QIAsymphony RGQ Applikationsark

Transkript

1 QIAsymphony RGQ Applikationsark QIAsymphony RGQ applikation artus EBV QS-RGQ-Kit (prøvetype: blod) Se efter nye elektroniske etiketteringsrevisioner på før udførelse af testen. Den aktuelle revisionsstatus angives af udstedelsesdatoen (format: måned/år). Generel information Kit Valideret prøvemateriale artus EBV QS-RGQ-kit, Version 1, Humant EDTA fuldblod Frontend-oprensning QIAsymphony DNA Mini-kit (kat. nr ) Prøvevolumen (inklusive overskydende volumen) 300 µl Analyseparametersæt Standard analysekontrolsæt artus_ebv_blood200_v4 MA_artus_EBV_blood200_V4* VirusBlood200_V5_DSP_artus_EBV Elueringsvolumen 60 µl Påkrævet softwareversion Version 4.0 eller højere Master-blandingsvolumen 30 µl Skabelon-volumen 20 µl Antal reaktioner 6 24* Kørselstid på AS-modul Til 6 reaktioner: Ca. 9 minutter Til 72 reaktioner: Ca. 35 minutter * Protokol til multianalysekørsel med artus CMV QS-RGQ-kittet for at placere CMV IC til oprensningsprocessen. For analyseopsætning for EBV kan der opsættes op til 216 (9 x 24) analyser i en kørsel på QIAsymphony AS. Maj 2012 Sample & Assay Technologies

2 Nødvendige materialer, der ikke er vedlagt Oprensningskit QIAsymphony DNA Mini Kit (QIAsymphony DNA-minikit) (kat. nr ) Adaptere til QIAsymphony SP Elution Microtube Rack QS (Cooling Adapter, EMT, v2, Qsym (Eluerings-mikrorørs-rack QS (køleadapter, EMT, v2, Qsym) kat. nr ) Tube Insert 3B (Insert, 2.0ml v2, samplecarr. (24), Qsym (Rørindsats 3B (indsats, 2,0 ml v2, prøveholder. (24), Qsym) kat. nr ) Forbrugsartikler til QIAsymphony SP Sample Prep Cartridges, 8-well (Prøveklarg. beholdere, 8- brønde) (kat. nr ) 8-Rod Covers (8-stavs dæksler) (kat. nr ) Filter-Tips (Filterspidser) µl (kat. nr ) Filter-Tips (Filterspidser) 200 µl (kat. nr ) Elution Microtubes CL (Eluerings-mikrorør CL) (kat. nr ) Tip disposal bags (Kanyleposer) (kat. nr ) Micro tubes 2.0 ml Type H (Mikrorør 2,0 ml Type H) eller Micro tubes 2.0 ml Type I (Mikrorør 2,0 ml Type I) (Sarstedt, kat. nr og , til anvendelse med prøver og interne kontroller Adaptere og reagensholdere til Reagent holder 1 QS (Cooling Adapter, Reagent Holder 1, QIAsymphony AS Qsym (Reagensholder 1 QS) (køleadapter, reagensholder 1, Qsym) kat. nr ) Reagent holder 2 QS (Cooling Adapter, Reagent Holder 2, Qsym (Reagensholder 2 QS (køleadapter, reagensholder 2, Qsym) kat. nr ) RG Strip Tubes 72 QS (Cooling Adapter, RG Strip Tubes 72, Qsym (RG strip-rør 72 QS (køleadapter, RG strip-rør 72, Qsym) kat. nr ) QIAsymphony RGQ Applikationsark: artus EBV QS-RGQ-kit (prøvetype: blod) Side 2 af 18

3 Forbrugsartikler til QIAsymphony AS Strip Tubes and Caps (Strip-rør og hætter), 0,1 ml (kat. nr ) Tubes, conical, 2 ml, Qsym AS (Rør, koniske, 2 ml, Qsym AS) (kat. nr )* eller Micro tubes 2.0 ml Type I (Mikrorør 2,0 ml Type I) (Sarstedt, kat. nr ) Tube, conical, 5 ml, Qsym AS (Rør, koniske, 5 ml, Qsym AS) (kat. nr )* eller Tubes with flat base from PP (Rør med flad basis fra PP) (Sarstedt, kat. nr ) Reagent Bottles, 30 ml, Qsym AS (Reagensglas, 30 ml, Qsym AS) (kat. nr ) Elution Microtubes CL (Eluerings-mikrorør CL) (kat. nr ) Filter-Tips (Filterspidser), µl (kat. nr ) Filter-Tips (Filterspidser), 200 µl (kat. nr ) Filter-Tips (Filterspidser), 50 µl (kat. nr ) Tip disposal bags (Kanyleposer) (kat. nr ) * Spørg efter tilgængelighed. QIAsymphony RGQ Applikationsark: artus EBV QS-RGQ-kit (prøvetype: blod) Side 3 af 18

4 Prøvehåndtering og -opbevaring Prøvetagning Blodprøve 5 10 ml EDTA-blod 8x vippeblanding ingen omrøring! Hepariniserede human prøver må ikke anvendes Opbevaring af prøver Overføres til et sterilt polypropylenrør Analysens følsomhed kan reduceres, hvis prøverne rutinemæssigt fryses eller opbevares i mere end 24 t. Transport af prøver Splintfri transport Forsendelse inden for 24 timer Send forsendelsen i henhold til de lovbefalede vejledninger i transport af patogent materiale* Blodprøver skal sendes på køl (2 8 C) Forstyrrende stoffer Prøveklargøring Heparin ( 10 IE/ml) påvirker PCR. Prøver, der er indsamlet i rør, der indeholder heparin som antikoagulant, eller prøver fra hepariniserede patienter må ikke anvendes. Forebyg dannelse af skum i eller på prøverne. Prøverne skal afbalanceres til stuetemperatur (15 25 C), før kørslen startes. * International Air Transport Association (Den internationale lufttransport-sammenslutning) (IATA). Dangerous Goods Regulations (Regler vedrørende transport af farligt gods). QIAsymphony RGQ Applikationsark: artus EBV QS-RGQ-kit (prøvetype: blod) Side 4 af 18

5 Procedure Tilsætning af den interne kontrol til prøverne Brug af QIAsymphony DNA-minikittet i kombination med artus EBV QS-RGQ-kit kræver indføring af den interne kontrol (EBV RG IC) i oprensningsproceduren for at overvåge effektiviteten af prøveklargøringen og efterfølgende analyse. For en multianalysekørsel, hvor både EBV og CMV vil blive analyseret i samme PCR, skal der sørges for, at CMV IC, fra artus CMV QS-RGQ-kittet, er anvendt i oprensningsprocessen. Interne kontroller skal tilsættes ved Buffer ATE (ATE), og det samlede volumen af blandingen af intern kontrol og Buffer ATE (ATE) forbliver 60 µl. Tabellen udgør tilsætning af intern kontrol til isolationen i et forhold på 0,1 µl pr. 1 µl elueringsvolumen. Vi anbefaler at klargøre friske blandinger for hver kørsel lige før brug. Volumen (µl) (Sarstedt - Komponent rør)* Volumen (µl) (BD -rør) Intern kontrol 9 9 Buffer ATE Endelig volumen pr. prøve (eksklusive dødvolumen) Samlet volumen for n- prøver 60 (n x 60) (n x 60) * Mikrorør 2,0 ml Type H og mikrorør 2,0 ml Type I, Sarstedt, kat. nr og Rør 14 ml, 17 x 100 mm af polystyren med rund bund (Becton Dickinson, kat.nr ). Beregningen af mængden af intern kontrol er baseret på de initielle elueringsvolumener (90 µl). Ekstra tom-volumen afhænger af typen af den anvendte prøve. Blanding af intern kontrol svarende til 6 ekstra prøver (dvs. 360 µl) er påkrævet. Fyld ikke mere end 1,92 ml total volumen (svarende til maks. 13 prøver. Disse volumener gælder specifikt for mikrorør 2,0 ml Type H og mikrorør 2,0 ml Type I, Sarstedt, kat. nr og ). Blanding af intern kontrol svarende til 10 ekstra prøver (dvs. 600 µl) er påkrævet. Fyld ikke mere end 13,92 ml total volumen (svarende til maks. 111 prøver. Disse volumener gælder specifikt for rør 14 ml, 17 x 100 mm af polystyren med rund bund Becton Dickinson, kat.nr ). QIAsymphony RGQ Applikationsark: artus EBV QS-RGQ-kit (prøvetype: blod) Side 5 af 18

6 Opsætning af QIAsymphony SP Skuffen Waste (Affald) Enhedsboksholder 1 4 Affaldsposeholder Holder til flaske til flydende affald Tomme enhedsbokse Affaldspose Tøm og indsæt flaske til flydende affald Skuffen Eluate (Eluat) Elueringsrack Elueringsvolumen* Brug plads 1, køleposition Forvalgt elueringsvolumen: 60 µl Initiel elueringsvolumen: 90 µl * Elueringsvolumenet er forvalgt til protokollen. Dette er det minimalt tilgængelige eluatvolumen i det sidste elueringsrør. Det initielle volumen af elueringsopløsning, der skal til for at sikre, at det aktuelle eluatvolumen er det samme som det forvalgte volumen. Skuffen Reagents and Cosumables (Reagenser og forbrugsartikler) Position A1 og/eller A2 Indsæt 1 reagensbeholder (RC) til op til 48 prøver eller 2 nye reagensbeholdere (RC) til op til 96 prøver Spids-rackholder position 1 18 Indsæt tilstrækkelige racks med engangsfilterspidser, 200 µl og µl (se Nødvendige plastartikler til 1 4 prøvebatches, side 7) Enhedsboksholder plads 1 4 Indsæt enhedsbokse med prøveklargøringsbeholdere eller 8-stavs dæksler (se Nødvendige plastartikler til 1 4 prøvebatches, side 7) QIAsymphony RGQ Applikationsark: artus EBV QS-RGQ-kit (prøvetype: blod) Side 6 af 18

7 Skuffen Sample (Prøve) Prøvetype Prøvevolumen (inklusive overskydende volumen) Prøverør Fuldblod 300 µl Mikrorør 2,0 ml Type H eller mikrorør 2,0 ml Type I (Sarstedt, kat. nr og ) Indsats Rør-indsats 3B (kat. nr ) Nødvendige plastartikler til 1 4 prøvebatches Et batch, To Tre Fire 24 batches, batches, batches, prøver* 48 prøver* 72 prøver* 96 prøver* Engangsfilterspidser, µl Engangsfilterspidser, µl Prøveklargøringsbeholdere stavs dæksler * Brug af mere end et rør med intern kontrol pr. batch og gennemførelse af mere end en indholdsscanning kræver ekstra engangsfilterspidser. Der er 32 filterspidser/spidsrack. Antal nødvendige filterspidser indeholder filterspidser til 1 indholdsscanning pr. reagensbeholder. Der er 28 prøveklargøringsbeholdere/enhedsboks. Der er tolv 8-stavs dæksler/enhedsboks. QIAsymphony RGQ Applikationsark: artus EBV QS-RGQ-kit (prøvetype: blod) Side 7 af 18

8 Opsætning af QIAsymphony AS Forbrugsartikler Under opsætningen angives de tilhørende positioner for hver forbrugsartikel på QIAsymphony ASmodulet på instrumentets berøringsskærm. Forbrugsartikler Strip-rør og hætter, 0,1 ml (250) Rør, koniske, 2 ml, Qsym AS (500)* Rør, konisk, 5 ml, Qsym AS (500)* Reagensglas, 30 ml, Qsym AS (50) Eluerings-mikrorør CL (24 x 96) Navn på berøringsskærm QIA# *StripTubes 0.1 QIA# *T2.0 ScrewSkirt QIA# *T5.0 ScrewSkirt QIA# *Bottle 30 ml QIA#19588 * EMTR Til brug sammen med adapter/reagensholder RG strip-rør 72 QS Reagensholder 1 QS Reagensholder 2 Q S Reagensholder 1 QS Reagensholder 2 QS Reagensholder 2 QS Eluerings-mikrorørs-rack QS * Til master-blandingskomponenter, system-klargjort master-blanding, analysestandarder og analysekontroller. Alternativt kan der bruges Sarstedt-rør, beskrevet i Nødvendige materialer, der ikke er vedlagt, side 2. Suffikset (m) på berøringsskærmen angiver, at væskestandsberegningerne for det respektive rør er blevet optimeret til reagenser, der danner en konkav menisk. Adaptere og reagensholdere Rack/reagensholder Navn Nødvendigt antal Prøve-rack Eluerings-mikrorørs-rack QS 1 Reagensholdere Reagensholder 1 QS 1 Analyse-racks RG strip-rør 72 QS 1 Beregnet til en analysekørsel med 72 reaktioner. QIAsymphony RGQ Applikationsark: artus EBV QS-RGQ-kit (prøvetype: blod) Side 8 af 18

9 Filterspidser Indsæt spids-racks startende med spidspladserne 1, 2 og 3 i skuffen Eluate and Reagents (Eluat og reagenser), og indsæt dernæst spids-racks på spidsplads 7, 8 og 9 i skuffen Assays (Analyser). Navn på Minimumsantal til Minimumsantal til Forbrugsartikel berøringsskærm 24 reaktioner 72 reaktioner Filterspidser, µl (1024) Filterspidser, 200 µl (1024) Filterspidser, 50 µl (1024) µl µl µl Kanyleposer 1 1 QIAsymphony RGQ Applikationsark: artus EBV QS-RGQ-kit (prøvetype: blod) Side 9 af 18

10 RT-PCR på Rotor-Gene Q Jf. det softwarespecifikke protokolark Settings to run artus QS-RGQ Kits ((Indstillinger til kørsel af artus QS-RGQ-kit) på Specifikke indstillinger af artus EBV QS-RGQ-kit Rotor-Gene AssayManager indstiller automatisk parametrene til artus EBV QS-RGQ-kit. Med Rotor-Gene software 2.1 vises de specifikke indstillinger herunder. Reaktionsvolumen (µl) 50 Hold Holdetemperatur: 95 C Holdetid: 10 min. Cyklusdrift 45 gange 95 C i 15 sek. 65 C i 30 sek. 72 C i 20 sek. Sørg for at aktivere touchdown-funktionen i 10 cyklusser i hærdningstrinnet Opsætning af Auto-Gain Optimisation 65 C (Prøver: Grøn; IC: Gul) Multianalysekørsel Detektionsområdet for fluorescenskanalerne skal bestemmes efter fluorescensintensiteterne i PCRrørene. Klik på Gain Optimisation (Gain-optimering) i dialogboksen New Run Wizard (Hjælp til ny kørsel) for at åbne dialogboksen Auto-Gain Optimisation Setup (Opsætning af Auto-gainoptimering) (se trin 6 og figur 7 i protokolarket Settings to run artus QS-RGQ Kits (Indstillinger til kørsel af artus QS-RGQ-kit)). I forbindelse med en enkelt analysekørsel skal kalibreringstemperaturen til 65, så den svarer til amplifikationsprogrammets hærdningsprogram. I forbindelse med en multianalysekørsel, hvor både EBV og CMV skal analyseres i samme PCR, skal fluorescenskanalintensiteterne justeres manuelt. QIAsymphony RGQ Applikationsark: artus EBV QS-RGQ-kit (prøvetype: blod) Side 10 af 18

11 1. Klik på Edit (Rediger) (figur 1) for at redigere fluorescenskanalerne. 1 Figur 1. Manuel justering af fluorescenskanalens intensitet Juster intensiteten for hver fluorescenskanal på forskellige rørpositioner for forskellige analyser (CMV og EBV). 2. Indstil rørpositionen for et rør til den første artus-analyse (f.eks. EBV). Indstil rørpositionen for alle fluorescenskanaler, og klik på OK (figur 2). 1 2 Figur 2. Indstilling af rørpositionen. QIAsymphony RGQ Applikationsark: artus EBV QS-RGQ-kit (prøvetype: blod) Side 11 af 18

12 3. Klik på Start for at begynde gain-optimeringen for den første artus-analyse (figur 3). 1 Figur 3. Start af gain-optimering. 4. Et nyt vindue Running Auto-Gain Optimisation (Kørsel af Auto-gain-optimering) åbnes. Vent indtil Completed (Udført) kommer til syne i dette vindue (figur 4). Indtast de valgte gain-værdier for begge kanaler, og klik dernæst på Close (Luk) (figur 4). QIAsymphony RGQ Applikationsark: artus EBV QS-RGQ-kit (prøvetype: blod) Side 12 af 18

13 2 1 3 Figur 4. Gain-optimering fuldført. Bemærk gain-værdier (i dette tilfælde 1,33 for begge fluorescenskanaler). 5. Gentag trin 1 4 for en rørposition for den anden artus-analyse (f.eks. CMV). 6. Klik på Edit Gain (Rediger gain) for at redigere gain-værdierne manuelt (figur 5). 1 Figur 5. Redigering af gain-værdierne manuelt. QIAsymphony RGQ Applikationsark: artus EBV QS-RGQ-kit (prøvetype: blod) Side 13 af 18

14 7. Vælg den laveste gain-værdi for Cycling Green beskrevet i trin 4, og indtast denne værdi manuelt i vinduet Gain for Green (Gain for grøn) (figur 6). Vælg den laveste gain-værdi for Cycling Yellow beskrevet i trin 4, og indtast denne værdi manuelt i vinduet Gain for Yellow (Gain for gul) (figur 6). 1 2 Figur 6. Manuel indtastning af de laveste gain-værdier. 8. Gain-værdierne, der bestemmes af kanalkalibreringen (eller tildeles manuelt), gemmes automatisk og angives i det sidste menuvindue af programmeringsproceduren (figur 7). Klik på Start Run (Start kørsel). Figur 7. Start af kørsel. Tolkning af resultater Dette afsnit beskriver, hvordan resultaterne på Rotor-Gene Q skal tolkes. Se også på oplysningerne om prøvestatus fra QIAsymphony SP/AS-resultatfiler med henblik på analyse af den komplette arbejdsgang fra prøve til resultat. Der bør kun bruges prøver med en gyldig status. Rotor-Gene AssayManager tolker automatisk PCR-resultater og giver en konklusion og et kvantitativt resultat. Følgende afsnit beskriver tolkningen af Rotor-Gene software 2.1 eller senere. QIAsymphony RGQ Applikationsark: artus EBV QS-RGQ-kit (prøvetype: blod) Side 14 af 18

15 Signaldetektion og -konklusioner blod Signal i Signal i kanalen kanalen Kvantitativt Cycling Cycling resultat Green Yellow (kopier/ml) Tolkning Ja Ja <288,4 Gyldigt resultat: EBV DNA detekteret, <1.000 kopier/ml Kvantitering ikke mulig, fordi det kvantitative resultat er under detektionsgrænsen. Reproducérbarheden for det positive resultat er ikke sikret. Gyldigt resultat: EBV DNA detekteret, <1.000 Ja Ja 288,4 og <1.000 kopier/ml Kvantitering ikke mulig, fordi det kvantitative resultat er under analysens lineære område. Gyldigt resultat: EBV DNA detekteret ved den Ja Ja og 5 x 10 7 beregnede koncentration Kvantitativt resultat er inden for analysens lineære område. Ja Ja >5 x 10 7 Nej Ja Nej Nej Gyldigt resultat: EBV DNA detekteret, >5 x 10 7 kopier/ml Kvantitering ikke mulig, fordi det kvantitative resultat er over analysens lineære område.* Gyldigt resultat: Intet EBV DNA kan detekteres. Ugyldigt resultat: Der kan ikke udledes noget resultat. * Hvis kvantificering ønskes, skal prøven fortyndes med EBV-frit blod og genbehandles. Det kvantitative resultat fra den genbehandlede prøve skal multipliceres med fortyndingsfaktoren. Men hvis C T- værdien for den interne kontrol af en negativ prøve er mere end 3 cyklusser højere end C T- værdien for den interne kontrol af kontrollen uden skabelon i kørslen (C T IC prøve C T IC NTC >3), så skal prøven behandles som ugyldig. Der kan ikke udledes noget resultat. Oplysninger om fejlkilder og deres løsning kan findes i Troubleshooting guide (Fejlfindingsvejledning) i artus EBV QS-RGQ-kit-håndbogen. QIAsymphony RGQ Applikationsark: artus EBV QS-RGQ-kit (prøvetype: blod) Side 15 af 18

16 Indstilling af tærsklen for PCR-analysen De optimale tærskelindstillinger for en given kombination af Rotor-Gene Q-instrumentet og artus QS- RGQ-kittet skal indstilles empirisk ved at teste hver individuel kombination, eftersom det er en relativ værdi, afhængigt af den generelle diagnostiske arbejdsgang. Tærsklen kan indstilles på en foreløbig værdi på 0,04 til analysen af den første PCR-kørsel, men denne værdi skal finindstilles i en komparativ analyse af de næste kørsler af arbejdsgangen. Tærsklen skal indstilles manuelt lige over baggrundssignalet for de negative kontroller og negative prøver. Middeltærskelværdien, der er beregnet ud fra disse eksperimenter, vil højst sandsynligt fungere for størstedelen af fremtidige kørsler, men brugeren skulle ikke desto mindre gennemse den genererede tærskelværdi med regelmæssige mellemrum. Tærskelværdien vil sædvanligvis være inden for området 0,03 0,05 og skal rundes op til højst tre decimalpladser. Kvantitering Kvantiteringsstandarderne (EBV QS 1 4) i artus EBV QS-RGQ-kittet behandles som tidligere oprensede prøver, og der anvendes samme volumen (20 µl). For at generere en standardkurve på Rotor-Gene Q-instrumenter bør alle 4 kvantiteringsstandarder bruges og defineres i dialogboksen Edit Samples (Rediger prøver) på Rotor-Gene Q-instrumentet som standarder med de specificerede koncentrationer (se instrumentets brugervejledning). Bemærk: Kvantiteringsstandarderne defineres som kopier/µl. Følgende ligning skal anvendes for at konvertere værdierne, der er bestemt ved hjælp af standardkurven, til kopier/ml af prøvematerialet. Resultat (kopier/ml) = Resultat (kopier/µl) x Initielt elueringsvolumen (90 µl)* Prøvevolumen (ml) Principielt skal det initielle prøvevolumen indsættes i ligningen ovenfor. Dette skal der tages hensyn til, når prøvevolumenet er blevet ændret før nucleinsyreekstraktionen (f.eks. ved at reducere volumenet ved centrifugering eller ved at øge volumenet ved at øge det volumen, der kræves til isoleringen). I forbindelse med en multianalysekørsel, hvor både CMV og EBV blev analyseret i samme PCR, skal der sørges for, at prøverne analyseres separat for CMV og EBV med tilsvarende kvantiteringsstandarder. * Beregningen er baseret på de initielle elueringsvolumener (90 µl). QIAsymphony RGQ Applikationsark: artus EBV QS-RGQ-kit (prøvetype: blod) Side 16 af 18

17 Eksempler på positive og negative PCR-reaktioner Detektion af kvantiteringsstandarderne (EBV RG QS 1 4) i fluorescenskanalen Cycling Green. NTC: Ingen skabelonkontrol (negativ kontrol). Detektion af den interne kontrol (IC) i fluorescenskanalen Cycling Yellow med samtidig amplifikation af kvantiteringsstandarderne (EBV RG QS 1 4). NTC: Ingen skabelonkontrol (negativ kontrol). QIAsymphony RGQ Applikationsark: artus EBV QS-RGQ-kit (prøvetype: blod) Side 17 af 18

18 For opdateret licensinformation og produktspecifikke ansvarsfraskrivelser henvises til den aktuelle QIAGEN-kit-håndbog eller brugervejledning. QIAGEN-kit-håndbøger og brugervejledninger kan findes på eller kan rekvireres fra QIAGENs tekniske serviceafdeling eller den lokale leverandør. Varemærker: QIAGEN, QIAsymphony, artus, Rotor-Gene (QIAGEN Group); BD (Becton, Dickinson and Company); Sarstedt (Sarstedt AG and Co.) QIAGEN. Alle rettigheder forbeholdes. Canada Ireland Norway China Italy Singapore Denmark Japan Spain Australia Finland Korea (South) Sweden Austria 0800/ France Luxembourg Switzerland Belgium Germany Mexico UK Brazil Hong Kong The Netherlands USA Sample & Assay Technologies