RESUMÉ OG FORKLARING AF TESTEN

Transkript

1 DxSelect (Dansk) REF EL Rev. A Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) til kvalitativ detektion af humane antistoffer mod JC-virus Til in vitro diagnostisk brug TILSIGTET BRUG Focus Diagnostics STRATIFY JCV DxSelect assay er beregnet til kvalitativ detektion af antistoffer mod JC-virus i humant serum eller plasma. Assayet er beregnet til anvendelse sammen med andre kliniske data til patienter med multipel sklerose, som modtager behandling med natalizumab, eller hvor en sådan behandling overvejes, som en hjælp ved risikostratificering for udvikling af progressiv multifokal leukoencefalopati. Assayet er udelukkende til professionel brug. Assayet er ikke beregnet til donorscreening. Dette assays ydeevne hos andre immunkompromitterede patientpopulationer eller hos patienter med andre sygdomstilstande, eller som undergår andre behandlinger, eller hos nyfødte og pædiatriske patienter er ikke klarlagt. RESUMÉ OG FORKLARING AF TESTEN Progressiv multifokal leukoencefalopati (PML) er en opportunistisk infektion i centralnervesystemet (CNS) forårsaget af JC-viruset (JCV), som er et polyomavirus, der kun er patogent for mennesker. Eksponering for JC-virus menes at finde sted tidligt i livet (før puberteten), og nyligt publicerede undersøgelser har rapporteret, at ca. 50 % til 60 % af alle voksne er blevet inficeret med JCV, hvilket ses ved tilstedeværelse af antistoffer mod JCV i serum. 1,2,3 I sjældne tilfælde kan virusset reaktiveres og medføre udvikling af PML, for eksempel hos immunkompromitterede individer.4,5,6 Behandling med immunmodulerende terapier øger risikoen for at udvikle PML hos JCV-inficerede individer. Mens eksponering for JCV er nødvendig for udvikling af PML, afhænger udvikling af sygdommen også af både værts- og virusfaktorer samt af immunstatus. 9 Da infektion med JCV er et nødvendigt trin for udvikling af PML, kan et assay, der detekterer JCVeksponering, være et potentielt nyttigt redskab til stratificering af patienter med hensyn til PML-risiko (dvs. identificering af patienter, der kan have lavere eller højere risiko for at udvikle PML). Patienter med multipel sklerose (MS) og Crohns sygdom (CD), der behandles med natalizumab, har øget risiko for PML. Man har identificeret tre risikofaktorer for PML hos patientpopulationer med MS og CD, som behandles med natalizumab: varigheden af behandlingen med natalizumab, tidligere brug af immunosuppressive lægemidler samt tilstedeværelsen af antistoffer mod JCV. Ved brug af disse tre risikofaktorer kan patientdelgrupper med både højere og lavere risiko for PML identificeres. Se venligst de aktuelle, lokalt tilgængelige ordinationsoplysninger eller supplerende oplysninger til læger for natalizumab (Tysabri ) med hensyn til detaljerede oplysninger om de kendte risici, der er forbundet med serologisk JCV-status og udvikling af PML hos natalizumab-behandlede patienter. Patienter, som har alle tre kendte risikofaktorer, har den største risiko for at udvikle PML. Risikostratificeringen for PML hos natalizumab-behandlede patienter, som tester positiv for JCV-antistoffer, er vist i Tabel 1. Tabel 1: Estimeret forekomst i USA af PML stratificeret efter risikofaktor Anti-JCV-antistofnegativ** <1/1.000 Anti-JCV-antistof-positiv* Eksponering for Ingen tidligere brug af Tidligere brug af TYSABRI immunosuppressive lægemidler immunosuppressive lægemidler 1-24 måneder <1/ / måneder 3/ / måneder 7/ /1.000 Noter: *Baseret på amerikanske PML-data efter markedsføring til og med 3. september 2013 og data for anvendelse af TYSABRI til og med 31. august **Beregning baseret på 2 tilfælde af anti-jcv-antistof negativ PML hos patienter, der var eksponeret for mindst 1 måneds terapi til og med 3. september Data for anti-jcv-antistof negative patienter afspejler verdensomspændende eksponering. Data udover 6 års behandling er begrænsede. Anti-JCV-antistof-status blev bestemt ved hjælp af en anti-jcv-antistoftest (ELISA), som er blevet valideret både analytisk og klinisk og er konfigureret med detektions- og hæmningstrin for at bekræfte tilstedeværelsen af JCV-specifikke antistoffer med en analytisk falsk negativ rate på 3 %.

2 Side 2 TESTPRINCIP I Focus Diagnostics STRATIFY JCV DxSelect testen er mikrotiterplader med 96 brønde for-coatet med JC virus-lignende partikler (VLP). Fortyndede serum- eller plasmaprøver og kontroller inkuberes i brøndene, således at JCV-specifikke antistoffer, der er til stede i prøverne, kan reagere med JC VLP-antigenet. Ikke-specifikke reaktanter fjernes ved vask. Peroxidase-konjugerede anti-human antistoffer tilsættes, således at disse kan reagere med JCV-specifikke antistoffer. Overskydende konjugat fjernes ved vask. Der tilsættes enzymsubstrat og kromogen, hvorved der finder en farveudvikling sted. Efter tilsætning af stopreagenset kvantificeres den resulterende farveændring ved spektrofotometrisk aflæsning af optisk densitet (OD). Resultaterne bestemmes ved aflæsning af OD i prøverne og sammenligning med cutoff-standardens ODaflæsninger. Hvert prøveresultat rapporteres som en indeksværdi. En prøve med en indeksværdi, der er større end en specificeret øvre cutoffværdi, rapporteres som positiv for detekterbare JCV-specifikke antistoffer, hvorimod en prøve med en indeksværdi under den specificerede nedre cutoff-værdi rapporteres som negativ for detekterbare JCV-specifikke antistoffer. En prøve med en indeksværdi, der er lig med eller imellem den øvre og den nedre cutoff-værdi rapporteres som ubestemmelig. Et ubestemmeligt resultat kræver yderligere evaluering i bekræftelses- (hæmnings)-assayet. I bekræftelses- (hæmnings)-assayet vil opløseligt JC VLP-antigen konkurrere med pladens bundne JC VLP-antigen om de JCV-specifikke antistoffer i serum- eller plasmaprøverne. Når de ubundne antistoffer er vasket væk, tilsættes der peroxidase-konjugerede anti-humane antistoffer, som binder sig til eventuelle indfangede JCV-specifikke antistoffer. Overskydende konjugat fjernes ved vask. Der tilsættes enzymsubstrat og kromogen, hvorved der finder en farveudvikling sted. Efter tilsætning af stopreagenset kvantificeres den resulterende farveændring ved spektrofotometrisk aflæsning af OD. Den procentvise hæmning beregnes for at bekræfte tilstedeværelse af JCV-specifikke antistoffer i prøven. Prøver med en procentvis hæmningsværdi, der er større end den specificerede cutoff-værdi, rapporteres som positive for detekterbare JCV-specifikke antistoffer, hvorimod prøver med procentvise hæmningsværdier, der er lavere end eller lig med cutoff-værdien, rapporteres som negative for detekterbare JCV-specifikke antistoffer. MEDFØLGENDE MATERIALER Focus Diagnostics STRATIFY JCV DxSelect testkittet indeholder følgende komponenter. Lad de medfølgende reagenser varme op til 20 til 25 C før brug. Alle uåbnede materialer er stabile ved 2 til 8 C indtil udløbsdatoen, der er anført på reagensetiketten. Åbnede materialer er stabile ved 2 til 8 C i én måned efter åbning, dog højst indtil udløbsdatoen. JCV Antigen Wells, 96 wells (JCV-antigenbrønde, 96 brønde) REF EL1951 Ag Fem plader med 96 brønde. Hver plade indeholder 12 otte-brønds mikrobrøndstrips af polystyren på en ramme. Hver brønd er coatet med rekombinant JCV VLP- (viruslignende partikel)-antigen. For at undgå kondensering, skal antigenstripsene varmes op til 20 til 25 C, inden de forseglede pakker åbnes. JCV Antigen, 0.05 ml (JCV-antigen, 0,05 ml) REF EL1952 Ag Fem hætteglas med rekombinant JC VLP. Indeholder 0,1 % natriumazid som konserveringsmiddel. Skal fortyndes før brug. JCV Cut-Off Calibrator, 0.3 ml (JCV-cutoff-standard, 0,3 ml) REF EL1953 KONTROL CAL Fem hætteglas med humant serum. Indeholder 0,1 % natriumazid som konserveringsmiddel. Skal fortyndes før brug. JCV Positive Control, 0.3 ml (JCV-positiv kontrol, 0,3 ml) REF EL1954 KONTROL + Fem hætteglas med humant serum. Indeholder 0,1 % natriumazid som konserveringsmiddel. Skal fortyndes før brug. JCV Negative Control, 0.3 ml (JCV-negativ kontrol, 0,3 ml) REF EL1955 CONTROL Fem hætteglas med humant serum. Indeholder 0,1 % natriumazid som konserveringsmiddel. Skal fortyndes før brug. JCV Conjugate, 16 ml (JCV-konjugat, 16 ml) REF EL1956 CONJ Ab Fem flasker affinitetsrensede og peroxidase-konjugerede anti-human antistoffer fra æsler. Indeholder protein, buffer og konserveringsmidler. Klar til brug. Casein Sample Diluent, 112 ml (Casein-prøvefortynder, 112 ml) REF EL1957 DIL SPE Fem flasker med protein, overfladeaktivt middel og ikke-azid-konserveringsmidler i PBS. Klar til brug. TMB Substrate, 16 ml (TMB-substrat, 16 ml) REF EL1958 SUBS TMB Fem flasker med tetramethylbenzidin (TMB) og hydrogenperoxid i buffer. En mørkeblå farve indikerer kontaminering med peroxidase. Hvis dette sker, skal der anvendes en ny flaske. Klar til brug. 10X Wash Buffer, 100 ml (10X vaskebuffer, 100 ml) REF EL0405 BUF WASH Fem flasker med overfladeaktivt middel i PBS med ikke-azid-konserveringsmidler. Forbered 1X vaskebufferopløsning før brug. 1X vaskebufferopløsning fremstilles ved at blande 100 ml 10X vaskebuffer med 900 ml destilleret eller deioniseret vand og skylle eventuelle krystaller ud. Der må kun anvendes destilleret eller deioniseret vand af højeste kvalitet til fremstilling af 1X vaskebuffer. Nogle kilder til deioniseret vand kan indeholde materialer, som kan interferere med assayet. Hvirvl det rundt, indtil det er godt blandet, og alle krystaller er opløst. Stop Reagent, 16 ml (Stopreagens, 16 ml) REF EL0105 SOLN STOP Fem flasker 1 M svovlsyre. Klar til brug. Forseglingstape 15 ark forseglingstape.

3 Side 3 MATERIALER, DER ER PÅKRÆVET, MEN IKKE MEDFØLGER 1. Destilleret eller deioniseret vand eller 500 ml skylleflaske 3. 1 liters målebæger 4. Reagensglas af borosilikatglas eller tilsvarende µl og 100 µl pipetter med engangsspidser (100 µl 8- eller 12-kanals-pipette anbefales til kørsler over 48 brønde) 6. 1 ml pipette eller dispenser og 25 ml pipetter 8. Stopur 9. Papirservietter eller absorberende papir 10. Håndvask eller affaldsbalje 11. Vortex-blander eller tilsvarende 12. ELISA-pladespektrofotometer, bølgelængde = 450 nm 13. Rent reagenstrug eller -reservoir til hvert reagens. HOLDBARHED OG HÅNDTERING 1. Kits og kitreagenser er stabile til udgangen af den måned, der er angivet med udløbsdatoen på etiketten ved opbevaring ved 2 til 8 C. 2. Reagenserne opbevares ved 2 til 8 C. 3. Anvend ikke testkits eller reagenser, hvis udløbsdatoen er overskredet. 4. Udsæt ikke reagenser for kraftigt lys under opbevaring eller inkubering. 5. Lad reagenserne varme op til C før brug. 6. Efter første brug skal alle komponenter sættes i køleskab (2 til 8 C) igen, og kan opbevares i én måned, dog højst indtil udløbsdatoen. 7. Brugte reagenser må ikke hældes tilbage i de originale beholdere. 8. Kontaminerede reagenser må ikke anvendes. 9. Reagenserne skal opbevares i deres originale beholdere. 10. Undlad at udskifte eller blande reagenser fra forskellige kit-varepartier eller fra andre producenter. ADVARSLER OG FORSIGTIGHEDSREGLER 1. Til in vitro diagnostisk brug 2. Alle blodprodukter skal behandles som potentielt smittefarlige. Kildematerialer, hvorfra dette produkt (herunder kontroller) stammer, er blevet screenet for hepatitis B-overfladeantigen, hepatitis C-antistof og HIV-1/2 (AIDS)-antistof ved hjælp af FDA-godkendte metoder og er fundet negative. Da ingen kendte testmetoder kan give 100 % sikkerhed for, at produkter, der stammer fra humant blod, ikke vil overføre disse eller andre smitstoffer, skal alle kontroller, serumprøver og udstyr, der kommer i berøring med disse prøver, imidlertid betragtes som potentielt smittefarlige og dekontamineres eller bortskaffes under overholdelse af passende forholdsregler for håndtering af 7,8 biologisk farligt materiale. CDC og NIH anbefaler, at potentielt smittefarlige materialer håndteres ved biosikkerhedsniveau Antigenbrøndene er fremstillet med rekombinant JC-viruslignende partikler. Efter tilsætning af patient- eller kontrolprøver skal stripsene betragtes som potentielt smittefarlige og håndteres i overensstemmelse hermed. 4. Natriumazid er blevet tilsat ved en koncentration på 0,1 % til nogle reagenser som antibakterielt middel. For at forhindre ophobning af eksplosive metalazider i afløbsrør af bly og kobber bør disse reagenser (se MEDFØLGENDE MATERIALER ovenfor) kun hældes i kloakken, hvis de er fortyndet, og der skylles efter med store mængder vand. Brug kobberfri og blyfri afløbssystemer, hvor det er muligt. Dekontaminér lejlighedsvis afløbene med 10 % natriumhydroxid (FORSIGTIG: ætsende), lad det stå i 10 minutter og skyl derefter med store mængder vand. 5. Anvend kun protokoller, der er beskrevet i denne indlægsseddel. Inkubationstider eller -temperaturer, der adskiller sig fra de specificerede, kan give fejlagtige resultater. 6. Krydskontaminering af patientprøver kan medføre fejlagtige resultater. Tilsæt patientprøver, og håndtér stripsene med forsigtighed for at undgå blanding af sera eller plasma fra tilstødende brønde i inkubationsbakken. Dekantér med forsigtighed. 7. Bakteriel kontaminering af serum- eller plasmaprøver eller reagenser kan frembringe fejlagtige resultater. Anvend aseptiske teknikker for at undgå mikrobiel kontaminering. 8. Udfør assayet ved 20 til 25 C. 9. Benyt korrekte pipetteringsteknikker og bibehold pipetteringsmønstret gennem hele proceduren for at sikre optimale og reproducérbare værdier. 10. Stopreagenset indeholder svovlsyre. Undgå kontakt med hud eller øjne. Ved kontakt skylles med rigelige mængder af vand. 11. En mørkeblå farve i TMB-substratet indikerer kontaminering med peroxidase. Hvis dette sker, skal der anvendes en ny flaske. PRØVETAGNING OG KLARGØRING Serum og plasma er prøvekilden. Der er ikke gjort forsøg på at vurdere assayets kompatibilitet med andre prøvetyper. Der må ikke anvendes hyperlipæmiske, varmeinaktiverede, hæmolyserede eller kontaminerede prøver, da det kan give fejlagtige resultater. Prøver, der indeholder antinukleare antistoffer eller rheumatoid faktor er ikke blevet evalueret med dette assay, og kan give fejlagtige resultater. Prøvetagning og -håndtering Blodprøverne skal tages aseptisk af uddannet personale under anvendelse af godkendte venepunkturteknikker. 7 For serum skal blodprøverne koagulere ved rumtemperatur, inden de centrifugeres. Plasmaprøver kan centrifugeres med det samme eller inden

4 Side 4 for 2 timer efter, at de er taget. Serum eller plasma overføres aseptisk til en tætsluttende, steril beholder til opbevaring. Separeret serum eller plasma bør ikke opbevares ved 22 C i mere end 8 timer. Hvis assayet ikke gennemføres inden for 8 timer, stilles prøven på køl ved 2 til 8 C. Hvis assayet ikke gennemføres inden for 48 timer, eller hvis prøver skal fragtes, fryses de ned til -20 C eller derunder. Undgå gentagen nedfrysning/optøning af prøver. 7 Optø og bland prøverne godt før brug. ASSAY-PROCEDURE DETEKTIONSASSAY 1. Lad alle de nødvendige reagenser varme op til 20 til 25 C før brug. Tag pakken med antigenbrønde ud af køleskabet. For at undgå kondensering i mikrobrøndstripsene skal antigenbrøndene varme op til til 20 til 25 C, inden folieposen åbnes. Hvis der skal anvendes mindre end en hel plade, skal ubrugte strips lægges tilbage i foliepakken med tørremiddel og lukkes helt tæt. Opbevar ubrugte antigenbrønde ved 2 til 8 C i den originale foliepose. (Bemærk: Når assayet er slut, skal rammen gemmes, så den kan bruges med de resterende strips). 2. Fortynd prøver, kontroller og standard 1:101. Mærk for eksempel rørene, og tilsæt 1 ml prøvefortynder i alle de mærkede rør. Tilføj 10 µl prøve, kontrol eller standard til de relevante rør, som indeholder 1 ml prøvefortynder, og bland godt på vortex-blander. Alle prøver og kontroller skal fortyndes én gang og køres som dobbeltbestemmelser, og cutoff-standarden skal fortyndes to gange og køres som dobbeltbestemmelse for i alt 4 brønde. Se afsnittet om kvalitetskontrol for yderligere detaljer. 3. Tilsæt 100 µl af 1:101 fortyndingen af prøver, kontroller og standard til de relevante brønde. Se et eksempel på et plade-layout nedenfor. 4. Dæk pladerne med forseglingstape, og inkubér dem i 60 ± 5 minutter ved 20 til 25 C. 5. Tag forseglingstapen af, og hæld indholdet af brøndene ud i en vask eller en affaldsbalje. Bemærk: Forseglingstapen må ikke genbruges. 6. Fyld forsigtigt hver brønd med 1X vaskebufferopløsning fra en skylleflaske, og hæld derefter indholdet ud i en vask eller en affaldsbalje. 7. Gentag vaskeprocessen (trin 6) 2 gange til. 8. Bank kraftigt på antigenbrøndene for at fjerne 1X vaskebufferen. Dup de tømte antigenbrønde tørre med bunden opad på rene papirhåndklæder eller absorberende papir for at fjerne rester af 1X vaskebuffer. 9. Tilsæt 100 µl konjugat i alle brønde ved brug af en 100 µl pipette. 10. Dæk pladerne med forseglingstape, og inkubér dem i 30 ± 2 minutter ved 20 til 25 C. 11. Gentag vasketrin 5 til og med Tilsæt 100 µl substratreagens i alle brønde ved brug af en 100 µl pipette. Inkubationstiden begyndes ved tilsætning af TMB-substrat til den første brønd. (Bemærk: Hæld aldrig substratreagens i det samme trug, som blev anvendt til konjugat). 13. Inkubér i 20 ± 2 minutter ved 20 til 25 C. 14. Stop reaktionen ved at tilsætte 100 µl stopreagens til alle brønde ved brug af en 100 µl pipette. Tilsæt stopreagenset i samme rækkefølge og tempo, som da der blev tilsat substrat. Brønde med blå farve vil skifte farve til gul. 15. Dup forsigtigt bunden af brøndene tør udvendigt med et papirhåndklæde for at fjerne dråber, der kan interferere med spektrofotometrets målinger. Gnid ikke med papirhåndklædet, da det kan ridse brøndens optiske overflade. (Bemærk: Store bobler på væskeoverfladen kan påvirke OD-målingerne). 16. Mål absorbansen i hver brønd inden for 15 minutter efter, at assayet er stoppet. Sæt ELISA-pladespektrofotometrets bølgelængde på 450 nm. Eksempel på plade-layout til detektionsassayet A C/O-1 C/O-1 Sample 5 Sample 5 Sample 13 Sample 13 Sample 21 Sample 21 Sample 29 Sample 29 Sample 37 Sample 37 B C/O-2 C/O-2 Sample 6 Sample 6 Sample 14 Sample 14 Sample 22 Sample 22 Sample 30 Sample 30 Sample 38 Sample 38 C PC PC Sample 7 Sample 7 Sample 15 Sample 15 Sample 23 Sample 23 Sample 31 Sample 31 Sample 39 Sample 39 D NC NC Sample 8 Sample 8 Sample 16 Sample 16 Sample 24 Sample 24 Sample 32 Sample 32 Sample 40 Sample 40 E Sample 1 Sample 1 Sample 9 Sample 9 Sample 17 Sample 17 Sample 25 Sample 25 Sample 33 Sample 33 Sample 41 Sample 41 F Sample 2 Sample 2 Sample 10 Sample 10 Sample 18 Sample 18 Sample 26 Sample 26 Sample 34 Sample 34 Sample 42 Sample 42 G Sample 3 Sample 3 Sample 11 Sample 11 Sample 19 Sample 19 Sample 27 Sample 27 Sample 35 Sample 35 Sample 43 Sample 43 H Sample 4 Sample 4 Sample 12 Sample 12 Sample 20 Sample 20 Sample 28 Sample 28 Sample 36 Sample 36 Sample 44 PC = positiv kontrol; NC = negativ kontrol; C/O cutoff-standard Sample 44 KVALITETSKONTROL DETEKTIONSASSAY Hver pladekørsel (eller strips fra en enkelt plade) skal inkludere cutoff-standarden og de to kontroller. Hvis der køres mere end én plade, skal cutoff-standarden og begge kontroller inkluderes på alle plader. Alle prøver og kontroller skal fortyndes én gang og køres som dobbeltbestemmelser, og cutoff-standarden skal fortyndes to gange og køres som dobbeltbestemmelse for i alt 4 brønde. Cutoff-standarden er sammensat, så den giver størst mulig differentiering mellem negative og positive prøver. Selvom absorbansværdien kan variere mellem kørsler og mellem laboratorier, skal middelværdien for brøndene med cutoff-standard ligge på mellem 0,600 og 1,700 ODenheder. Mindst 3 af de 4 replikater af cutoff-standardens OD skal ligge inden for 0,100 absorbansenhed fra middelværdien. Én af replikaterne kan eventuelt udelukkes; hvis en replikat udelukkes, skal middelværdien af OD beregnes igen ved brug af de 3 acceptable værdier. Resultaterne rapporteres som indeksværdier i forhold til cutoff-standarden. Indeksværdierne beregnes ved at dividere middelværdierne af kontrollernes eller prøvernes OD med middelværdien af cutoff-standardens OD. Bemærk: Visse mærker af ELISA-pladespektrofotometre kan give ikke-numeriske resultater i stedet for OD-værdier for målinger over spektrofotometrets detektionsgrænse. Hvis dette er tilfældet, kan indeksværdierne ikke bestemmes. En prøve med OD-værdier eller resultater, der viser mere end spektrofotometrets måleområde, er positiv for tilstedeværelse af antistoffer mod JCV.

5 Side 5 Kørselsvalidering 1. Beregn %CV for OD-værdierne for den positive kontrol og den negative kontrol. a. %CV for OD-værdierne for den positive kontrol og den negative kontrol skal være mindre end eller lig med Indeksværdien for den positive kontrol skal være mellem 0,90 og 1, Indeksværdien for den negative kontrol skal være mindre end 0,20. Hvis cutoff-standarden eller kontrollerne ikke er inden for disse parametre, skal prøvens testresultater betragtes som ugyldige, og assayet skal gentages. Yderligere kontroller kan testes i overensstemmelse med retningslinjer eller krav ifølge lokale, statslige og/eller føderale bestemmelser eller akkrediteringsorganisationer. Validering af prøver 1. Beregn %CV for OD-værdierne for hver prøve. a. %CV for OD-værdierne for hver prøve skal være mindre end eller lig med Hvis %CV for hver prøves OD-værdi er større end 20, bør prøven testes igen. FORTOLKNING AF TESTRESULTATER DETEKTIONSASSAY Beregn indeksværdien for alle prøver, og rapportér resultaterne som angivet i tabellen nedenfor. Indeksværdien beregnes ved at dividere middelværdien af prøvens OD med middelværdien af cutoff-standardens OD. Indeks Fortolkning Anbefaling >0,40 Positiv En prøve med en indeksværdi på >0,40 er positiv for tilstedeværelse af antistoffer mod JCV. 0,20 og 0,40 Ubestemmelig: En prøve med en indeksværdi på 0,20 men 0,40 betragtes som et ubestemmeligt resultat. Prøver med ubestemmelige resultater i ELISA et evalueres i bekræftelses(hæmnings)- assayet, og de endelige resultater skal rapporteres fra analysen af bekræftelses-assayet. <0,20 Negativ* En indeksværdi på < 0,20 indikerer, at der ikke er detekteret antistoffer mod JCV. *Bemærk, at det anbefales periodisk at teste patienter igen, hvis deres test for JCV-antistoffer er negativ. 9 ASSAYPROCEDURE - BEKRÆFTELSES- (HÆMNINGS)-ASSAY 1. Kør bekræftelsesassayet for alle prøver, der giver et "ubestemmeligt" resultat i detektionsassayet. Hver prøve vil blive fortyndet med prøvefortynder (ikke-hæmmet prøve) og med bekræftelsesfortynder (hæmmet prøve). 2. Lad alle de nødvendige reagenser varme op til 20 til 25 C før brug. Tag pakken med antigenbrønde ud af køleskabet. For at undgå kondensering skal mikrobrøndstripsene varme op til 20 til 25 C, inden folieposen åbnes. Hvis der skal anvendes mindre end en hel plade, skal ubrugte strips lægges tilbage i folieposen med tørremiddel og lukkes helt tæt. Opbevar ubrugte antigenbrønde ved 2 til 8 C i den originale foliepose. (Bemærk: Når assayet er slut, skal rammen gemmes, så den kan bruges med de resterende strips). 3. Fremstil bekræftelsesfortynder. a. Fremstil en 1:2500 fortynding af JCV-antigen i prøvefortynder. Tilsæt for eksempel 10 µl JCV-antigen til 25 ml prøvefortynder eller 5 µl JCV-antigen til 12,5 ml prøvefortynder. Bemærk: JCV-antigen må ikke blandes med vortex-blander. JCV-antigenopløsningen skal vendes op og ned adskillige gange så det blandes grundigt. 4. Fremstil, ligesom i detektionsassayet, de ikke-hæmmede prøver, kontroller og standarden ved at fortynde 1:101 med prøvefortynder. Mærk for eksempel rørene, og tilsæt 1 ml prøvefortynder i alle de mærkede rør. Tilføj 10 µl prøve, kontrol eller standard til de relevante rør, som indeholder 1 ml prøvefortynder, og bland godt på vortex-blander. Alle ikke-hæmmede prøver og ikke-hæmmede kontroller skal fortyndes én gang og køres som dobbeltbestemmelser, og den ikke-hæmmede cutoff-standard skal fortyndes to gange og køres som dobbeltbestemmelse for i alt 4 brønde. Se afsnittet om kvalitetskontrol for yderligere detaljer. 5. Fremstil den hæmmede positive kontrol (PC-I) og de hæmmede prøver ved at fortynde 1:101 med bekræftelsesfortynder. Mærk for eksempel rørene, og tilsæt 1 ml bekræftelsesfortynder i alle de mærkede rør. Tilføj 10 µl positiv kontrol eller prøve til de relevante rør, som indeholder 1 ml bekræftelsesfortynder, og bland godt ved pipettering. Opløsninger, der indeholder JCV-antigen må ikke vortexblandes. Den hæmmede positive kontrol og de hæmmede prøver skal fortyndes én gang og køres som dobbeltbestemmelser. Se afsnittet om kvalitetskontrol for yderligere detaljer. 6. Når den sidste prøve er fortyndet, skal alle prøverne hvile i mindst 10 minutter til højst 20 minutter ved 20 til 25 C, inden assayet køres. 7. Tilsæt 100 µl af 1:101 fortyndingen af ikke-hæmmet standard og ikke-hæmmede kontroller og prøver til de relevante brønde. Se et eksempel på et plade-layout nedenfor. 8. Tilsæt 100 µl af 1:101 fortyndingen af hæmmet positiv kontrol (PC-I) og hæmmede prøver til de relevante brønde. Se et eksempel på et plade-layout nedenfor. 9. Dæk pladerne med forseglingstape, og inkubér dem i 60 ± 5 minutter ved 20 til 25 C. 10. Tag forseglingstapen af, og hæld indholdet af brøndene ud i en vask eller en affaldsbalje. Bemærk: Forseglingstapen må ikke genbruges. 11. Fyld forsigtigt hver brønd med 1X vaskebufferopløsning fra en skylleflaske, og hæld derefter indholdet ud i en vask eller en affaldsbalje. 12. Gentag vaskeprocessen (trin 11) 2 gange til. 13. Bank kraftigt på antigenbrøndene for at fjerne 1X vaskebufferen. Dup de tømte antigenbrønde tørre med bunden opad på rene papirhåndklæder eller absorberende papir for at fjerne rester af 1X vaskebuffer. 14. Tilsæt 100 µl konjugat i alle brønde ved brug af en 100 µl pipette. 15. Dæk pladerne med forseglingstape, og inkubér dem i 30 ± 2 minutter ved 20 til 25 C. 16. Gentag vasketrin 10 til og med 13.

6 Side Tilsæt 100 µl substratreagens i alle brønde ved brug af en 100 µl pipette. Inkubationstiden begyndes ved tilsætning af TMB-substrat til den første brønd. (Bemærk: Hæld aldrig substratreagens i det samme trug, som blev anvendt til konjugat). 18. Inkubér i 20 ± 2 minutter ved 20 til 25 C. 19. Stop reaktionen ved at tilsætte 100 µl stopreagens til alle brønde ved brug af en 100 µl pipette. Tilsæt stopreagenset i samme rækkefølge og tempo, som da der blev tilsat substrat. Brønde med blå farve vil skifte farve til gul. 20. Dup forsigtigt bunden af brøndene tør udvendigt med et papirhåndklæde for at fjerne dråber, der kan interferere med spektrofotometrets målinger. Gnid ikke med papirhåndklædet, da det kan ridse brøndens optiske overflade. (Bemærk: Store bobler på væskeoverfladen kan påvirke OD-målingerne). 21. Mål absorbansen i hver brønd inden for 15 minutter efter, at assayet er stoppet. Sæt ELISA-pladespektrofotometrets bølgelængde på 450 nm. Eksempel på plade-layout til bekræftelsesassayet A C/O-1 C/O-1 Sample 5 Sample 5 Sample 13 Sample 13 (empty) (empty) Sample 5-I Sample 5-I Sample 13-I Sample 13-I B C/O-2 C/O-2 Sample 6 Sample 6 Sample 14 Sample 14 (empty) (empty) Sample 6-I Sample 6-I Sample 14-I Sample 14-I C PC PC Sample 7 Sample 7 Sample 15 Sample 15 PC-I PC-I Sample 7-I Sample 7-I Sample 15-I Sample 15-I D NC NC Sample 8 Sample 8 Sample 16 Sample 16 (empty) (empty) Sample 8-I Sample 8-I Sample 16-I Sample 16-I E Sample 1 Sample 1 Sample 9 Sample 9 Sample 17 Sample 17 Sample 1-I Sample 1-I Sample 9-I Sample 9-I Sample 17-I Sample 17-I F Sample 2 Sample 2 Sample 10 Sample 10 Sample 18 Sample 18 Sample 2-I Sample 2-I Sample 10-I Sample 10-I Sample 18-I Sample 18-I G Sample 3 Sample 3 Sample 11 Sample 11 Sample 19 Sample 19 Sample 3-I Sample 3-I Sample 11-I Sample 11-I Sample 19-I Sample 19-I H Sample 4 Sample 4 Sample 12 Sample 12 Sample 20 Sample 20 Sample 4-I Sample 4-I Sample 12-I Sample 12-I Sample 20-I Sample 20-I Cut-offs, Controls and Samples diluted in Sample Diluent (Uninhibited controls and samples) Positive Control and Samples diluted in Confirmation Diluent (Inhibited controls and samples) KVALITETSKONTROL - BEKRÆFTELSES- (HÆMNINGS)-ASSAY Hver pladekørsel (eller strips fra en enkelt plade) skal inkludere den ikke-hæmmede cutoff-standard og de to ikke-hæmmede kontroller. Hvis der køres mere end én plade, skal den ikke-hæmmede cutoff-standard og begge ikke-hæmmede kontroller inkluderes på alle plader. Alle ikkehæmmede prøver og ikke-hæmmede kontroller skal fortyndes én gang og køres som dobbeltbestemmelser, og den ikke-hæmmede cutoffstandard skal fortyndes to gange og køres som dobbeltbestemmelse for i alt 4 brønde. Den hæmmede positive kontrol (PC-I) skal også fortyndes én gang og køres som dobbeltbestemmelse på alle plader. Alle hæmmede prøver skal fortyndes én gang og køres som dobbeltbestemmelse. Cutoff-standarden er sammensat, så den giver størst mulig differentiering mellem negative og positive prøver. Selvom absorbansværdien kan variere mellem kørsler og mellem laboratorier, skal middelværdien for brøndene med cutoff-standard ligge på mellem 0,600 og 1,700 ODenheder. Mindst 3 af de 4 replikater af cutoff-standardens OD skal ligge inden for 0,100 absorbansenhed fra middelværdien. Én af replikaterne kan eventuelt udelukkes; hvis en replikat udelukkes, skal middelværdien af OD beregnes igen ved brug af de 3 acceptable værdier. Resultaterne rapporteres som % hæmning. Resultaterne rapporteres som % hæmning. Se afsnittet Fortolkning af testresultater Bekræftelsesassay (hæmningsassay) vedrørende beregning af % hæmning. Bemærk: Visse mærker af ELISA-pladespektrofotometre kan give ikke-numeriske resultater i stedet for OD-værdier for målinger over spektrofotometrets detektionsgrænse. Hvis dette er tilfældet, kan % hæmning ikke bestemmes. En prøve med et resultat, der viser en hæmmet OD-værdi, der er højere end spektrofotometrets måleområde indikerer, at der ikke er detekteret antistoffer mod JCV. Der behøves ingen yderligere bekræftende test. Kørselsvalidering 1. Beregn %CV for OD-værdierne for den ikke-hæmmede positive kontrol, den hæmmede positive kontrol (PC-I) og den ikke-hæmmede negative kontrol. a. %CV for OD-værdierne for den ikke-hæmmede positive kontrol og den hæmmede positive kontrol (PC-I) og den ikkehæmmede negative kontrol skal være mindre end eller lig med Den ikke-hæmmede indeksværdi for den positive kontrol skal være mellem 0,90 og 1, Den positive kontrols % hæmning skal være større end 70 %. 4. Indeksværdien for den negative kontrol skal være mindre end 0,20. Hvis cutoff-standarden eller kontrollerne ikke er inden for disse parametre, skal prøvens testresultater betragtes som ugyldige, og assayet skal gentages. Yderligere kontroller kan testes i overensstemmelse med retningslinjer eller krav ifølge lokale, statslige og/eller føderale bestemmelser eller akkrediteringsorganisationer. Validering af prøver 1. Beregn %CV for de ikke-hæmmede og hæmmede OD-værdier for hver prøve. a. %CV for de ikke-hæmmede og hæmmede OD-værdier for hver prøve skal være mindre end eller lig med Hvis %CV for de ikke-hæmmede og hæmmede OD-værdier for hver prøve er større end 20, bør prøven testes igen. FORTOLKNING AF TESTRESULTATER BEKRÆFTELSES- (HÆMNINGS)-ASSAY Beregn den procentvise hæmning (% hæmning) for alle prøver, og rapportér resultaterne som angivet i tabellen nedenfor.

7 Side 7 % hæmning beregnes ved først at beregne middelværdien af den ikke-hæmmede OD og middelværdien af den hæmmede OD for prøven. % hæmning beregnes som følger: [(ikke-hæmmet middel-od hæmmet middel-od)/ikke-hæmmet middel-od]*100 = % hæmning Rapportér % hæmning rundet op/ned til én decimal (for eksempel skal 40,357 % rapporteres som 40,4 %). % Hæmning Fortolkning Anbefaling >45,0% Positiv En prøve med en % hæmning på >45 er positiv for tilstedeværelse af antistoffer mod JCV. Der behøves ingen yderligere bekræftende test. 45,0% Negativ* En prøve med en % hæmning på 45 indikerer, at der ikke er detekteret antistoffer mod JCV. Hvis en prøves % hæmning er negativ, rapporteres prøven som værende negativ. Der behøves ingen yderligere bekræftende test. *Bemærk, at det anbefales periodisk at teste patienter igen, hvis deres test for JCV-antistoffer er negativ. 9 BESTEMMELSE AF AFSKÆRINGSPUNKTET For at karakterisere antistofresponset mod smitstoffer hos mennesker er det afgørende at have referencesera fra både inficerede og ikkeinficerede individer. Det skal dog bemærkes, at JCV-infektion er usædvanlig, idet den er klinisk asymptomatisk, hvilket gør det vanskeligt at skelne generelt mellem JCV-inficerede og ikke-jcv-inficerede individer. Selvom ca % af alle JCV-inficerede individer udskiller viral dna i urinen, detekteres JCV-dna ofte ikke i inficerede individers blod eller urin, selv ikke når infektionen medfører udvikling af PML. 9 Der er ingen evidens for, at testning for JCV-dna i blod eller urin kan identificere alle JCV-inficerede individer, men udskillelse af virus i urinen er en bekræftelse af infektion med JCV. Derfor blev sera fra patienter med virus i urinen anvendt til at bestemme de positive referencesera til assayet. Assayets afskæringspunkt blev bestemt ud fra fordelingen af serologiske respons i prøver indsamlet fra patienter med JCV-virus i urinen i STRATIFY JCV DxSelect assayet. Det nedre afskæringspunkt for detektionsassayet blev sat til 0,2 og det øvre afskæringspunkt til 0,4, og detektionsassayets hæmningsafskæringspunkt blev sat til 45 %. Assayet har en estimeret falsk negativ-rate på 2,2 % baseret på et negativt JCV-antistofresultat i 4 ud af 184 serumprøver indsamlet fra patienter med virus i urinen i forsøget STRATIFY-1. BEGRÆNSNINGER 1. Assayets ydeevnekarakteristika er baseret på test af prøver fra patienter med multipel sklerose, som var behandlingsnaive i forhold til eller under behandling med natalizumab. 2. Ydeevnen for dette assay er ikke blevet fastlagt for andre matricer end serum eller plasma (EDTA, natriumheparin). 3. Alle resultater fra dette og andre serologi-assays skal korreleres med den kliniske historie, epidemiologiske data og andre data, der er tilgængelige for den behandlende læge, ved evaluering af patienten. 4. Lægen skal tage alle kendte risikofaktorer i betragtning, når JCV-serologisk status anvendes som hjælp til at evaluere risikoen for at udvikle PML. 5. Der er stadig en risiko for, at patienter, som er anti-jcv-antistof negative, kan udvikle PML, da det er muligt at få en ny JCV-infektion eller et falsk negativt resultat. Den rapporterede serokonversionsrate hos patienter med MS (skifter fra anti-jcv-antistof negativ til positiv og forbliver positiv i efterfølgende tests) er 3 til 8 procent årligt. Derudover kan nogle patienters serostatus ændres med mellemrum. 6. Negative resultater udelukker ikke tilstedeværelse af JC-virus (antistofniveauet i blodet kan være midlertidigt nedsat, for eksempel i tilfælde af immunsuppression, eller kan være under assayets detektionsgrænse) 7. Detektionsgrænsen (cutoff) er fastsat ved brug af sera fra individer med positiv urintest for JCV-dna og antages at gælde for individer, der ikke udskiller JCV-dna i urinen. 8. Testen må ikke udføres før mindst to uger efter plasmaudskiftning på grund af fjernelse af antistoffer fra serum. 9. Gammaglobulin vides at krydsreagere med dette assay. Patienter, som undergår γ-globulin-terapi, kan få fejlagtige resultater. 10. Prøver, som indeholder antistoffer mod C. pneumonia, CMV, HIV eller HSV-1, kan krydsreagere med dette assay. 11. Mulig krydsreaktivitet med antistoffer mod andre polyomavirusser (Merkelcelle-virus, WU-virus eller KI-virus) er ikke blevet evalueret. 12. Assayets ydeevne er ikke blevet evalueret med prøver, der indeholder rheumatoid, antinukleart antistof eller har bakteriel kontaminering. Disse stoffer kan interferere med assayets ydeevne. 13. Assayreagenser fra ét kit må ikke anvendes sammen med reagenser fra et andet kit. 14. Dette assay må ikke anvendes til at diagnosticere PML eller vurdere natalizumabs effektivitet. 15. Høje positive resultater kan forekomme med en OD, der er højere end spektrofotometrets måleområde, hvorved der ikke vil blive givet en numerisk OD-værdi, og læse-enheden vil ikke beregne en indeksværdi. De enkelte laboratorier bør bestemme rapporteringsområdet for deres indeksværdier. Når OD er højere end dette område, kan indeksværdien rapporteres som værende større end områdets top. 16. Prævalensen af JCV-specifikke antistoffer i testpopulationen vil påvirke assayets prædiktive værdi. 17. Et enkelt positivt resultat indikerer kun en tidligere immunologisk eksponering. Niveauet af antistofreaktion må ikke benyttes til bestemmelse af aktiv infektion eller sygdomsstadie. 18. Størrelsen af indeksværdien over cutoff-værdien indikerer ikke hvor meget antistof der er til stede i alt.

8 Side 8 YDEEVNEKARAKTERISTIKA Klinisk ydeevne (komparativ overensstemmelse) Da PML er en sjælden hændelse hos natalizumab-behandlede patienter, blev der anvendt data indsamlet fra både indberetninger i kliniske forsøg og indberetninger efter markedsføring af bekræftede PML-tilfælde til at vurdere den kliniske ydeevne af STRATIFY JCV DxSelect assayet til PML risikostratificering. Der blev udviklet en klinisk plan for indsamling af serumprøver fra natalizumab-behandlede patienter før debut af PML til testning for JCV-antistof. I alt 31 tilgængelige serumprøver fra patienter med bekræftet PML, som blev indsamlet mindst 6 måneder før den kliniske PML-diagnose, blev testet for JCV-antistof-status ved hjælp af STRATIFY JCV DxSelect assayet. Udover præ- PML prøverne, blev 1330 prøver fra MS-patienter testet ved STRATIFY JCV DxSelect assayet. I alt 707 patienter, der blev behandlet, testede positiv for antistoffer mod JCV ved hjælp af testen, og positivitetsraten blev estimeret til at være 58,7 % (414/707) med et 95 % CI på 54,9 % til 62,1 %. Et assay er statistisk informativt, hvis procentdelen af positive resultater hos patienter med den relevante sygdom er større end procentdelen af positive resultater i den udsatte befolkning. Den JCV-antistof-positivitet på 100 %, der blev påvist hos de 31 natalizumabbehandlede PML-patienter før PML-diagnosen, var væsentligt anderledes end JCV-antistof-positiviteten på 58,7 % hos MS-populationen og udgør ca. en fordobling af risikoen for PML i forhold til forekomsten af PML i den generelle natalizumab-behandlede population. I tidligere kliniske studier med natalizumab brugte man statistisk modellering til at estimere risikoen for at udvikle PML. Den relative risiko for patienter, som har fået natalizumab i mindst 18 måneder, er vist i nedenstående tabel. Risikoen blev beregnet på baggrund af statistisk modellering med en antagelse om, at der er ét hypotetisk PML-tilfælde med et negativt testresultat (38 PML-tilfælde: 37 positive og 1 hypotetisk negativt) samt en antagelse om, at der er patienter i studiet. Tabel 1: Estimeret forekomst af PML efter JCV-serologisk status Antal med PML Antal uden PML Samlet antal behandlede patienter JCV-serologisk status Positiv Negativ 1* I alt Risiko for PML (pr ) behandlet med natalizumab 18 måneder for positivt resultat Risiko for PML (pr ) behandlet med natalizumab 18 måneder for negativt resultat Relativ risiko 5,09 95 % CI: 3,70 til 7,01 0,17 95 % CI: 0,03 til 0,95 30,4 95 % CI: 5,3 til 437,4 *For det negative resultat antoges et hypotetisk tilfælde for at muliggøre beregning af punktestimatet. Studierne viste, at positivitetsraten for JCV-antistoffer ikke er afhængig af tidligere IS-brug eller varigheden af behandlingen med natalizumab. Resultaterne af STRATIFY JCV DxSelect assayet kan anvendes sammen med de andre etablerede PML-risikofaktorer,tidligere IS-brug og varigheden af behandlingen med natalizumab til at stratificere en persons risiko for PML. Se venligst Tabel 1 og ordinationsoplysningerne for yderligere risikoestimater. Ydeevne med præ-pml prøver. STRATIFY JCV DxSelect assayet blev sammenlignet med et godkendt anti-jcv assay (STRATIFY JCV antistof ELISA) ved brug af serumprøver fra PML-patienter mindst 6 måneder før PML-diagnosen. Eftersom PML er en sjælden hændelse hos natalizumab-behandlede patienter, blev der anvendt data indsamlet fra både indberetninger i kliniske forsøg og indberetninger efter markedsføring af bekræftede PMLtilfælde til at vurdere STRATIFY JCV DxSelect assayets kliniske ydeevne for PML-risikostratificering. Enogtredive tilgængelige serumprøver fra patienter med bekræftet PML, der var indsamlet mindst 6 måneder før den kliniske PML-diagnose, blev testet på ét internt testcenter for JCV-antistof-status ved hjælp af STRATIFY JCV DxSelect assayet og den validerede laboratoriemetode. Prøvesættet udviste 100 % (31/31) positiv overensstemmelse (95 % CI: 89,0 % til 100 %) med det validerede assay. Ydeevne med arkiverede kliniske prøver To grupper prospektivt indsamlede og arkiverede kliniske prøver hentet fra de kliniske studier STRATIFY-2 og AFFIRM blev anvendt til at vurdere STRATIFY JCV DxSelect assayets ydeevne i forhold til den validerede laboratoriemetode, der blev anvendt i de kliniske studier STRATIFY-2 og AFFIRM. Den ene gruppe bestod af patienter, der fik natalizumab, og den anden patientgruppe havde ikke fået natalizumabbehandling (og overvejede at få natalizumab). Prøverne var blindede og tilfældigt fordelt til to eksterne testcentre og et internt testcenter. Dataene for hver gruppe blev analyseret hver for sig. Resultaterne for de to grupper hver for sig er vist i nedenstående tabeller. Den procentvise positiv-overensstemmelse var større end 97 % for begge grupper og den procentvise negativ-overensstemmelse var større end 90 % for begge grupper.

9 Tabel 2: Overensstemmelse for kliniske prøver patienter, der fik natalizumab STRATIFY JCV DxSelect Positiv Godkendt anti-jcv-assay Negativ STRATIFY JCV DxSelect Side 9 Positiv Negativ I alt Procentvis positiv-overensstemmelse (PPA) Procentvis negativ-overensstemmelse (NPA) 97,0 % (385/397) 95 % CI: 94,8 til 98,3 % 90,6% (281/310) 95 % CI: 86,9 til 93,4 % Tabel 3: Overensstemmelse for kliniske prøver - patienter, der overvejer natalizumab STRATIFY JCV DxSelect Positiv Godkendt anti-jcv-assay Negativ Positiv Negativ I alt % positiv-overensstemmelse (PPA) % negativ-overensstemmelse (NPA) 98,5% (326/331) 95 % CI: 96,5 til 99,4% 91,8% (268/292) 95 % CI: 88,1 til 94,4% I alt I alt Positivitetsrate og forventede værdier: STRATIFY JCV DxSelect assayet blev anvendt til at evaluere positivitetsraten for JCV-antistof i serum- og plasmaprøver fra en geografisk forskelligartet kohorte på 1330 MS-patienter. Kohorten omfattede MS-patienter fra kliniske forsøg, inklusive et afsluttet klinisk fase 3-studie med natalizumab hos MS-patienter (AFFIRM C-1801) og et igangværende studie til evaluering af seroprævalens hos MS-populationen (STRATIFY-2 [101JC402). De kliniske karakteristika for MS-patienterne i de to studier er vist i Tabel 5. Alders- og kønsfordelingen i MS-kohorten, der blev testet med STRATIFY JCV DxSelect ligner alders- og kønsfordelingen af de MS-patienter, der blev behandlet med natalizumab efter markedsføring. Positivitetsraten for JCV-antistof hos MS-kohorten var %, hvilket svarer til det, der er blevet rapporteret i litteraturen. 9, 10 Det blev vist, at positivitetsraten for JCV-antistof steg med alder og var lavere hos kvinder sammenlignet med mænd, hvilket også svarer til det, der er blevet rapporteret i litteraturen hos raske voksne ved hjælp af lignende assaymetoder. 10,3, 2 Data for seroprævalens blev evalueret for hvert studie. Seroprævalensen, der blev observeret ved hjælp af STRATIFY JCV DxSelect assayet var på 59 % (467/792) i STRATIFY-2-studiet og 55 % (296/538) i AFFIRM-studiet. Disse seroprævalensværdier svarer til de seroprævalensværdier, der blev observeret i de kliniske studier, hvor forholdet mellem JCV-serologisk status og PML-udvikling blev beskrevet. Derudover påviste STRATIFY JCV DxSelect assayet 100 % overensstemmelse med 31 præ-pml prøver. Tabel 4: Demografiske data og prævalensen af JCV-antistof for MS-patienter AFFIRM (N=538) STRATIFY-2 (N=792) Alder (år) Aldersinterval Middel 35,8 46,4 Median Køn (%)* Mænd 173/538 (32,2 %) 202/792 (25,5%) Kvinder 365/538 (67,8%) 590/792 (74,5%) Geografi Nordamerika og EU/resten af verden USA Positivitetsrate for JCV-antistof 1 (95 % CI) % JCV-antistof-positiv 297/538 (55,2%) 467/792 (59,0%) (51,0 til 59,4) % JCV-antistof-negativ 241/538 (44,8%) (40,6 til 49,0) 1. I alt 10,4 % af de prøver, der blev testet i AFFIRM-studiet og 16,4 % af de prøver, der blev testet i STRATIFY-2-studiet, var ubestemmelige i DETEKTIONSASSAYET. (55,5 til 62,3) 325/792 (41,0%) (37,7 til 44,5)

10 Side 10 Reproducerbarhed Assayets reproducerbarhed blev vurderet ved hjælp af en protokol, der er baseret på en CLSI-retningslinje for estimering af et assays præcision 11. Protokollen bestod i at teste tre replikater af hvert panelmedlem ved to kørsler om dagen på i alt fem dage på to eksterne testcentre og ét internt testcenter. Prøvepanelet for reproducerbarhed bestod af fire serumprøveniveauer og fire plasmaprøveniveauer (EDTA) samt den høje og lave positive kontrol. De fire niveauer omfattede en negativ, lav, ubestemmelig og moderat positiv prøve fremstillet i en serummatrix og en negativ, lav, ubestemmelig og moderat positiv prøve fremstillet i en plasmamatrix. De ubestemmelige prøver blev testet samtidig i bekræftelsesassayet og i detektionsassayet. Tabel 5: Reproducerbarhed Parameter Prøvematrix Prøvens navn Kvalitative resultater ND I D NV I alt N Middel Mellem behandlingssteder Kvantitative resultater Variabilitetskomponenter Mellem kørsler/ operatører Mellem dage Inden for assayet (repeterbarhed) I alt SD %CV SD %CV SD %CV SD %CV SD %CV OD Cutoff 120 1,131 0,145 12,8 0,067 5,9 0,088 7,8 0,037 3,2 0,186 16,5 Kontroller Negative kontroller Positive kontroller ,102 0,010 9,5 0,007 7,1 0,010 9,7 0,006 6,1 0,017 16, ,202 0,008 0,7 0,010 0,8 0,022 1,8 0,036 3,0 0,044 3,7 Ubestemmelig ,270 0,010 3,7 0,009 3,4 0,011 4,2 0,014 5,1 0,023 8,3 INDEKS Plasma Lav positiv ,410 0,000 0,0 0,000 0,0 0,022 5,5 0,023 5,7 0,032 7,9 Medium positiv ,858 0,041 4,7 0,025 3,0 0,018 2,1 0,059 6,9 0,078 9,1 Negativ ,129 0,002 1,8 0,007 5,5 0,013 9,8 0,008 5,8 0,017 12,8 Ubestemmelig ,283 0,012 4,3 0,000 0,0 0,011 3,9 0,018 6,3 0,024 8,5 Serum Lav positiv ,422 0,004 0,9 0,004 1,1 0,018 4,2 0,013 3,1 0,023 5,4 Medium positiv ,055 0,048 4,5 0,000 0,0 0,041 3,9 0,045 4,3 0,078 7,4 Negativ ,109 0,024 22,3 0,000 0,0 0,018 16,5 0,013 11,7 0,033 30,1 % Hæmning Plasma Serum Ubestemmelig ,05 2,006 3,9 0,000 0,0 3,648 7,1 3,357 6,6 5,348 10,5 Ubestemmelig ,59 3,889 6,2 2,438 3,9 0,000 0,0 5,550 8,9 7,202 11,5 ND = Ikke detekteret, I = Ubestemmelig, D = Detekteret, NV = Ugyldig Reproducerbarhed ved det nedre afskæringspunkt For at demonstrere præcisionen tæt på det nedre afskæringspunkt blev to kunstigt fremstillede prøver, en serum- og en plasmaprøve (EDTA), med en analytkoncentration tæt på assayets nedre afskæringspunkt testet. Hver prøve blev fortyndet tyve gange og testet på ét internt center i detektionsassayet og i bekræftelsesassayet. Som vist i følgende tabel var %CV 2,6 %.

11 Side 11 Tabel 6: Reproducerbarhed ved det nedre afskæringspunkt Prøve Deskriptiv statistik for detektionsassayet (Indeks) Deskriptiv statistik for bekræftelsesassayet (% hæmning) matrix N Min Maks Middel SD %CV N Min Maks Middel SD %CV Plasma 20 0,33 0,36 0,34 0,01 2, ,66 66,97 65,11 1,43 2,2 Serum 19* 0,19 0,21 0,2 0,01 2, ,89 60, ,16 2 *Én replikat var ugyldig Krydsreaktivitet Krydsreaktivitet blev evalueret i et tredelt studie, der blev udført på et internt testcenter. Studiets første del evaluerede krydsreaktiviteten med kommercielt tilgængelige humane antistoffer, som blev tilsat JCV-negativt serum og plasma målt ved STRATIFY JCV DxSelect assayet. De potentielt krydsreagerende antistoffer blev tilsat i koncentrationer, der blev vurderet til at være 2-4 gange højere end den anslåede detektionsgrænse for JCV-antistoffer. Ingen af de testede antistoffer blev detekteret med STRATIFY JCV DxSelect assayet. Der sås ingen reaktivitet med de tre potentielt krydsreagerende antistoffer, der blev testet i første del af forsøget. Tabel 7: Krydsreaktivitet - Første del Tilsatte antistoffer Antal detekteret Krydsreaktant Koncentration Serum Plasma Antistof mod Escherichia coli 0,4 µg/ml 0/3 0/3 Antistof mod Mycobacterium tuberculosis 0,4 µg/ml 0/3 0/3 Antistof mod Pneumocystis jiroveci ikke kvantificeret 0/3 0/3 I anden del af studiet bestod forsøgspanelet af mindst tyve overskydende prøver, der tidligere var testet positiv for hvert af de potentielt krydsreagerende antistoffer. Hvert medlem af panelet blev evalueret ved brug af STRATIFY JCV DxSelect assayet sammen med relevante kontroller. Seroprævalensen af JCV for hver gruppe af potentielt krydsreagerende reaktanter i panelet blev sammenlignet med den forventede seroprævalens af JCV i den normale befolkning. Hvis en gruppe udviste en højere seroprævalens af JCV (>70 %) end forventet, kunne det være tegn på potentiel krydsreaktivitet. Fire patientgrupper (C. pneumoniae, HIV, CMV, HSV 1) udviste en positivitetsrate, der var en smule højere end den, der er indberettet fra tidligere forsøg. Resultaterne tyder på, at disse grupper udviser potentiel krydsreaktivitet. Tabel 8: Krydsreaktivitet Anden del Sammenligning af seroprævalens Prøvematrix Krydsreaktant Antal replikater eller prøver i alt Screeningsresultattælling (baseret på indeks) D IND ND Bekræftet resultattælling (baseret på % hæmning) Ikke testet Endelig fortolkning Tælling % D ND D ND D ND Ukendt HIV ,3 22,7 C. pneumoniae ,1 22,9 C. trachomatis ,0 40,0 CMV ,0 20,0 Candida ,5 32,5 EBV ,5 37,5 Serum HSV ,8 29,2 HSV ,0 55,0 HHV ,0 45,0 Listeria ,1 52,9 Mycoplasma ,0 50,0 Treponema pallidum ,4 31,6 VZV ,0 35,0 Alle ,8 33,2 D= Detekteret, ND = Ikke detekteret, IND = Ubestemmelig

12 Side 12 Tredje del af vurderingen af krydsreaktivitet bestod af en evaluering af den potentielle krydsreaktivitet med andre polyomavirusser. Heri indgik en undersøgelse af krydsabsorption ved brug af BKV viruslignende partikler (VLP). I alt 40 kliniske prøver, der tidligere havde testet positive for JCVantistoffer i STRATIFY JCV DxSelect assayet, blev testet i et assay af bekræftelsestypen ved brug af JCV VLP og BKV VLP. Et kontrolsæt bestod af prøver tilsat JCV VLP i samme VLP-koncentration som den, der anvendes i bekræftelsesassayet. De testede prøver blev tilsat BKV VLP i samme koncentration. De testede prøver anses for at være krydsreaktive, hvis den procentvise ændring i signal mellem prøver uden tilsætning og prøver tilsat BKV VLP er > 45 %. Kontrolsættet udviste en procentvis ændring i OD, der svarede til forventningerne. Testprøverne udviste en procentvis ændring i OD-værdier som følge af BKV VLP i området -15 til 27 %. Ingen af prøverne udviste en ændring på >45 % i ODsignal, når de var tilsat BKV VLP, hvilket tyder på, at assayet ikke krydsreagerer med BKV. Yderligere analyse af VP1-proteinets struktur hos andre polyomavirusser tyder på, at BKV og JCV er mere tæt beslægtede (79,4 % lighed) end andre polyomavirusser, såsom Merkelcelle-virus og WU-virus og KI-virus (30,8 til 50,8 % lighed). På grund af forskellene i virusstruktur blev der ikke udført et lignende eksperiment med VLP fra andre polyomavirus. Interferens Potentiel interferens pga. endogene stoffer blev evalueret ved hjælp af en protokol, der er baseret på en CLSI-retningslinje for estimering af effekten af interfererende stoffer. 12 Testpanelet bestod af serum- og plasmaprøver, der indeholdt JCV-antistof med en indeksværdi, der er tæt på assayets afskæringspunkt. Prøverne blev tilsat det potentielt interfererende stof på det højest mulige endogene niveau og blev sammenlignet med baseline-testning af de samme serum- og plasmaprøver, som ikke indeholdt det interfererende stof. For alle de potentielt interfererende stoffer, med undtagelse af γ-globulin, forårsagede den observerede signalforskel ingen ændringer i fortolkningen af det endelige resultat. Potentiel interferens mistænkes, hvis den procentvise ændring fra baseline er >20 %. Kommercielt tilgængelig γ-globulin fremstilles ud fra normalt humant serum, som indeholder IgG-antistoffer, og da seroprævalensen af antistoffer mod JCV-virus er ca. 55 % i den normale population, forventes det at reagere med dette assay. Tabel 9: Resumé af interferens Signal sammenlignet med baseline Plasma Serum Stoffets navn Stofkoncentration Gennemsnitligt indeks % Gennemsnitligt indeks Ændring % Ændring Baselineprøve Interferensprøve fra Baselineprøve Interferensprøve fra baseline baseline Albumin 120 mg/ml 0,35 0,38 8,6 0,43 0,37-14,0 Ascorbinsyre 0,03 mg/ml 0,40 0,42 5,0 0,42 0,44 4,8 Bilirubin 0,2 mg/ml 0,33 0,33 0,0 0,42 0,38-9,5 Kolesterol 5 mg/ml 0,48 0,40-16,7 0,46 0,44-4,3 Gammaglobulin 60 mg/ml 0,38 3,54 831,6 0,41 3,52 758,5 Hæmoglobin 110 mg/ml 0,41 13,5 0,46 5,0 Hæmoglobin 165 mg/ml 0,36 0,38 6,1 0,44 0,39-10,1 Hæmoglobin 220 mg/ml 0,35-2,4 0,37-16,0 Triglycerider 10 mg/ml 0,36 0,35-2,8 0,40 0,37-7,5 Bemærk: Tre fortyndinger af gammaglobulin-stamopløsning gav indeksværdierne - 3,22; 3,57 og 3,40. HOOK EFFEKT Hook effekten blev undersøgt under optimeringen af JCV VLP-coatingens koncentration og konjugatfortyndingen ved hjælp af et panel af serumprøver med negativ reaktivitet til stærkt positiv reaktivitet (udover pladeaflæserens grænse på OD 450 4,000) over for JCV. Der blev ikke observeret nogen Hook effekt ved den optimale VLP-coating-koncentration og konjugatfortynding for dette assay ved hjælp af det testede panel. SAMMENLIGNING AF PRØVEMATRIX Et panel bestående af 109 parrede serum- og plasmaprøver (EDTA) blev evalueret i STRATIFY JCV DxSelect assayet. Af de i alt 109 par blev ét par elimineret fra regressionsanalysen, fordi resultatet af serumprøven var ugyldigt. Af de øvrige 108 par blev 7 par kvalitativt detekteret med OD-værdier, der lå over spektrofotometrets måleområde. Disse prøvepar er medtaget i sammenligningen af kvalitative resultater herunder, men elimineret fra regressionsanalysen, da der ikke kunne beregnes en indeksværdi. Passing-Bablok-regressionanalyse af serum- og plasmaprøveparrene gav en hældning på 1 med et 95 % CI på (0,9928 til 1,0167) og et skæringspunkt på 0 med et 95 % CI på (-0,0068 til 0,0016). Analyse af de kvalitative resultater gav en procentvis positiv-overensstemmelse = 96,7 % (58/60), 95 % CI: (88,6 til 99,1 %) og procentvis negativ-overensstemmelse = 97,9 % (47/48), 95 % CI: (89,1 til 99,6 %).

13 Side 13 Tabel 10: Sammenligning af prøvematrix - Kvalitative resultater for serum vs. plasma Endeligt serumresultat (tælling) Endeligt plasmaresultat ND D Ugyldig Alle ND D Alle Figur 1: Passing-Bablok-regressionsanalyse (serum vs. plasma) Prøvesammenligning - Frisk vs. frossen Et panel af 53 par friske og frosne plasmaprøver og 53 par friske og frosne serumprøver blev evalueret i STRATIFY JVC DxSelect assayet. Af de i alt 106 par blev to serumprøver og tre plasmaprøver udelukket af regressionsanalysen, da de havde OD-aflæsninger over spektrofotometrets måleområde. Et serumprøvepar blev udelukket fra regressionsanalysen, fordi resultatet af den friske prøve var ugyldigt. Passing-Bablok-regressionanalyse af de friske vs. frosne prøvepar gav en hældning på 1 med et 95 % CI på (0,9900 til 1,0221) og et skæringspunkt på 0 med et 95 % CI på (-0,0090 til 0,0028). Analyse af de kvalitative resultater gav en procentvis positiv-overensstemmelse = 96 % (72/75), 95 % CI: (88,9 til 98,6 %) og en procentvis negativoverensstemmelse = 96,7 % (29/30), 95 % CI: (83,3 til 99,4%).

14 Side 14 Tabel 11: Prøvesammenligning - Frisk vs. frossen Endeligt resultat, frossen (tælling) Prøvematrix Endeligt resultat, frisk ND D Alle Plasma ND D Alle Serum ND D NV 1 1 Alle Alle ND = Ikke detekteret, D = Detekteret, NV = Ugyldig * Tre plasmaprøver og to serumprøver havde resultater, der lå over spektrofotometrets måleområde. Disse prøver betragtes som værende detekteret. Figur 2: Prøvesammenligning - regressionsanalyse frisk vs. frossen Bemærk: To serumprøver og tre plasmaprøver blev udelukket af regressionsanalysen, da de havde OD-aflæsninger over spektrofotometrets måleområde. Et serumprøvepar blev udelukket fra regressionsanalysen, fordi resultatet af den friske prøve var ugyldigt.

15 REFERENCER STRATIFY JCV DxSelect Side Stolt A, Sasnauskas K, Koskela P, Lehtinen M, Dillner J. Seroepidemiology of the human polyomaviruses. J Gen Virol Jun;84(Pt 6): Knowles WA, Pipkin P, Andrews N, Vyse A, Minor P, Brown DW, Miller E. Population-based study of antibody to the human polyomaviruses BKV and JCV and the simian polyomavirus SV40. J Med Virol Sep;71(1): Kean JM, Rao S, Wang M, Garcea RL. Seroepidemiology of human polyomaviruses. PLoS Pathog Mar;5(3):e Epub 2009 Mar Chesters PM, Heritage J, McCance DJ. Persistence of DNA sequences of BK virus and JC virus in normal human tissues and in diseased tissues. J Infect Dis Apr;147(4): Cinque P, Koralnik IJ, Clifford DB. The evolving face of human immunodeficiency virus-related progressive multifocal leukoencephalopathy: defining a consensus terminology. J Neurovirol. 2003;9 Suppl 1: Cinque P, Koralnik IJ, Gerevini S, Miro JM, Price RW. Progressive multifocal leukoencephalopathy in HIV-1 infection. Lancet Infect Dis Oct;9(10): CLSI H18-A4. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline. 4 th Ed. (2010). 8. CDC-NIH Manual. (1999) Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 4th ed. And National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Protection of Laboratory Workers from Instruments, Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue (NCCLS M29-A). 9. Gorelik L, Lerner M, Bixler S, Crossman M, Schlain B, Simon K, Pace A, Cheung A, Chen LL, Berman M, Zein F, Wilson E, Yednock T, Sandrock A, Goelz SE, Subramanyam M. Anti-JC virus antibodies: implications for PML risk stratification. Ann Neurol Sep;68(3): Egli A, Infanti L, Dumoulin A, Buser A, Samaridis J, Stebler C, Gosert R, and Hirsch HH. Prevalence of Polyomavirus BK and JC Infection and Replication in 400 Healthy Blood Donors. J Infect Dis (6): CLSI EP05-A2 Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods; Approved Guideline 2 nd Edition.(2004) 12. CLSI EP07-A2 Interference Testing in Clinical Chemistry; Approved Guideline 2 nd Edition. (2005) En elektronisk version af indlægssedlen er tilgængelig på under fanen produkter. En papirkopi af denne indlægsseddel kan fås uden yderligere omkostninger ved henvendelse til teknisk serviceafdeling ved Focus Diagnostics. STRATIFY JCV og STRATIFY JCV logoet er registrerede varemærker, der tilhører Biogen. Focus Diagnostics og DxSelect og de tilknyttede logoer er varemærker, der tilhører Quest Diagnostics. AUTORISERET REPRÆSENTANT mdi Europa GmbH, Langenhagener Str. 71, Langenhagen-Hannover, Tyskland BESTILLINGSOPLYSNINGER Telefon: (800) (kun USA) (562) (internationalt) Fax: (714) TEKNISK ASSISTANCE Telefon: (800) (kun USA) Fax: (562) (562) (internationalt) Besøg vores hjemmeside på: PI.EL DA Rev. A Udfærdiget dato: 16 Mar 2015 Cypress, California USA