Herlev og Gentofte Hospital. The influence of different fixatives and preparation methods on morphology, immunohistochemistry and molecular analyses

Transkript

1 Herlev og Gentofte Hospital The influence of different fixatives and preparation methods on morphology, immunohistochemistry and molecular analyses

2 Problem Rutinemæssigt bruges 10% neutralbuffet formalin til fiksering af alt væv på Patologiafdelingen Denne fiksering giver en god morfologi og alle rutinefarvninger, specialfarvninger og immunhistokemiske farvninger er opsat til denne fiksering Den er dog ikke så god til de nye molekylær patologiske metoder, da formalin danner bindinger i og mellem proteinerne. Desuden er formalin på listen over kræftfremkaldende stoffer og er stærk allergen

3 Problem Tissue-Tek Xpress Molecular Fixative (MF) fra Sakura (MF) skulle ifølge producenten og nogle artikler give en næsten ligeså god morfologi. MF indeholder: Methanol >75%, hvilket vil sige det er giftigt Vi besluttede at afprøve MF op imod formalin fikseringen, for at se om vi kan erstatte formalin til fiksering Vi begrænsede forsøget til tarmvæv taget fra cancer tarme, skåret ud i små stykker på 2 x 2 x 4 mm og fikseringstider på 4 og 6 timer (9 i alt). Vi præparerede vævet på henholdsvis VIP og Xpress VIP præparerer natten over og Xpress præparerer på 1 time

4 Farvninger Vi farvede: Immunfarvninger: Molekylær analyser: HE (oversigtsfarvning) AvG (bruges meget til tarmbiopsier, da den skelner mellem muskulatur og bindevæv) CK20 (meget stabil i epitel) Actin SMM-1 (stabil i muskulatur) Ki67 (stabil i prolifererende kerner) CD117 (problematisk farvning) PMS2 (problematisk på ikke optimalt fikseret væv) β-actin (kvantitetsmålinger) Fraktions analyse (kvalitetsmålinger)

5 Bedømmelse Score Beskrivelse 0 Morfologien er fuldstændig ødelagt og der ses ingen eller få genkendelige vævsstrukturer 1 Morfologien er uacceptabel til diagnostik, der ses megen skrumpning og/eller utydelig kromatinstruktur 2 Morfologien er acceptabel til diagnostik, dog ses lidt skrumpning og/eller kromatinstrukturen er let utydelig 3 Morfologien er optimal, alle vævsstrukturer ses uden skrumpning og kromatinstrukturen er tydelig Score Beskrivelse 0 Farvningen kan ikke bruges, da vævskomponenterne ikke har fået den forventede farve. 1 Farvningen er uacceptabel til diagnostik, der ses over-/underfarvning og/eller vævskomponenterne har fået blandingsfarve og/eller forkert farve 2 Farvningen er acceptabel til diagnostik, dog ses let over-/underfarvning og/eller vævskomponenterne har fået en let blandingsfarve 3 Farvningen er optimal, alle vævskomponenter har fået den forventede farve

6 Resultater HE, APS og immunhiostokemi NBF Morfologi APS CK20 Actin SMM-1 Ki67 CD117 PMS2 NBF score 3 antal Procent 89,83% 84,18% 91,18% 41,67% 91,67% 94,44% 83,33% NBF score 2 antal Procent 9,60% 15,82% 8,82% 58,33% 8,33% 5,56% 16,67% NBF score 1 antal Procent 0,56% 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% NBF score 0 antal Procent 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% MF Morfologi APS CK20 Actin SMM-1 Ki67 CD117 PMS2 MF score 3 antal Procent 7,78% 14,86% 58,33% 88,89% 100,00% 77,78% 22,22% MF score 2 antal Procent 88,89% 72,00% 19,44% 11,11% 0,00% 22,22% 63,89% MF score 1 antal Procent 3,33% 13,14% 22,22% 0,00% 0,00% 0,00% 13,89% MF score 0 antal Procent 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% 0,00%

7 4 og 6 timers formalin fiksering på VIP 4 timer 6 timer

8 4 timers formalin fiksering på VIP og Xpress VIP Xpress

9 4 og 6 timers MF på Xpress 4 timer 6 timer

10 4 timer fiksering i formalin og MF på Xpress Formalin MF

11 Alcian PikroSirius (APS): 4 timers fiksering i formalin og MF på Xpress Formalin MF

12 CK20: 4 timers fiksering i formalin og MF på Xpress Formalin MF MF uden forbehandling

13 PMS2: 4 timers fiksering i formalin og MF på Xpress Formalin MF MF uden forbehandling

14 Actin SMM1: 4 timers fiksering i formalin og MF på Xpress Formalin MF MF uden forbehandling

15 Ki67: 4 timers fiksering i formalin og MF på Xpress Formalin MF MF uden forbehandling

16 CD117: 4 timers fiksering i formalin og MF på Xpress Formalin MF MF uden forbehandling

17 Resultater DNA (Formalin/MF)

18 DNA formalin >< Molecular fix Formalinfixeret 200bp Molekylærfix 200bp Formalinfixeret 300bp Molekylærfix 300bp

19 DNA formalin >< Molecular fix Formalinfixeret 400bp Molekylærfix 400bp Formalinfixeret 600bp Molekylærfix 600bp

20 DNA VIP >< Xpress Delt op på formalin og molecular fix NBF Xpress 200bp NBF VIP 200bp NBF Xpress 300bp NBF VIP 300bp MF Xpress 200bp MF VIP 200bp MF Xpress 300bp MF VIP 300bp

21 DNA VIP >< Xpress Delt op på formalin og molecular fix NBF Xpress 400bp NBF VIP 400bp NBF Xpress 600bp NBF VIP 600bp MF Xpress 400bp MF VIP 400bp MF Xpress 600bp MF VIP 600bp

22 Diskussion Ser man på morfologien scorer formalinfikseringen højere end MF, hvilket er i overensstemmelse med teorien, der siger at MF, som er et koagulerende fiksativ vil skrumpe vævsstrukturerne specielt i epitel og muskulatur I farvningen HE er der ingen forskel, bortset fra at baggrundsfarvningen med Eosin er lidt kraftigere i MF, hvilket også følger teorien, da formalin fikseringen bruger de ladede grupper, der tiltrækker anionfarvestoffer APS er en farvning, der bruges til at skelne mellem muskulatur og bindevæv, vha. en konkurrence mellem 2 anionfarvestoffer. Da farvningen er optimeret til at virke på formalinfikseret væv, bliver fordelingen af farverne i MF fikseret væv ikke korrekt. Der var især problemer med de immunhistokemiske farvninger for CK20 og PMS2, når vævet var fikseret i MF, hvilket for CK20 s vedkommende er lidt overraskende, da den bliver betragtet som stabil.

23 Diskussion I de molekylære analyser ses en større mængde og længere fragmenter DNA ved MF fiksering, hvilket teorien også støtter, da formalins tværbindinger af histonerne ødelægger DNA Præparationen har åbenbart også en påvirkning af DNA mængde og fragment længde Præparation på Xpress giver mindre og kortere fragmenter DNA, hvilket teorien ikke helt er klar omkring, men det formodes at mikrobølgerne eller væskerne i Xpress påvirker DNA negativt Før Xpressen skylles i Tissue Tek Xpress Pre-Processing Solution (Propan- 2-ol 25-50%, Acetone 25-50% og Dimethylsulfoxid 1-<5%) I Xpressen præpareres i Tissue Tek Xpress Processing Reagent 1 (Acetone 50-75%, Propan-2-ol 20-<50% og Dimethylsufloxid 1-<5%), efterfulgt af paraffin Måske kan DNA ikke tåle så store mængder af acetone eller mikrobølger

24 Konklusion Formalin fiksering er bedst til morfologisk bedømmelse af patologiske tilstande Histokemiske farvninger, der er afhængige af en differentiering mellem anionfarvestoffer, ændres meget ved fiksering med MF Nogle antistoffer er upåvirkede af fiksativ, mens andre bliver meget påvirkede af det Nogle antistoffer kræver måske ikke forbehandling efter fiksering med MF Kvantitet og kvalitet af DNA er bedre med MF Mulige tiltag Væv, der senere skal anvendes til molekylær analyser sendes til patologiafdelingen uden fikseringsmiddel Der implementeres i arbejdsgangen ved udskæring en blok, der præpareres på VIP registreres i Patologisystemet Der udtages frisk væv til Biobank Frisk væv er altid optimal til molekylære analyser

25 Perspektivering Analyse af hvorfor Xpress en giver disse lidt ringere molekylære resultater Test af væskerne fra Xpress uden mikrobølger Test af mikrobølger og konventionelle væsker Evt. test af andre væsker +/- mikrobølger OSV. Yderligere optimering af oprensning fra paraffinsnit Yderligere test af nye fikseringsmidler efterhånden som de udvikles