myelodysplasi

Læs mere

Dansk MPN Forening. Polycytæmi Vera Essen el Trombocytose Primær Myelofibrose

Dansk MPN Forening. Polycytæmi Vera Essen el Trombocytose Primær Myelofibrose Dansk MPN Forening Polycytæmi Vera Essen el Trombocytose Primær Myelofibrose Landsforeningen for blodkræftsygdommene Polycytæmia Vera (PV) Primær Myelofibrose (PMF) Essentialis Trombocytosis (ET) Stiftet

Læs mere

OPTIMERING AF PCR MHP. DETEKTION AF SNP ER I CERS6.

OPTIMERING AF PCR MHP. DETEKTION AF SNP ER I CERS6. OPTIMERING AF PCR MHP. DETEKTION AF SNP ER I CERS6. Bachelorprojekt Udarbejdet af Sandra Reinholt Nielsen 14.08.1981 Projektperiode: 6. April 9.juni 2009 Vejledere: Søren Jensen, Lektor, Professionshøjskolen

Læs mere

FYSISKE MÅLINGER PÅ MÆLK

FYSISKE MÅLINGER PÅ MÆLK FYSISKE MÅLINGER PÅ MÆLK Fysiske målinger på mælk - Hvordan måler man, om koen er syg? 1 Introduktion til forsøget Yverbetændelse, også kaldet mastitis, er en ofte forekommende produktionssygdom hos malkekøer

Læs mere

Protokol for genetisk bestemmelse af ABO blodtyper

Protokol for genetisk bestemmelse af ABO blodtyper Page1 Udarbejdet i samarbejde mellem: Kåre Lehmann, Annabeth Høgh Petersen, Anne Rusborg Nygaard og Jørn M. Clausen Page2 VIGTIGT: SKIFT PIPETTE SPIDSER/TIPS EFTER HVER GANG!! Så undgår du at forurene

Læs mere

Bioteknologi A. Gymnasiale uddannelser. Vejledende opgavesæt 1. Mandag den 31. maj 2010 kl. 9.40-14.40. 5 timers skriftlig prøve

Bioteknologi A. Gymnasiale uddannelser. Vejledende opgavesæt 1. Mandag den 31. maj 2010 kl. 9.40-14.40. 5 timers skriftlig prøve Vejledende opgavesæt 1 Bioteknologi A Gymnasiale uddannelser 5 timers skriftlig prøve Vejledende opgavesæt 1 Mandag den 31. maj 2010 kl. 9.40-14.40 Side 1 af 8 sider pgave 1. Genmodificeret ris Vitamin

Læs mere

Validering af molekylærbiologiske analyser. Marianne Antonius Jakobsen Afsnitsleder for molekylærbiologisk lab. Klinisk Immunologisk afdeling, OUH.

Validering af molekylærbiologiske analyser. Marianne Antonius Jakobsen Afsnitsleder for molekylærbiologisk lab. Klinisk Immunologisk afdeling, OUH. Validering af molekylærbiologiske analyser Marianne Antonius Jakobsen Afsnitsleder for molekylærbiologisk lab. Klinisk Immunologisk afdeling, OUH. Hvordan laver man en god validering? Standarden: Mere

Læs mere

akut myeloid leukæmi Børnecancerfonden informerer

akut myeloid leukæmi Børnecancerfonden informerer akut myeloid leukæmi i AML (akut myeloid leukæmi) 3 Biologi Ved leukæmi fortrænges den normale knoglemarv af de syge celler, som vokser uhæmmet, og som følge heraf kommer der tegn på knoglemarvssvigt.

Læs mere

therascreen BRAF Pyro -kit Håndbog 24

therascreen BRAF Pyro -kit Håndbog 24 Marts 2015 therascreen BRAF Pyro -kit Håndbog 24 Version 2 Til in vitro-diagnostisk brug 971470 QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, 40724 Hilden, TYSKLAND R2 1074213DA Sample & Assay Technologies QIAGEN prøve-

Læs mere

myelodysplastisk syndrom (MDS) Børnecancerfonden informerer

myelodysplastisk syndrom (MDS) Børnecancerfonden informerer myelodysplastisk syndrom (MDS) i myelodysplastisk syndrom (MDS) 3 Fra de danske børnekræftafdelinger i Aalborg, Århus, Odense og København, oktober 2011. Definition Der findes ikke noget dansk navn for

Læs mere

Vi går derfor ud fra, at I ved, at DNA molekyler er meget lange molekyler

Vi går derfor ud fra, at I ved, at DNA molekyler er meget lange molekyler DNA-profil analyse Indledning DNA-profil analyser eller i daglig tale DNA-fingeraftryk er en metode, der bruges, når man skal finde ud af, hvem der er far et barn, hvis der altså er flere muligheder. Det

Læs mere

VONWILLEBRANDSSYGDOM,

VONWILLEBRANDSSYGDOM, VONWILLEBRANDSSYGDOM, VON WILLEBRAND-FAKTOR OG P-PILLER Julie Brogaard Larsen, lægestuderende Center for Hæmofili og Trombose Aarhus Universitetshospital DAGENS PROGRAM Lidt von Willebrand-historie von

Læs mere

Polycytæmia Vera og Sekundær Polycytæmi

Polycytæmia Vera og Sekundær Polycytæmi Polycytæmia Vera og Sekundær Polycytæmi Patientinformation Regionshospitalet Silkeborg Diagnostisk Center Hæmatologisk Ambulatorium Polycytæmia Vera og Sekundær Polycytæmi Polycytæmia betyder mange celler

Læs mere

Øvelse med tarmkræftceller i kultur.

Øvelse med tarmkræftceller i kultur. Øvelse med tarmkræftceller i kultur. Baggrund Hver 3. dansker bliver ramt af kræft, inden de er blevet 75 år. Tyktarmskræft er den 3. hyppigste kræftform hos både mænd og kvinder, hvor henholdsvis 7.3

Læs mere

Behandling af Crohn s sygdom med lægemidlet Methotrexat

Behandling af Crohn s sygdom med lægemidlet Methotrexat Hillerød Hospital Kirurgisk Afdeling Behandling af Crohn s sygdom med lægemidlet Methotrexat Patientinformation April 2011 Forfatter: Gastro-medicinsk ambulatorium Hillerød Hospital Kirurgisk Afdeling

Læs mere

Elektroforese. Navne: Rami Kassim Kaddoura Roman Averin Safa Sarac Magnus Høegh Jensen Frederik Gaarde Lindskov

Elektroforese. Navne: Rami Kassim Kaddoura Roman Averin Safa Sarac Magnus Høegh Jensen Frederik Gaarde Lindskov Elektroforese Navne: Rami Kassim Kaddoura Roman Averin Safa Sarac Magnus Høegh Jensen Frederik Gaarde Lindskov Klasse: 1.4 Fag: Biologi Vejleder: Brian Christensen Skole: Roskilde tekniske gymnasium, Htx

Læs mere

Kemiøvelse 2 C2.1. Buffere. Øvelsens pædagogiske rammer

Kemiøvelse 2 C2.1. Buffere. Øvelsens pædagogiske rammer Kemiøvelse 2 C2.1 Buffere Øvelsens pædagogiske rammer Sammenhæng Denne øvelse er tilpasset kemiundervisningen på modul 3 ved bioanalytikeruddannelsen. Kemiundervisningen i dette modul indeholder blandt

Læs mere

Appendix 1: Udregning af mængde cellesuspention til udsåning. Faktor mellem total antal celler og antal celler der ønskes udsås:

Appendix 1: Udregning af mængde cellesuspention til udsåning. Faktor mellem total antal celler og antal celler der ønskes udsås: Appendix Appendix 1: Udregning af mængde cellesuspention til udsåning Fortyndingsfaktor: Efter trypsinering og centrifugering af celler fra cellestokken, opblandes cellerne i 1 ml medie. For at lave en

Læs mere

Kvalitetskontrol i molekylærbiologisk rutinediagnostik

Kvalitetskontrol i molekylærbiologisk rutinediagnostik i molekylærbiologisk rutinediagnostik Respirationsvejsvirus som model Mette Høgh, cand. scient, ph.d. Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Hvidovre Hospital Mette.hoegh@hvh.regionh.dk Oversigt Introduktion

Læs mere

Opgave 1 Slankemidler

Opgave 1 Slankemidler Opgave 1 Slankemidler Overvægt er et stigende problem i den vestlige verden, og der er derfor udviklet forskellige slankemidler. Et eksempel på et slankemiddel er Orlistat. Den kemiske struktur af Orlistat

Læs mere

Puffere. Øvelsens pædagogiske rammer. Sammenhæng. Formål. Arbejdsform: Evaluering

Puffere. Øvelsens pædagogiske rammer. Sammenhæng. Formål. Arbejdsform: Evaluering 1 Puffere Øvelsens pædagogiske rammer Sammenhæng Denne øvelse er tilpasset kemiundervisningen på modul 3 ved bioanalytikeruddannelsen. Kemiundervisningen i dette modul indeholder blandt andet syrebaseteori

Læs mere

Brugsanvisning for SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD

Brugsanvisning for SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD 1 Producent Brugsanvisning for SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD for DHPLC systemer Læs venligst denne brugsanvisning grundigt igennem, før dette produkt anvendes. Gem denne brugsanvisning til

Læs mere

Biotechnology Explorer

Biotechnology Explorer Biotechnology Explorer Oprensning af genomisk DNA fra plantemateriale Manual Katalog nr. 166-5005EDU explorer.bio-rad.com Oversat og bearbejdet af Birgit Sandermann Justesen, Nærum Gymnasium, februar 2009

Læs mere

KRIMINALDETEKTIVEN GERNINGSSTEDETS GÅDE PCR

KRIMINALDETEKTIVEN GERNINGSSTEDETS GÅDE PCR KRIMINALDETEKTIVEN GERNINGSSTEDETS GÅDE Elevvejledning PCR PCR trin for trin PCR involverer en række gentagne cykler, der hver består af følgende tre trin: Denaturering, primer påsætning og forlængelse

Læs mere

Leucocyt-forstyrrelser

Leucocyt-forstyrrelser Leucocyt-forstyrrelser Udarbejdet af KLM med inspiration fra Kako S4 pensum fra bogen Hæmatologi af H. Karle Granulocytsygdomme Lymfocytsygdomme Leukæmier M-proteinæmi Analyser Referenceområde [LKC]: 3.0

Læs mere

Gerningsstedets gåde Den usynlige sandhed - DNA PCR Basics Kit. Katalog nr. 166-2600EDU

Gerningsstedets gåde Den usynlige sandhed - DNA PCR Basics Kit. Katalog nr. 166-2600EDU 1 Gerningsstedets gåde Den usynlige sandhed - DNA PCR Basics Kit Katalog nr. 166-2600EDU Bemærk: Kittet indeholder temperaturfølsomme dele. Åbn derfor straks pakken og læg de dele, der er mærket med -20

Læs mere

Materialeliste: Ready-to-loadTM DNA prøver til elektroforese. Medfølgende reagenser og tilbehør. Egne materialer

Materialeliste: Ready-to-loadTM DNA prøver til elektroforese. Medfølgende reagenser og tilbehør. Egne materialer Elevvejledning 1 Materialeliste: Ready-to-loadTM DNA prøver til elektroforese A B C D E F Plasmid DNA (uskåret) Plasmid skåret med Bgl I Plasmid skåret med Eco RI Lambda DNA (uskåret) Lambda DNA skåret

Læs mere

Kemiøvelse 2 1. Puffere

Kemiøvelse 2 1. Puffere Kemiøvelse 2 1 Puffere Øvelsens pædagogiske rammer Sammenhæng Denne øvelse er tilpasset kemiundervisningen på modul 3 ved bioanalytikeruddannelsen. Kemiundervisningen i dette modul indeholder blandt andet

Læs mere

Regnskovens hemmeligheder

Regnskovens hemmeligheder Center for Undervisningsmidler, afdeling København Regnskovens hemmeligheder Øvelsesvejledning Formål Et gen for et kræfthelbredende protein er blevet fundet i nogle mystiske blade i regnskoven. Forskere

Læs mere

BIOTEKNOLOGI HØJT NIVEAU

BIOTEKNOLOGI HØJT NIVEAU STUDENTEREKSAMEN 2007 2007-BT-1 BITEKNLGI HØJT NIVEAU Torsdag den 31. maj 2007 kl. 9.00 14.00 Sættet består af 1 stor og 2 små opgaver samt 1 bilag i 2 eksemplarer. Det ene eksemplar af bilaget afleveres

Læs mere

Spm. 1.: Hvis den totale koncentration af monomer betegnes med CT hvad er så sammenhængen mellem CT, [D] og [M]?

Spm. 1.: Hvis den totale koncentration af monomer betegnes med CT hvad er så sammenhængen mellem CT, [D] og [M]? DNA-smeltetemperaturbestemmelse KemiF2-2008 DNA-smeltetemperaturbestemmelse Introduktion Oligonucleotider er ofte benyttet til at holde nanopartikler sammen med hinanden. Den ene enkeltstreng er kovalent

Læs mere

Børnecancerfonden informerer HLH. Hæmofagocytisk lymfohistiocytose _HLH_Informationsbrochure.indd 1 16/05/

Børnecancerfonden informerer HLH. Hæmofagocytisk lymfohistiocytose _HLH_Informationsbrochure.indd 1 16/05/ HLH Hæmofagocytisk lymfohistiocytose 31429_HLH_Informationsbrochure.indd 1 16/05/2017 14.46 HLH Hæmofagocytisk lymfohistiocytose 31429_HLH_Informationsbrochure.indd 2 16/05/2017 14.46 3 Fra de danske børnekræftafdelinger

Læs mere

CYP7A1 (0,1 nm) CYP7A1 (0nM) UBIC (0,1 nm)

CYP7A1 (0,1 nm) CYP7A1 (0nM) UBIC (0,1 nm) Opgave 1 Leveren spiller en central rolle i lipid metabolismen og i opretholdelse af lipid homeostasen i hele kroppen. Lipidmetabolismen er fejlreguleret hos blandt andet svært overvægtige personer samt

Læs mere

Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD

Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD 1 Producent Brugsanvisning for SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD for DHPLC systemer Læs venligst denne brugsanvisning grundigt igennem, før dette produkt anvendes. Gem denne brugsanvisning til senere

Læs mere

Proteiner. Proteiner er molekyler der er opbygget af "aminosyrer",nogle er sammensat af få aminosyrer medens andre er opbygget af mange tusinde

Proteiner. Proteiner er molekyler der er opbygget af aminosyrer,nogle er sammensat af få aminosyrer medens andre er opbygget af mange tusinde Proteiner Proteiner er molekyler der er opbygget af "aminosyrer",nogle er sammensat af få aminosyrer medens andre er opbygget af mange tusinde Der findes ca. 20 aminosyrer i menneskets organisme. Nogle

Læs mere

HVAD BESTÅR BLODET AF?

HVAD BESTÅR BLODET AF? i Danmark HVAD BESTÅR BLODET AF? HVAD BESTÅR BLODET AF? Blodet er et spændende univers med forskellige bittesmå levende bestanddele med hver deres specifikke funktion. Nogle gør rent, andre er skraldemænd

Læs mere

Som substrat i forsøgene anvender vi para nitrophenylfosfat, der vha. enzymet omdannes til paranitrofenol

Som substrat i forsøgene anvender vi para nitrophenylfosfat, der vha. enzymet omdannes til paranitrofenol Enzymkinetik Introduktion I disse forsøg skal I arbejde med enzymet alkalisk fosfatase. Fosfataser er meget almindelige i levende organismer og er enzymer med relativt bred substrat specificitet. De katalyserer

Læs mere

therascreen NRAS Pyro -kit Håndbog

therascreen NRAS Pyro -kit Håndbog Marts 2015 therascreen NRAS Pyro -kit Håndbog 24 Version 1 Til in vitro-diagnostisk brug 971530 1061828DA QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, 40724 Hilden, TYSKLAND R3 1061828DA Sample & Assay Technologies

Læs mere

Hvad er så vigtigt ved målinger?

Hvad er så vigtigt ved målinger? Forskningsnyheder om Huntingtons Sygdom På hverdagssprog Skrevet af forskere. Til det globale HS-fællesskab Spændende opdagelse i blodceller fra patienter med Huntingtons Sygdom Mængden af huntingtinprotein

Læs mere

Den forebyggende undersøgelse for livmoderhalskræft

Den forebyggende undersøgelse for livmoderhalskræft Den forebyggende undersøgelse for livmoderhalskræft Alle danske kvinder mellem 23 og 65 år bliver tilbudt at deltage i forebyggende folkeundersøgelse (screening) for livmoderhalskræft. Man bliver automatisk

Læs mere

Klip-og-kopier DNA: reparér mutationer med 'genom-redigering' DNA, RNA og protein

Klip-og-kopier DNA: reparér mutationer med 'genom-redigering' DNA, RNA og protein Forskningsnyheder om Huntingtons Sygdom På hverdagssprog Skrevet af forskere. Til det globale HS-fællesskab Klip-og-kopier DNA: reparér mutationer med 'genom-redigering' Forskere kan lave præcise ændringer

Læs mere

Diagnosticering af Clostridium perfringens type C infektion i neonatale grise

Diagnosticering af Clostridium perfringens type C infektion i neonatale grise Diagnosticering af Clostridium perfringens type C infektion i neonatale grise med real-time PCR og ELISA DVHS 3. maj 2013 Speciale af cand.med.vet. Camilla Bjørn Olesen 1 De næste 25 min Baggrund Formål

Læs mere

Neonatal screeningsalgoritme for cystisk fibrose

Neonatal screeningsalgoritme for cystisk fibrose Neonatal screeningsalgoritme for cystisk fibrose Forslag til dansk screeningsalgoritme for CF 1. First tier: Alle nyfødte får målt immunoreaktiv trypsinogen (IRT) i den etablerede filterpapirblodprøve,

Læs mere

[BESØGSSERVICE INSTITUT FOR MOLEKYLÆRBIOLOGI OG GENETIK, AU]

[BESØGSSERVICE INSTITUT FOR MOLEKYLÆRBIOLOGI OG GENETIK, AU] Enzymkinetik INTRODUKTION Enzymer er biologiske katalysatorer i alle levende organismer som er essentielle for liv. Selektivt og effektivt katalyserer enzymerne kemiske reaktioner som ellers ikke ville

Læs mere

Optimering af oprensning og kvantificering af DNA template i forbindelse med cancerdiagnostik

Optimering af oprensning og kvantificering af DNA template i forbindelse med cancerdiagnostik Afgangsprojekt for Den Sundhedsfaglige Diplomuddannelse Professionspraksis Optimering af oprensning og kvantificering af DNA template i forbindelse med cancerdiagnostik Et kvalitetsudviklingsprojekt Udarbejdet

Læs mere

Forstå dine laboratorieundersøgelser. myelomatose

Forstå dine laboratorieundersøgelser. myelomatose Forstå dine laboratorieundersøgelser ved myelomatose Denne vejledning giver indblik i de målinger og undersøgelser, der udføres hos patienter med myelomatose. Resultaterne af disse målinger og undersøgelser

Læs mere

Laboratorieprotokol for manuel isolering af DNA fra 0,5 ml prøve

Laboratorieprotokol for manuel isolering af DNA fra 0,5 ml prøve Laboratorieprotokol for manuel isolering af DNA fra 0,5 ml prøve Til isolering af genomisk DNA fra indsamlingssætserierne Oragene - og ORAcollect. Du kan finde flere sprog og protokoller på vores webside

Læs mere

BIOTEKNOLOGI HØJT NIVEAU

BIOTEKNOLOGI HØJT NIVEAU STUDETEREKSAME 2006 2006-BT-2 BIOTEKOLOGI HØJT IVEAU Onsdag den 16. august 2006 kl. 9.00 14.00 Sættet består af 1 stor og 2 små opgaver. Alle hjælpemidler tilladt. STOR OPGAVE 1. Myoglobin A. Den røde

Læs mere

Opsætning af real-time PCR til analyse af generne. VKORC1 og CYP2C9. hos patienter i Marevan behandling. Kathrine Gail Andersen

Opsætning af real-time PCR til analyse af generne. VKORC1 og CYP2C9. hos patienter i Marevan behandling. Kathrine Gail Andersen Opsætning af real-time PCR til analyse af generne VKORC1 og CYP2C9 hos patienter i Kathrine Gail Andersen Professionsbachelorprojekt 2013-2014 Bioanalytikeruddannelsen, University College Sjælland Campus

Læs mere

Lær HemoCue WBC DIFF at kende

Lær HemoCue WBC DIFF at kende Lær HemoCue WBC DIFF at kende Udfordringen At foretage en klinisk vurdering, teste patienten, diagnosticere og tage beslutning om behandling i løbet af en enkelt konsultation er ofte en udfordring for

Læs mere

Akut myeloid leukæmi. LyLe, Svendborg d Stine Ulrik Mikkelsen læge, ph.d.- studerende Hæmatologisk Klinik Rigshospitalet

Akut myeloid leukæmi. LyLe, Svendborg d Stine Ulrik Mikkelsen læge, ph.d.- studerende Hæmatologisk Klinik Rigshospitalet Akut myeloid leukæmi LyLe, Svendborg d. 30.09.2017 Stine Ulrik Mikkelsen læge, ph.d.- studerende Hæmatologisk Klinik Rigshospitalet Akut lymfatisk leukæmi (ALL) ~ 60 nye tilfælde per år i DK Hyppigst hos

Læs mere

Next Generation Sequencing

Next Generation Sequencing Next Generation Sequencing For 60 år siden blev DNA opdaget. I øjeblikket afprøver vi NGS, og til sommer kører vi BRCA-gener med den nye metode I år er det 60 år siden, at DNA s struktur blev erkendt,

Læs mere

MÅLRETTET BEHANDLING AF LUNGEKRÆFT PATIENTINFORMATION OM NYESTE BEHANDLINGSMULIGHEDER

MÅLRETTET BEHANDLING AF LUNGEKRÆFT PATIENTINFORMATION OM NYESTE BEHANDLINGSMULIGHEDER MÅLRETTET BEHANDLING AF LUNGEKRÆFT PATIENTINFORMATION OM NYESTE BEHANDLINGSMULIGHEDER I løbet af det seneste årti har vi fået langt mere viden om, hvordan kræft udvikler sig. På baggrund af denne viden

Læs mere

Forskningsnyheder om Huntingtons Sygdom På hverdagssprog Skrevet af forskere. Til det globale HS-fællesskab Ofte stillede spørgsmål, januar 2011

Forskningsnyheder om Huntingtons Sygdom På hverdagssprog Skrevet af forskere. Til det globale HS-fællesskab Ofte stillede spørgsmål, januar 2011 Forskningsnyheder om Huntingtons Sygdom På hverdagssprog Skrevet af forskere. Til det globale HS-fællesskab Ofte stillede spørgsmål, januar 2011 Svar på ofte stillede spørgsmål om HD - den første i en

Læs mere

LEKTION 2_ TEKST_ BIOLUMINESCENS. Bioluminescens. Alger der lyser i mørket

LEKTION 2_ TEKST_ BIOLUMINESCENS. Bioluminescens. Alger der lyser i mørket Bioluminescens Alger der lyser i mørket Alger bruges som sagt allerede i dag til at producere værdifulde stoffer, der indgår i mange af de produkter, vi køber i supermarkeder, på apoteker og tankstationer.

Læs mere

Spm. A: Hvad viser data i Figur 1?

Spm. A: Hvad viser data i Figur 1? Opgave 1 Leptin er et plasma proteinhormon der primært produceres af og secerneres fra fedtceller (adipocytter). Leptin, der er kodet af ob (obecity) genet, er 16 kda stort. Leptins fysiologiske funktion

Læs mere

Besvarelse af opgaverne til den Spm.A: efter TGA TCA Spm. B:

Besvarelse af opgaverne til den Spm.A: efter TGA TCA Spm. B: Besvarelse af opgaverne til den 20-9-06 Spm.A: Her vil vi gerne sætte et relativt lille stykke DNA (FLAG) sammen med et relativt stort stykke (PRB1). Det lille stykke er for lille til at vi kan PCR amplificere

Læs mere

Studienummer: MeDIS Exam 2015. Husk at opgive studienummer ikke navn og cpr.nr. på alle ark, der skal medtages i bedømmelsen

Studienummer: MeDIS Exam 2015. Husk at opgive studienummer ikke navn og cpr.nr. på alle ark, der skal medtages i bedømmelsen MeDIS Exam 2015 Titel på kursus: Uddannelse: Semester: Videregående biokemi og medicinudvikling Bachelor i Medis 5. semester Eksamensdato: 26-01-2015 Tid: kl. 09.00-11.00 Bedømmelsesform 7-trin Vigtige

Læs mere

BIOLOGI A-NIVEAU NY ORDNING. Tirsdag den 19. august 2008. Kl. 09.00 14.00 STX082-BIA STUDENTEREKSAMEN AUGUST 2008

BIOLOGI A-NIVEAU NY ORDNING. Tirsdag den 19. august 2008. Kl. 09.00 14.00 STX082-BIA STUDENTEREKSAMEN AUGUST 2008 STUDENTEREKSAMEN AUGUST 2008 BIOLOGI A-NIVEAU Tirsdag den 19. august 2008 NY ORDNING Kl. 09.00 14.00 Af opgaverne 1, 2, 3 og 4 skal tre og kun tre af opgaverne besvares STX082-BIA Undervisningsministeriet

Læs mere

Akut leukæmi. LyLe, København d Stine Ulrik Mikkelsen læge, ph.d.-studerende Hæmatologisk Klinik Rigshospitalet

Akut leukæmi. LyLe, København d Stine Ulrik Mikkelsen læge, ph.d.-studerende Hæmatologisk Klinik Rigshospitalet Akut leukæmi LyLe, København d. 29.09.2018 Stine Ulrik Mikkelsen læge, ph.d.-studerende Hæmatologisk Klinik Rigshospitalet Sygehistorie 51-årig tidligere rask kvinde. Kun indlagt ved fødsler Højfebril,

Læs mere

Kemiøvelse 2 C2.1. Puffere. Øvelsens pædagogiske rammer

Kemiøvelse 2 C2.1. Puffere. Øvelsens pædagogiske rammer Kemiøvelse 2 C2.1 Puffere Øvelsens pædagogiske rammer Sammenhæng Denne øvelse er tilpasset kemiundervisningen på modul 3 ved bioanalytikeruddannelsen. Kemiundervisningen i dette modul indeholder blandt

Læs mere

Dette er en kladde til et genoptryk af Eksperimentel Genteknologi fra 1991. Ideer, rettelser og forslag modtages gerne. Kh Claudia.

Dette er en kladde til et genoptryk af Eksperimentel Genteknologi fra 1991. Ideer, rettelser og forslag modtages gerne. Kh Claudia. Transformation af E.coli K 12 Version 3. marts 2009 (C) Claudia Girnth-Diamba og Bjørn Fahnøe Dette er en kladde til et genoptryk af Eksperimentel Genteknologi fra 1991. Ideer, rettelser og forslag modtages

Læs mere

Betændelse i ryggens knogler

Betændelse i ryggens knogler Patientinformation Betændelse i ryggens knogler Infektionsmedicinsk Afdeling Q Denne pjece er til dig, som har fået påvist betændelse i en knogle i ryggen - eller som er ved at få undersøgt, om du har

Læs mere

Testet i udlandet. Oversigt af udenlandske analyser rekvireret fra Færøerne i 2013 11-11-2013. Forfatter: Janus Vang, Ph.D.

Testet i udlandet. Oversigt af udenlandske analyser rekvireret fra Færøerne i 2013 11-11-2013. Forfatter: Janus Vang, Ph.D. 11-11-2013 Testet i udlandet Oversigt af udenlandske analyser rekvireret fra Færøerne i 2013 Forfatter: Janus Vang, Ph.D. ANSVARLIG: REGIN W. DALSGAARD, BESTYRELSESFORMAND FOR VINNUFRAMI INTRODUKTION Færøernes

Læs mere

[BESØGSSERVICE INSTITUT FOR MOLEKYLÆRBIOLOGI OG GENETIK, AU]

[BESØGSSERVICE INSTITUT FOR MOLEKYLÆRBIOLOGI OG GENETIK, AU] Enzymkinetik INTRODUKTION Enzymer er biologiske katalysatorer i alle levende organismer som er essentielle for liv. Selektivt og effektivt katalyserer enzymerne kemiske reaktioner som ellers ikke ville

Læs mere

Modul 3: Sandsynlighedsregning

Modul 3: Sandsynlighedsregning Forskningsenheden for Statistik ST01: Elementær Statistik Bent Jørgensen Modul 3: Sandsynlighedsregning 3.1 Sandsynligheder................................... 1 3.2 Tilfældig udtrækning fra en mængde........................

Læs mere

Title Mevalonat Kinase Defekt (MKD) (eller HYper IgD syndrome)

Title Mevalonat Kinase Defekt (MKD) (eller HYper IgD syndrome) www.printo.it/pediatric-rheumatology/dk/intro Title Mevalonat Kinase Defekt (MKD) (eller HYper IgD syndrome) Version af 2016 1. HVAD ER MKD 1.1 Hvad er det? Mevalonat kinase mangel er en genetisk sygdom.

Læs mere

langerhans celle histiocytose i Børnecancerfonden informerer

langerhans celle histiocytose i Børnecancerfonden informerer langerhans celle histiocytose i langerhans celle histiocytose 3 Fra de danske børnekræftafdelinger i Aalborg, Århus, Odense og Rigshospitalet, September 2004. Biologi Langerhans cellerne spiller den centrale

Læs mere

Lynvejledning til GIST RapidScreen Pyro Plug-in

Lynvejledning til GIST RapidScreen Pyro Plug-in Lynvejledning til GIST RapidScreen Pyro Plug-in Februar 2017 Til installation og anvendelse med PyroMark Q24-instrumenter og PyroMark Q24- softwareversion 2.0 Sample to Insight Om GIST RapidScreen Pyro

Læs mere

Myelodysplastisk syndrom

Myelodysplastisk syndrom Myelodysplastisk syndrom Forskning og fremtidig MDS Foundation & LyLe København, d. 11. maj 2019 Stine Ulrik Mikkelsen Læge, ph.d.-studerende Hæmatologisk Klinik / Epigenom Laboratoriet Rigshospitalet

Læs mere

Matematiske modeller Forsøg 1

Matematiske modeller Forsøg 1 Matematiske modeller Forsøg 1 At måle absorbansen af forskellige koncentrationer af brilliant blue og derefter lave en standardkurve. 2 ml pipette 50 og 100 ml målekolber Kuvetter Engangspipetter Stamopløsning

Læs mere

Familiær middelhavsfeber

Familiær middelhavsfeber www.printo.it/pediatric-rheumatology/dk/intro Familiær middelhavsfeber Version af 2016 2. DIAGNOSE OG BEHANDLING 2.1 Hvordan diagnosticeres det? Overordnet set anvendes følgende tilgang: Klinisk mistanke:

Læs mere