Undersøgelse af mulige hormonelle bivirkninger ved imatinib mesylate (Glivec ) behandling hos mænd.

Transkript

1 D E T N A T U R V I D E N S K A B E L I G E F A K U L T E T K Ø B E N H A V N S U N I V E R S I T E T Undersøgelse af mulige hormonelle bivirkninger ved imatinib mesylate (Glivec ) behandling hos mænd. Investigation of possible hormonal side-effects of imatinib mesylate (Glivec ) treatment in men Speciale af Mette Eliasen Vollmond, Københavns universitet August 2010 Vejledere: Lone Rønnov-Jessen, Biologisk institut Anna-Maria Andersson, Rigshospitalets Afdeling for Vækst og Reproduktion 1

2 Resumé Herværende speciale omhandler det mandlige reproduktive system, med udgangspunkt i en undersøgelse af hvorvidt behandling med imatinib påvirker de mandlige kønshormoner. Imatinib mesylate (Glivec ) er et farmakologisk stof, der har vist sig at være særdeles effektivt til behandling af kronisk myeloid leukæmi (CML) og med relativt få bivirkninger. CML er en cancer i de hvide blodlegemer, der opstår pga. en kromosomal translokation, der resulterer i dannelsen af et nyt fusionsgen, Bcr-Abl. Bcr-Abl proteinet fungerer som en onkogen tyrosinkinase, hvis aktivitet, fører til en øget og ukontrolleret vækst af de myeloide stamceller i rygmarven. Imatinib virker kompetitivt ved at binde til ATPbindingsstedet på Bcr-Abl kinasen og blokerer derved for bindingen af ATP. Herved forhindres kinasens fosforylering af substrat og den resulterende celleproliferation. Forskellige studier har imidlertid indikeret, at de mandlige reproduktive hormoner kan blive påvirket af imatinibbehandling. Det er blevet foreslået at imatinib måske kan interferere med leydigcellernes produktionen af testosteron, ved at hæmme receptortyrosinkinaserne, PDGF-receptor og c-kit i testikelvævet. For en nærmere afklaring heraf, har man på Afdeling for Vækst og Reproduktion på Rigshospitalet, iværksat et prospektivt klinisk studie, der undersøger hvorvidt den mandlige kønshormonbalance bliver signifikant påvirket ved behandling med imatinib. Til studiet er der foretaget immunanalyser af testosteron, østradiol, LH, FSH, inhibin B og SHBG af 22 nydiagnosticerede CML patienter, fra blodprøver taget ved diagnosticering og efter 3, 6, 9, 12 og 15 mdrs. behandling med imatinib. Efterfølgende blev frit testosteron beregnet ud fra SHBG og total testosteron. FSH og inhibin B bruges til vurdering af spermatogenesen. En Wilcoxon's test viste, at der ikke var nogen signifikant forskel på koncentrationerne af testosteron, frit testosteron, østradiol, LH og FSH før og efter behandling. Der blev til gengæld fundet en signifikant stigning af inhibin B efter 9 og 12 mdrs. behandling samt et signifikant fald af SHBG efter 3 mdrs. behandling. Vores resultater støtter altså ikke hypotesen om, at imatinibbehandling skulle have en effekt på den mandlige reproduktive funktion. Hverken produktionen af androgener eller spermatogenesen synes at være påvirket af behandlingen. Da studiet kun inkluderer 22 testpersoner, kan styrken af testen dog være for svag til at opdage eventuelle effekter. Der har endvidere desværre manglet en del oplysninger omkring blodprøvetidspunkt og dosis, som kan have stor indflydelse på resultaterne. For at opnå en mere sikker vurdering af imatinibs mulige hormonelle bivirkninger, er der brug for yderligere undersøgelser af området, som tager hensyn til disse parametre. 2

3 Abstract This thesis deals with the male reproductive system, based on an investigation as to whether treatment with imatinib mesylate affects the male reproductive hormone level. Imatinib mesylate (Glivec ) is a drug used for treatment of chronic myeloid leukaemia (CML) with a high level of efficiency, and is generally well tolerated in humans. CML is cancer of the white blood cells, derived from a chromosomal translocation, which causes the formation of a new fusion gene, Bcr-Abl. The protein of Bcr-Abl functions as an oncogene tyrosine kinase, the activity of which results in an increased and unrestricted growth of the myeloide stem cells of the spinal cord. Imatinib works competitively by binding the ATP-binding domaine of the Bcr-Abl kinase, and so inhibiting the binding of ATP. The phosporylation af the substrate is prevented by this, and the signals for cell proliferation stop. However, studies have indicated that male reproductive hormones are possibly affected by treatment with imatinib. It was suggested that imatinib may interfere with the production of testosterone by inhibiting the receptor tyrosine kinases: PDGFR og c-kit in the testis. To clarify this suspicion, scientists at the Department of Growth and Reproduction at Rigshospitalet have conducted a study to investigate whether the male reproductive hormone levels are significantly affected by treatment with imatinib. In 22 newly diagnosed CML patients, levels of testosterone, estradiol, LH, FSH, inhibin-b and SHBG were measured by immuno assays from blodsamples taken before treatment and after respectively 3, 6, 9, 12 and 15 months of imatinib treatment. Free testosterone was calculated from total testosterone and SHBG. FSH and inhibin B was used for the evaluation of spermatogenesis. Wilcoxon's tests showed no significant effects on the levels of testosterone, free testosterone, estradiol, LH, and FSH during the treatment with imatinib. However, a significant increase was seen in inhibin-b after 9 and 12 months of treatment, and a decrease of SHBG after 3 months. The results did not support the hypothesis that the reproductive hormone levels were affected by treatment with imatinib. Neither the production of androgens nor spermatogenesis seemed to be affected. However, because the study only included 22 subjects, the statistical evidence of the analyses might be too weak to show any effects. Furthermore. unfortunately a lot of the information about blood sample times and imatinib dosing were missing, and these factors might have had an influence on the results. 3

4 To achieve a more accurate estimate of possible side-effects with imatinib treatment on the male reproductive system, further investigations in the field are needed, which more systematically take these parameters into account. 4

5 Indholdsfortegnelse Forord... 6 Introduktion... 7 Det mandlige reproduktive system... 9 Testiklernes struktur... 9 Testiklernes funktion Produktion af androgener Spermatogenesen Regulering af reproduktiv funktion LH-testosteron aksen FSH-inhibin aksen Sertoli-leydigcelle interaktion Forstyrrelse af den mandlige kønshormonbalance Gynecomasti Hormonanalyse Imatinib mesylate (Glivec ) Imatinib og forstyrrelse af reproduktiv funktion C-kit PDGF receptorer Kliniske erfaringer med imatinib behandling Materialer og metoder Testpersoner Metode Blodprøvetagning Hormonanalyser Statistik Resultater Diskussion Konklusion og perspektivering Ordliste...59 Litteraturliste

6 Forord Dette er et praktisk speciale, der undersøger hvorvidt imatinib mesylat (Glivec ), der bruges til behandling af flere kræftformer som f.eks. kronisk myeloid leukæmi (CML) og gastrointestinal stromal tumor (GIST), forstyrrer den mandlige kønshormonbalance. Rigshospitalets Afdeling for Vækst og Reproduktion har stået for indhentning af prøver og udførelse af hormonanalyser fra 31 nydiagnosticerede patienter med kronisk myeloid leukæmi (CML), som alle skulle i behandling med imatinib mesylat (Glivec ). Forsøget er et spin-off studium af en større nordisk undersøgelse af imatinib mesylat (Glivec ) behandling iværksat af Nordic CML Study Group. Jeg har ikke selv været involveret i den praktiske del af forsøget, men jeg har tilbragt to dage i hormonlaboratoriet med laboranterne, for at få indsigt i analysemetoderne. Det har været min opgave at bearbejde og analysere resultaterne, hvilket har dannet udgangspunkt for dette speciale. Imatinib mesylat bliver markedsført som Glivec og har været på markedet siden Det anses som standard startbehandling for patienter med CML. I specialet bruger jeg fremover betegnelsen imatinib for dette medikament. Tak til Anna-Maria Andersson fra Afdeling for Vækst og Reproduktion på Rigshospitalet for god vejledning. Også en tak til de andre ansatte på afdelingen for løbende råd og støtte. Til sidst en tak til min interne vejleder Lone Rønnov-Jessen for hjælp og støtte i forhold til projektet og de gældende formaliteter. Også en stor tak til Rune Brink, der har hjulpet med illustrationerne. 6

7 Introduktion Det mandlige reproduktive system er et komplekst system, der indbefatter et samspil mellem flere organer i kroppen. Hypofysen udskiller signaler, der via blodbanen sendes til de mandlige gonader, testiklerne, hvor de dels påvirker modningen af sædceller og dels produktionen af kønshormoner. Kønshormonerne sendes efterfølgende rundt i hele kroppen, via blodkredsløbet og modtages af forskellige væv, der på forskellig vis reagerer på disse hormoner. Desuden indgår hormonerne i en vigtig feedback mekanisme, hvorved de kan regulere deres egen produktion. Det har stor betydning for mænds fysiske og mentale tilstand, at dette system fungerer optimalt, da kønshormonerne er med til at regulere en lang række funktioner i kroppen. Forsøg med dyr har vist, at når de udsættes for hormonforstyrrende stoffer får de samme problemer, som der i stigende grad findes blandt børn og unge i den vestlige verden, som f.eks. ikke nedfaldne testikler (kryptokisme), tidlig pubertet, nedsat testosteronniveau og nedsat sædproduktion. Dette sammenfald tyder på, at vi i vores dagligdag udsættes for en stigende mængde hormonforstyrrende stoffer, som optages ved indånding, gennem huden og via vores kost. Af den årsag har der i de senere år været stor fokus på mulige hormonforstyrrende stoffer, som f.eks. phtalater og parabener. Flere af disse stoffer er mulige at undgå og kan i mange tilfælde erstattes af andre stoffer. Et lidt større problem er, at også flere former for medicin er mistænkt for at virke hormonforstyrrende og de er ikke helt så nemme at erstatte. Imatinib er et farmakologisk stof, der i de seneste år har vist sig at være effektivt til behandling af blodkræftsygdommen kronisk myeloid leukæmi (CML). I et ikke-prospektivt studie viste det sig imidlertid, at flere af mændene under imatinib behandling udviklede gynecomasti (udvikling af bryster) og fik efterfølgende konstateret nedsat testosteronniveau (Gambacorti-Passerini et al. 2003). Efterfølgende er der rapporteret flere enkelttilfælde af gynecomasti i forbindelse med imatinib behandling (Kim et al. 2005; Mariani et al. 2008). Der er derfor mistanke om, at imatinib kan have en forstyrrende virkning på de mandlige reproduktive hormoner. 7

8 Der er desuden blevet observeret en hæmmet spermiogenese hos dyr under imatinibbehandling ( men endnu ikke hos mennesker. Der er dog brug for en mere omfattende og systematisk undersøgelse af dette område, for at få afklaret hvorvidt imatinib signifikant forstyrrer de mandlige reproduktions hormoner og evt. påvirker spermatogenesen. En afklaring af dette, vil kunne forbedre behandlingen af patienterne, da man i tilfældet af en nedsat testosteronproduktion, ville kunne give patienterne tilskud af androgener og derved mindske de symptomer længerevarende testosteronmangel kan forårsage såsom træthed, nedsat libido, nedsat fertilitet, øget risiko for osteoporose og gynecomasti. Årsagen til at patienterne vil kunne risikere disse langtidseffekter af nedsat testosteron, er at imatinib er en livslang behandling, da medicinen ikke kurerer CML, men holder det i skak. Formålet med specialet er, i et prospektivt klinisk studie, at efterprøve, om den mandlige kønshormonbalance bliver signifikant påvirket ved behandling med imatinib for kronisk myeloid leukæmi. Jeg vil først redegøre for, hvordan det mandlige reproduktive system fungerer og hvordan det kan forstyrres af udefrakommende stoffer, med udgangspunkt i undersøgelsen af imatinib. Mulige effekter på testosteronproduktionen vil blive undersøgt vha. analyser af serum testosteron, luteinising hormone (LH), østradiol og sex hormone binding globulin (SHBG), samt ved en bestemmelse af frit testosteron baseret på T og SHBG målinger før og under behandling med imatinib, af ny-diagnosticerede mandlige patienter med kronisk myeloid leukæmi. Påvirkning af spermatogenesen vil blive undersøgt ved måling af serum inhibin B og follicle stimulating hormone (FSH), som begge er valide serummarkører for spermatogenesen (Andersson et al. 2004; Jensen et al. 1997). 8

9 Det mandlige reproduktive system Mandens primære reproduktive organ er testiklerne, som har to funktioner; 1) spermatogenese: produktionen af mandens reproduktive celler, sædcellerne også kaldet spermatozoer og 2) secernering af de mandlige kønshormoner. For at forstå disse reproduktive funktioner er det nødvendigt at danne sig et overblik over den strukturelle organisering af testiklerne. Testiklernes struktur Testiklerne ligger i pungen, som er en udposning af bugvæggen. Her migrerer de som regel ned i 7. fostermåned, da spermproduktion kræver omgivelser der er ca. 2 C køligere end den indre kropstemperatur (Vander et al. 2004). Hver testikel er opdelt i rum, der hver indeholder et par snoede hule rør; de seminiferøse tubuli (sædkanaler), hvor sædcellerne bliver produceret (figur 1). Sædkanalernes væg består af et ydre lag af glatmuskulatur og et indre epitellag dannet af sertoliceller, hvis opgave er at modne og kontrollerer udviklingen af sædcellerne. Sertolicellerne er som andre epitellag, hæftet til /omgivet af en basalmembran. I midten af hver kanal findes et væskefyldt rum, lumen, hvor de færdige, men stadig umodne, sædceller ligger. Væsken sekreres af sertolicellerne og indeholder bl.a. androgenbindende protein (ABP). De udifferentierede stamceller, som kaldes spermatogonier, ligger i omkredsen af sædkanalerne helt op ad basalmembranen og vil i løbet af deres udvikling vandre ind mod lumen, imellem 2 sertoliceller. Sertolicellerne er forbundet med hinanden via tight junctions, som opdeler kanalens væg i en basal afdeling og en luminal afdeling. Denne ring af sammenkædede sertoliceller danner sertolicellebarrieren også kaldet blod-testis barrieren, som kan kontrollere hvilke stoffer, der kan trænge fra blodet ind til den adluminale afdeling og lumen. Den kan herved skabe nogle helt specielle omgivelser som er nødvendige for sædcellernes fortsatte differentiering, på deres vej ind mod lumen (Brook & Marshall, 2001b; Vander, 2004). De seminiferøse tubuli fra forskellige områder af testiklerne samles i et netværk af forbundne rør, rete testis, og bliver efterhånden samlet i enkelte rør, de efferente ductules, der leder indholdet ud af selve testiklen. 9

10 Figur 1: Testiklens struktur. A: tværsnit af testikel. B: tværsnit og organisering af de seminiferøse tubuli og de interstitiale leydigceller og blodkar. C: Vægstrukturen af en seminiferøs tubulus med germalceller i forskellige udviklingstrin. På figuren ses en enkelt sertolicelle. Modificeret fra (Cooke & Saunders, 2002) Der findes udover sertolicellerne en anden type celler i testikkelvævet, som ligger i rummene mellem de seminiferøse tubuli. Det er de interstitielle leydigceller, der producerer det mandlige kønshormon, testosteron. Hos mennesker udgør leydigcellerne (sammen med blod- og lymfekar samt få andre celletyper) kun op til 10% af testiklerne. Resten af vævet, over 90%, består af sædkanaler (Sharpe, 1983). 10

11 Hver testikel er fasthæftet til en epididymis, eller bitestikel, som er et lille organ indeholdende et rørsystem, hvori sædcellerne samles og færdigudvikles. Vas deferens (sædlederen) fører sæden videre fra bitestiklen til urinrøret. Testiklernes funktion Produktion af androgener Testosteron er mandens primære kønshormon og tilhører en gruppe steroid hormoner kaldet androgener. I denne gruppe hører også androstenedione og dehydroepiandrosterone (DHEA), der ligesom testosteron hovedsageligt udskilles af testiklernes leydigceller. En lille procentdel dannes i binyrerne. Syntesen af androgener sker ud fra kolesterol og følger den normale steroidsyntese (figur 2). Figur 2: Steroidsyntese. Viser de biosyntetiske veje, der fører til produktionen af progesteron, aldosteron, kortisol, testosteron og østradiol. Enzymerne, der er ansvarlige for hvert trin, er vist i blå bokse. Modificeret fra 11

12 Afhængigt af hvor langt hormonet når i syntesevejen, secerneres det som en af de 3 førnævnte androgener, der alle har en maskuliniserende effekt, men i forskellig grad, hvilket vil blive behandlet senere. En del af testosteronpuljen bliver omdannet til østradiol vha. enzymet aromatase inden sekretionen. Østradiol er også et steroidhormon men hører, i modsætning til de andre nævnte steroider, under østrogenfamilien og ses som det vigtigste kvindelige kønshormon (Vander, 2004) Når steroiderne er syntetiserede, diffunderer de nemt ud gennem leydigcellens plasmamembran (da de er fedtopløselige) og trænger herefter over i blodbanen. Her bliver størstedelen af steroidhormonerne, både testosteron og østradiol, bundet til en bestemt type plasmaproteiner, SHBG, som øger mængden af steroider, der kan blive ført rundt med blodet til kroppens forskellige væv (Vander, 2004). En lille del af hormonerne vil forblive frit i blodplasma og opnår en ligevægt med det bundne hormon: Frit hormon + bindingprotein hormon-protein kompleks Det er den frie koncentration af hormonet, der fysiologisk set er vigtigst, da det kun er hormoner fra denne pulje, der kan diffundere over kapillærvæggene og over i modtagercellen. Testosteron virker i sin egen form, kun på udvikling af indre- og ydre kønsdele i fosterstadiet dvs. de primære kønskarakterer og på muskelceller. I alle andre væv der påvirkes af testosteron, bliver hormonet efter dets indtrængen i cellernes cytoplasma, omdannet af enzymet 5α-reductase til dihydrotestosterone (DHT), som er mere potent end testosteron (figur 3). Figur 3: Hormonoverførsel fra leydigcelle til målcelle. I målcellen kan testosteron blive omdannet til dihydrotestosterone (DHT) eller østradiol, alt efter hvilke enzymer der er tilstede. Hormonerne trænger ind i cellekernen, og påvirker genekspressionen. 12

13 Både testosteron og DHT binder til androgenreceptorer i cytoplasma og herefter translokeres hormon-recepter-komplekset ind i kernen af målcellen, hvor det virker som en transkriptionsfaktor og bestemte gener kommer herved til udtryk. Testosteron kan også blive aromatiseret til østradiol i målcellen, ligesom i leydigcellerne, og mister herved sin maskuliniserende effekt (Brook & Marshall, 2001b). Androgenerne har stor indflydelse på kroppens forskellige væv og er bl.a. årsag til den store ændring der sker under puberteten, hvor de igangsætter de sekundære kønskarakteristika. Dette sker som følge af en stigning i hypofyseforlappens LH sekretion, der fører til en øget testosteronproduktion i leydigcellerne idet LH stimulerer leydigcellerne (Brook & Marshall, 2001b). De sekundere kønskarakteristika inkluderer vækst af ydre kønsorganer (penis og testikler), kønsbehåring og skægvækst, øget kropsbehåring, skeletmuskelvækst, forstørrelse af strubehoved som resulterer i dybere stemmeleje, stimulering af talgkirtler i huden (medfører akne) og maskulin fedtfordeling. Androgener stimulerer også secernering af væksthormon, som fører til længdevækst af knoglerne (Vander, 2004). Androgener er også ansvarlige for udvikling af sexlyst (libido) og påvirker humør, aggressivitet og stress. Desuden virker testosteron som en parakrin faktor i testiklerne, hvor det, sammen med FSH, skal være tilstede i en vis koncentration for, at spermatogenesen kan igangsættes i puberteten. Herefter skal testosteron være tilstede for at spermatogenesen vedligeholdes (Brook & Marshall, 2001b; Vander, 2004). Testosteron har, sammen med de andre androgener, en selvregulerende effekt ved at indgå i et negativ-feedback system med hypothalamus og hypofysens forlap, hvilket vil blive behandlet senere. Spermatogenesen Den anden af testiklernes funktioner er produktion af sædceller, også kaldet spermatogenese. I løbet af fosterperioden vandrer de primordiale germal celler ind i testikelvævet. Her ligger germal cellerne, også kaldet spermatogonier i dette stadie, uforandrede indtil puberteten, hvor de begynder at udvikle sig til sædceller, spermatozoer (se figur). 13

14 Figur 4: Skematisk oversigt over spermatogenesen. Spermatogonie type A, kan dels forny sig selv og dels differentieres til type B spermatogonier. Efter mitose, meiose 1 og 2 kaldes germalcellerne for spermatider, som differentieres til spermatozoer (sædceller) under spermiogenesen. Fra: gameten.htm. Sertolicellerne spiller en afgørende rolle under hele denne udvikling. De secernerer hormoner og diverse næringsstoffer ind i det adluminale rum og skaber herved et helt specielt miljø, hvori germalcellerne kan modnes og overleve. Derudover danner sertolicellerne fasthæftningssteder til germalcellerne, som herved får fysisk støtte under deres udvikling, men som også har den fordel at gøre den parakrine signalering mellem cellerne mere effektiv. Spermatogenesen er en proces, der kan opdeles i tre faser: stamcellefornyelse, germalcelle proliferation, og spermiogenese (figur 4). Stamcellefornyelse er den mekanisme, der sørger for at vedligeholde den konstante pulje af stamceller man har fra fødslen og som ligger klar til at blive differentieret til sædceller. Stamceller i testiklerne kaldes type A spermatogonier og ligger placeret tæt opad basalmembranen. Når de deler sig ved mitose dannes to datter celler, hvoraf den ene bevares som stamcelle og den anden differentieres til type B spermatogonie og udgør den første generation i spermatogenesens proliferative fase. Type B spermatogonierne bevæger sig fra basal kompartment af de seminiferouse tubuli og ind i den adluminale kompartment, hvor de gennemgår endnu en mitotisk deling og kaldes nu for primære spermatocytter. Hver af de primære spermatocytter resulterer i produktionen af fire haploide spermatider via Meiose I og II (Brook & Marshall, 2001b; Plant & Marshall, 2001). I spermiogenesen, den sidste fase af spermatogenesen, gennemgår spermatiderne en række morfologiske ændringer, hvorved den udvikles til en højt 14

15 specialiseret spermatozo (sædcelle). Spermatozoerne slippes til sidst fri i lumen af tubuli (Brook & Marshall, 2001b; Plant & Marshall, 2001), hvor de ligger klar til videre modning. Regulering af reproduktiv funktion Den reproduktive funktion bliver reguleret af et samspil af hormoner, tilsammen kaldet for hypothalamus- hypofyse-gonade-aksen (figur 5) Figur 5: Skematisk oversigt over hypothalamushypofyse-gonade aksen hos mænd. Fra jpg. Det første hormon i kæden er gonadotropinreleasing hormone, GnRH, som udskilles i bølger fra neuroendocrine celler i hypothalamus hvert 90. minut. Dette sker som følge af periodiske aktionspotentialer i denne specielle celletype. GnRH når ned til den forreste lap af hypofysen via det portale kredsløb. I hypofyseforlappen stimulerer GnRH udskillelsen af de to gonadotropiner; follikelstimulerende hormon, FSH og luteiniserende hormon, LH, fra en celletype kaldet basofilceller. Hormonerne sendes via blodbanen til testiklerne, hvor de henholdsvis påvirker modningen af sædceller og produktionen af kønshormoner. Hjernen er altså den primære regulator af reproduktionen (Vander, 2004). 15

16 LH-testosteron aksen Testosteron regulerer sin egen produktion ved at indgå i en feedback-mekanisme, hvor det hæmmer hypofysens udskillelse af LH på to måder 1) Det påvirker hypothalamus til at mindske størrelsen af GnRH bølger, hvilket resulterer i formindsket sekretion af gonadotropiner og 2) det påvirker hypofyseforlappen direkte og hæmmer LH sekretionen ved at sænke basofilcellernes følsomhed for GnRH (Vander, 2004). Således vil en forhøjet testosteronproduktionen, hvilket medfører en større koncentration af cirkulerende testosteron, hæmme frigivelsen af LH, som vil føre til en sænket stimulation af leydigcellerne. På den måde bliver testosteronkoncentrationen holdt i balance. LH kontrollerer hastigheden af testosteronsyntesen ved at regulere det enzym, der omdanner kolesterol til pregnenolone (figur 6). Dette sker ved at LH binder til overfladen af leydigcellerne, via specifikke G-protein-koblede receptorer, som påvirker den katalytiske aktivitet af adenylat cyclase i membranen. Denne omdanner ATP til camp, der kan aktivere en kinase (PKA), der fører til aktivering af det pågældende enzym, så syntesevejen af testosteron kan fortsætte (Brook & Marshall, 2001b). Dvs jo højere serum-lh koncentration, des mere stimuleres leydigcellerne til at syntetisere testosteron. Figur 6: Model af de molekylære processer der finder sted i leydigcellens testosteronproduktion. LH binder til en receptor i membranen, hvorved adenylatcyklase aktiveres og omdanner ATP til camp. Herved startes en kaskade af reaktioner, deriblandt forflytning af kolesterol ind i mitokondrierne vha. StAR proteion og PB-receptor. I mitokondrierne er kolesterol med til at danne pregnenolone, som translokeres til E.R. hvor det via en serie af reaktioner omdannes til testosteron. Modificeret fra: F4.large.jpg 16

17 FSH-inhibin aksen Spermatogenesen initieres og vedligeholdes af de to gonadotropiner, FSH og LH. LH stimulerer spermatogenesen indirekte, ved at stimulere syntesen af testosteron fra leydigcellerne, der virker som en parakrin faktor på sertolicellerne. Testosteron er med til at vedligeholde sædproduktionen, men kan ikke i sig selv initiere den. FSH skal være tilstede i passende koncentration, for at starte produktionen af sædceller, hvilket normalt sker i puperteten (Brook & Marshall, 2001b). FSH syntetiseres og udskilles som nævnt af celler i hypofyseforlappen. Dets eneste, men meget vigtige funktion hos mænd, er at inducere proliferation af sertoliceller (Plant & Marshall, 2001) og stimulerer dem til at udskille paracrine agenter. Disse agenter fungerer som næringsstoffer og er nødvendige for germalcellerne under deres udvikling. Sertolicellerne udskiller desuden stoffer, der fungerer som overlevelsesfaktorer for de differentierede spermatozoer i lumen (Plant & Marshall, 2001). FSH fungerer på denne måde som en indirekte stimulator for spermatogenesen. Sekretion af FSH fra hypofysen reguleres af inhibin B, via en negativ feedback mekanisme. Der eksisterer to aktive former af inhibin, inhibin A og inhibin B, der begge består af en α-del og en β- del. Det er β-delen der bestemmer, om det er inhibin A eller B. Hos mænd er inhibin B den cirkulerende form og dannes i testiklerne, hovedsageligt af sertolicellerne før puberteten, mens det stadig er til diskussion, hvilke celler i voksne testikler, der producerer inhibin (Andersson, 2000; Meachem, Nieschlag & Simoni, 2001). Forskere har i et nyere studie vist, at inhibin også kan dannes i prostata og binyrene (O'Connor & De Kretser, 2004). Den negative feedback mekanisme består i, at FSH stimulerer sertolicellernes sekretion af inhibin B, som via blodbanen når op til hypofysen, hvor det hæmmer udskillelsen af FSH, så der opstår en homeostasis. Ud over at indgå i reguleringen af FSH, fungerer inhibin B subunits også lokalt (som autocrin eller parakrin faktor) i testiklerne, hvor de danner aktiviner (homo- eller heterodimerer af β-enheden). Aktivinernes funktion er, i modsætning til inhibinerne, at stimulere FSH produktionen. Inhibiner og aktiviner hører begge under transforming growth factor-β (TGF-β) familien (O'Connor & De Kretser, 2004). 17

18 Serum inhibin B og FSH har vist sig at være gode markører for spermatogenesen og dermed for fertiliteten (Jensen et al. 1997). Et studie hvor man sammenlignede subfertile mænd med fertile mænd viste, at især inhibin B/FSH ratioen er anvendelig til analyse af fertiliteten hos mænd (Andersson et al. 2004). Denne viden benyttes i nærværende opgave til at vurdere om stoffet imatinib kan påvirke spermatogenesen ud fra målinger af inhibin B og FSH før og under behandlingen. Flere undersøgelser af inhibin B har været med til at forklare, hvorfor dette molekyle kan fungere som markør for spermatogenesen. Inhibin B er, som før nævnt, en heterodimer, der består af en α og en β-b del. Litteraturen siger generelt, at inhibin B udskilles fra testiklernes sertoliceller, men forskere har v.h.a immunanalyser observeret, at hos voksne mænd findes kun α-delen i sertolicellerne. β-b enheden blev detekteret i specifikke germalcelle typer, hovedsageligt i pachytene spermatocyter og tidlige runde spermatider, hvilket tyder på at inhibin B er et samlingsprodukt med én del stammende fra sertolicellerne og én del fra visse stadier af germal celler (Andersson, Muller & Skakkebaek, 1998). Denne observation kan være svaret på hvorfor der er en sammenhæng mellem inhibin B og spermatogenesen. Hvis germalceller af en eller anden årsag ikke udvikles normalt, vil β-b delen ikke blive produceret og man vil se en formindsket inhibin B koncentration. Produktionen af FSH vil som resultat af en manglende negativ feedback, ikke blive hæmmet og produktionen vil derfor stige. Dette kan være en forklaring på hvorfor forhøjet FSH også er et tegn på en forstyrrelse af spermatogenesen. Figur 7: Regulering af inhibin B produktion. FSH stimulerer sertolicellefunktion og spermatogenesen samt produktionen af inhibin B's α-del. Syntesen af inhibin B's β-del er på den ene eller anden måde afhængig af specifikke germalcelletyper. Modificeret fra (Andersson, 2000) 18

19 Andre forskere mener ikke, at germalcelle stadier er med til at producere inhibin B, men at germalcellerne i stedet er med til at regulere udskillelsen af inhibin B fra sertolicellerne (Andersson, 2000) (figur 7). O Connor and Kretser, foreslår ud fra flere undersøgelser at det ikke er inhibin B, men sandsynligvis activin (to B-β kædet sammen), der produceres i germale cellestadier (og forklarer hermed hvorfor der er fundet mrna for β-b) og som påvirker sertolicellerne som en parakrin eller autocrin faktor (O'Connor & De Kretser, 2004). Der er dog enighed om at inhibin B-produktionen hos voksne mænd både afhænger af FSH og, på den ene eller den anden måde, af spermatogenesen, og begge teorier kan forklare, hvorfor et formindsket inhibin B og et forhøjet FSH serum niveau, er tegn på en forringet spermatogenese. Sertoli-leydigcelle interaktion Mens der er enighed om at testosteron fra leydigcellerne fungerer som en parakrin faktor på sertolicellernes proliferation og dermed på spermatogenesen, er der diskussion om påvirkningen også går i modsat retning, altså hvorvidt parakrine faktorer fra sertoliceller spiller en rolle i reguleringen af leydigcellernes testosteronproduktion (Svechnikov & Soder, 2008; Young et al. 2000). Forsøg med grise tyder på at FSH kan have en stimulerende effekt på testosteronproduktionen via parakrine faktorer fra sertolicellerne, mens resultater fra humane in vivo forsøg tyder på, at FSH ikke spiller nogen betydelig rolle for testosteronproduktionen gennem parakrine faktorer fra sertolicellerne (Young et al. 2000). Young foreslår at denne uenighed kan skyldes forskelle arterne imellem. En af de paracrine factorer, der har vist sig at være vigtig i reguleringen af leydigcelle funktionen er ghrelin, et peptid, der har vist sig at hæmme testosteronproduktionen in vitro (Svechnikov & Soder, 2008). I herværende speciale vil fokus være på den mere overordnede hormonelle regulering, da den har langt størst betydning og er mest relevant for undersøgelsen af imatinib. Overordnet kan det siges at GnRH regulerer udskillelsen af FSH og LH som henholdsvis stimulerer spermatogenesen via sertolicellerne og den androgene produktion i leydigcellerne. De to gonadotropiner kontrolleres via negativ feedback af de hormoner de stimulerer dannelsen af: inhibin-b fra sertolicellerne og testosteron fra leydigcellerne. 19

20 Forstyrrelse af den mandlige kønshormonbalance Forstyrrelser i kønshormonbalancen hos mænd kan være meget omfattende og giver sig til udtryk på forskellige måder, alt efter hvornår man er blevet udsat for de stoffer der er årsag til forstyrrelsen. En ændret hormonbalance under fosterudviklingen kan eksempelvis resultere i hypospadi og kryptorkisme hos nyfødte og senere i livet kan en forstyrrelse af hormonbalancen bl.a. medføre for tidlig pubertet, infertilitet eller gynecomasti (brystudvikling). Infertilitet skyldes oftest en fejl i selve testiklen. Det kan være manglende funktion af sertoliceller eller en fejl i leydigcellerne, som medfører for lav eller manglende testosteronproduktion. Infertilitet kan også skyldes en fejl i hypofysens produktion af LH og FSH, der i sidste ende påvirker spermatogenesen. Infertilitet er et emne, som er meget aktuelt, da der i de senere år har været en stigning i ufrivillig barnløshed, hvilket der findes mange årsager til. Et andet, og i denne sammenhæng mere relevant, symptom på en ændret hormonbalance er gynecomasti. Gynecomasti Gynecomasti er defineret som en øget proliferation af brystkirtelvævet hos mænd og er hermed forskellig fra pseudogynecomasti (adipomasti), hvor forstørrelsen af brystet blot skyldes en fedtakkumulering i brystvævet, hvilket ofte ses hos overvægtige mænd (Eckman & Dobs, 2008). Gynecomasti forekommer ofte som en midlertidig tilstand hos nyfødte, hos drenge i puberteten samt hos ældre mænd. Årsagen til dette er, at gynecomasti skyldes en forhøjet cirkulerende østrogen/androgen ratio, hvilket er et kendetegn for disse tre perioder af livet (Johnson & Murad, 2009). Der kan være flere årsager til en høj østrogen/androgen ratio: 1) Der kan være tale om en forøget produktion af østrogener. Dette kan ske ved en forøget aromatase aktivitet f.eks. forårsaget af leydig eller sertolicelle tumorer, eller ved en forøgelse af fedtvæv. En større mængde fedtvæv medfører at flere af de cirkulerende androgener optages og omdannes til østrogener, da enzymet aromatase især findes i hud og fedtvæv (Johnson & Murad, 2009). 2) En forøget østrogen/androgen ratio kan også skyldes en formindsket androgen produktion, som bl.a. ses hos mænd med primær eller sekunder testikelfejl. Dette kan skyldes en formindsket aktivitet af de enzymer, der er involveret i biosyntesen af testosteron eller en manglende stimulering af testosteronproduktionen. 20

21 3) En lille androgen aktivitet i forhold til østrogen aktivitet kan også forekomme i forbindelse med medicinsk behandling, f.eks. ved antiandrogen behandlig af prostatacancer (Di et al. 2005). Medikamenter kan blokere androgenreceptorer, så de cirkulerende androgener ikke har en virkning i målcellerne og receptorerne for østrogen kan aktiveres af visse typer medicin eller af det omgivende miljø (Johnson & Murad, 2009) % af gynecomastitilfældene skyldes indtag af medicin og andre stoffer som marijuana og steroider (Eckman & Dobs, 2008). 4) Endelig spiller serumkoncentrationen af SHBG også en rolle for balancen mellem frit testosteron og østrogen. En ændring af denne koncentration kan derfor også være årsag til gynecomasti (Johnson & Murad, 2009). Hormonanalyse Hvis der opstår symptomer, der giver mistanke om en fejl i det reproduktive system, kan man vha. hormonanalyser finde ud af hvad årsagen kan være og hvor i systemet fejlen er. Hvis det er leydigcellerne, der ikke fungerer optimalt, vil man typisk se et formindsket testosteronniveau og et forhøjet LH niveau, da der ikke er så meget testosteron til at hæmme produktionen af LH fra hypofysen. Hvis man kun ser en stigning i FSH koncentrationen, kan det indikere en fejl i de seminifære tubuli. Disse fænomener kaldes for primær hypogonadisme. Hvis analysen både viser lave koncentrationer af gonadotropiner og testosteron er det et tegn på, at det er den første del af hormonkæden, der ikke fungerer ordentligt, så leydigcellerne ikke bliver stimuleret til at syntetisere testosteron. Dette fænomen, som altså skyldes en forstyrrelse i produktionen af gonadotropiner, kaldes sekunder hypogonadisme (Brook & Marshall, 2001b). I de sidste års undersøgelser af imatinib har man observeret et fald i testosteronkoncentrationen hos patienterne og man har en mistanke om, at det skyldes en hæmning af c-kit og pdgf receptorer i testis. For at forklare dette, vil jeg først give en kort introduktion til kronisk myeliod leukæmi og derefter redegøre for imatinibs virkemåde. 21

22 Kronisk myeloid leukæmi Kronisk myeloid leukæmi (CML) er en cancer i de hvide blodlegemer, der opstår i knoglemarvens bloddannende stamceller. Sygdommen er karakteriseret ved en øget og ukontrolleret vækst af myeloide stamceller, som resulterer I en ophobning af granulocytter, erytrocytter og thrombocytter I blodet (figur 8) (Sawyers, 1999). Normalt danner knoglemarven blodstamceller, som efterhånden udvikler sig til funktionelle blodlegemer (figur 8). En blodstamcelle kan enten blive til en myeloid stamcelle eller en lymfoid stamcelle. De lymfoide stamceller differentieres til lymfoblaster som udvikles til lymfocytter, en type hvide blodlegemer, der er involveret i kroppens specifikke immunforsvar. De myeloide stamceller differentieres til én ud af følgende tre blodlegemer: erytrocytter (røde blodlegemer) der transporterer ilt rundt til vævene og bortskaffer CO2 granulocytter (hvide blodlegemer) der er med til at bekæmpe infektioner thrombocytter (blodplader) der spiller en vigtig rolle ved blodets koagulation. Figur 8 Blodlegemeudvikling. Simpelt diagram der viser udviklingen af forskellige blodlegemer fra hæmatopoietiske stamceller til modne celler. Fra: q/treatment/cml#keypoint3. Sygdommen er karakteriseret ved at der i leukæmicellerne findes en genmutation, der består af en translokation mellem kromosom nr. 9 og 22 hvorved det såkaldte Philidelphia kromosom er opstået (se figur). Ved translokationen fusionerer Bcr genet fra kromosom 22 med Abl genet fra kromosom 9 hvorved et nyt Bcr-Abl fusionsgen bliver skabt (Sherbenou & Druker, 2007). 22

23 Figur 9 Philidelphia kromosom. Viser hvordan translokationen mellem kromosom 9 og 22 skaber et nyt fusionsgen: Bcr-Abl opstår. Fra nt/cml#keypoint3 Man kender ikke den oprindelige funktion af Bcr og Abl genet, men man ved at Abl genet koder for en tyrosinkinase, hvis aktivitet er nøje reguleret. Fusionen resulterer i, at der i de defekte celler i knoglemarven dannes et nyt protein, der viser sig at fungere som en oncogen cytoplasmisk tyrosinkinase, hvis aktivitet ikke bliver reguleret (Goldman & Melo, 2001; Sherbenou & Druker, 2007). Dette er et godt eksempel på hvordan et protooncogen (Abl-genet), som man kalder gener involveret i reguleringen af cellevækst (vækstfaktorer, vækstfaktorreceptorer, signaltransducere bl.a.) kan omdannes til et aktivt oncogen via en mutation eller kromosomal omrokering. Det nye konstitutivt aktive Bcr-Abl oncoprotein kan ukontrolleret føre fosfatgrupper fra ATP til tyrosinenheder på andre proteiner i cellen. Herved aktiveres flere signal-tranduktionsveje som involverer PI3 kinase, RAS, RAF, JUN kinase, MYC og STAT, der typisk indgår i kontrol af vækst og differentiering af normale hæmatopoietiske celler(sawyers, 1999). Denne konstante aktivering af specifikke signalveje inde i cellen, resulterer i en øget celleproliferation og ophobning af de celler der indeholder mutationen (Kantarjian et al. 2006). Sygdommen rammer 2 ud af pr år og rammer oftest middelaldrene mænd (peaker ved år) (von & Duyster, 2010). Sygdommen starter med at den omtalte translokation opstår, hvorefter der følger en nogenlunde stabil kronisk fase på 3-6 år. Den kroniske fase er karakteriseret ved en enorm stigning i antallet af hvide blodlegemer og blodplader i blod og knoglemarv. Hvis sygdommen ikke behandles går den ind i en accelererende fase og udvikles med tiden til akut leukæmi (Sherbenou & Druker, 2007). Progressionen i de sidste faser af sygdommen skyldes en ophobning af flere ikke-tilfældige genetiske abnormaliteter, så som duplikering af Philidelphia kromosomet samt mutationer og sletning af tumor-suppressor gener, hvilket formentligskyldes Bcr- Abl genet (Sawyers, 1999). 23

24 I behandling mod CML anvendes især målrettet terapi, hvormed man kan angribe specifikke cancerceller uden at skade almindelige celler. Da CML er en sygdom, der opstår pga. et enkelt onkogen, har denne terapiform været særdeles effektiv (von & Duyster, 2010). Målet i behandlingen af CML er således at hæmme Bcr-Abl kinaseaktiviteten ved at blokere for en del af enzymet, så det ikke kan udføre sin funktion. En af de tyrosinkinasehæmmere, som har vist bedst resultater i behandlingen af CML, er imatinib mesylate (Glivec ). 24

25 Imatinib mesylate (Glivec ) Normalt fungerer Bcr-Abl tyrosinkinasen, som nævnt, ved at overføre phosphatgrupper fra ATP molekyler til et substrat, der gennem denne phosphoryleringsproces aktiveres og igangsætter signalkaskader i cellen. Bcr-Abl-signalet bliver herved ført videre til kernen og resulterer i ukonrolleret vækst. Imatinib (oprindeligt kaldet STI571, som forkortelse for signal-transduction inhibitor) er en lille Abl-kinase, som blev syntetiseret for at hæmme aktiviteten af Bcr-Abl oncogenet. Det lille molekyle virker kompetitivt ved at binde til ATP-bindingsstedet på Bcr-Abl kinasen og blokerer derved for bindingen af ATP (Goldman & Melo, 2001) (figur 10). Figur 10 Imtinibs (ST1571) hæmning af Bcr-Abl aktivitet. Imatinib binder til BCR-ABL kinasens ATP-bindingsted og forhindrer derved fosforylering af substratet. Fra (Goldman & Melo, 2001) Denne binding forhindrer Bcr-Abl kinasen i at fosforylere nedstrøms signalproteiner, som dermed ikke bliver aktiveret og signaltransduktionsvejene stoppes. Cellekernen får derved ikke besked om at øge proliferation og der produceres ikke flere defekte blodlegemer. Nyere forsøg har vist, at celler, der udtrykker Bcr-Abl, er afhængige af dette oncogen, -ikke bare for proliferation, men også for at overleve. Hæmningen af Bcr-Abl proteinet resulterede i, at de defekte celler gik i apoptose (Sherbenou & Druker, 2007). På den måde kan man i mange tilfælde stort set udrydde celler der udtrykker Bcr-Abl, uden at dræbe de raske stamceller, hvorfra de opstod (Goldman & Melo, 2001; Sherbenou & Druker, 2007). I 2001 (hvor imatinib kom på markedet) blev der lavet en større en undersøgelse af 532 patienter i imatinib behandling, hvor 88% af dem 25

26 således opnåede normalt celleantal i blodprøverne i løbet af et år (Institut for Rationel Farmakoterapi, 2001). Imatinib blev syntetiseret til at hæmme Bcr-Abl tyrosinkinasen, men det har vist sig at imatinib også hæmmer få andre tyrosinkinaser, hvis kinasedomæne har en lignende strukturel organisering. Der er tale om 2 proteiner; c-kit (stem-cell factor receptor) og PDGFR (platelet-derived growth factor recepter), som begge tilhører type III gruppen af receptor tyrosinkinaser (Buchdunger et al. 2000; Sherbenou & Druker, 2007). Denne undergruppe er karakteriseret ved 5 immunoglobulinlignende enheder i den ekstracellulære del, der sørger for binding af ligand og dimerisering, én transmembran helix, der fastgør receptoren til cellemembranen og en cytoplasmisk del, der indeholder 2 kinasedomainer (figur 11). Receptor tyrosinkinasernes funktion er, at overføre vækstregulerende signaler over plasmamembranen (Mithraprabhu & Loveland, 2009). Figur 11 Skematisk illustration af receptor tyrosinkinase Ud over at hæmme andre tyrosinkinaser, hæmmer imatinib også de abl-kinaser, der findes i normale celler. Effekten af denne hæmning ved imatinibbehandling er tilsyneladende lille, hvilket kunne tyde på at abl proteinet ikke spiller nogen essentiel rolle i normale signalveje hos voksne mænd (Goldman & Melo, 2001). Imatinib og forstyrrelse af reproduktiv funktion Flere studier har foreslået, at det er hæmningen af c-kit og PDGFR og deres downstream signalveje, der er skyld i hormonændringerne hos mænd under imatinib behandling (Gambacorti-Passerini et al. 2003; Kim et al. 2005; Mariani et al. 2008). Denne antagelse kommer af, at de to receptorer også er tyrosinkinaser og strukturmæssigt ligner Bcr-Abl proteinet, som imatinib er rettet mod, samt ud fra den viden der findes om deres ekspression og funktion. For at undersøge hvordan c- kit og PDGFR muligvis kan blive hæmmet af imatinib, vil de blive behandlet nærmere herunder. 26

27 C-kit C-kit bliver overordnet udtrykt i hematopoietiske stamceller, i germal celler, i interstitiale kajalceller (type celler fundet i mave-tarm systemet) og i nogle tumorer. Flere studier har undersøgt mere præcist, hvor i testikelvævet c-kit receptoren bliver udtrykt. Et studie fra 1991 har, vha. insitu hybridisering, påvist at c-kit receptoren findes i leydigceller og type-a spermatogonier hos mus (Sorrentino et al. 1991). Efterfølgende har studier af human testikelvæv, vha. immunhistokemi, ligeledes lokaliseret c-kit i membranen på leydigceller og i type A spermatogonier (når de er i differentiering fra A1-A4) og derudover i type B spermatogonier, men ikke i germalceller før dette stadie, dvs i de spermatogonale stamceller (Sandlow et al. 1996). Derudover udtrykkes c-kit i runde spermatiders acrosomale granula, og i acrosomet i spermatozoerne, hvilket tyder på at receptoren også har en funktion i den akrosomale proces. I de postmeiotiske stadier af spermatogenesen, dvs. fra og med spermatiderne er det en trunkeret udgave af c-kit, tr-kit, der kommer til udtryk (Schnabel et al. 2005). Tr-Kit svarer til en mindre del af den cytoplasmiske region af c-kit og reguleres altså ikke af den ydre ligand, SCF (stem cell factor). Forskere har, vha. immunhistokemi af prøver fra normale og infertile mænd, fundet ud af at SCF udtrykkes i sertolicellerne (Sandlow et al. 1996). Studier med mus har desuden vist, at sertolicellernes udtryk af mrna for SCF induceres af hormonet FSH, via en forøgelse af camp niveau i cellen (Rossi et al. 2000). Signalet fra hypofysen er på denne måde nødvendig for, at sertolicellerne kan udføre deres opgave, som er at give næring og vækstfaktorer til germalcellerne under deres udvikling. C-kitreceptorer sender SCF signalet videre over cellemembranen hos germalcellerne, hvor det når ind til cellekernen og påvirker genekspressionen (figur 12). Figur 12 Viser sammenhæng mellem FSH, SCF og c-kit stimulering. 27

28 C-kit receptorens signaloverførsel starter når SCF binder til dens ekstracellulære domæne, hvilket resulterer i en dimerisering af to sideliggende c-kit receptorer, der fører til proteinkinase aktivitet. Herved er det muligt for receptorerne at fosforylere hinandens intracellulære tyrosinenheder via autofosforylering. De fosforylerede tyrosinenheder udgør hver et fasthæftningssted for diverse signalmolekyler og adapterproteiner, indeholdende et eller flere SH2-domæner, som herved bliver fosforylerede. Herefter danner disse molekyler udgangspunkt for adskillige signalveje der fører til proliferation af cellen. Blandt disse signalveje er PI3-kinase, RAS/MAPK og JAK/STATvejen (Mithraprabhu & Loveland, 2009) (figur 13). Hvilke signalveje der aktiveres afhænger af celletype og cellens udviklingstrin (Mithraprabhu & Loveland, 2009; Tickenbrock et al. 2008). Figur 13 Skematisk oversigt over c-kit signaltransduktion. Modificeret fra Phosphatidylinositol 3-kinase signalvej: PI3-kinase proteinet er en heterodimer, som består af en regulatorisk enhed, p85, og en katalytisk enhed, p110. PI3-kinase binder til c-kit via et eller begge SH2 domæner på dens p85 enhed. Dette fører til aktivering af PI3-kinasens katalytiske enhed, som nu binder og fosforylerer proteinet PIP2 og danner PIP3. Proteinkinaserne Akt og PDK1 binder via deres PH domæne til PIP3 ved plasmamembranen, hvorved PDK1 kan fosforylere og aktivere Akt, som efterfølgende fosforylerer den pro-apoptiske factor BAD. Fosforyleringen hæmmer BAD og blokkerer signalet om apoptose. (Cobb & Ross, 2007; Roskoski, Jr., 2005). 28

29 Studier af PI3-kinasens rolle i c-kit signalering anvender en mutantform af c-kit, hvor Tyr ved position 719, som er det sted PI3-kinasen binder ved fosforylering, udskiftes med fenylanalin og kaldes Y719F (Mithraprabhu & Loveland, 2009). Ras/MAP kinase signalvej: GRB2 er et adapterprotein, der via sit SH2 domæne, binder til c-kit ved fosforylering. Her associerer det med proteinet SOS og proteinkomplekset aktiverer det lille G- protein, RAS. Herved startes en proteinkinasekaskade, som består af RAF1, MEK1/2, p38, MAPK 3/2, som i sidste ende fører til aktivering af MAPK. MAPK kan påvirke transkriptionsfaktoraktiviteten og derved øge proliferation (Mithraprabhu & Loveland, 2009). JAK/STAT signalvej: JAK2 (Janus kinase 2) er en cytoplasmisk tyrosinproteinkinase, som binder til c-kit receptoren og aktiveres gennem autofosforylering. Tyrosinenheder på receptoren fosforyleres herved, hvilket muliggør binding af signalproteiner med et SH2 domæne, som oftest transkriptionsfaktorerne STATs (signal transducers and aktivators of transcription). Fosforylerede STATs kan herefter bevæge sig ind i cellekernen og ændre transkriptionen (Cobb & Ross, 2007). Mange studier med mus og rotter har efterhånden demonstreret at ekspression af c-kit og dens ligand, SCF, er nødvendig for proliferation, overlevelse, migration og modning af germalceller i embryonale og postnatale testikler (Buchdunger et al. 2000; Mauduit, Hamamah & Benahmed, 1999; Mithraprabhu & Loveland, 2009; Rossi et al. 2008; Sandlow et al. 1996). Flere af studierne viser at c-kit/scf interaktion er afgørende for påbegyndelse af spermatogenesen, dvs for differentiering af type A-spermatogonier (A1-A4) og i overgangen fra mitotisk til meiotisk cellecyklus, samt for overlevelse af germalcellerne i den meiotiske fase (Rossi et al. 2008; Yan, Suominen & Toppari, 2000). Derimod kræver udviklingen af cellerne i det senere stadie af spermatogenesen, spermiogenesen, en nedregulering af c-kit signalering (Schnabel et al. 2005). In vivo undersøgelser med mus har vist, at det især er c-kits aktivering af PI3K/Akt vejen (se figur 13) der er nødvendig for spermatogenesen (Blume-Jensen et al. 2000). Blokering af denne signalvej (forhindring af PI 3-kinase i at binde til c-kit) resulterede i formindsket proliferation og forhøjet apoptose af spermatogonier og dermed i sterilitet hos homozygote mutant mus. Disse resultater er i overensstemmelse med in vitro forsøg med mus, som ligeledes målte en øget frekvens af germal celler i apoptose ved blokering af c-kit medieret PI3K-vej (Kissel et al. 2000). Studier med Drosophila har vist at JAK/STAT signalering er nødvendig for selvfornyelse af germale stamceller (Mithraprabhu & Loveland, 2009), der er dog intet der tyder på at c-kit medieret JAK/STAT signalering spiller en rolle i pattedyrs testikelfunktion. 29

30 C-kit receptorens betydning for leydigcellernes differentiering og testosteronproduktion er blevet studeret i flere forsøg, da c-kit findes i leydigcellernes cellemembran. Leydigcellernes syntese og udskillelse af testosteron er som før nævnt, afhængig af LH fra hypofysen. Den mekanisme hvormed LH stimulerer testosteron produktionen, involverer binding af LH til dens receptor på leydigcellen og en camp-medieret signalvej, der fører til kolesterol mobilisering (Rothschild et al. 2003). Denne signalvej anses som den primære mekanisme for syntese af testosteron, men andre faktorer end LH har vist sig at kunne stimulere leydigcellernes steroidgenese in vitro via andre signalveje, der ikke involverer camp. Et af de studier, der har ville undersøge om c-kit signalering er involveret i reguleringen af leydigscellernes testosteronprodukton, udførte in vivo forsøg med kity719f / kity719f knock-in mutant mus (Rothschild et al. 2003). Denne mutation har før vist sig at forhindre c-kits aktivering af PI3-kinase vejen og har resulteret i sterilitet hos mus pga. blokering af spermatogenese (Blume- Jensen et al. 2000; Kissel et al. 2000). For at vurdere leydigcellernes steroidogenese hos mutantmusene undersøgte Rothschild i 2003 dels om det totale antal leydigceller blev påvirket af c- kit mutationen og dels testosteronproduktionsraten pr. celle. De fandt vha. stereologiske målinger frem til, at det totale antal leydigceller var ens hos mutantmusene og kontrolmusene. For at kunne afgøre om c-kit mutationen påvirker leydigcellernes cellecyklus, undersøgte de desuden leydigcellernes proliferative indeks og apoptosehastighed. Det proliferative indeks blev vurderet ved at mærke musene med BrdU og efterfølgende undersøge testikelvævet for inkorporering af BrdU vha. immunhistokemi. Frekvensen af apoptose i leydigcellerne blev vurderedes vha. TUNEL assay af mutant og kontrolmus testikelvæv. De fandt ingen signifikant forskel i BrdU inkorporering i leydigcellerne ej heller i apopotosefrekvensen hos mutant og kontrolmus. Derudover blev mutantmusenes leydigcellers differentieringsstatus (størrelse og organelstruktur) sammenlignet med vildtype kontrolceller ved elektronmikroskopi og der blev ikke fundet nogen forskel. Sammenlagt tyder resultaterne på at c-kit medieret PI3-kinaseaktivitet ikke spiller en rolle i leydigcelledifferentiering på trods af disse celletypers ekspression af c-kit receptorer. C-kits involvering, via PI3-kinase, i leydigcellernes steroidogenesekapacitet blev undersøgt, ved at måle både serum og intratestikulær testosteronkoncentrationen samt LH-koncentrationen. Serumtestosteronkoncentrationen hos mutanterne var en smule (men ikke signifikant) lavere end hos alderssvarende kontrolmus og der var ingen forskel i den intratestikulære testosteronkoncentration per testikel hos mutantmus og viltypemus. LH koncentrationen var 30

31 derimod signifikant ændret hos mutantmusene og var øget til det femdobbelte i forhold til vildtypemusene. Disse observationer kan tyde på at mutantleydigcellernes testosteronproduktion til at begynde med er forringet, hvilket vil mindske den negative feedback mekanisme og derved øge secernering af LH fra hypofysen. At mutantmusenes testosteronkoncentration var nogenlunde den samme som hos kontrolmusene, kan forklares ved, at den forhøjede LH stimulering kompenserer for mutationens påvirkning af steroidogenesen ved at øge den camp medierede testosteronproduktion. Denne forklaring blev sandsynliggjort ved et efterfølgende forsøg, der udelukkede muligheden for, at den forhøjede LH skyldtes en direkte påvirkning af hypofysen frem for testiklerne. For at underbygge resultaterne yderligere viste Rothschild efterfølgende, at c-kit signalering er involveret i reguleringen af leydigcellernes testosteronproduktion in-vitro. Her fandt de at leydigceller fra kontrolmus inkuberet med SCF, fordoblede testosteronproduktionen, i forhold til kontrolceller, der ikke var inkuberet med SCF. De observerede desuden et højere steroidogenetisk respons hos mutantleydigceller ved stimulering med LH end hos normale leydigceller. Et af de tidligere in-vivo studier med KitY719F/ KitY719F mutant mus viste, i lighed med ovenstående resultat, stort set ingen forskel på serumtestosteronkoncentrationen hos mutantmus og kontrolmus, men en forhøjet LH koncentration hos mutantmusene (Kissel et al. 2000). Disse studier tyder altså på at c-kit er involveret i leydigcellernes steroide kapacitet, via aktivering af PI 3-kinase signalering, men at testosteronkoncentrationen bliver vedligeholdt af en forøget LH stimulering af den camp-medieret signalvej. Samlet set tyder observationerne på, at en hæmning af c-kit vil resultere i en ufuldstændig spermatogenese (manglende proliferation af spermatogonier, færre germal celler går i meiose og flere går i apoptose), som vil nedsætte fertiliteten, samt en nedsat testosteron produktionskapacitet i leydigcellerne, som imidlertid kompenseres for via en forhøjet LH koncentration. PDGF receptorer Platelet-derived growth factors PDGF-A og B har længe været kendt som vigtige faktorer i regulering af celledifferentiering, cellevækst og proliferation og er involveret i mange sygdomme. Under PDGF familien hører også PDGF-C og D. De fire PDGF-isomerer er kun biologisk aktive når de er i form af en homo- eller heterodimer. 31

32 Der findes to typer af PDGF receptorer: PDGF-Rα og PDGF-Rβ, der som før nævnt hører under tyrosinkinase receptorer. De to receptortyper dimeriserer til en ud af tre receptorkombinationer: αα, ββ eller αβ, som har forskellige ligand bindingskapacitet. Efter binding af PDGF dimer sker der, ligesom ved c-kit aktivering, en autofosforylering af de to receptorers kinaseenheder, som herved bliver til bindingssted for diverse signaltransduktionsmolekyler med SH2 domæner. PDGF receptoren aktiverer, ligesom c-kit, PI3 kinase/akt og Ras/MAPK vejen. Derudover binder PDGF receptoren til substrater som p190 RasGAP, PLC-γ og Src som herved aktiveres og starter intracellulære signalkaskader, der fører til øget proliferation og celleoverlevelse (Cobb & Ross, 2007) (figur 14). Figur 14 Oversigt over PDGF receptor signaltransduktion. Fra y.php?ppl=fac_jmh I testiklerne udtrykkes PDGF receptorer og deres ligand efter det normale mønster: ligand i epitelvæv og receptorer i stroma. PDGF-Rα findes således i leydigcellerne og PDGF-A udtrykkes i sertolicellerne (Mariani et al. 2002). Leydigcellepopulationen hos voksne består af leydigceller udviklet fra henholdsvis udifferentierede mesenkymale stamceller og fra mitoseaktive leydigceller (Mendis-Handagama & Ariyaratne, 2001). Forsøg med mus har vist at stamcellerne, leydigcellerne udvikles fra, er PDGF-Rα positive og differentieres ved binding af PDGF-A til mesenkymlignende forstadieceller, som gennem adskillige trin af proliferation og differentiering udvikles til modne voksen-leydigceller (Gnessi et al. 2000; Teerds & Rijntjes, 2007) (figur 15). Udviklingen sker først omkring puberteten, da flere trin i processen kræver LH, i modsætning til den fetale type leydigceller. Studier har vist at PDGF-A -/- mus udvikler en progressiv reduktion af testikelstørrelse, tab af leydigceller, formindsket cirkulerende testosteron og spermatogenesestop på 32

33 trods af normal LH koncentration (Gnessi et al. 2000; Mariani et al. 2002). Disse symptomer tilskrives manglende differentiering af PDGF-Rα-positive mesenkymceller til voksen leydigceller. Figur 15 En simpel model over udvikling af voksenleydigceller. Både proliferation og differentiering af cellerne er afhængige af LH. PDGF-A er nødvendig for differentiering af stamcelle til forstadiecelle. Modificeret fra (Teerds & Rijntjes, 2007). I modsætning til musene i dette forsøg, har mændene i imatinib behandling først fået blokeret PDGF-A signalering senere i livet, de fleste af dem først efter puberteten, hvor de har etableret en population voksenleydigceller. De mekanismer, der resulterer i differentiering af voksenpopulationen af leydigceller, fortsætter imidlertid i den modne testikel, for at vedligeholde et konstant antal leydigceller (Mendis-Handagama & Ariyaratne, 2001; Teerds & Rijntjes, 2007). En hæmning af PDGF-Rα hos patienterne behandlet med imatinib, kunne derfor betyde at leydigcellepuljen vil blive mindre med tiden, da de døde leydigceller ikke bliver erstattet med nye leydigceller pga. manglende differentiering af de mesenkymale stamceller. Som følge heraf vil testosteronproduktionen derfor kunne falde. PDGF-A er ikke den eneste vækstfaktor, der er involveret i leydigcellefunktion. Studier har vist at PDGF-B har en mindre stimulerende effekt på leydigcellernes basal og LH-stimulerede testosteron produktion (Risbridger, 1993). Der er altså meget der tyder på, at hæmning af PDGF receptorer både kan medføre manglende udvikling af leydigceller og en mindre effektiv testosteronproduktion hos den enkelte leydigcelle, 33