Regnskovens hemmeligheder

Transkript

1 Center for Undervisningsmidler, afdeling København Regnskovens hemmeligheder Øvelsesvejledning Formål Et gen for et kræfthelbredende protein er blevet fundet i nogle mystiske blade i regnskoven. Forskere har klippet bladenes gener i tilfældige stykker og sat dem ind i en gruppe bakterieceller. Men kun nogle af cellerne indeholder genet for det kræfthelbredende protein. Derfor skal disse celler adskilles fra de andre, hvorefter proteinet skal isoleres og oprenses. Teori DNA fra nogle mystiske blade fra regnskoven er blevet skåret over af restriktionsenzymer og splejset ind i plasmider, der så er indsat i bakterier. På denne måde er generne blevet opformeret og gemt i bakterierne. Det kaldes et DNA-bibliotek. Når der ledes efter genet for et bestemt protein, i dette tilfælde GFP, kan man nu lede i DNA-biblioteket. Kun de bakterier, der indeholder GFP, vil fluorescere i UV-lys. Biblioteket udstryges på en agarplade, således at bakterierne adskilles og kan formere sig til kolonier. Derefter kan en koloni, der indeholder bakterier med genet for GFP, udvælges. Og bakteriekolonien kan opformeres. Proteinerne frigøres ved lysering af bakterierne. Til sidst kan proteinerne adskilles ved brug af hydrofob interaktionskromatografi. Da GFP er et hydrofobt protein, vil det blive tilbageholdt længere tid i kolonnen end andre mindre hydrofobe proteiner. Side 1 af 5

2 Apparatur og kemikalier Podenåle Agarplader, 2 stk Lyophiliseret bakteriecelleblanding Inkubatorovn, 37 o C Rørglas med vækstmedie UV-lampe Prøverør med låg Pipetter TE-buffer (10 mm Tris/EDTA) Lysozym Centrifuge Ligevægtsbuffer (2 M (NH 4 ) 2 SO 4 ) Bindingsbuffer (4 M (NH 4 ) 2 SO 4 ) Vaskebuffer (1,3 M (NH 4 ) 2 SO 4 ) Kromatografikolonne HIC Reagensglas og reagensglasstativ Fremgangsmåde 1. Vend petriskålene på hovedet og skriv navne i bunden 2. Stryg bakterier ud på de to plader. Formålet med det er at få adskilte kolonier af de forskellige bakterieceller, så dem, der indeholder det ønskede gen, kan multipliceres og isoleres. Udstrygningen foretages ved at dyppe podenålen i beholderen med bakterieceller og derefter gøre som i nedenstående figur: Side 2 af 5

3 3. Stil pladerne med bunden i vejret i inkubatoren ved 37 o C til næste dag. Skal bruges indenfor timer. 4. Tag pladerne ud af inkubatoren. Se først på dem i normalt lys og derefter i UV-lys. Lad være med at se ind i UV-lampen. Find grønne kolonier, der ikke er i kontakt med andre kolonier. Vend pladen om og marker dem. 5. Identificer nogle hvide kolonier på den anden plade. De må ikke være i kontakt med andre kolonier. Marker dem på bagsiden af pladen. 6. Tag to rørglas med 2 ml vækstmedie i hvert. Mærk det ene med + og det andet med Brug øjet på en steril podenål til at røre ved en af de grønne kolonier og tag celler op uden at tage agar med. Kom podenålsøjet ned i +-glasset og drej nålen mellem fingrene som vist på figuren nedenfor. 8. Gør det samme med en enkelt hvid koloni på den anden plade. Husk at bruge en ny steril podenål. Det er meget vigtigt at der kun tages celler fra en enkelt koloni. 9. Lad rørglassene i inkubatoren ved 32 o C natten over eller ved stuetemperatur 2 dage. 10. Nu er der produceret levende kulturer af to bakterielle kloner, en der producerer GFP, og en der ikke gør. Nu skal GFP ekstraheres fra bakteriecellerne. Mærk to prøverør med navn og dato samt hhv. + og - Side 3 af 5

4 11. Tag de to kulturer ud af inkubatoren og se på dem i normalt lys og i UV-lys. Notér farveforskelle. 12. Brug en ren pipette til at overføre hele indholdet af +-glasset til prøverøret med +. Sæt låget på. 13. Sæt prøverøret i centrifugen og centrifuger det ved max hastighed i 5 min. 14. Åbn røret og hæld langsomt supernatanten fra. Så ligger der en bakterieklump tilbage i røret. 15. Kig på bakterieklumpen under UV-lys. Notér dine observationer 16. Overfør 250 µl TE-buffer til prøverøret med bakterieklumpen. Opløs klumpen ved hurtigt at pipettere op og ned nogle gange 17. Tilsæt med pipette 1 dråbe lysozym til prøverøret. Sæt låg på og omryst ved at banke på røret med fingeren. Lysozymet vil nedbryde bakteriecellevæggene. Observér røret under UV-lys. Frys røret ned indtil næste gang. Nedfrysningen får bakterierne til at eksplodere og gå helt i stykker. 18. Optø prøverøret i hænderne. Centrifuger røret ved max hastighed i 10 min. 19. Mens du venter, kan du gøre kromatografikolonnen klar: Ryst kolonnen kraftigt for at løsne materialet i kolonnen. Ryst derefter nedad eller bank forsigtigt mod bordet et par gange, så kolonnematerialet lægger sig i bunden. Lad bufferen løbe ud af kolonnen dette tager 3-5 min. 20. Tilsæt 1 ml ligevægtsbuffer til kolonnens top, derefter 1 ml mere. Lad bufferen løbe igennem indtil den når til 1 ml-mærket lige over kolonnematerialet. Sæt låg på både top og bund. 21. Når prøverøret er centrifugeret i 10 min (se pkt. 18), undersøges det i UV-lys. Bakterieaffaldet skulle gerne ligge på bunden. Notér bundfaldets og supernatantens farver. Overfør med pipette 250 µl af supernatanten til et nyt prøverør. 22. Rens pipetten og overfør 250 µl bindingsbuffer til prøverøret med supernatanten. 23. Mærk tre reagensglas med hhv. 1, 2 og 3. Sæt dem i et stativ. 24. Tag propper af top og bund af kolonnen, og lad væske løbe igennem. Når væskestanden er ved toppen af kolonnematerialet, placeres kolonnen i reagensglas Overfør 250 µl af supernatanten i bindingsbuffer til kolonnens top ved at lade væsken løbe ned langs siden af kolonnevæggen. Side 4 af 5

5 26. Se på kolonnen i UV-lys. Notér dine observationer. Lad hele supernatantvolumenet løbe ned i glas Placér kolonnen i glas 2 og tilsæt på samme forsigtige måde 250 µl vaskebuffer og lad hele volumenet løbe ned i glas 2. Undersøg kolonnen i UV-lys og notér dine observationer. 28. Placér kolonnen i glas 3. Tilsæt 750 µl TE-buffer til kolonnen og lad det hele løbe ned i glas 3. Undersøg kolonnen med UV-lys. Notér dine observationer 29. Undersøg de tre reagensglas med UV-lys og notér farveforskelle. Efterbehandling 1. Gør rede for dine observationer undervejs 2. Du har brugt en bakterie til at udbrede et gen, der producerer et specielt planteprotein. Hvilken funktion havde centrifugen i pkt. 13, lysozymet i pkt. 17 og fryseren i pkt. 17? 3. Hvorfor kasseres supernatanten i pkt. 14? 4. Hvad er formålet med at lysere bakterierne? 5. Hvorfor kasseres bundfaldet i pkt. 21? Hvad indeholder det? 6. Beskriv princippet i hydrofob interaktionskromatografi. Hvad er formålet med det? 7. Forklar funktionerne af de fire buffere 8. Lykkedes det for dig at isolere og oprense GFP fra de klonede bakterieceller? Hvilke resultater understøtter dit svar? Side 5 af 5