Spm. B: Hvad viser data i Figur 2?

Transkript

1 Opgave 1 Kernereceptorer (nuclear receptors) udgør en familie af ligandaktiverede transkriptionsfaktorer, der regulerer transkription af en række gener, som respons på tilstedeværelse af f.eks.lipofile hormoner. PPARγ, PPARα, FOXO1 og ERRα er eksempler på medlemmer af denne familie. For at klone cdna, der koder for protein, der kan interagere med PPARγ, blev der brugt de i Figur 1 viste plasmider. Figur 1: Struktur af plasmiderne pas2-1 og pact2 brugt til kloning af cdna kodende for PPARγ interagerende proteiner fra rotte. MCS, multi-klonings-site indeholdende genkendelsessites for en række unikke restriktionsenzymer; bla, β-lactamase gen (giver ampicillin resistens i E. coli); TRP1, phosphoribosylanthranilate isomerase; 2μ, S. cerevisiae replikations-origin fra 2μ plasmidet; ColE1 origin, E. coli replikations-origin; P ADH1, ADH1 promotoren fra S. cerevisiae; T ADH1, transkriptionsterminatoren fra S. cerevisiae s ADH1 gen; GAL4DB, DNA bindende domæne fra Gal4p transkriptionsfaktoren; GAL4AD, transkriptionsaktiverende domæne fra Gal4p transkriptionsfaktoren; LEU2, beta-isopropylmalate dehydrogenase. 1

2 Spm. A: Beskriv, hvorledes du med PPARγ cdna til rådighed ville isolere cdna kloner, der koder for proteiner der findes i brunt fedtvæv og kan interagere med PPARγ. Du har udover plasmiderne i Figur 1 adgang til alle nødvendige enzymer, kemikalier og celler. En af de cdna kloner, der blev identificeret med ovenstående protokol, var PGC-1α. For at undersøge PGC-1α s potentielle in vivo funktion blev de i Figur 2 viste eksperimenter udført. Figur 2: GST-PGC1-α fusionsprotein (PGC-1) eller kun GST (GST-V) blev koblet til sepharosekugler og inkuberet med in vitro produceret [ 35 S]-mærket PPARγ, TRβ, RXR, RARα eller ERα protein i fravær (-) eller tilstedeværelse (+) af disse proteiners specifikke ligander (BRL, T3, 9-cis RA, RA eller β-est). PPARγ, TRβ, RXR, RARα og ERα er alle kernereceptorer (nuclear receptors). Efter 60 minutters inkubation blev sepharosekuglerne sedimenteret ved centrifugering, vasket to gange med bindingsbuffer ± ligand og dernæst separeret ved SDS-PAGE gelelektroforese og analyseret på en PhosphoImager. Spm. B: Hvad viser data i Figur 2? I muskler udgør pyruvat-dehydrogenase-komplekset (der katalyserer den irreversible omdannelse af pyruvate til acetyl-coa) et hastighedsbestemmende trin i regulering af glukose oxidation. Kinasen PDK4 spiller en rolle i regulering af pyruvat-dehydrogenase-kompleksets aktivitet. For at undersøge, om PGC-1α kan have en regulerende effekt på PDK4 ekspressionen, blev der udført forsøg, der gav de i Figur 3 viste resultater. 2

3 Figur 3: A, northern blot af RNA isoleret fra lægmuskel fra rotter, der ikke har løbet (C, Sedentary) eller har løbet (Ex, exercise). Som prober er anvendt radioaktivt mærket PGC-1α cdna, PDK4 cdna eller 18S DNA. Data fra kvantificering af blottet er vist under dette. Resultaterne i kvantificeringen af PGC-1α og PDK4 mrna mængderne er angivet relativt til mrna mængden af disse hos rotter, der ikke har løbet. B, northern blot af RNA isoleret fra lægmuskel fra rotter der har opholdt sig ved stuetemperatur (C, room temperature) eller været eksponeret til 4 o C i 6 timer (Cold, Cold exposed). Under blottet er vist resultatet fra kvantificeringen af dette, hvor mængden af PGC-1α mrna og PDK4 mrna er sat til 1 for rotter, der har opholdt sig ved stuetemperatur. Spm. C: Hvad viser data i Figur 3? Der blev fremstillet et Adenovirus, der udtrykker en PGC-1α-myc in frame fusion og et adenovirus, der udtrykker GFP (green fluorescent protein). Myc er en epitop, som et specifikt, monoklonalt antistof genkender. De rekombinante adenovira blev brugt til infektion af en muskecellelinje, C 2 C 12. Data i Figur 4 viser resultatet af et northern blot og et western blot udført på henholdsvis RNA og protein isoleret fra C 2 C 12 celler transficeret med adenovirus, der udtrykker enten GFP eller PGC- 1α myc. Der er vist data fra to uafhængige transfektioner. 3

4 A B C Figur 4: Northern (A) og western (C) blot af RNA henholdsvis protein isoleret fra C 2 C 12 celler transficeret med enten en adenovirus, der udtrykker GFP eller en in frame fusion mellem PGC-1α og myc epitopen. Endvidere er mængden af PDK4 transkript bestemt ved real time PCR angivet i B. Mængden af PDK4 transkript er normaliseret til PDK4 mængden i celler inficeret med adenovirus, der udtrykker GFP. Til northern blottet er anvendt en radioaktiv PGC-1α probe og en 18S specifik probe. Til western blottet er anvendt et anti-myc-antistof, et anti-mcad-antistof, et anti-pdk4-antistof eller et anti-α-tubulin-antistof. Transkription af MCAD genet vides at blive stimuleret af PGC-1α. Det er det øverste bånd i PDK4 western blottet der er det korrekte. Ad, angiver hvilket gen, den anvendte adenovirus udtrykker. Resultaterne i (A) og (C) er for to uafhængige transfektioner. Spm. D: Hvad viser data i Figur 4? For at undersøge promotorregionen af PDK4 genet ønskes promotoren klonet i det reporterplasmid, der er vist i Figur 5. Nukleotidsekvensen af det ønskede område er vist i Figur 6. 4

5 Figur 5: Struktur af reporterplasmidet pgl3-basic. luc+, et promotorløst luciferasegen, Amp R, β- lactamasegen der giver ampicillin-resistens i E. coli; ori, replikationsorigin fra E. coli. De viste restriktionssites er unikke i plasmidet. Genkendelsessekvensen for de viste enzymer er; KpnI, 5 GGTACC 3 ; SacI, 5 GAGCTC 3 ; MluI, 5 ACGCGT 3 ; NheI, 5 GCTAGC 3 ; SmaI, 5 CCCGGG 3 ; XhoI, 5 CTCGAG 3 ; BglII, 5 AGATCT 3 ; HindIII. 5 AAGCTT 3. 5

6 5 tctagataag aatatcattc tttgtggcat cggatgatgc ctgaaaggaa ataggattgt gattgtgtgt ccagggtaaa aggggaatgt ctactttcta cttgcttcat caaagagagt ctgccactca agcatccaca tgtgaaacat atcaatggga ctgactttct tgcaagcaaa acttacaatt aattaatcat aatttatatt aatttaagag taaaattgtt agcattaaaa aaagaaaata cagtcccaag aaaacatgat catttcctac atgcttgtga gatggtgaca tgagtgttgt ataagctccc agtccataaa acccagtact gcgagtgcat gtattgtcca agtcatataa tgtgttacaa ctgaacagaa aacaaagaag atatatagtg actgacgaga gagagagaga gagagagaga gagagagcct tgcttctttt tgtttttgtt tttgttttta taatctcctg gacagttctt tgcttccctg agcttttgtg attccaagcc tgaattatgg gttctggcag tgtctgtgtg cagccagcgg tgctgtctaa gctcctttag cttcagtgct ggagccacag tgctatgaat tgcatttact ttgcccactt ttcttcctct tttctctcaa gagtcagttg ctgatgtctg gtcatccacc tctgggttat ttctcggtgt ctttaagaac ctgcaccaga tgctcattac cagaaaaccg tgactgttga aggtctccat tggatttttt cccccatagg tctgagcaaa atgcttggac acaatggcag gcataaatgc tagaacttat atgtgaccac tagacagagg tggtgggatg gacagaaagc caacgtgtta tttctaagca agtcacacaa gtggacacaa cattaggcag acccccagta ttggtggtag gtttaagagg aggaactttg atgctagacc tgtgcctgca caagtccact aaacagcaga gcactggaat SacI ctggggcaga gtttgaacta gaggcagaaa tcagacatca gtcctgtgac tgggtgagct ctcatggggg aaaatgcaaa gagtgcaccc accgtcatct atgactttca taacacccca gtctcctcat atgcaagggt cgaaggctaa gggtgccttg gataacaaac tgcccttgca gcttattact attagtagtt cccattacat tgcatttgca accaagtcgt tacagcgtcc ctaaacactg gcttcattct acagtccatt tagagtgaac gggaggacga gagaggttag NheI gatgagagcg ttatgacccg ctagcatgtt tcaacagcag tcattaggga ggtcaatatt gggcagtaac aaagtagggt aggatgcact gagcctctgg gaaatgaaag agcccaaata actaaaatat gctactggtg cctgctagtg acaaaggctg ctttttggaa ggagggcagc cgcaatgaag aaagagcttt tggagcagac tggggagtgg agggcggtca agagcaaact agaaggcctt agagaaagag gggaatgaca gggaaggggg actacagggc cagccaaacc ctcagcaaat cgctctttag tttgcattta attaacaggt agaaagtgtt acaggagaga agtgaactgg gattttccac cacattaata ataagcctat ttaggcagtt tctaaacttg agctgttcgc taagaagaaa gtggataaaa ctgtagggtg gtccttgctt tcgaggtcca atggcaaaga agcccatact ttagtaagca gatgattggc tactgtaaaa gtcccgctct gagcgaacac caatgcacgc tccgcggtga gattcttgga aacagtttct ggctaggaat gcgtgacatt gagatggctc tggagttgta aacaaggaca agtctgggcg ggcctgaagt cctagcgacc tgggatctat cccaaggggg cccacgtcat cccggatgcc tgctgtggct gctcccccta tcccacccca accctcctcc ctctcaccct ttgccccttg caggccatgg aaaccgtgtc gggatcactg tgccaggcct ttctagtgac cgcggccaaa gggaggagcc caaagttctt tctctgagct gattggtgtg gccccaagtt cagagtccca gagcctcctc ctggctggag ttgtggagag ggcgtggagg tagataaaag gcaagacatc gggtggtggg aagacccaag tgtcaaccct tcacccaggc 3 Figur 6: Nukleotidsekvensen af 2,3 kb opstrøms for translationsstart af PDK4 genet. Positionen af de genkendelsessites, der både findes i multi-klonings-sitet (MCS) i pgl3-basic og i den viste nukleotidsekvens er angivet ved understregning. Spm. E: Beskriv, hvorledes du ville klone de 2,3 kb opstrøms for PDK4 s translationsstartsite i pgl3-basic. Sekvensen og orienteringen af eventuelt anvendte oligonukleotider skal angives. For at undersøge PDK4 promotoren blev der fremstillet en række 5 deletioner i PDK4 promotoren fusionet til luciferasegenet i pgl3-basic. Efter co-transfektion af 6

7 disse i C 2 C 12 celler med enten et tomt plasmid eller et plasmid, der udtrykker PGC- 1α, blev luciferaseaktiviteten målt i celleekstrakter. Resultaterne er vist i Figur 7. Figur 7: A, resultatet fra co-transfektion af C 2 C 12 celler med et plasmid ( mpdk4.luc.2281) indeholdende 2281 nukleotider opstrøms for PDK4 translationsstart og luciferase-genet i pgl3-basic samt enten et tomt plasmid (pcdna(-)) eller et plasmid, der udtrykker PGC-1α (PGC-1α). Til normalisering af transfektionseffektiviteten er der også co-transficeret med et plasmid, der udtrykker et andet luciferasegen fra en konstitutiv promotor. B, resultaterne fra co-transfektion af C 2 C 12 celler med plasmider med forskellige promotorfragmenter fusioneret til luciferase-genet i pgl3-basic, et plasmid til normalisering af transfektionseffektiviteten samt enten pcdna(-) eller PGC-1α. Normalized RLU, luciferase aktivitet normaliseret for transfektionseffektivitet og til luciferase-aktiviteten i celler transficeret med mpdk4.luc.2281 og pcdna(-). Spm. F: Hvad viser data i Figur 7? Figur 8A viser en alignment af en del af PDK4 promotoren fra mus, rotte og menneske. Der er tre konserverede potentielle bindings-sites for transkriptionsfaktorer. For at undersøge disse elementers rolle i regulering af PDK4 transkription, blev der fremstillet de i Figur 8 viste mutationer i PDK4 promotoren. Disse promotorers aktivitet blev undersøgt efter transfektion i C 2 C 12 celler og sammenlignet med vildtypen. Resultaterne er vist i Figur 8. 7

8 Figur 8: A, En alignment af en del af PDK4 promotoren fra mus, rotte og menneske. Tre potentielle promotorelementer er indrammet og benævnt, IRS, NR½ eller Sp1. B, nukleotidsekvensen af vildtype IRS og af en fremstillet IRS mutant. Endvidere er vist resultaterne af co-transfektionsforsøg i C 2 C 12 celler med vildtype og mutant promotor fusioneret til luciferasegenet i pgl3-basic samt enten en tom vektor (pcdna(-)) eller et plasmid, der udtrykker transkriptionsfaktoren FOXO1 (FOXO1) eller PGC- 1α(PGC-1α). Normalized RLU, luciferaseaktivitet der er korrigeret for transfektionseffektivitet og normaliseret til luciferaseaktiviteten i C 2 C 12 celler transficeret med mpdk4.luc.2281 og pcdna(-) C, nukleotidsekvensen af en del af vildtype-promotoren og mutationer i IRS, NR½ eller Sp1 sitene. Vildtype-fragmentet eller de tre mutant-fragmenter er enkeltvis indsat i pgl3-basic, co-transficeret i C 2 C 12 celler sammen med pcdna(-) eller et plasmid der udtrykker PGC-1α (PGC-1α). Luciferaseaktiviteten er bestemt 24 timer senere. Normalized RLU, luciferaseaktivitet der er korrigeret for transfektionseffektivitet og normaliseret til luciferaseaktiviteten i C 2 C 12 celler transficeret med mpdk4.luc.371 og pcdna(-). I de skematiske tegninger af luciferase-fusionerne i B og C er de tre elementer IRS, NR½ og Sp1 angiver med symbolerne vist over sekvensen i A. Spm. G: Beskriv, hvorledes du ville fremstille et 2,3 kb langt PDK4 promoter fragment med de viste mutationer i IRS elementet. Sekvens og orientering af eventuelt anvendte primere skal angives. 8

9 Spm. H: Hvad viser data i Figur 8? For at få yderligere information omkring regulering af PDK4 promotoren blev der udført electrophoretic mobility shift assay (EMSA) forsøg med et 63 nukleotider langt DNA fragment fra PDK4 promotoren indeholdende NR½ sitet fra Figur 8A og rekombinant østrogen-receptor-relateret ERRα protein. Resultatet af forsøget er vist i Figur 9. 9

10 rerrα n.s. Ab ERRα Ab Lane Figur 9: EMSA assay med et [ 32 P]-mærket 63 bp langt oligonukleotid fra PDK4 promotoren indeholdende NR½ sitet fra Figur 8A samt rekombinant fremstillet ERRα. ERRα Ab, antistof rettet mod ERRα; n.s. Ab, antistof der ikke er rettet mod ERRα; rerrα, rekombinant ERRα protein; wt (lane 6 8), angiver at der er tilsat stigende mængder af en umærket version af det 63 bp lange oligonukleotid; NRmut (lane 9-10), angiver at der er tilsat en stigende umærket mængde af det 63 bp lange oligonukleotid indeholdende de i Figur 8C viste mutationer i NR½ sitet; NRmut (lane 11 13), angiver at [ 32 P]-mærket 63 nukleotider langt oligonukleotid indeholdende de i Figur 8C viste mutationer i NR½ sitet er anvendt. 10

11 Spm. I: Hvad viser data i figur 9? 11