Sysmex analyseprincipper

Transkript

1 Hæmoglobin: 4 µl blod tilsættes 2000 µl Cellpack, og blandingen mikses. Af denne opløsning anvendes de 1000 µl til RBC/PLT-måling. De 1004 µl der er tilbage tilsættes 500 µl Sulfolyser. Se flowchart Hæmoglobin (Billede 1). Flowchart - Hemoglobin Probe Blood: 4µL Sulfolyser 0,5mL Forfortynding: 4 µl Blod + 2 ml Cellpack Heraf bruges 1004 µl til Hgb Dilution ratio: 1:747 Hb Detektion: Fotometri 555nm Sample tube RBC/HGB sample chamber Flowcelle Billede 1: Flowchart Analyseprincip Hæmoglobin Første trin i processen er en hæmolyse af de røde blodlegemer. SLS s* hydrofobe og hydrofile orientering bevirker en absorption af molekylet i erythrocytmembranen, så denne ødelægges, men forbliver opløselig. Andet trin i processen bevirker, at SLS*-molekylets hydrofobe del ændrer globinmolekylets facon (proteinet denatureres), så hæm-delen frilægges og bliver lettilgængelig for iltning af ferrojern Fe ++ til ferrijern Fe +++. Tredje trin er dannelse af SLS-hæmoglobin. SLS-molekylets frie negative ladning danner forbindelse med hæmgruppens positive Fe +++. (Billede 2) * SLS = sodium lauryl sulfat (Sulfolysereagens) Reagens - Hemoglobin Den hydrofobe del af SLS denaturerer globulinet. Fe 2+ i hemmolekylet oxideres til Fe 3+ (Fe 2+ > Fe 3+ ). Den hydrofile del af SLS molekylet binder sig til Fe 3+ og former et stabilt komplex. Fe 2+ Fe 3+ Fe 3+ SLS molekyler 10 Billede 2: Analyseprincip Hæmoglobin

2 Målemetode Hæmoglobin SLS-hæmoglobin måles ved en spektrofotometrisk metode ved 555 nm. (Billede 3) Koncentrationen af Hæmoglobin er ligefrem proportionalt med absorbansen og udregnes vha Lambert-Beers lov A = c*d*ε, hvor A: Absorbans, c: koncentration, d: Lysvejen og ε: Ekstinktionskoefficienten. Hb-kuvetten renses med Cellpack. Hb-blank måles på Cellpack. Analysering af fortynding: 1:747 Analysesvar-Blank = Hb-resultat. Fotometri - Hemoglobin Måles ved 555nm Prøveflow Cellpack Lysdiode Linse Filter kuvette Sensor 11 Billede 3: Målemetode Interferens Hæmoglobin Hb kan være falsk forhøjet ved ekstreme Lipidværdier, hvorved MCHC også bliver for høj. Leucocytter lyseres af sulfolysereagenset, men kan ved ekstreme høje værdier ( x10 9 /L) interferer.

3 RBC & PLT kanal Måling af RBC og PLT med Impedansmetoden: Cellpack har en osmolalitet på 250 mmol/l lidt lavere end normalt blod, hvilket gør, at erytrocytterne trækker vand ind i cellerne og MCV bliver større. Det gør adskillelsen mellem erytrocytter og trombocytter bedre. Der kan anvendes både DCL(fortyndet)- og DST(koncentrat) Cellepack. Impedans DC-Detektion Metode (ledningsevneprincip) DC = direct current = jævnstrøm Tælleprincippet bygger på impedans (modstand) der opstår, når en celle opløst i en elektrolytvæske (Cellpack) passerer gennem et apertur. På hver side af aperturet er der placeret en elektrode, hvor der er påtrykt en spænding, hvilket medfører der vil gå en strøm. Når fortynding trækkes igennem aperturet vil cellen fortrænge en del af fortyndingsvæsken. Da cellen har en større modstand end væsken, vil denne større modstand kunne måles. (Billede 4) Impedans hydrodynamisk fokusering 17 Billede 4: Impedans Ifølge Ohm s lov er der følgende sammenhæng mellem spænding, strøm og modstand: U (spænding) = R (modstand) x I (strømstyrke) Holdes strømstyrken konstant, vil der komme en øget spændingsforskel, hver gang der passerer en celle gennem hullet. Denne spændingsforskel afhænger af cellens størrelse. En stor celle fortrænger mere væske end en lille celle og giver derfor anledning til en større stigning i modstanden svarende til en større spændingsforskel. Forskellens størrelse er proportionalt med cellens størrelse, og hver impuls svarer til én celle. Hydrodynamisk Fokusering Da antallet af celler, der tælles i erythrocyt-thrombocytkanalen, er meget stort og da signalerne fra thrombocytter er meget små i forhold til signalerne fra erythrocytter, vil der på grund af turbulens omkring aperturen, kunne ske fejlregistrering af celler. Det vil også kunne ske, at to

4 celler passerer hullet samtidig, og derved registreres som én stor celle i stedet for to små. For at undgå disse fejl anvendes der Hydrodynamic Focusing. Hydrodynamic Focusing = Sheath-flow (sheath = skede) = omsluttende væskestrøm Prøverøret, hvor den fortyndede blodprøve presses frem til aperturen, er anbragt lige foran aperturet og på linje med dens midte. Rundt om prøverøret og gennem aperturen presses sheath reagens med stor hastighed. Dette medfører, at cellerne i den fortyndede prøve alle passerer igennem aperturens midte og kun en celle ad gangen (som perler på en snor). For at undgå turbulens efter passagen anvendes der ligeledes sheath reagens. (Billede 4) Suges et kendt volumen af en fortyndet blodprøve gennem hullet, vil alle spændingsændringer og impulser kunne registreres og omsættes til antal celler pr. liter blod samt et histogram over størrelsesfordelingen. Ved anvendelse af variable diskriminatorer registreres partikler i intervallet ca fl som erythrocytter, og i intervallet ca fl som thrombocytter. (Billede 5) Impedansmetoden - RBC og PLT Flydende diskriminatorer. Trombocytter har en størrelse på mellem 8-12 fl Populationen detekteres mellem 2 og 30 fl Erytrocytter har en størrelse på mellem fl Populationen detekteres mellem 25 og 250 fl Kurverne skal altid starte og slutte på grundlinjen og ligge indenfor diskriminatorene. 2-6 fl fl 250 fl 22 Billede 5: Histogram RBC & PLT De mørkeblå celler er trombocytter, og de lyseblå er erytrocytter.

5 MPV Beregning Ud fra trombocytkurven kan Middelcelle trombocyt volumen beregnes. Denne anvendes ikke som rutine parameter. (Billede 6) Impedans - PLT PLT Antal trombocytter MPV Mean Platelet Volumen, Normalområde: 8-12 fl MPV (fl) = Pct (%) PLT (x 10 3 /µl) fast diskriminator 2-6 fl 12 fl fl 23 Billede 6: PLT Histogram PLT Interferens Interferens impedansmetoden Impedansmetoden kan bla. påvirkes af: 1. Fragmenter eller mikroerytrocytter 2. Store trombocytter 3. RBC agglutiner 4. Hypoosmolalitet 31 Billede 8: PLT Histogram Impedans-metoden har nogle begrænsninger se Extended instruks og PLT-O og PLT-F.

6 RDW Beregning Ud fra erytrocytkurven kan distribueringsvidden beregnes (Billede 7). Denne anvendes ikke som rutine parameter. Histogram RBC Distribution Width +/- 1 SD modsvarer 68,26 % af kurven RDW-CV 100 % L2 - L1 RDW-CV (%) = L2 + L1 X % L1 L fl Normal område % RDW-SD 100 % 20 % Normal område fl fl Kurvens skæringspunkt ved 20% af tophøjden 25 Billede 7: RBC Histogram/RDW RDW (RBC distribuerings vidde): Anisocytose. Variation af størrelsen på erytrocytter. EVF Beregning RBC Pulse Height Detection Method V T Ph V Impulshøjden for hver enkelt erytrocyt måles i impedanskanalen 28 Billede 8: EVF Beregning Der måles på et fast volumen 9,3 µl. V T er total blodvolumen, og V er volumen af erytrocytterne. Derved vil vi få en EVF (Erytrocyt Volumen Fraktion) som er relateret til centrifugeret EVF, som er referencemetoden. (billede 8)

7 Indeks Beregning Indeksberegning RBC indeks beregnes som følger: MCV = HCT / RBC * 1000 MCH = Hb / RBC MCHC = Hb / HCT MCHC Hb MCH HCT RBC MCV 30 Billede 9: Indeksberegning MCV (Middel Celle Volumen) MCH (Middel Celle Hæmoglobin) MCHC (Middel Celle Hæmoglobin Koncentration) Hb (Hæmoglobin) HCT (EVF: Erytrocyt Volumen Fraktion) RBC (Røde Blod Celler)

8 WDF kanal WNR kanal RET kanal PLT-F kanal Tælling af celler vha. flourescens flowcytometri WBC/BASO & NRBC + DIFF + RETIC Flowcytometri Sysmex anvender flowcytometri teknologi med en halvleder laser som lyskilde til analysering af WBC/BASO & NRBC + DIFF + RETIC. En fuldblodsprøve bliver automatisk aspireret, fortyndet og farvet med et fluorescerende farvestof polymethine, der binder sig til RNA og DNA. Det fortyndede farvede prøvemateriale bliver hydrodynamisk fokuseret og ført gennem flowcellen. I flowcellen bliver hver celle belyst af lyset fra laseren, der udsender en intens monokromatisk lysstråle. Den enkelte celle vil sprede noget af lyset og noget af lyset vil absorberes af de farvede cellebestanddele, som derved fluorescerer og udsender lys af en længere bølgelængde (lavere energiindhold) i alle retninger. Det fremadrettede spredte lys, der udsendes (Forward Scattered Light, FSL), giver oplysning om cellens størrelse. Det lys, som spredes til siden (Side Scattered Light, SSC), giver oplysning om cellens indre (kernestørrelse/granula/celleorganeller). Det fluorescerende lys-intensitet (Side Flourescence Light, SFL) giver oplysning om, hvor meget farvestof cellerne har optaget. Intensiteten af fluorescensen øges, når indholdet af RNA og DNA øges. (Billede 10) Det er herved muligt at tælle og analysere hver enkelt celle med hensyn til cellestørrelse, kernestørrelse og indhold af RNA/DNA. For hver analysering udfærdiges et scattergram. (Billede 12) Fluorescens Flowcytometri 3 forskellige typer af information for hver celle: RNA/DNA indhold Intracellulær struktur Størrelse 39 Billed 10: Flowcytometri Forward Scatter Light: Cellestørrelse. Side Scatter Light: Den intracellulære struktur. Side Fluorescens Hight: RNA/DNA indholdet i cellen.

9 WDF-kanalen: DIFF (LYMF, MONO, NEU, EOS, IG) WDF-lysercell lyserer RBC og PLT og delvist WBC. WBC mister celleoverfladens form og der formes mikropore på membranen. Reaktionen resulterer i at den indre struktur i cellen træder i karakter. De basofiles granula ødelægges af reagenset, derfor vil de tælles sammen med de neutrofile granulocytter. Basofil resultatet kommer fra WNR kanalen. WDF fluorocell bindes til DNA/RNA. (Billede 11) WDF kanal Reagens reaktion XN series Reaction Lym Mono Neut Eo Billede 11: Reagensreaktion WDF WDF Scattergram I dette scattergram er cellerne delt op i populationer af MONO, LYMF, EOS, NEUT+BASO, IG. Intensiteten af det spredte lys (Side Scattered Light, SSC (kernestørrelse/granula/celleorganeller)) vises ud ad X-aksen og Intensiteten af det fluorescerede lys (Side Flourescence Light, SFL (DNA/RNA)) vises ud ad Y-aksen. (Billed 12) Pink: Lymfocytter Grøn: Monocytter Lyseblå: Neutrofile Orangerød: Eosinofile Mørkblå: IG (Umodne Granulocytter) Lyseblå + Mørkblå: Neusum (OUH analyse) WDF kanal SFL SSC Billede 12: WDF Scattergram

10 ACAS & SAFLAS Til differentieringen anvendes der et unikt analyseredskab i softwaret: ACAS (Adaptive Cluster Analysis System) og SAFLAS (Sysmex Adaptive Flagging Algoritme base on Shape recognition). På baggrund af dette system bliver cellepopulationerne beskrevet med 6 forhold som afbildes i WDF scattergrammet. 1. Størrelsen af populationen 2. Længden af populationen 3. bredden af populationen 4. Centroide af populationen 5. Formen af populationen 6. Hældningen af populationen Analyseredskabet gør at hver patient har sit eget unikke scattergram. Hvis de 6 forhold ikke kan diffeneres ses populationerne som grå skyer. WNR-kanalen: WBC/BASO & NRBC WNR lysercell lyserer og skrumper RBC, NRBC, PLT og WBC - undtagen BASO pga reagensets lave ph værdi. WNR-fluorocell bindes til DNA/RNA. (Billede 13) Reagensreaktion - WNR Baso Reaction Lym Mono Gran. NRBC RBC Billede 13: WNR Reagensreaktion WNR Scattergram I WNR scattergrammet ses en NRBC-population, BASO-population og en WBC-population (- baso) Intensiteten af det fluorescerede lys (Side Flourescence Light, SFL (DNA/RNA)) vises ud ad X-aksen og intensiteten af det fremad rettede lys (Forward Scattered Light, FSL (cellestørrelse)) op af Y-aksen. Basofile granulocytter vil pga af størrelsen lægge som en population for sig selv. NRBC separeres vha WNR-fluorocell, og da der ikke er så meget DNA/RNA i NRBC, vil de lægge sig i en population for sig selv.

11 Lyseblå:Granulocytter (altså neutrofile også umodne og eosinofile), Monocytter & Lymfocytter Gulgrøn: Basofilocytter Pink: NRBC Det vil altid være WNR-kanalens leucocyttal der afgives, da man i denne kanal får et total leucocyttal (lyseblå+gulgrøn population). (Billede 14 & Billede 15) WNR kanalen FSC BASO NRBC SFL Billede 14: WNR Scattergram WNR kanal Reagens reaktion FSC Baso Reaktion NRBC Lym RBC Mono SFL Gran. Billede 15: WNR scattergram/reagensreaktion

12 RET kanalen (Reticulocytter) I Reticulocyt-kanalen tilsættes prøven efter fortynding med cellpack DFL RET-fluorocell, som farver RNA. Reticulocyt Scattergram RET channel RET PLT-O FSC FSC SFL SFL Billede 16: Reticulocyt Scattergram X-aksen viser indholdet af RNA i reticulocytterne. Y-aksen viser Cellestørrelse. Da 95% af cellens indehold er hæmoglobin er det udtryk for dette indhold. (Billedet til venstre er med lineær Y-akse og billedet til højre er med logaritmisk Y-akse). I scattergrammet ses en Retic-populationen, en RBC- og PLT-population. (Billede 16) Stærk Blå: Modne erytrocytter Pink: LFR (lav fluorescens) Rød: MFR (mellem fluorescens) Orange: HFR (høj fluorescens) Turkis: PLT Hvis Plt-kurven ikke er i orden på Impedans-kanalen, kan XN vælge PLT-O målingen, hvis der er analyseret reticulocytter.

13 PLT-F kanal I PLT-F kanalen tilsættes prøven, efter fortynding med Cellpack DFL PLT-flourocell, som får trombocytterne til at fluorescere. (Billede 17) PLT-F channel - Reagent reaction Fluorescence (SFL) WBC large PLT small ~ middle RET small RBC small Billede 17: Reagensreaktion PLT-F PLT-F Scattergram PLT-F channel PLT-F FSC SFL Billede 18: PLT-F Scattergram X-aksen viser indholdet af DNA/RNA. Y-aksen viser størrelsen af cellerne. I scattergrammet ses en PLT-population, RBC population & WBC population (her kan klumper ses). Stærk Blå: Erytrocytter og reticulocytter Turkis: Modne Trombocytter Grøn: Umodne trombocytter Rød & Blå (højre hjørne): Leucocytter PLT-F er en reflex test, og det er på baggrund af regler i softwaret der bestemmer om prøven skal analyseres med denne metode.