Det gode liv med aterosklerose

Transkript

1 Det gode liv med aterosklerose Aalborg Universitet 2014 P2-projekt B267a Bioteknologi 20. maj 2014 Anne-Kirstine Corfitz Petersen, Anne Mette Frøbert, Christoffer Søndergaard Rasmussen, Jonas Munk Jensen, Julie Simone Nielsen, Katrine Amalie Hamborg Nielsen & Mark Jakobsen Modificeret efter

2 Titel: Det gode liv med aterosklerose Semester: 2. semester Semester tema: Human biologi Projektperiode: 03/02/14 30/06/14 (P2) ECTS: 15 Vejleder: Mette Sondrup Andersen Bivejleder: Sara Bjørn Aaen Projektgruppe: B267a Første Studieår Bioteknologi Strandvejen Aalborg Anne-Kirstine Corfitz Petersen Anne Mette Frøbert Christoffer Søndergaard Rasmussen Jonas Munk Jensen Julie Simone Nielsen Katrine Amalie Hamborg Nielsen Mark Jakobsen Oplagstal: 10 Sideantal: 56 Bilagsantal og -art: 16 Afsluttet den: 20. maj 2014 SYNOPSIS Dette projekt tager udgangspunkt i metoder til at mindske udviklingen af aterosklerose. Aterosklerose er en livsstilssygdom, som ikke kan helbredes. Graden af sygdommen kan dog påvirkes gennem livsstilsændringer og medicinsk forebyggelse. Disse metoder vil i forbindelse med opnåelsen af et godt liv med aterosklerose belyses. Gennem et interview med en tidligere myokardieinfarktpatient skabes en forståelse af, hvordan forløbet opleves på et nært plan. Ud fra diskussionen konkluderes, at både livsstilsændringer og medicin kan værre effektive metoder til at nedsætte aterosklerose. Behandlingsformen afhænger af patienten, i forhold til opfattelsen af det gode liv og de ressourcer, patienten har. Ydermere undersøges bestanddele samt indhold af proteiner i blodet gennem mikroskopi af blodudstrygninger og SDS- PAGE. I blodudstrygningen blev alle blodceller med undtagelse af basofilocytter identificeret. I SDS-PAGE blev forskellige blodfraktioner undersøgt og der blev fundet en række forventede blodproteiner. Ikke alle forventede proteiner kunne spores og der var en række proteinbånd, der ikke kunne forklares teoretisk. Rapportens indhold er frit tilgængeligt, men offentliggørelse (med kildeangivelse) må kun ske efter aftale med forfatterne.

3 Forord Dette projekt er udarbejdet af gruppe B267a, der læser til civilingeniører i bioteknologi på andet semester ved Aalborg Universitet. Projektets overordnede tema er Human Biologi, hvor projektet skal tage udgangspunkt i organer, væv eller celler af menneskelig eller anden oprindelse. I dette projekt er fokus rettet mod kredsløbet med udgangspunkt i plaquedannelsen under udviklingen af aterosklerose. Projektet består både af en teoretisk del, omhandlende udvikling og forebyggelse af aterosklerose med en vinkling på det gode liv, samt en praktisk del, hvor blodcellernes morfologi samt proteinerne i blodet undersøges. Formålet med P2 er, at de studerende skal kunne redegøre for opbygningen af mennesker, herunder de væsentligste organsystemer, og samspil mellem mennesker og omgivelser på molekylært, cellulært eller organisme-niveau. Derudover skal der kunne redegøres for væsentlige biologiske faktorer for et godt menneskeliv. De studerende skal yderligere kunne foretage eksperimentelle analyser på udvalgte humane celler, væv, organer, hele mennesker eller humane model-systemer samt kunne redegøre for og anvende de analytiske teknikker, der er benyttet i projektet. Sidst skal de studerende kunne perspektivere de valgte løsninger. Projektet henvender sig til personer med samme eller højere faglige niveau. Kildehenvisninger er udarbejdet efter Chicago-metoden, hvor der, så vidt muligt, refereres til en kilde i teksten via tekstforfatterens efternavn samt udgivelsesår; (Efternavn år) og i tilfælde med manglende årstal; (Efternavn n.d.). Efter rapporten findes appendiks, indeholdende supplerende teori og beregninger, samt bilag. Der henvises til appendiks og bilag på følgende måder; (Appendiks X) samt (Bilag X). Tak til vores vejleder Mette Sondrup Andersen og bivejleder Sara Bjørn Aaen for deres råd og vejledning i forbindelse med projektet. Derudover tak til interviewperson Steen Jakobsen, Blodbanken på Aalborg Universitetshospital for tapning af blod til forsøget, ledende overlæge Kim Varming for rundvisning og foredrag i Blodbanken på Aalborg Universitetshospital og klinisk professor Søren Risom Kristensen for rundvisning på Klinisk Biokemisk Afdeling på Aalborg Universitetshospital. Aalborg Universitet, 20. maj 2014

4

5 Indholdsfortegnelse 1. Problemanalyse Indledning Blodet og dets bestanddele Blodkarrenes struktur Hæmostase Aterosklerose Risikofaktorer til aterosklerose Ateroskleroses udvikling og plaquedannelse Blodpropper grundet ateroskelerose Forebyggelse af aterosklerose Diskussion af aterosklerose og det gode liv Problemformulering Forsøg Forsøgsteori Farvning af blodceller og mikroskopi Blodfraktionering ved differentiel centrifugering Klargøring til SDS-PAGE Gelelektroforese Proteinerne i blodfraktionerne Oversigt over proteiner Metode Materialeliste Kemikalieliste Mikroskopi af fuldblodsudstrygning Fraktionering af fuldblodsprøve Mikroskopi af fraktion SDS-PAGE Forsøgsresultater Blodfraktionering... 33

6 3.2 Mikroskopi analyse SDS-PAGE SDS-PAGE analyse Diskussion Mikroskopi diskussion SDS-PAGE diskussion Konklusion Perspektivering Referencer Appendiks: materiale- og kemikalieliste A1 Teoretiske udregninger af buffere A2 Buffere til fremstilling af fraktionerne A3 Buffere til fremstilling og kørsel af gelerne A4 Analysemetode til identificering af molekylevægt på proteinbånd i SDS-PAGE Bilag B1 Interview med forhenværende myokardieinfarkt patient... 68

7 1. Problemanalyse 1.1 Indledning Aterosklerose (åreforkalkning) er den hyppigste årsag til hjertekarsygdomme i Danmark (Videbæk et al. 2010). Dannelsen af aterosklerose er ophobning af plaque i kroppens arterier, hvilket kan medføre alvorlige sygdomme og symptomer (Wyller 2011a). I dagens Danmark lever omkring personer med en hjertekarsygdom (Hjerteforeningen 2014). I Danmark var hjertekarsygdomme årsag til ud af i alt dødsfald i 2012 (Danmarks Statistik 2014; Hjerteforeningen 2014). Hjertekarsygdomme er, efter kræft, den hyppigste dødsårsag i Danmark, hvilket sammen med den høje prævalens gør sygdommen til et væsentligt fokuspunkt. Desuden medfører følgerne af hjertekarsygdomme store økonomiske omkostninger for staten, grundet mange indlæggelser samt et højt medicinforbrug. I 2005 løb omkostningerne op i næsten 6 milliarder kroner dækkende over sygehusudgifter til behandling og forbruget af hjertemedicin (Statens Institut for Folkesundhed 2007). Til sammenligning er de samlede udgifter til sundhedsvæsenet i Danmark omkring 103 milliarder kr. årligt (Lunding 2014). Udgifterne til behandling af hjertekarsygdomme er endnu et grundlag for en øget indsats mod forebyggelse af hjertekarsygdomme og den primære årsag hertil, aterosklerose. Forebyggelse er det primære indsatsområde, da aterosklerose ikke kan kureres. Flere faktorer øger risikoen for udviklingen af aterosklerose, blandt andet hypertension (forhøjet blodtryk) og forhøjet kolesterol. Udviklingen af aterosklerose starter typisk allerede i teenageårene og er en tilstand, som næsten alle vil udvikle tegn på i løbet af livet (Grayston 2005). Dermed er det væsentligt at gribe tidligt ind og have fokus på eliminering af risikofaktorerne for at forebygge udviklingen. Dette kan opnås gennem livsstilen, hvor en eventuel regulering af blandt andet usunde madvaner og manglende motion spiller en væsentlig rolle (Nørskov 2006). En efterlevelse af denne livsstil vil derfor betegnes som en sund livsstil i dette projekt. Forslag og guides, til hvordan risikoen for at udvikle aterosklerose nedsættes, findes overalt på nettet på diverse sundhedssider, dagblade og private organisationer som Hjerteforeningen. Det er dog ikke kun her, der er fokus på aterosklerose. Offentlige myndigheder som Sundhedsstyrelsen og Fødevarestyrelsen har projekter, som har til formål at forebygge og øge fokus på folkesygdomme, som aterosklerose (Sundhedsstyrelsen 2013). Fødevarestyrelsen er mest fremtrædende i forhold til forebyggelse med de offentlige kostråd, som alle har fokus på at nedsætte risikoen for folkesygdomme, herunder hjertekarsygdomme. Flere af anbefalingerne omhandler at lægge livsstil og vaner om (Fødevarestyrelsen 2013). I det moderne samfund kan det, at skulle efterleve en række anbefalinger, dog opleves som en indgriben i friheden, der oftest betragtes som en væsentlig faktor til opnåelsen af høj livskvalitet. Der er mange Side 1 af 72

8 forskellige definitioner på det gode liv. For nogle er det en tilstand uden sygdom, hvor der lægges vægt på sund livsstil. For andre er det forbundet med lysten, der kan indebære en usund livsstil men samtidig kan give en forhøjet risiko for adskillige sygdomme. Det kan dog ikke garanteres, at en sund livsstil vil hindre en alvorlig udvikling af aterosklerose. Derfor er det også individuelt, hvor stort man finder behovet for at efterleve forskrifterne til forebyggelse af sygdomme som aterosklerose (Bartkowiak 2010). Det kan være relevant at anvende medicin til forebyggelse af yderligere udvikling, hvis graden af aterosklerose er for høj til, at en ændring i livsstil ikke alene er tilstrækkelig, eller hvis en livsstilsændring ikke ønskes eller er muligt (Bagger 2014). Statistikken antyder at mange hjertekarpatienter anvender medicin, da antallet af brugere af hjertemedicin i 2008 svarede til 37 % af den danske befolkning (Hjertestatistik 2010). Statistikken klargør dog ikke, hvorvidt medicinen tages som alternativ eller supplement til en sund livsstil. Der kan stilles spørgsmål om, hvorvidt der er sammenhæng mellem det store medicinforbrug og patienters opfattelse af det gode liv, eller om en forebyggelse igennem livsstilsændringer er at foretrække (Hjerteforeningen 2013a). Fokus i projektet er rettet mod, hvordan det gode liv med aterosklerose kan opnås, hvor forebyggelsen gennem en sund livsstil sættes op mod behandling med medicin. Viden omkring blodet og dets bestanddele, blodkarrenes strukturer, herunder primært arterierne, samt dannelsen af blodpropper er væsentlig for forståelsen af aterosklerose. Risikofaktorerne; hypertension og forhøjet kolesterol samt hvilke aktive forebyggelsesmetoder, der kan anvendes for at mindske disse, belyses. Afslutningsvist sidestilles aterosklerose og det gode liv, hvor forebyggelsen af aterosklerose gennem livsstilsændringer og medicin sammenlignes og diskuteres. Dette undersøges blandt andet gennem et patientinterview for et nuanceret perspektiv. Anden del af projektet består af undersøgelser af blodet gennem mikroskopi og SDS-PAGE. Her ønskes blodets bestanddele og bestanddelenes indhold af proteiner klargjort. 1.2 Blodet og dets bestanddele Kendskab til blodets bestanddele og deres funktioner er relevant, for at forstå hvordan aterosklerose opstår. Blodet består af % blodplasma samt % blodelementer (Martini et al. 2012). Disse spiller en vigtig rolle i kroppen, hvor det har ansvaret for en række essentielle opgaver; transport, regulering og forsvar. Blodets biologiske hovedfunktion er transport af gasser, som ilt og kuldioxid, samt signal-, nærings- og affaldsstoffer. Blodet regulerer derudover ph, ionsammensætning og temperatur i kroppen. Sidst har nogle af blodets bestanddele en afgørende rolle i immunforsvaret, hvor de beskytter mod toksiner og patogener. Grundet blodets essentielle funktioner, er det nødvendigt, at blodet ved Side 2 af 72

9 Figur 1: Forsimplet opdeling af blodets bestanddele hvor 55 % af blodet består af plasma, mens de resterende 45 % hovedsageligt består af erytrocytter, leukocytter samt trombocytter (Egebo 2005) karlæsioner kan begrænse blodtab gennem hæmostasen Blodets egenskaber er knyttet til bestemte proteiner i blodplasmaet og de tre typer blodlegemer; erytrocytter (røde blodlegemer), leukocytter (hvide blodlegemer) samt trombocytter (blodplader) (Figur 1), hvis morfologi og funktioner forklares i det følgende (Martini et al. 2012). Blodplasma Blodplasma er blodets matrix og består af 7 % blodplasmaproteiner, 92 % vand og 1 % andre stoffer. Der findes forskellige blodplasmaproteiner, som alle varetager forskellige funktioner. Dette er blandt andet koagulationsfaktorerne, der har en afgørende rolle under koagulation, samt lipoproteiner, som transporterer triglycerider og andre lipider til cellerne (Martini et al. 2012). A B Figur 2: Erytrocytters morfologi (A) og trombocytters morfologi (B) (Martini et al. 2012). Side 3 af 72

10 Erytrocytter Erytrocytter udgør 99,9 % af elementerne i blodet. De er runde, bikonkave celler uden cellekerne og kun indeholdende få organeller (Figur 2 A). En gennemsnitlig erytrocyt har en diameter på 7,8 µm, og er 2,85 µm, hvor den er tykkest. Midten er den tyndeste del af cellen, som gennemsnitligt er på 0,8 µm Erytrocytterne har til opgave at transportere ilt fra lungekapillærerne til resten af kroppen, hvorved cellerne forsynes med ilt. Dette sker ved hjælp af det jernholdige hæmoglobin, der udgør mere end 95 %, og som farver cellerne røde (Martini et al. 2012). Trombocytter Trombocytter udgør mindre end 0,1 % af elementerne i blodet. Trombocytter er gennemsnitligt 4 µm i diameter og omkring 1 µm tykke. De har en forholdsvis uregelmæssig form og har ingen kerne men indeholder en række proteiner og enzymer (Figur 2 B). Trombocytter ses som små sorte fragmenter i forstørret blod (Martini et al. 2012). Trombocytter spiller en væsentlig rolle i hæmostasen, hvor de udskiller forskellige stoffer, der stimulerer vasokonstriktion (Martini et al. 2012). Under trombocytaktivering vil trombocytter hæfte sig til vævet og forme en prop om det skadede væv (Martini et al. 2012). Trombocytterne bidrager til koagulationsprocessen ved at frigive forskellige elementer, blandt andre en række af de nødvendige koagulationsfaktorer samt calcium-ioner. Leukocytter Leukocytter er betegnelsen for granulocytterne; neutrofilocytter, eosinofilocytter og basofilocytter, samt agranulocytterne; monocytter og lymfocytter (Martini et al. 2012). Leukocytter udgør, ligesom trombocytterne, mindre end 0,1 % af elementer i blodet men er en vigtig del af kroppens immunforsvar. De udfører ikke deres funktion i blodet men anvender det som transportvej (Sand et al. 2008). Ved infektioner forlader leukocytterne blodbanen for at bekæmpe fremmede organismer i det omkringliggende væv, hvorefter de returnerer til blodbanen via lymfekarrene (Wyller 2011b). Leukocytterne har forskellige opgaver og morfologi. Neutrofilocytter udgør % af de cirkulerende leukocytter. De er runde og typisk omkring 12 µm i diameter. Cellekernen er delt i to til fem forbundne ansamlinger (Figur 3 A). I neutrofilocytters cytoplasma findes mange granula, som indeholder enzymer og bakteriedræbende stoffer. Eosinofilocytter udgør 2-4 % af leukocytterne i blodet. Ved parasitinfektion og allergiske reaktioner stiger antallet kraftigt. Eosinofilocytter er, som neutrofilocytter, omkring 12 µm i diameter og ligeledes runde. Deres cellekerne er todelt men forbundet (Figur 3 B). Cytoplasmaet indeholder basisk granula. Basofilocytterne udgør mindre end 1 % af leukocytterne. Basofilocytter er runde celler med en diameter på 8-10 µm og er dermed mindre end neutrofilocytter og eosinofilocytter. Deres kerne er, som Side 4 af 72

11 A B C D E Figur 3: De fem forskellige leukocytter; neutrofilocyt (A), eosinofilocyt (B), basofilocyt (C), monocyt (D) og lymfocyt (E) (Martini et al. 2012). eosinofilocytters, todelt og samtidig forbundet (Figur 3 C). Basofilocytter indeholder et stort antal granula. Disse frigives i den interstitielle væske ved karlæsioner. Her vil basofilocytterne medvirke i inflammation og ophobes i det skadede væv, hvor det frigivne granula øger inflammationen. Derudover kan basofilocytterne afgive histamin, der udvider blodkarrene, samt heparin, som skal modvirke blodkoagulation (Martini et al. 2012). Monocytter udgør normalt 2-8 % af de cirkulerende leukocytter. De kugleformede celler kan være over 15 µm i diameter. Monocytter er dermed de største af leukocytterne og er næsten dobbelt så store som erytrocytter (Figur 3 D). Monocytter har en stor cellekerne, der normalt er oval eller har form som en kidney-bønne samt er omgivet af cytoplasma (Martini et al. 2012). Monocytterne befinder sig kun kort tid i blodet, inden det kommer ud i vævene. Her differentieres de til makrofager og får nye egenskaber (Wyller 2011b). Når immunsystemet er aktiveret, vil makrofagerne frigive kemiske stoffer, som tiltrækker og stimulerer blandt andre neutrofilocytter og monocytter (Martini et al. 2012). Lymfocytter udgør de resterende % af leukocytterne i blodet. Lymfocytter er 7-8 µm i diameter og dermed kun lidt større end erytrocytter. De kendetegnes ved, at cellekernen er meget stor og kun omgivet af en tynd ring af cytoplasma (Figur 3 E) (Martini et al. 2012). 1.3 Blodkarrenes struktur Transport af blodet rundt i kroppen er afgørende for udførelse af blodets funktioner. Dette foregår i kroppens blodårer, som kan inddeles i arterier, kapillærer og vener. Arteriernes tykke muskulatur bevirker, at blodet kan transporteres rundt ved højt tryk og forsyne kroppens væv med iltet blod (Martini et al. 2012). Kapillærer er små, tyndvæggede kar, som forbinder arterier og vener. Kapillærer indeholder ikke muskulatur, hvilket tillader diffusion mellem kapillærerne og vævet (Martini et al. 2012). Venerne har mindre muskulatur end arterierne og transporterer iltfattigt blod tilbage til hjertet (Martini et al. 2012). Arteriernes struktur er den væsentlige for forståelse af aterosklerose, da det kun er i disse blodkar, hvor plaque opstår. Derudover er opbygningen af arterierne afgørende for, at blodkoagulation induceres af en karlæsion. Arterievæggen består af tre lag; tunica eksterna, tunica media og tunica intima (figur 4). Tunica eksterna består af bindevæv, som forankrer blodkarret til omgivelserne. Tunica media Side 5 af 72

12 Figur 4: Arteriers struktur. Inderst findes tunica intima, som består af et endotellag, basalmembran og et tyndt bindevæv. Tunica media består af glat muskulatur og elastiske fibre, hvor tunica eksterna består af bindevæv (Modificeret fra Martini et al 2012). består af glat muskulatur samt elastiske fibre mellem muskelcellerne. Det er aktivering af glat muskulaturen, som forårsager vasokonstriktion, hvor muskulaturen i blodkarret vil kontrahere, og blodkarrets volumen bliver mindre. Dette skaber trykket, hvormed blodet sendes videre. Inderst i blodkarret findes tunica intima, der består af et endotellag omgivet af en basalmembran og et tyndt bindevæv, subendotellet (Martini et al. 2012). Subendotellet består blandt andet af kollagen samt proteinet von Willebrands-faktor (vwf) (Borup 2010). 1.4 Hæmostase Hæmostase betegner de mekanismer, som samarbejder om standsningen af en blødning ved karlæsioner. En karlæsion medfører vasokonstriktion af muskulaturen i karret, og der vil induceres trombocytaggregering og koagulation (Borup 2010). Et intakt endotellag er normalt antitrombotisk. En skade på endotellaget vil resultere i blotlæggelse af kollagen fibre samt vwf fra subendotellet. Bestemte receptorer i trombocytters membran medfører, at de bindes og fastgøres hertil. Stimuleringen af trombocytternes receptorer bevirker, at de aktiveres, hvormed trombocytterne bliver mere klæbrige og lettere aggregerer. Aggregeringen fortsætter, indtil der er dannet en trombe, som stopper blødningen (Vejergang n. d.). Tromben er skrøbelig og ustabil og vil derfor kunne opløses af trykket i blodbanen, når vasokonstriktionen ophører. Derfor påbegyndes koagulationen kort efter karlæsionen, hvorved der dannes et netværk af fibrin omkring trombocytaggregatet (Borup 2010). Koagulationen afhænger af tilstedeværelsen af koagulationsfaktorer i blodplasmaet, som indgår i en reaktion, kaldet koagulationskaskaden. Normalt cirkulerer koagulationsfaktorerne rundt i blodet som proenzymer, hvor et peptid blokerer det aktive site. Ved en karlæsion aktiveres de initierende faktorer, Side 6 af 72

13 ved at andre enzymer fra subendotellet fraspalter det blokerende peptid. Efterfølgende aktiverer faktorerne hinanden (Martini et al. 2012). Koagulationskaskaden kan opdeles i tre reaktionssekvenser; den eksterne, den interne og den fælles (Figur 5). Ved en karlæsion vil vævsfaktorer, blandt andre faktor III, frigives fra karskaden til blodet. Dette inducerer den eksterne reaktionssekvens, hvorigennem en lille mængde faktor X hurtigt vil aktiveres til Faktor Xa (Martini et al. 2012). Faktor Xa er det første skridt i den fælles reaktionssekvens (Martini et al. 2012). Den hurtige dannelse af faktor Xa vil medvirke til en aktivering af en lille mængde protrombin til trombin igennem den fælles reaktionssekvens. Trombin kan blandt andet aktivere en række faktorer, der er nødvendige i den interne reaktionssekvens (Borup 2010). Det er efterfølgende den interne reaktionssekvens, som opretholder kaskadereaktionen og danner yderligere faktor Xa i større mængder, ved at trombin bevirker positiv feedback (Borup 2010). Den fælles reaktionssekvens aktiverer, som tidligere beskrevet, protrombin til trombin, der efterfølgende både vil holde den interne reaktionssekvens i gang samt aktivere fibrinogen til fibrin. Fibrin vil polymeriseres og danne et uopløseligt krydsbundet netværk af fibrinfibre, som er en stabil trombe (Borup 2010). Figur 5: Forenklet oversigt over hæmostasen. Stiplede pile indikerer en konvertering, mens hele pile indikerer en aktivering eller en konsekvens. Karlæsion vil føre til sammentrækning af glatte muskelceller og endotelceller i karvæggen, kaldet vasokonstriktion. Dette vil give en reduceret blodgennemstrømning. Karlæsionen vil desuden medføre, at trombocytter aktiveres, hvorved de bliver klæbrige og danner en ustabil trombe. Tromben stabiliseres af et fibrinnetværk, der vil dannes gennem koagulationskaskaden (Modificeret fra Borup 2010). Side 7 af 72

14 Blodets koagulering er afhængig af flere faktorer, blandt andre calcium-ioner og K-vitamin. Alle tre reaktionssekvenser har en række faktorer, som er afhængige af calcium-ioner som cofaktorer. Dermed vil en nedsat calcium-ion-koncentration i blodplasmaet hæmme koaguleringen (Martini et al. 2012). Desuden kræver leveren tilstrækkelige mængder K-vitamin for at kunne carboxylere fire af de nydannede koagulationsfaktorer, hvilket medfører, at de kan krydsbinde til calcium-ioner. Mangel på K-vitamin kan derfor medføre, at koagulationskaskaden ikke kan fuldendes (Borup 2010). 1.5 Aterosklerose Risikofaktorer til aterosklerose Plaquedannelse i forbindelse med aterosklerose øger risikoen for karlæsioner, hvilket vil igangsætte hæmostasen. Forskellige faktorer har indvirkning på udvikling af aterosklerose, heriblandt forhøjet kolesterol og hypertension. Da disse ofte opstår som resultat af en bestemt livsstil, betegnes arteriosklerose som en livsstilssygdom. Dette betyder samtidig, at graden, hvormed sygdommen udvikles, aktivt kan forebygges gennem en sund livsstil. Forhøjet kolesterol Kolesterol er et fedtstof, som transporteres gennem blodet af lipoproteinerne; very low density lipoprotein (VLDL), low density lipoprotein (LDL) og high density lipoprotein (HDL). VLDL-partikler transporterer triglycerider fra leveren til vævene, hvor triglyceriderne hydrolyseres og afgives som fedtsyrer. Herved omdannes VLDL-partiklen til en LDL-partikel. Indtagelse af en fedtholdig kost vil således medføre, at en større mængde triglycerider udsendes til blodbanen via VLDL-partikler. Dermed vil der også kunne dannes en højere koncentration LDL-partikler i blodet. LDL-partikler indeholder kun små mængder af triglycerider men er til gengæld rige på kolesterol. LDL-partikler afgiver kolesterol til celler, der har behov herfor. Er mængden af LDL-partikler forhøjet, kan de derfor ikke deponere al kolesterolet til cellerne, hvilket kan medføre at LDL-partiklerne aflejres i karvæggen. HDL-partikler står for den reverse kolesteroltransport. HDL-partiklen kan optage overskydende mængder kolesterol fra cellerne eller fra andre lipoprotein-partikler. Derefter vil HDL-partiklen transportere kolesterolmolekylerne til leveren, hvor det bliver nedbrudt, hvorefter HDL-partiklen vender tilbage til blodbanen (Borup 2010). Kolesteroltallet er et udtryk for den totale koncentration af VLDL-, LDL- og HDL-kolesterol i blodet (Hansen 2009b). En ideel samlet koncentration af kolesterol fra LDL- og HDL-partikler overstiger ikke Side 8 af 72

15 5 mmol/l, hvor det fra LDL-partiklerne ikke må overstige 3 mmol/l og fra HDL-partiklerne som minimum skal udgøre 1 mmol/l (Borup 2010). Hypertension Hypertension betegner en tilstand, hvor hjertet øger det blodtryk, blodet pumpes ud med i arterierne (Biotronik 2010). Herved øges den mekaniske belastning på karvæggen og forårsager slid på de afstivede arterier (Wyller 2011a). Dette øger risikoen for skader, der kan igangsætte en koagulation, som vil forværre tilstanden i arterien (WebMD 2012). Længerevarende hypertension kan medføre, at den arterielle muskulatur styrkes, hvilket kan medføre både skader, da det høje tryk kan få små arterier til at briste, og forsnævringer (Blood Pressure UK 2008). Dette giver en større tendens til aflejringer i arterierne (Cleveland Clinic 2013) Ateroskleroses udvikling og plaquedannelse Ophobning af plaque giver en øget risiko for blodpropper. Plaque består af kolesterol, inflammatoriske celler, glatte muskelceller, bindevævsfibre og kalk i varierende mængder. En forhøjet mængde LDLpartikler i blodet vil føre til en større mængde LDL-partikler i arterievæggene. I arterievæggene oxideres LDL-kolesterol lettere end i blodet, da andelen af antioxidanter her er mindre samtidig med, at der dannes flere frie radikaler end i blodbanen (Borup 2010). Modificerede LDL-partikler i karvæggen genkendes af immunforsvarets makrofager, som vil bindes og optages heraf. Store mængder kolesterolholdigt lipid ophobes i makrofagerne, som omdannes til lipidholdige skumceller (Borup 2010). Skumceller er mindre mobile end makrofager og kan briste, hvilket medfører aflejring af lipider i arterievæggen, i tunica intima, hvor de ses som fedtstriber (Brock 2008; Borup 2010). De aflejrede lipider beskadiger karvæggen, som vil aktivere blandt andet glat muskulaturen og fibroblaster. Vækst af glat muskulaturen vil tykne karvæggen (Martini et al. 2012), hvor fibroblasterne vil udskille matrixproteiner. Matrixproteinerne vil danne en fibrøs kappe over lipidaflejringerne, hvormed den dannede plaque vil bestå af to lag; en fibrøs kappe og en lipidkerne (Borup 2010). Den fibrøse kappe består af glatte muskelceller og bindevævsfibre med varierende mængder af inflammatoriske celler, oftest makrofager og lymfocytter (Virmani et al. 2007). Lipidkernen består af skumceller indeholdende LDL-kolesterol (Donald 2003) Blodpropper grundet ateroskelerose I tilfælde hvor den dannede plaque løsrives eller brister, er der risiko for, at der opstår en akut blodprop, idet løsrevet plaque kan medføre tilstopning af blodforsyningen til blandt andet vitale organer. Der findes to typer plaque; stabilt og ustabilt (figur 6). Stabilt plaque består af en tyk kappe over en lille Side 9 af 72

16 lipidkerne. Dette plaque indeholder en stor mængde kollagen, der styrker og stabiliserer kappen, hvilket gør det mindre sandsynligt, at den brister (Donald 2003). I takt med udviklingen af aterosklerose vil endotelceller, skumceller og glatte muskelceller dø igennem apoptose eller nekrose, hvilket fører til dannelse af ustabilt plaque. Bristningen af skumceller medfører lipidaflejringer, mens de færre glatte muskelceller i kappen bevirker at denne svækkes (Vancraeynest 2011). Desuden vil makrofager og skumceller udskille metalloproteaser, der vil nedbryde den fibrøse kappe, så denne svækkes yderligere (Shah 2003). Ved et stort indhold af LDL-partikler i blodet vil dette ophobe sig i plaquen og udvide lipidkernen yderligere. Herved dannes store lipidrige kerner omgivet af skrøbelige fibrøse kapper, der let brister. (Vancraeynest 2011). Ved brist af den fibrøse kappe vil lipidkernen eksponeres for blodet. Denne er meget trombotisk grundet de oxiderede lipider samt faktor III, en initierende koagulationsfaktor, der stammer fra makrofagerne. Herved induceres trombocytaktivering og aggregering samt blodkoagulation, således der dannes en trombose (Shah 2003). Tromboser kan blokere blodstrømmen lokalt eller løsrives, hvorved der dannes en embolus. Den føres til et smallere blodkar, hvor den vil fæstnes og danne en emboli. Derved vil iltforsyningen til det pågældende væv delvist eller helt aflukkes (Wyller 2011a). Tromboser kan dannes ved at plaque med tiden udvides nok til at blokere karret betydeligt (Beckerman 2012). Ustabilt plaque kan også løsrives og danne en emboli (Ballegaard 2000). Derudover kan tromboser dannes, hvis ustabilt plaque brister og medfører karlæsion ved enten at sprækkes, nedbrydes eller løsrives (Virmani et al. 2007). Figur 6: Til venstre ses stabilt plaque bestående af en tyk fibrøs kappe over en lille lipidkerne. Til højre ses ustabilt plaque bestående af en tynd, skrøbelig, fibrøs kappe over en stor lipidkerne (Modificeret fra Webb 2008) Side 10 af 72

17 1.5.4 Forebyggelse af aterosklerose Udviklingen af aterosklerose kan forebygges ved forskellige tiltag, da det er en livsstilssygdom. Dette beskrives oftest med den primære, sekundære og tertiære forebyggelse. Den primære forebyggelse består i at forhindre selve sygdommen i at opstå. Risikofaktorerne er ikke nødvendigvis problemer i sig selv men bliver det på baggrund af de følgende konsekvenser (Tønnesen et al. 2005). I forbindelse med aterosklerose kan en sund livsstil medvirke til minimering af risikofaktorerne og dermed selve udviklingen heraf (Hansen 2009b). Forebyggelsestypen afhænger af den individuelle patient. Vurdering af forskellige faktorer, som blandt andet blodtryk, kolesterolkoncentrationen i blodet, fysisk aktivitet og alder, spiller ind. Resultaterne kan samlet give udtryk for risikoen for at udvikle hjertekarsygdomme indenfor en tiårig periode (Prescott et al. 2013). Er risikoen under fem procent vil der oftest lægges vægt på den primære forebyggelse gennem livsstilsændring. Vurderes risikoen til at være over fem procent vil den primære forebyggelse komplementeres af en sekundær forebyggelse (Prescott et al. 2013). Sekundær forebyggelse har til formål at begrænse sygdommen for at forbedre tilstand og overlevelseschancer (Stender 1996). Aterosklerose kan ikke kureres, men videreudviklingen kan begrænses. Livsstilsændringer er ikke altid tilstrækkelige, og medicinsk behandling kan være nødvendig (Hansen 2009a). Dette er også tilfældet for den tertiære forebyggelse, som har til formål at bremse tilbagevendende symptomer samt forhindre forværring (Tønnesen et al. 2005). I både den primære, sekundære og tertiære forebyggelse indgår livsstilsændringer som den vigtigste del af behandlingen, men hvorvidt, patienten efterlever dette, varierer. I den sekundære og tertiære forebyggelse kan der i så fald tildeles medicin som alternativ eller supplerende behandling. Sund livsstil Som en del af en sund livsstil kan højere fysisk aktivitet medføre flere positive effekter. Undersøgelser viser, at fysisk aktivitet kan hæve mængden af HDL-kolesterol i blodet samt nedsætte triglycerid- og LDL-koncentrationen, idet musklernes evne til at forbrænde fedt forbedres (Hjerteforeningen 2013b). Den øgede mængde af HDL-kolesterol i blodet kan muligvis skyldes øget fedtnedbrydende aktivitet (Gordon et al 1998). Kolesteroltallet kan ydermere reguleres via kosten. En stor indtagelse af fedtholdig mad medfører en større produktion af VLDL-partikler i leveren, der omdannes til LDL-partikler. Derudover har typen af fedtsyrer også en betydning. Umættede og især polyumættede fedtsyrer er substrater, som Acetyl-Coenzyme A Acetyltransferase (ACAT) bruger under katalysen til esterficering af kolesterol. Kolesterolestre er en måde at oplagre kolesterol på i lipoproteiner, mens det er frit kolesterol, der afleveres til cellerne Side 11 af 72

18 (Chen 2001). En høj koncentration af uesterficeret kolesterol hæmmer desuden transkription af genet for LDL-receptorer, som er nødvendige for, at kolesterol kan optages af cellerne. Herved optages mindre kolesterol fra LDL-partiklen i blodbanen (Borup 2010). Mættede fedtsyrer medvirker til en nedsat diffusion af LDL-receptorer i cellemembranen, hvorved interaktionen med LDL-partikler foregår mindre effektivt (Borup 2010). Derfor er et af de gennemgående kostråd ligeledes, at indholdet af mættede fedtsyre skal begrænses, da disse spiller en stor rolle som risikofaktor (Fødevarestyrelsen 2013). Da fedtsyrer er vigtige for kroppens vitale funktioner, er det væsentligt ikke at udelukke fedt fra kosten. Mættede fedtsyrer kan derfor med fordel erstattes af fødevarer indeholdende umættede fedtsyre. To meget omtalte flerumættede fedtsyrer er omega-3 og omega- 6, da disse er essentielle. Det er dog igen relevant at skelne mellem de to typer. Danskernes kost har et skævt forhold mellem omega-3 og omega-6 fedtsyrer, hvor det høje indtag af omega-6 fedtsyrer overskygger omega-3 fedtsyrernes virkning (Terney 2013). De umættede omega-3-fedtsyrer har en gavnlig effekt på nedsættelse af aterosklerose, da de blandt andet nedregulerer den mrna, der koder for et overførselsprotein, som overfører triglycerider til VLDL-partiklerne. Hermed vil der dannes mindre VLDL-partikler i leveren (Laksafoss 2013). Omega 3 er derudover væsentlig for dannelsen af prostaglandigner, som er en række vigtige signalstoffer. Disse kan blandt andet sænke blodtrykket og virker blodfortyndende (Vagn-Hansen 2013). Ydermere øger omega-3 mængden af HDL, hvormed forholdet mellem LDL og HDL i blodet forbedres (Scmedes 2000). Kolesterol i kosten vil kun påvirke blodets indhold af kolesterol i begrænset omfang. Øges indtaget af kolesterol gennem kosten, vil levercellernes produktion nedsættes, hvor et nedsat indtag vil øge dannelsen i leveren (Sand et al 2008). Dog kan et stort indtag af triglycerider medføre en overproduktion af kolesterol til dannelse af lipoproteiner, hvorved også syntesen af LDL-receptorer hæmmes (Borup 2010). En anden metode til nedsættelse af leverens dannelse af kolesterol er indtagelse af antioxidanterne C-vitamin og E-vitamin, som, forskellige resultater antyder, er effektive forebyggelsesmidler til aterosklerose. E-vitamin og C-vitamin sørger for at regenerere celler i blodbanen, så mindre kolesterol er nødvendig. C-vitamin beskytter og reparerer E-vitamin, hvormed det forbliver i blodbanen i længere tid og giver en øget beskyttelse mod oxidering af LDL-kolesterol (Dilling 2012) Derudover kan primært E- vitaminet D-alfa-tokoferol forhindre oxidering af fedtstoffer i blodet (Traber MG 2013). Det er dog uvist, om antioxidanter kan anvendes som forebyggelse for alle typer patienter (Cherubini 2005). Mængden af K-vitamin i kosten har ligeledes en betydning for udviklingen af aterosklerose. K-vitamin indgår i syntesen af en række koagulationsfaktorer, der er nødvendige i forbindelse med blodkoagulering ved karlæsioner. Forskning viser, at K-vitamin aktiverer bestemte K-vitamin-afhængige proteiner, Side 12 af 72

19 som blandt andet inhiberer forkalkning af arterier (Adams 2005). Risikofaktorerne til aterosklerose kan dermed nedsættes gennem øget motion og forskellige tiltag i kosten. Forebyggelse og behandling kan suppleres medicinsk. Medicinsk behandling af aterosklerose Medicin, der anvendes til behandling af aterosklerose kan have forskellige angrebspunkter. Normalt behandles der med antitrombocytmidler, lipidsænkende og antihypertensiv lægemidler (Christensen 2007). Af antitrombocytmidler findes K-vitimin-hæmmere, som vil hæmme den nødvendige carboxylering af koagulationsfaktorerne i leveren (Borup 2010). Derudover findes fem typer lipidsænkende lægemidler, som sænker fedt- og kolesterolindholdet i blodet, hvor den mest anvendte er statiner. Statiner er det middel, der sænker LDL-kolesterol mest effektivt, med op til % (Larsen 2012). Over en periode på 5 år nedsætter det risikoen for myokardieinfarkttilfælde med 33 % (Christensen 2007). Statiner hæmmer enzymet hydroxy-metyl-glutaryl-coenzyma-reduktase (HMG-CoA) i kroppen, som er afgørende for hastigheden af kolesteroldannelsen (Larsen 2013). I takt med faldet i hastigheden af kolesteroldannelsen vil cellerne kompensere herfor ved at syntetisere flere LDL-receptorer. Begge mekanismer bevirker, at LDL-kolesterolindholdet i blodet sænkes (Nichols 2014). Statiner kan have bivirkninger som muskelsmerter og kan yderst sjældent have dødelige konsekvenser (Schneider 2012a). Andre lipidsænkende midler har vist en øget risiko for dødsfald grundet andre sygdomme samtidig med, at nedsættelsen af dødsfald grundet symptomer af aterosklerose er mindre end ved brug af statiner. Af denne grund anvendes statiner som udgangspunkt som lipidsænkende lægemiddel (Bucher 1999), trods stadig usikkerhed vedrørende langtidsrisikoen (Institut for Rationel Farmakoterapi 2010). Af antihypertensiv midler findes blandt andet calciumantagonister, som blokerer calciumkanalers åbning i cellemembranen, hvorved koncentrationen af calcium i cellerne sænkes. Calcium er nødvendigt for muskelcellers sammentrækning, og calciumantagonister medfører, at hjertets sammentrækningskraft sænkes. Derudover udvider calciumantagonister arteriolerne, så blodtrykket sænkes og hjertet belastes mindre (Smed 2012). Forebyggelses- og behandlingsmetoden, der vælges, afhænger af patientens situation og ønsker. Alle tre forebyggelsesmetoder; primær, sekundær og tertiær, anvender hovedsageligt livsstilsændringer, men hvis dette ikke er ønsket eller kan efterleves af patienten, kan medicinsk behandling være nødvendig. Side 13 af 72

20 1.6 Diskussion af aterosklerose og det gode liv Følgende stilles medicin op i mod livsstilsændringer i en diskussion om hvilke forebyggelsesmetoder, der er bedst til opnåelse af det gode liv for patienter med aterosklerose. For et nuanceret perspektiv belyses det med teoretisk litteratur samt gennem et interview med en patient, der gennemgår et forebyggelsesforløb mod yderligere udvikling af aterosklerose, grundet et tidligere tilfælde af myokardieinfarkt. Interviewet kan ses i sin helhed i Bilag B1. Udviklingen af aterosklerose kan medføre en række symptomer, som kommer til udtryk ved alt fra smerter til svigt af vitale organer. Symptomer på aterosklerose opstår, når omkring to tredjedele af karrets tværsnit er aflukket (Nørskov 2006). En ændring i livsstil er relevant både hos raske personer for at begrænse udviklingen af aterosklerose, samt hos personer der allerede har udviklet en større grad af aterosklerose for at nedsætte yderligere udvikling samt risikoen for blodpropper (Christensen 2007). En livsstilsændring forsøges implementeret inden medicinsk behandling anvendes, da medicin medfører risiko for bivirkninger. Derfor prioriteres kostomlægning også som en central del af forebyggelsen hos patienter med aterosklerose, uanset om der suppleres med medicin (Christensen 2007). Patienter tilbydes professionel rådgivning, der har til formål både at informere og motivere til udførelse af den krævede ændring (Christensen 2007). I almen praksis er der opnået 85 % deltagelse med assistance fra diætister, hvilket indikerer en god effekt (Christensen 2007). Heraf vil 90 % have behov for vedvarende motivation, mens de resterende 10 % vil opnå permanent forandring af livsstil (Strømming 2006). I forbindelse med livsstilsændring er et andet fokuspunkt motion. Regelmæssig motion nedsætter risikoen for aterosklerose 2-3 gange i forhold til personer, der ikke motionerer (Christensen 2007). Moderat aktivitet er tilstrækkelig til at nedsætte symptomerne på aterosklerose hos patienter, der allerede har udviklet dette (Thompson et al. 2003). Aterosklerose behandles derfor også igennem ordineret motion (Klarlund 2011). En resultatopsamling af motion på recept viste, at der fra 2004 til 2009 har været cirka 5640 danskere, der har fået ordineret motion, og at det forventedes at stige de følgende år (Bredahl et al. 2010). Både kostændring og motion kan være lige så effektivt som medicinsk behandling, såfremt disse overholdes (Christensen 2007; Klarlund 2011). En livsstilsændring kan samtidig have en positiv effekt på en række risikofaktorer for aterosklerose som hypertension, overvægt og type 2 diabetes. Livsstil og medicin er ikke altid alternativer, men oftest komplementære(christensen 2007). Side 14 af 72

21 I planlægningen af et behandlingsforløb tages der højde for, hvordan patienten opnår et godt liv med sygdommen. Der er flere overvejelser, der har betydning for hvordan det gode liv tilgodeses. Det gode liv kan defineres på utallige måder alt efter hvilket perspektiv, det beskrives fra (Tønnesen et al. 2005). Smerte grundet bivirkninger af medicin samt krav til livsstilsændringer kan være modstridende med opfattelsen af det gode liv. Behandlingen sammensættes med øje for færrest mulige bivirkninger, men skal samtidig være realistisk ved, at det gode liv tilgodeses, så patienten kan opretholde motivationen til at efterleve en eventuel ny livsstil. I forbindelse med undersøgelse af rehabilitering i forskellige sociale klasser er det vist, at patienter der er lavt uddannede, enlige eller har mangel på fortroligt netværk, har sværere ved at efterleve de krav, der stilles i forhold til livsstilsændringer. Disse patienter klassificeres som ressourcesvage patienter og har en øget risiko for tilbagefald og forværring af deres tilstand (Meillier 2007). Vores interviewperson er et eksempel på en ressourcestærk patient, da han blandt andet har fået stor støtte af familien. Han blev som 39-årig udsat for en akut blodprop i hjertet, hvilket har påvirket hans livsstil og opfattelse af det gode liv. Han blev efter blodproppen vurderet til at have mere end 5 % risiko for tilbagefald. Derfor blev både hjerterigtig kost, motion og medicin en fast del af hans hverdag med det formål at forebygge tilbagefald. Hjerterigtig kost dækker over en diæt der følger Fødevarestyrelsens ti officielle kostråd (Fødevarestyrelsen 2013). Patienten beskriver det ikke som en udfordring at skulle ændre livsstil. Han er blot blevet mere opmærksom på at dyrke motion regelmæssigt og spise sundere alternativer. Han udtaler: I starten var jeg selvfølgelig meget fanatisk med hvad jeg spiste, men efterhånden så prøvede jeg at spise lidt forskelligt, samtidig med at jeg fik tjekket mit helbred hvert halve år. På den måde fandt jeg ud af hvilken kost jeg kan tåle uden at det påvirker mig (Bilag B1). Dette indikerer således, at patienter trods en livsstilsændring fortsat har mulighed for i nogen grad at leve, som de lyster. Motion har ligeledes ikke været en særlig udfordring for patienten, da han i vinterperioden dyrkede badminton. Den ændrede livsstil har dog medført, at patienten har oplevet en følelse af begrænsninger, eftersom han skulle følge nogle bestemte retningslinjer. Begrænsningerne overskygges dog af motivationen til at følge retningslinjerne, da dette minimerer chancerne for tilbagefald. Han mener dog ikke, at det gode liv decideret hænger sammen med sundhed, selvom han går op i sund kost og motion. Han mener, at det gode liv er ren nydelse, hvilket også fremgår af hans beskrivelse af det gode liv: Det gode liv vil jeg definere som, når jeg en fredag aften kan tage en rigtig dejlig øl, godt krydret og mørk det er livet. Og så bare sidde og slappe af med nogle popcorn, samtidig med at man ser en rigtig god fodboldkamp. Ellers vil jeg også mene at det er godt at have et sikkert bagland ved siden af, som jeg kan irritere og drille (Bilag B1). For patienten er det således friheden til at leve efter lysten og familien der skaber det gode liv. Side 15 af 72

22 Friheden til at leve, som man lyster, som væsentlig faktor for opnåelse af det gode liv, indikerer at en medicinsk behandling ligeledes kan være at foretrække. Symptomerne på ubehandlet aterosklerose vil normalt overstige bivirkningerne ved medicinsk behandling, hvorfor ingen behandling formentlig sjældent er at foretrække. Dette valg af behandlingsform medfører dog en række ulemper. Oftest vil patienten opleve bivirkninger af større eller mindre grad grundet medicinen, som for eksempel smerter, der kan påvirke dagligdagen (Schneider 2012b). Der kan også være tale om kroniske bivirkninger, der kan gøre det vanskeligere at opnå et godt og langt liv. Ses der bort fra aspektet med bivirkninger grundet medicin, kan det diskuteres hvorvidt en ændring af livsstil fortsat vil være den optimale behandling i forhold til opnåelse af det gode liv. Medicin kan muligvis medføre negative psykologiske konsekvenser, idet det kan give en følelse af at være syg (Zinckernagel et al. 2014). Denne følelse har den interviewede dog ikke, og han mener således ikke, at medicin har en betydning for det gode liv. Er patienten ikke i stand til at opretholde motivationen til en livsstilsændring og har mange tilbagefald, vil dette ligeledes have negative psykologiske konsekvenser. Hvilken behandlingsform, der således i højest grad vil kunne tilgodese det gode liv, vil dermed afhænge af patienten og dennes ressourcer. Ressourcesvage patienter vil formodentlig have en lavere tendens til at kunne gennemføre livsstilsændringer, mens ressourcestærke patienter som den interviewede har lettere ved at gennemføre livsstilsændringer og ikke føler sig begrænset af dem. I denne sammenhæng er det vigtigt at understrege, at livsstilsændringer ikke altid er mulige, da nogle patientgrupper ikke har de nødvendige ressourcer. Side 16 af 72

23 1.7 Problemformulering Aterosklerose er, grundet dets symptomer og prævalens, en af de hyppigste dødsårsager i Danmark. Aterosklerose er en sygdom, som i høj grad interagerer med blodets bestanddele, idet en række af disse indgår i en plaquedannelse. Dette kan medføre forsnævring af arterierne. Udviklingen af aterosklerose kan ikke undgås og dannelsen heraf begynder allerede tidligt i livet. Gennem en bestemt livsstil er den dog mulig at begrænse. Afhængigt af hvordan det gode liv opfattes, kan en omlægning af livsstil opfattes som en begrænsning af det gode liv. Det vil i projektet undersøges hvilke nødvendige tiltag en sådan livsstilsændring kræver, samt hvilken betydning disse kan have for opnåelsen af det gode liv. De forskellige tiltag vil påvirke koncentrationen af enkelte bestanddele i blodet, som har indflydelse på udviklingen af aterosklerose. En blodprøve anvendes til at undersøge blodets bestanddele, som separeres ved centrifugering. Derudover undersøges forekomsten af de forskellige proteiner i blodet ved hjælp af SDS-PAGE. Side 17 af 72

24 2. Forsøg Alle de teoretiske udregninger for bufferne kan findes i appendiks A Forsøgsteori Mikroskopianalyse af en fuldblodsudstrygning sammenholdes med teorien vedrørende andelen af de forskellige celler i blodet samt deres morfologi. Dele af blodet medvirker under dannelse af aterosklerose, blandt andet under hæmostasen. Tilstedeværelsen af blodets proteiner analyseres og identificeres via en sodiumdodecylsulfat-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE), hvor størrelsen af proteinerne i blodet sammenlignes med proteinmarkøren, Unstained Protein Molecular Weight Marker (#26610) Farvning af blodceller og mikroskopi Giemsa farve Cellerne i blodet kan identificeres via mikroskopi ved hjælp af Giemsa farve. Giemsa farve er en blanding af farvestoffer, hvoraf de vigtigste komponenter er farverne oxideret eosin Y, metylen blå og azur B (Sigma-Aldrich 2014a). Eosin Y er et anionfarvestof, og binder derfor til positivt ladede områder i celle- eller vævsmateriale (Møller 2013). Eosin Y bevirker, at erytrocytter, cytoplasma, cellemembraner og ekstracellulære strukturer farves orange til lyserøde (Bruckner 2013). Metylen blå og azur B er kationfarvestoffer, og binder derfor til negativt ladede områder i celle- eller vævsmateriale (Møller 2013). Hermed vil cellekernerne farves forskellige nuancer af blå til lilla (Sigma-Aldrich 2001). Cellernes forskellige morfologi vil ved farvning med Giemsa farve, der fremhæver deres karakteristika, kunne identificeres. Erytrocytter indeholder cytoplasma, som vil farves af eosin Y. Generelt for leukocytter er farvningen af cellekernen, cytoplasma og cellemembranerne. Derudover kan eventuelle granula i cellerne farves. Neutrofilocytter indeholder granula, men da de er kemisk neutrale, vil de ikke farves. Granula i eosinofilocytterne er basiske og vil farves kraftigt af det røde farvestof eosin fra Giemsa farven eller andre sure farvestoffer. Modsat eosinofilocytterne er granula i basofilocytter sure. De vil farves kraftig lilla eller blå af basiske farvestoffer som metylen blå og azur B. Da cellekernen ligeledes farves i forskellige nuancer af blå til lilla kan den være svær at se i basofilocytten. Agranulacytter farves ikke yderligere. Grundet monocytternes kugleform vil de se endnu større ud, når de flades ud ved blodudstrygning, og er dermed lette at identificere. Lymfocytter kendetegnes ved at cellekernen er meget stor og kun omgivet af en tynd ring af cytoplasma (Martini et al. 2012). Side 18 af 72

25 Figur 7: Blodfraktionering ved differentiel centrifugering med Histopaque (Modificeret fra Wikipidia 2008) Blodfraktionering ved differentiel centrifugering For nærmere undersøgelse af cellerne og bestanddelene i blodet, laves en fraktionering af blodet igennem en differentiel centrifugering. Blodet er tilsat ethylen diamin tetraacetic acid (EDTA). Dette hindrer blodet i at koagulere ved at danne kompleks med calcium-ionerne, der er en nødvendig cofaktor til en række af koagulationsfaktorerne i blodet (Patel 2009). Til fraktionering af blodet anvendes Histopaque, der består af Ficoll (et polysukrose) samt natrium diatrizoat, der modvirker, at Ficoll gør opløsningen tyktflydende. Histopaque overføres til bunden af et centrifugerør med blodet liggende øverst. Ved centrifugering vil Ficoll bevirke, at erytrocytterne aggregerer og bundfælder (Sigma-Aldrich 2014b). Desuden bevirker Ficolls lave osmotiske tryk, at granulocytternes densitet øges, idet vand vil trænge ind i cellerne (GE Healthcare 2007). Dette medfører, at opløsningen bliver overmættet og granulocytterne fælder ud i bunden af centrifugerøret sammen med erytrocytterne (Sigma-Aldrich 2014b). De resterende bestanddele har en højere densitet end Histopaque og vil forblive herover. Øverst vil plasma og størstedelen af trombocytterne findes, mens monocytter og lymfocytter vil placere sig i fasen mellem plasma og Histopaque (figur 7) (GE Healthcare 2007) Klargøring til SDS-PAGE Koagulation af plasma Fraktionen med plasma og trombocytter tilsættes calciumchlorid i en større mængde end tilsat EDTA, hvorved der igen vil forekomme frie calcium-ioner. Dette vil medføre en koagulation. Ved centrifugering vil plasmaet adskilles i supernatant og pellet. Efter udtagningen af pellet vaskes denne med PBSbuffer for at skylle eventuel supernatant ud. Fosfatbufferet saltvand (PBS), har lignende osmolaritet og Side 19 af 72