/11 1. FORMÅL

Transkript

1 PLATELIA LYME IgG 1 plade KVALITATIV PÅVISNING AF IgG-ANTISTOFFER MOD BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO I HUMANT SERUM, PLASMA ELLER CEREBROSPINALVÆSKE VED ENZYMIMMUNANALYSE /11 1. FORMÅL Platelia Lyme IgG er en indirekte ELISA-immunanalyse til kvalitativ påvisning af IgG-antistoffer mod Borrelia burgdorferi sensu lato i humant serum, plasma eller cerebrospinalvæske (CSF). 2. KLINISK VÆRDI Lyme-borreliose (eller Lyme-sygdom) er en ikke-smittefarlig infektion, forårsaget af en bakterie fra spirochetaceae-familien, Borrelia burgdorferi, som overføres af flåter af slægten Ixodes (2). Forskellige dyr fungerer som vært for bakterierne, og overførsel til mennesker sker via bid fra inficerede flåter. Overførselsrisikoen er større, jo længere flåtens bid varer. Prævalensen af Lyme-sygdom er høj i lande med tempereret og koldt klima på den nordlige halvkugle fra Kina til Nordamerika og fra Skandinavien til Nordafrika. Det anslås, at der er ca tilfælde årligt i USA (3) og sandsynligvis mere end i Europa, hvor der findes en positiv gradient fra vest mod øst (4). Det er nu klar påvist, at Borrelia burgdorferi, der er beskrevet i 1984 som en unik bakterieart, i virkeligheden er et kompleks af adskillige arter, hvoraf fem er patogene for mennesker: Borrelia burgdorferi sensu stricto (ss), Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia spielmanii og Borrelia bavariensis (7,8). To andre arter er potentielt patogene: Borrelia valaisiana og Borrelia lusitaniae. Disse syv arter findes i Europa, mens kun B. burgdorferi sensu stricto er til stede i USA. De kliniske symptomer på Lyme-sygdom er meget forskellige og sommetider svære at erkende (6). Der kan skelnes mellem 3 stadier i den kliniske udvikling af sygdommen. Det tidlige stadium (stadium I) kan være asymptomatisk og er karakteriseret ved et influenza-lignende syndrom. I 50 til 80 % af tilfældene opstår der flere dage eller uger efter flåtbidet et karakteristisk lokalt hududslæt med centrifugal udbredelse kaldet erythema migrans (EM). Uden behandling vil hæmatogen spredning af Borrelia flere uger senere fremkalde inflammatorisk artrit, neurologiske eller meningeale sygdomme samt kutane eller kardielle symptomer (stadium II). Efter adskillige måneder eller år kan sygdommen udvikle sig til et kronisk stadium med forskellige niveauer af acrodermatitis chronica atrophicans, encefalopati, encefalomyelit og kronisk artrit (stadium III) (1). Hver art af Borrelia burgdorferi har specifik tropisme. Erythema migrans i stadium I er associeret med alle tre arter. Neurologiske komplikationer er imidlertid oftere associeret med B. garinii og artrit med B. burgdorferi ss, mens acrodermatitis chronica atrophicans er specifik for B. afzelii. Diagnosen Lyme-sygdom må ikke bekræftes uden omhyggelig undersøgelse af patientens generelle anamnese, kliniske og biologiske kriterier samt vurdering af sandsynligheden for patienteksponering for bid af flåter. Da direkte påvisning, dyrkningsisolation eller anvendelse af molekylærbiologiske metoder er vanskelig, forbliver serologi et hovedelement i biologisk udredning af Lyme-sygdom (1,5,9). IgM-antistoffer mod Borrelia burgdorferi dukker op ca. 3 til 6 uger efter smitte og kan vare ved gennem sygdommens udvikling. IgG-antistoffer viser sig senere og topper først efter måneder eller år. Selvom serologi er mindre anvendeligt i det tidlige stadium, er det essentielt i andet og tredje stadium - især ved fravær af erythema migrans. Hvis serologien er negativ på trods af mistænkelig klinisk status, skal der udføres en ny serologisk test 3 uger efter den første test. Tilstedeværelse af specifikke IgM-antistoffer er ikke synonymt med nylig infektion. På samme måde er tilstedeværelse af specifikke IgG-antistoffer ikke altid tegn på tidligere infektion. Desuden er bestemmelse af det intratekale synteseindeks for anti-borrelia burgdorferi sensu lato specifikke IgG-antistoffer en hjælp til diagnosestilling ved mistanke om Lyme-neuroborreliose (10, 11, 12). Antigenerne og antistofferne i Platelia Lyme IgG (ref )- og Platelia Lyme IgM (ref )-analyserne er blevet udvalgt for at muliggøre påvisning af hhv. specifikke IgG-antistoffer og specifikke IgM-antistoffer mod de forskellige amerikanske og europæiske stammer af Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi ss, B. garinii, B. azfelii). 3. PRINCIP Platelia Lyme IgG er en kvalitativ test til påvisning af IgG-antistoffer mod Borrelia burgdorferi sensu lato i humant serum, plasma eller CSF ved hjælp af en indirekte ELISA-enzymimmunmetode. Den fasta fasen (mikroplattans brunnar) bestryks med antihumana µ-kedjeantikroppar. En blandning av nativt Borrelia-antigen och monoklonal antikropp mot flagellärt Borrelia-antigen märkt med peroxidas används som konjugat. Testet består av följande steg: Trin 1 Patientprøver (serum eller plasma) og kontroller fortyndes 1:101. CSF-prøver fortyndes 1:2. De fortyndede prøver fordeles derefter i brøndene i mikropladen. Der inkuberes i 1 time ved 37 C, hvorunder IgG-antistofferne mod Borrelia burgdorferi i prøven binder sig til belægningen med Borrelia-antigen i mikropladebrøndene. Efter inkubation fjernes ubundne nonspecifikke antistoffer og andre serumproteiner ved vask. 1

2 Trin 2 Konjugatet (peroxydasemærket, monoklonalt antistof, der er specifikt for humane gammakæder) tilsættes i mikropladebrøndene. Der inkuberes i 1 time ved 37 C, hvorunder det mærkede monoklonale antistof binder sig til det serum- IgG, der er fastholdt af Borrelia-antigenet. Efter endt inkubation fjernes det ubundne konjugat ved vask. Trin 3 Tilstedeværelsen af immunkomplekser (Borrelia-antigen, IgG-antistoffer mod Borrelia burgdorferi, anti-igg-konjugat) påvises ved tilsætning af et farveudviklende enzymsubstrat i hver brønd. Trin 4 Efter inkubation ved stuetemperatur ( C) standses enzymreaktionen ved tilsætning af 1N-svovlsyreopløsning. Den aflæsning af optisk densitet, der opnås med et spektrofotometer indstillet til 450/620 nm, er proportional med mængden af IgGantistoffer mod Borrelia burgdorferi i prøven. 4. PRODUKTOPLYSNINGER De leverede reagensmængder er afpasset, så de muliggør 96 test i maks. 6 kørsler. Alle reagenser er udelukkende beregnet til in vitro-diagnosticering. Mærkning Reagenstype Præsentation R1 Microplate Mikroplade (brugsklar) 12 strimler med 8 aftagelige brønde, som er coatet med inaktiveret Borrelia-antigen R2 Concentrated Washing Solution (20x) Koncentreret vaskeopløsning (20x) Tampon TRIS-NaCl (ph 7,4), 2 % Tween 20 Konserveringsmiddel: 0,04 % ProClin 300 R3 Negative Control Negativ kontrol Humant serum negativt for IgG-antistoffer mod Borrelia burgdorferi og negativt for HBs-antigen, anti-hiv1, anti-hiv2 og anti-hcv Konserveringsmiddel: 0,15 % ProClin 300 R4 Cut-off Control Cut-off-kontrol Humant serum reaktivt for IgG-antistoffer mod Borrelia burgdorferi og negativt for HBs-antigen, anti-hiv1, anti-hiv2 og anti-hcv Konserveringsmiddel: 0,15 % ProClin 300 R5 Positive Control Positiv kontrol Humant serum reaktivt for IgG-antistoffer mod Borrelia burgdorferi og negativt for HBs-antigen, anti-hiv1, anti-hiv2 og anti-hcv Konserveringsmiddel: 0,15 % % ProClin 300 R6 Conjugate (51x) Konjugat (51x) Murint, monoklonalt antistof mod humane gammakæder koblet til peroxydase fra peberrod Konserveringsmiddel: 0,16 % ProClin 300 R7 Diluent Fortynder til prøver og konjugat (brugsklart) Tris-NaCl (ph 7,7), serum fra kalvefostre, 0,1 % Tween 20 og fenolrød Konserveringsmiddel: 0,15 % ProClin 300 R9 Chromogen TMB Kromogen (brugsklar) tetramethylbenzidin (< 0,1 %), H 2O 2 (<1 %) R10 Stopping Solution Stopopløsning (brugsklar) 1N-svovlsyreopløsning 1 1 x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,7 ml 2 x 65 ml 1 x 28 ml 1 x 28 ml Opbevaringsbetingelser og udløbsdato fremgår af æsken. 5. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Resultaternes pålidelighed afhænger af korrekt implementering af følgende regler for god laboratoriepraksis: Brug ikke reagenser efter udløbsdatoen. Undgå sammenblanding eller nogen form for forbindelse mellem reagenser fra forskellige partier i samme kørsel. BEMÆRK: Det gælder for vaskeopløsning (R2, etiketidentifikation: 20x, grønfarvet), kromogen (R9, etiketidentifikation: TMB, turkisfarvet) og stopopløsning (R10, etiketidentifikation: 1N, rød), at det er muligt at anvende andre partier end dem i dette sæt under forudsætning af, at reagenserne er fuldstændig tilsvarende, og at samme parti anvendes i hele kørslen. 2

3 Vent 30 minutter før brug, så reagenserne kan stabilisere sig ved stuetemperatur ( C). Rekonstituér eller fortynd reagenserne forsigtigt for at undgå kontaminering. Undgå at udføre testen i nærheden af reaktive dampe (syre, alkaliske dampe og aldehyddampe) eller støv, der kan påvirke konjugatets enzymaktivitet. Benyt engangsmateriale, eller hvis dette ikke er muligt, udstyr af glas, som er vasket grundigt og skyllet med deioniseret vand. Grundig vask af mikropladen er et afgørende trin i proceduren: Udfør det anbefalede antal vaske, og sørg for, at alle brønde bliver helt fyldt og derefter helt tømt. Ukorrekt vask kan føre til unøjagtige resultater. Undgå, at mikropladen bliver tør mellem vaskene og fordelingen af reagenserne. Benyt aldrig den samme beholder til at fordele konjugatet og enzymsubstratet. Enzymreaktionen er meget følsom over for metaller eller metalioner. Undgå derfor, at metalelementer kommer i berøring med de forskellige opløsninger med konjugat eller kromogen. Kromogenopløsningen (R9) bør være farveløs. Hvis farven bliver blå, kan reagenset ikke anvendes og skal udskiftes. Anvend en ny pipettespids til hver prøve. Kontrollér, at pipetterne og andet udstyr er i orden og fungerer korrekt. Sundheds- og sikkerhedsmæssige forholdsregler Materiale af human oprindelse, der er brugt til forberedelse af reagenser, er blevet testet og fundet ikke-reaktivt over for hepatitis B-overfladeantigen (HBsAg), antistoffer mod hepatitis C-virus (anti-hcv) samt antistoffer mod HIV 1 og HIV 2. Eftersom ingen metode kan give fuld garanti for fravær af smitsomme stoffer, skal reagenser af human oprindelse og patientprøver håndteres som potentielt smittefarlige. Alt materiale, herunder vaskeopløsninger, der kommer i direkte kontakt med prøver og reagenser, som indeholder materiale af human oprindelse, skal betragtes som potentielt smittefarligt. Brug engangshandsker ved håndtering af prøver og reagenser. Undlad at pipettere med munden. Undgå at spilde prøver eller opløsninger, der indeholder prøve. Spildte materialer skal skylles af med blegemiddel i en opløsning på 10 %. Ved spild af syre skal syren først neutraliseres med natriumbikarbonat. Derefter skal der foretages rengøring med blegemiddel i en 10 %-opløsning og aftørring med sugende papir. Det materiale, der anvendes til rengøringen, skal bortskaffes i en beholder til kontamineret affald. Patientprøver, reagenser med materiale af human oprindelse samt kontaminerede materialer og produkter skal dekontamineres før bortskaffelse: - enten ved nedsænkning i blegemiddel med en endelig koncentration på 5 % natriumhypoklorit i 30 minutter - eller ved autoklavering ved 121 C i mindst to timer. ADVARSEL: Benyt ikke opløsninger, der indeholder natriumhypoklorit, i autoklaven. Undgå, at hud og slimhinder kommer i kontakt med kromogen og stopopløsning (fare for forgiftning, irritation eller forbrændinger). Kemiske og biologiske rester skal håndteres og bortskaffes i henhold til god laboratoriepraksis. Alle reagenser i sættet er udelukkende beregnet til in vitro-diagnosticering. Se piktogrammet(merne), som er angivet på mærkaterne, og informationerne sidst i brugsanvisningen i forbindelse med farer og forholdsregler for kemiske komponenter i dette testsæt. Sikkerhedsdatabladet kan findes på 6. PRØVETAGNING, FORBEREDELSE OG OPBEVARING 1. Serum, plasma (EDTA, heparin eller citrat) og CSF anbefales som prøvetyper. 2. Bemærk følgende anbefalinger for håndtering, behandling og opbevaring af blodprøver: Tag alle blodprøver under overholdelse af de generelle forholdsregler vedrørende venepunktur. Lad serumprøver koagulere fuldstændigt, før de centrifugeres. Sørg for, at glassene altid holdes lukkede. Adskil serummet eller plasmaet fra koaglet eller de røde blodlegemer i et tæt tillukket opbevaringsglas efter centrifugeringen. Prøverne kan opbevares ved +2-8 C, hvis testen udføres inden for 7 dage. Hvis testen ikke udføres inden for 7 dage, eller hvis prøverne skal transporteres, skal de nedfryses til mindst -20 C. Prøver, der har været optøet mere end fem gange, må ikke anvendes. Tidligere nedfrosne prøver bør omrøres grundigt (Vortex) efter optøning, før testen udføres. 3. Serum- eller plasmaprøver, der indeholder op til 90 g/l albumin eller 100 mg/l ukonjugeret bilirubin, lipæmiske prøver, der indeholder, hvad der svarer til 36 g/l triolein (triglycerid), og hæmolyserede prøver, der indeholder op til 10 g/l hæmoglobin, påvirker ikke resultaterne. 4. Prøverne må ikke opvarmes. 3

4 5. En IgG intratekal syntese påvises ved anvendelse af CSF-prøver, indsamlet ved lumbalpunktur, samtidig med serum eller plasma. Bemærk de anbefalinger, der normalt gælder for CSF-prøver. Det er især vigtigt, at der ikke anvendes problematiske prøver med heterogent aspekt (i så fald er det bedre at anvende supernatanten efter centrifugering) eller stærkt hæmolyserede prøver. CSF skal testes umiddelbart efter udtagning. Prøven kan opbevares ved 4-8 C (kortvarigt) eller ved -20 C (længerevarigt), hvis det er nødvendigt at opbevare den til undersøgelse på et senere tidspunkt (11). Bemærk: CSF-prøvers stabilitet ved 4-8 C eller -20 C, efter gentagne nedfrysninger og optøninger eller ved tilstedeværelse af interfererende komponenter angivet i punkt 3 ovenfor, er ikke undersøgt. 7. ANALYSEPROCEDURE 7.1 Påkrævede materialer, der ikke medfølger Vortex-mixer. Mikropladelæser med filtre på 450 nm og 620 nm (*). Mikropladeinkubator termostatindstillet til 37±1 C (*). Automatisk, halvautomatisk eller manuel mikropladevasker (*). Sterilt destilleret eller deioniseret vand. Engangshandsker. Beskyttelsesbriller. Sugende papir. Automatiske eller halvautomatiske, justerbare eller forudindstillede pipetter eller multipipetter til udmåling og dispensering af µl samt 1, 2 og 10 ml. Måleglas med en volumen på 25 ml, 50 ml, 100 ml og 1000 ml. Natriumhypoklorit (blegemiddel) og natriumbikarbonat. Beholder til biologisk farligt affald. Engangsreagensglas. * Kontakt vores tekniske afdeling for at få detaljerede oplysninger om det anbefalede udstyr. 7.2 Rekonstituering af reagenser R1: Lad mikropladen henstå ved stuetemperatur i 30 minutter ( C), før posen åbnes. Tag transportbakken ud, læg straks ubrugte teststrimler tilbage i posen, og kontrollér, at posen indeholder tørremiddel. Forsegl posen omhyggeligt, og opbevar den ved +2 8 C. R2: Fortynd vaskeopløsningen R2 i destilleret vand i forholdet 1:20, fx 50 ml R2 og 950 ml destilleret vand, for at få den brugsklare vaskeopløsning. Klargør 350 ml fortyndet vaskeopløsning til én plade med 12 strimler, hvis der foretages manuel vask. R3, R4, R5: Fortynd reagenserne i forholdet 1:101 med fortynderen R7 (fx 10 µl R3 + 1 ml R7). R6+R7: Konjugatet (R6) er koncentreret 51x og skal homogeniseres før anvendelse. Fortynd konjugatet med fortynderen R7 i forholdet 1:51. Til én plade fortyndes 0,5 ml konjugat (R6) med 25 ml fortynder (R7). Del disse mængder i 5 for at få den volumen, der er påkrævet til 2 strimler. 7.3 Opbevaring og validitet af åbne og/eller rekonstituerede reagenser Sættet skal opbevares ved +2-8 C. Hvis opbevaring sker ved +2-8 C før åbning, kan hver komponent anvendes frem til udløbsdatoen, der fremgår af yderetiketten på sættet. R1: Efter åbning er strimlerne stabile i op til 1 måned, hvis de opbevares ved +2-8 C i den samme omhyggeligt lukkede pose (kontrollér, at posen indeholder tørremiddel). R2: Efter fortynding kan vaskeopløsningen gemmes i 2 uger ved C. Når den koncentrerede vaskeopløsning opbevares ved C, er den stabil indtil udløbsdatoen på etiketten, forudsat at der ikke forekommer kontamination. R3, R4, R5, R6, R7: Efter åbning og uden kontamination er reagenserne stabile i op til 1 måned ved opbevaring ved +2-8 C. R6+R7: Efter rekonstituering er konjugat-arbejdsopløsningen stabil i 8 timer ved stuetemperatur ( C) eller i 24 timer ved +2 8 C. R9: Efter åbning og uden kontamination er reagenset stabilt i op til 2 måneder ved opbevaring ved +2-8 C. R10: Efter åbning og uden kontamination er reagenset stabilt indtil udløbsdatoen på etiketten ved opbevaring ved +2-8 C. 7.4 Procedure for serum- eller plasmaprøver Følg analyseproceduren og reglerne for god laboratoriepraksis nøje. Lad reagenserne stabilisere sig ved stuetemperatur ( C), før de anvendes. Benyt negative og positive kontroller samt cut-off-kontroller ved hver kørsel for at validere analyseresultaterne. 1. Opret en præcis fordelings- og identifikationsplan for kontroller og patientprøver. 2. Forbered den fortyndede vaskeopløsning (R2) (se afsnit 7.2). 3. Tag transportbakken og strimlerne (R1) ud af beskyttelsesposen (se afsnit 7.2). 4. Fortynd kontrollerne R3, R4, R5 og patientprøverne (S1, S2 ) med fortynder (R7) i forholdet 1:101: 10 µl prøve og 1,0 ml fortynder (R7). Bland de fortyndede prøver i Vortex-mixeren. 5. Følg den nedenfor angivne rækkefølge nøje, og tilfør hver brønd 200 µl fortyndet kontrol og patientprøve: 4

5 A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 6. Dæk mikropladen med selvklæbende pladeforsegling, som presses fast ned mod pladen, så den slutter helt til overalt. Inkubér straks mikropladen i et termostatkontrolleret vandbad eller et varmeskab ved 37 ± 1 C i 1 time ± 5 minutter. 7. Fjern den selvklæbende pladeforsegling efter første inkubationsperiode. Sug indholdet af alle brønde op i en beholder til biologisk farligt affald (en beholder med natriumhypoklorit). Vask mikropladen 4 gange med 350 µl vaskeopløsning (R2). Vend mikropladen på hovedet, og dup den forsigtigt mod sugepapiret for at fjerne resterende væske. 8. Forbered konjugat-arbejdsopløsningen (R6+R7) (se afsnit 7.2). Fordel straks 200 μl konjugat-arbejdsopløsning (R6+R7) i alle brøndene. Opløsningen skal rystes forsigtigt før brug. 9. Dæk mikropladen med selvklæbende pladeforsegling, som presses fast ned mod pladen, så den slutter helt til overalt. Inkubér straks mikropladen i et termostatkontrolleret vandbad eller et varmeskab ved 37 ± 1 C i 1 time ± 5 minutter. 10. Fjern den selvklæbende pladeforsegling efter anden inkubationsperiode. Sug indholdet af alle brønde op i en beholder til biologisk farligt affald (en beholder med natriumhypoklorit). Vask mikropladen 4 gange med 350 µl vaskeopløsning (R2). Vend mikropladen på hovedet, og dup den forsigtigt mod sugepapiret for at fjerne resterende væske. 11. Fordel hurtigt og i mørke 200 µl kromogenopløsning (R9) i hver brønd. Lad reaktionen foregå i mørke i 30 ± 5 minutter ved stuetemperatur ( C). Benyt ikke selvklæbende pladeforsegling til denne inkubation. 12. Stands enzymreaktionen ved at tilsætte 100 µl stopopløsning (R10) i hver brønd. Benyt samme rækkefølge og fordelingshastighed som for enzymsubstratet. 13. Tør undersiden af pladen omhyggeligt af. Aflæs den optiske densitet ved 450/620 nm ved hjælp af en mikropladelæser inden for 30 minutter efter standsning af reaktionen. Strimlerne skal opbevares i mørke før aflæsning. 14. Kontrollér, at der er overensstemmelse mellem aflæsningen, fordelingsplanen for pladen og prøverne, før resultaterne rapporteres. 7.5 Procedure for cerebrospinalvæskeprøver Bemærk: Bestemmelsen af den intratekale syntese for anti-lyme IgG-antistoffer er baseret på anvendelse af Reibers formel. På samme tidspunkt udtages der parrede prøver af serum/plasma og CSF for hver enkelt patient, hvor der er mistanke om Lyme-neuroborreliose. Begge prøver testes i samme kørsel. Fortynd CSF-prøverne i fortynder (R7) i forholdet 1:2: 150 µl CSF-prøve og 150 µl fortynder (R7). Følg den ovenfor angivne protokol for serum- eller plasmaprøver nøje undtagen ved fortynding af CSF-prøver. 8 BEREGNING OG FORTOLKNING AF RESULTATER 8.1 Beregning af cut-off-værdi (CO) Cut-off-værdien (CO) svarer til middelværdien af de optiske densiteter (OD) for de to cut-off-kontrolreplikater (R4): CO = gennemsnit af OD for R Beregning af prøveforhold (serum eller plasma) Prøveresultatet udtrykkes i forhold ved brug af følgende formel: Prøveforhold = Prøves OD/CO 8.3 Kvalitetskontrol Medtag alle kontrollerne for hver mikroplade og for hver kørsel, og analysér de opnåede resultater. Nedenstående kriterier skal opfyldes ved validering af analysen: Værdier for optisk densitet: - CO > 0,200-0,80 x CO < OD R4 replikat 1 < 1,20 x CO - 0,80 x CO < OD R4 replikat 2 < 1,20 x CO (Den enkelte OD for hvert replikat af cut-off-kontrollen (R4) må ikke afvige mere end 20 % fra OD-værdien). Optisk densitetsforhold: - Forhold R3 (OD R3 / CO) < 0,5 - Forhold R5 (OD R5 / CO) > 2,0 Hvis kriterierne for kvalitetskontrollen ikke er opfyldt, skal testkørslen gentages. 5

6 8.4 Fortolkning af resultater (serum eller plasma) Prøveforhold Resultat Fortolkning Forhold < 0,80 Negativ 0,80 forhold < 1,2 Tvivlsom Forhold 1,2 Positiv Prøven betragtes som ikke-reaktiv for tilstedeværelse af IgGantistoffer mod Borrelia burgdorferi sensu lato. Prøven betragtes som tvivlsom for tilstedeværelse af IgGantistoffer mod Borrelia burgdorferi sensu lato. Resultatet skal bekræftes ved ny test af en anden prøve udtaget mindst 3 uger efter den første. Prøven betragtes som positiv for tilstedeværelse af IgGantistoffer mod Borrelia burgdorferi sensu lato. Hvis der er mistanke om infektion, kan supplerende serologiske test, som fx påvisning af IgM anti-borrelia-antistoffer, være nyttige til at bekræfte diagnosen. Hvis serologien er positiv eller tvivlsom, anbefales det, at prøven testes med en bekræftelsesmetode som fx Western-blot (9). 8.5 Beregning til bestemmelse af intratekal syntese Den intratekale syntese bestemmes ved at beregne IgG-antistofindekset (AI IgG) ved hjælp af Reibers formel (10, 11, 12). Bestem de respektive OD-værdier for hver parret serum- og CSF-prøve (OD IgG Serum, OD IgG CSF), og kontroller, at værdierne ligger mellem 0,000 og 3,000. ADVARSEL: Hvis Serum OD (OD IgG Serum) eller CSF OD (OD IgG CSF) ikke ligger inden for det ovennævnte OD-område, skal prøven testes igen med en større fortynding af prøven i R7-fortynderen, der følger med sættet. Efter fortynding skal prøvens OD ligge mellem 0,000 og 3,000. Bemærk i så fald fortyndingsfaktoren, der skal anvendes til beregning af indekset for intratekal IgG-syntese (se nedenfor). Bestem følgende data for hver testet serum: Albumin (g/l) = Albumin Serum Total IgG (g/l) = Total IgG Serum Bestem følgende data for hver testet CSF: Albumin (mg/l) = Albumin CSF Total IgG (mg/l) = Total IgG CSF Beregn de forskellige kvotienter ved hjælp af formlerne herunder: Q Alb = Albumin CSF / [Albumin Serum x 1000] Q lim(igg) = 0,93 x [Q Alb 2 + (6 x 10-6 )] 1/2 1,7 x 10-3 Q IgG = Total IgG CSF / [Total IgG Serum x 1000] Q Spec(IgG) = OD IgG CSF / [OD IgG Serum x 50,5] ADVARSEL: Hvis CSF- og serumprøverne f.eks. er fortyndet hhv. 1:5 og 1:10, for at værdierne skal ligge mellem ODintervallet 0,000-3,000, skal CSF-OD (OD IgG CSF) ganges med 5, og serum-od (OD IgG Serum) ganges med 10, inden beregningsformlen Q Spec(IgG) anvendes. Bestem IgG-antistofindekset (AI IgG) ved hjælp af en af de to formler herunder: AI IgG = Q Spec(IgG) / Q IgG [hvis Q IgG < Q lim(igg)] Eller AI IgG = Q Spec(IgG) / Q lim(igg) [hvis Q IgG > Q lim(igg)] 8.6 Fortolkning af antistofindekset (AI IgG) med henblik på bestemmelse af intratekal syntese Reibers formel til bestemmelse af IgG-antistofindeks gælder ikke i følgende situationer: CSF-prøveforhold < 0,50 (*) CSF-prøveforhold 0,50 men med serum/plasma-forhold < 0,50 (*) (*) Forhold = OD / middel R4 6

7 CSF-resultaterne skal fortolkes i henhold til algoritmen herunder: Bestem CSF-forhold CSF-forhold < 0,50 CSF-forhold 0,50 CSF IgG negativ Bestem serumforhold Serumforhold < 0,50 Serumforhold 0,50 CSF-forhold < 0,80 CSF-forhold 0,80 Reibers formel CSF-resultatet må ikke fortolkes CSF IgG positiv Fortolkning af IgG-antistofindeks Algoritme til bestemmelse af IgG-antistofindeks ved hjælp af Platelia Lyme IgG-sættet Den intratekale IgG-syntese er bekræftet, når IgG-antistofindekset er højere end 1,30. Der er ingen intratekal IgG-syntese, når IgG-antistofindekset er højere end 0,70 men lavere eller lig med 1,30. Resultatet bør ikke anses som gyldigt, når IgGantistofindekset er lavere end eller lig med 0,70 (procedurefejl, serum og CSF ikke udtaget på samme dag, CSF-kontaminering osv ). Fortolkning af AI IgG Positiv AI IgG > 1,30 Negativ 0,70 < AI IgG 1,30 Ugyldigt resultat AI IgG 0, Hjælp til fejlfinding Reaktioner, der ikke kan valideres eller gentages, skyldes ofte: Utilstrækkelig vask af mikroplader. Kontamination af negative prøver med serum eller plasma med en høj antistoftiter. Kontamination af enzymsubstratet med kemiske oxidationsmidler (blegemiddel, metalioner osv.) Kontamination af stopopløsning. 8.8 Eksempel på beregning (serum eller plasma) Bemærk: Følgende data er angivet som eksempel og må ikke bruges i stedet for egne resultater. Kontroller og patientprøver OD (450/620 nm) Forhold Resultat R3 0,144 0,29 Negativ R4 0,502 / / R4 0,498 / / R5 1,440 2,88 Positiv Prøve 1 1,650 3,30 Positiv Prøve 2 osv. 0,120 0,24 Negativ 7

8 Cut-off-værdi: - CO = (0,502+0,498)/2 = 0,500 Værdier for optisk densitet: - OD CO = 0,500 (N > 0,200) - OD R4 replikat 1 = 0,502 (0,80 x OD CO < OD R4 replikat 1 < 1,20 x OD CO) - OD R4 replikat 2 = 0,498 (0,80 x OD CO < OD R4 replikat 2 < 1,20 x OD CO) Optisk densitetsforhold: - Forhold R3 = 0,29 (N < 0,5) - Forhold R5 = 2,88 (N > 2,0) Kvalitetskontrol: Godkendt 9 YDEEVNE 9.1 Prævalens Prævalensbestemmelse af IgG-antistoffer mod Borrelia burgdorferi sensu lato i humant serum blev udført vha. et panel på 295 prøver indhentet fra bloddonorer fra den nordlige del af Frankrig. Følgende resultater blev opnået: 291 negative, 1 tvivlsom og 3 positive sera. Prævalensen er vha. Platelia Lyme IgG-analysen fastlagt til 1,02 % (3/295). 9.2 Specificitet Specificitet i ikke-endemisk område Specificiteten blev estimeret på et panel af 279 sera indhentet fra sunde bloddonorer, der er bosat i et ikke-endemisk område i den nordlige del af Frankrig. Prøverne blev valgt ud fra negative resultater opnået vha. en kommercielt tilgængelig EIA-analyse, der blev anvendt i Europa (CE-mærket) og anses som reference Specificitet i endemisk område Specificiteten blev ligeledes bestemt ud fra et panel af 193 sera indhentet fra sunde bloddonorer bosat i et endemisk område i den østlige del af Frankrig. Ingen af disse donorer udviste kriterier med relation til Lyme-sygdom (ingen kliniske symptomer på borreliose eller flåtbid i anamnesen). Prøverne blev valgt ud fra negative resultater opnået vha. en kommercielt tilgængelig EIAanalyse, der blev anvendt i Europa (CE-mærket) og anses som reference. De opnåede resultater vises i følgende tabel: Panel af sera Negativ Tvivlsom (1) Positiv (2) Specificitet Ikke-endemisk område (n=279) Endemisk område (n=193) (278/278) [98,9 %-] 99,5 % (190/191) [97,1 %-99,9 %] (1) Tvivlsomme resultater blev ekskluderet ved specificitetsberegning. (2) Den positive prøve fundet ved Platelia Lyme IgG-analysen var negativ ved Western blot. IC 95 %: 95 % konfidensinterval. 8

9 9.3 Sensitivitet Sensitiviteten for Platelia Lyme IgG-analysen blev beregnet og inkluderet i sensitivitetsresultater fra Platelia Lyme IgManalysen (Ref ) på et panel af 70 prøver fra patienter, der udviste forskellige former for Lyme-sygdom i forskellige kliniske stadier. Resultaterne vises i følgende tabel og blev sammenlignet med sensitiviteter fundet med kommercielt tilgængelige EIAanalyser, der blev anvendt i Europa (CE-mærket) og anses som reference: Klinisk stadium Antal sera Platelia Lyme (1) Reference Europa (1) IgG IgM IgG + IgM IgG + IgM Erythema migrans (Stadium I) 17 66,7 % [38,4 %-88,2 %] 58,8 % [32,9 %-81,6 %] 82,4 % [56,6 %-96,2 %] 93,3 % [68,1 %-99,8 %] Neuroborreliose (Stadium II) 33 96,9 % [83,4 %-99,9 %] 36,7 % [19,9 %-56,1 %] 96,9 % [83,4 %-99,9 %] 97,0 % [84,2 %-99,9 %] Acrodermatitis chronica atrophicans (Stadium III) 5 [54,9 %-] 20,0 % [0,05 %-71,6 %] [54,9 %-] [54,9 %-] Lyme Arthritis (Stadium III) 15 [81,9 %-] (1) Tvivlsomme resultater blev ekskluderet ved sensitivitetsberegning. IC 95 %: 95 % konfidensinterval. 0,0 % [0,0 %-18,1 %] [81,9 %-] [81,9 %-] Sensitiviteten for Platelia Lyme IgG-analysen blev også påvist på et dokumenteret panel af prøver leveret af CDC (Center for Disease Control), og blev sammenlignet med sensitiviteter indhentet vha. kommercielt tilgængelige EIA-analyser, der blev anvendt i Europa (CE-mærket) og USA (FDA-godkendt) og anses som reference. Resultaterne vises i følgende tabel: Klinisk stadium Erythema migrans Antal sera 28 Platelia Lyme (1) Reference Reference USA Europa (1) (1) IgG IgM IgG + IgM IgG + IgM IgG + IgM 38,5 % [20,2 %- 59,5 %] 73,7 % [48,8 %-90,9 %] 86,4 % [65,1 %-97,1 %] 70,4 % [49,8 %-86,3 %] 87,0 % [66,4 %-97,2 %] Arthritis / Arthralgia 6 [60,7 %- ] 40,0 % [5,3 %-85,3 %] [60,7 %-] [60,7 %-] [60,7 %-] Ukendt stadium 4 [36,8 %- ] [0,05 %-] (1) Tvivlsomme resultater blev ekskluderet ved sensitivitetsberegning. IC 95 %: 95 % konfidensinterval. [47,3 %-] [19,4 %-99,9 %] [36,8 %-] 9

10 9.4 Beregning af IgG-antistofindeks til bestemmelse af intratekal syntese Der blev udført en ekstern evaluering af 104 parrede prøver fra patienter uden Lyme-neuroborreliose (n=19) eller med mistanke om (n=29), sandsynlighed for (n=36) og bekræftet (n=20) Lyme-neuroborreliose. De detaljerede resultater vises for hver kategori herunder: Status I alt CSF kunne ikke fortolkes CSF negativ CSF positiv AI IgG - indeks positiv AI IgG - indeks negativ Ingen LNB Mistanke om LNB Sandsynlighed for LNB AI IgG - indeks ugyldigt Bekræftet LNB Status I alt Positiv (CSF-forhold eller AI IgG) Negativ (CSF-forhold eller AI IgG Kunne ikke fortolkes (CSF-forhold eller AI IgG) Ingen LNB 19 1 (5,3 %) 18 (94,7 %) 0 (0,0 %) Mistanke om LNB (48,3 %) 15 (51,7 %) 0 (0,0 %) Sandsynlighed for LNB (66,7 %) 10 (27,8 %) 2 (5,5 %) Bekræftet LNB (85,0 %) 2 (10,0 %) 1 (5,0 %) 9.5 Præcision Præcision inden for kørsel (repetérbarhed): Med henblik på at evaluere repetérbarheden inden for analysen blev én negativ, én tvivlsom og to positive prøver testet 30 gange i løbet af samme kørsel. Forholdet (prøvens OD/CO) blev bestemt for hver prøve. Middelforholdet, standardafvigelsen (SD) og variationskoefficienten (% CV) for hver af de fire prøver vises nedenfor i tabellen: Præcision inden for kørsel (repetrbarhed) N=30 Negativ prøve Tvivlsom prøve Lav positiv prøve Høj positiv prøve Forhold (prøvens OD/cut-off-værdi) Middel 0,10 0,95 1,38 6,31 SD 0,007 0,082 0,116 0,134 % CV 6,0 % 8,6 % 8,4 % 2,1 % Præcision mellem kørsler (reproducérbarhed): Med henblik på at evaluere reproducérbarheden mellem kørsler blev én negativ, én tvivlsom og to positive prøver testet i dobbelttest i to kørsler om dagen over en periode på 20 dage. Forholdet (prøvens OD/CO) blev bestemt for hver prøve. Middelforholdet, standardafvigelsen (SD) og variationskoefficienten (% CV) for hver af de fire prøver vises nedenfor i tabellen: Præcision mellem kørsler (reproducerbarhed): N=80 Negativ prøve Tvivlsom prøve Positiv prøve Høj positiv prøve Forhold (prøvens OD/cut-off-værdi) Middel 0,19 0,85 3,92 6,67 SD 0,032 0,115 0,335 0,650 % CV 17,3 % 14,8 % 8,4 % 9,7 % 10

11 9.6 Krydsreaktivitet 384 blodprøver med karakteristika, der potentielt kan resultere i ikke-specifikke reaktioner, blev testet med Platelia Lyme IgGanalysen. Resultaterne vises i følgende tabel: Panel Antal prøver Tvivlsom (1) Positiv Krydsreaktivitet % Syfilis ,3 % (2) CMV ,0 % (2) EBV ,0 % Leptospirose ,1 % (2) Malaria ,3 % (2) Antinukleære antistoffer (ANA) ,0 % Heterofile antistoffer (HAMA) ,0 % Rheumatoidfaktor ,3 % (2) HSV ,0 % Toksoplasmose ,0 % Røde hunde ,0 % Mæslinger ,0 % Fåresyge ,0 % HIV ,0 % VZV ,0 % I alt ,33 % (1) Tvivlsomme resultater blev ekskluderet ved krydsreaktivitetsberegning. (2) Ikke væsentlig forskellig fra prævalensen i endemisk område (Fisher-test, p>0,05). 2 CMV- og malaria-sera, der blev fundet positive med Platelia Lyme IgGanalysen, blev ligeledes fundet positive med den kommercielt tilgængelige EIA-analyse, der blev anvendt i Europa (CE-mærke), men blev ikke bekræftet med Western blotting. Reumatoidfaktorserummet, der blev fundet positivt med Platelia Lyme IgGanalysen, blev også fundet positivt med den kommercielt tilgængelige EIAanalyse anvendt i Europa samt med Western blotting. Leptospiroseserummet, der blev fundet positivt med Platelia Lyme IgGanalysen, blev fundet tvivlsomt med den kommercielt tilgængelige EIA-analyse anvendt i Europa og blev bekræftet negativt med Western blotting. Syfilisserummet, der blev fundet positivt med Platelia Lyme IgG-analysen, blev fundet negativt med den kommercielt tilgængelige EIA-analyse anvendt i Europa samt med Western blotting. 10 PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER Diagnosen Borrelia burgdorferi-infektion kan kun fastlægges på baggrund af en kombination af kliniske og biologiske data. Resultatet af en enkelt test til påvisning af IgG anti-borrelia burgdorferi-antistoffer er ikke tilstrækkeligt bevis for diagnosen infektion med Borrelia burgdorferi sensu lato. Hvis serologien er positiv eller tvivlsom, anbefales det, at prøven testes med en bekræftelsesmetode som fx Western-blot (9). Diagnosen Lyme-neuroborreliose kan kun fastlægges på baggrund af en kombination af kliniske og biologiske data for patienten. CSF-resultaterne og fortolkningen ud fra denne protokol må ikke anvendes alene og er ikke tilstrækkeligt bevis for diagnosen. Beregningen af IgG-antistofindekset ved hjælp af Reibers formel og denne protokol er ikke gyldig, hvis ikke alle biologiske data tages med i betragtning (Albumin Serum, Albumin CSF, Total IgG Serum, Total IgG CSF, OD IgG Serum, og OD IgG CSF). Det er ligeledes vigtigt at anvende de korrekte enheder, som beskrevet i formlen ovenfor. Denne protokol er udelukkende tilpasset anti-borrelia IgG-antistoffer.Den er ikke evalueret for anti-borrelia IgM-antistoffer og for andre IgG-antistoffer. Denne protokol er udelukkende tilpasset CSF-test. Ingen andre biologiske væsker (synovialvæsker ) er evalueret. 11

12 11 PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL Alle producerede reagenser fremstilles i henhold til vores kvalitetssikringssystem, lige fra modtagelsen af råmaterialer til markedsføringen af slutproduktet. Hvert parti gennemgår kvalitetskontrol og frigives kun til salg, hvis det opfylder de foruddefinerede kvalitetskriterier. Dokumentation vedrørende produktion og kontrol af hvert parti opbevares hos virksomheden. 12 REFERENCER 1. Aguero-Rosenfeld, M. E., Wang, G., Schwartz, I., Wormser, G Diagnosis of Lyme borreliosis. Clin. Microbiol. Rev. 18: Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E., Davis, J.P Lyme disease a tickborne spirochetosis? Science. 216: Center for Disease Control and Prevention Lyme disease United States, Morb. Mortal. Wkly. Rep. 53: Hubalek, Z., Halouzka, J Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato genomic groups in Europe, a review. Eur. J. Epidemiol. 13: Reed, K. D Laboratory testing for Lyme disease: possibilities and practicalities. J. Clin. Microbiol. 40: Stanek, G., Strle, F Lyme borreliosis. Lancet. 362: Wang, G., Van Dam, A. P., Spanjaard, L., Dankert, J Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato: taxonomic, epidemiological, and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 12: Rudenko, N., Golovchenko, M., Grubhoffer, L Updates on Borrelia burgdorferi sensu lato complex with respect to public health. Ticks Tick Borne Dis. 2(3): Wilske, B Diagnosis of Lyme borreliosis in Europe. Vector Borne Zoonotic Dis. 3: Bednarova, J Cerebrospinal-Fluid profile in neuroborreliosis and its diagnosis significance. Folia Microbiol. 51: Deisenhammer F., Bartos A., Egg R., Gilhus N.E., Giovannoni G., Rauer S., Sellebjerg F Guidelines on Routine Cerebrospinal Fluid Analysis. Report from EFNS Task Force. Europ. Journ. of Neurol Reiber H., Lange P Quantification of Virus-Specific Antibodies in Cerebrospinal Fluid and Serum: Sensitive and Specific Detection of Antibody Synthesis in Brain. Clin. Chem. 37:

13 13

14 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /11 Fax : +33 (0)