Undersøgelse af sidestrømme på Hanstholm Fiskemelsfabrik, primært med fokus på limvand og soluble

Transkript

1 Trash2Cash Delrapport nr. 2.3 Undersøgelse af sidestrømme på Hanstholm Fiskemelsfabrik, primært med fokus på limvand og soluble Delprojekt 2: Hvidfisk udnyttelse af affald Teknologisk Institut

2 Trash2Cash Delrapport nr. 2.3 Undersøgelse af sidestrømme på Hanstholm Fiskemelsfabrik, primært med fokus på limvand og soluble 2014 Udarbejdet af: Teknologisk Institut Kontakt: Sara Kobbelgaard, tlf Rapporten er udarbejdet som led i projektet Trash2Cash Delprojekt 2: Hvidfisk udnyttelse af affald Trash2Cash Projektholder: Nordsøen Forskerpark, Willemoesvej 2, 9850 Hirtshals info@nordso .dk, tlf Faglig projektledelse: Teknologisk Institut, Teknologiparken, Kongsvang Allé 29, 8000 Aarhus C keha@teknologisk.dk, tlf Finansieret af: Markedsmodningsfonden Region Nordjylland Deltagende virksomheder

3 Indholdsfortegnelse 1. Formål Teori Fremgangsmåde Karakterisering af limvand og soluble Viskositet af soluble Prøveudtagning Resultat Analyser af limvand og soluble Spraytørring af limvand og soluble Protein og aminosyre Molekylvægtsfordeling Aminosyreanalyse Inddampning af limvand - viskostiet af soluble Viskositetsmåling Molekylvægtsfordeling Konklusion

4 1. Formål Undersøgelse af sidestrømme på Hanstholm Fiskemelsfabrik; primært med fokus på limvand og soluble. Formålet er at karakterisere disse procesfraktioner og afdække, om indholdet kan være interessant i relation til produktudvikling. 2. Teori Fiskemel og fiskeolie fremstilles ud fra procesdiagrammet, som ses i Figur 1. Første trin er kogning af industrifisk eller fiskeafskær (uden tilsætning af vand). Dette resulterer i en pressekage og en 2-faseopløsning bestående af fiskeolie og limvand. Fiskeolie og limvand adskilles i en dekanter. I dag inddampes faktionen af limvand til soluble. Soluble er en viskøs opløsning, som indeholder 30 % tørstof bestemt ved refraktometer. Soluble tilsættes pressekagen og indgår dermed i fiskemelet. Til produktionsprocessen af fiskemel kan desuden tilføres blodvand, hvis indhold er uafklaret. Sammensætningen af disse vandige procesfraktioner er ikke kendt. Indholdet af vandopløselige proteiner, størrelse og sammensætning er ikke klarlagt, og der ligger en udviklingsmæssig opgave heri. Hanstholm Fiskemelsfabrik forarbejder 50 tons fisk i timen, hvilket giver 35 tons limvand, som inddampes x7 til 5 tons soluble. Figur 1. Procesdiagram for fiskemelsproduktion 4

5 3. Fremgangsmåde 3.1. Karakterisering af limvand og soluble Limvand skal karakteriseres, således at sammensætningen af denne procesfraktion er kendt. Sammensætningen bestemmes ved kvantificering af: vand, aske, fedt og protein. 1. Totalt vandindhold bestemmes vha. inddampning samt Karl Fischer. Bestemmelsen foretages af Teknologisk Institut a. Inddampning foretages vha. frysetørring og spraytørring. 2. Aske bestemmes af Hanstholm Fiskemelsfabrik 3. Bestemmelse af fedt udføres vha. Soxhlet. Bestemmelsen foretages af Hanstholm Fiskemelsfabrik 4. Protein bestemmes vha. LECO som totalt indhold af nitrogen. Bestemmelsen foretages af Hanstholm Fiskemelsfabrik 5. ph af limvand bestemmes. Det er estimeret, at ph er 6-7. ph-bestemmelse foretages af Teknologisk Institut De vandopløselige proteiner i limvand skal karakteriseres mht. størrelsesfordeling og aminosyresammensætning. Karakterisering af protein foretages af Teknologisk Institut: 1. SDS-gel anvendes til bestemmelse af størrelsesfordelingen af protein 2. Sammensætningen af frie aminosyrer bestemmes vha. HPLC 3. Sammensætningen af total aminosyrer bestemmes vha. HPLC 3.2. Viskositet af soluble Det forventes, at en andel af limvand består af collagen. Derfor er det interessant at undersøge, hvorledes viskositeten påvirkes, hvis inddampningen foregår i surt miljø. Det er muligt, at man kan udføre en termisk ekstraktion af gelatine ud fra collagen, hvis inddampningen foregår under sure betingelser. Alternativt kan limvand tilsættes proteaser, hvorved peptidbindingerne i proteiner spaltes, således at solublefraktionen bliver mindre viskøs Prøveudtagning Det er væsentligt at udtage forskellige fraktioner af limvand, så det afdækkes, om sammensætningen af limvand afhænger af fiskeart. Det skal afdækkes, hvilken temperatur limvand opnår i processen, samt hvad temperaturen er under inddampning til soluble. 5

6 4. Resultat 4.1. Analyser af limvand og soluble Analyser udført ved Hansholm Fiskemelsfabrik er listet i Tabel 1. Fedtindholdet bliver opkoncentreret i processen fra limvand til soluble, men soluble centrifugeres, hvorefter olien fjernes, og dermed reduceres fedtindholdet totalt set. Indholdet af olie i soluble afspejler således ikke opkoncentreringen fra limvand til soluble, og det ses, at fedtindholdet er ens i 1 og 2. De fleste analyser er foretaget på prøve 1 og 2, da vi har modtaget prøve 3-6 efterfølgende. Tabel 1. Analyser foretaget af Hanstholm Fiskemelsfabrik Prøve Beskrivelse Tørstof Fedt Fedtfri tørstof Protein i tørstof 1 Limvand fraskær 6,9 % 0,4 % 6,5 % 73,5 % 2 Soluble fraskær 32,9 % 0,4 % 32,5 % 70,3 % 3 Limvand tobis 10,4 % 0,4 % 10,0 % 76,8 % 4 Soluble tobis 36,9 % 1,8 % 35,1 % 75,7 % 5 Limvand blåhvilling 9,0 % 1,0 % 8,0 % 70,7 % 6 Soluble blåhvilling 31,4 % 1,6 % 29,8 % 77,2 % Ved Teknologisk Institut blev prøverne frysetørret. Ud fra dette blev vandindholdet vurderet (Tabel 2). Tørringen blev foretaget i triplikat, og resultater stemmer overens med bestemmelsen af tørstof. Tabel 2. Frysetørring af prøver Prøve Vandprocent Stdev RSD [%] 1 93,3 0,11 0, ,1 0,14 0,20 6

7 Desuden blev ph af prøver bestemt (Tabel 3). Tabel 3. ph måling Prøve ph 1 6,8 2 6,2 3 6,5 4 6,1 5 7,5 6 6,4 Det ses, at limvandprøverne (1, 3, 5) er højere i ph end deres tilsvarende solubles (2, 4, 6) Spraytørring af limvand og soluble Det blev undersøgt, om det er muligt at spraytørre limvand og soluble. Udbyttet er angivet i Tabel 4. Udbyttes beregnes som isoleret pulver ift. tørstoffet i den anvendte mængde prøve. Der vil være et tab af pulver i spraytørringsprocessen pga. adhæsion til overfladerne i anlægget, dvs. det reelle udbytte er højere. Tabel 4. Spraytørring af sidestrømme. Prøve Solubles [g] Tørstof [g] Pulver [g] Udbytte % % % Indledningsvis blev det undersøgt, om det var muligt at spraytørre de viskøse solubles 2 og 4. Dette forløb fint, og det var ikke noget problem at spraytørre 4, som indeholder mere fedt end 2. De spraytørrede prøver ses i Figur 2. 7

8 Figur 2. Spraytørret solubles. 2-Afskær (venstre) og 4-Tobis (højre) Derefter blev et større volumen af limvand spraytørret, hvilket gav et fint resultat, som ses i Figur 3. Figur 3. Spraytørret limvand. 5-Blåhvilling De flydende prøver kunne spaytørres uden forbehandling og ved stuetemperatur. Udbyttet baseret på tørstofindhold og den isolerede mængde pulver var sammenlignelig mellem limvand og solubles. Forskellen i 1 og 3 kan formentligt tilskrives den større mængde tørstof, som teoretisk er blevet bearbejdet, og dermed udgør tabet ved adhæsion mindre af det samlede udbytte. Adhæsionen til glasvarerne i spaytørreren var ensartet for limvand og solubles. Det kan udledes fra Tabel 4, at der er et tab på mellem 11 og 13 g pulver for de tre prøver, hvilket primært tilskrives adhæsion til spraytørren. 8

9 Protein og aminosyre Kemiske analyser af prøverne 1-6 blev gennemført for at afdække molekylvægtsfordelingen af prøverne samt indholdet af aminosyrer. Aminosyreanalysen blev gennemført for: Frie aminosyrer hvorved de frie aminosyrer, som er tilgængelige i prøveopløsningen, bestemmes Den totale aminosyresammensætning - prøven hydrolyseres for at afdække den totale aminosyresammensætning afhængigt af udgangsstoffet Molekylvægtsfordeling Molekylvægtsfordeling af limvand og soluble blev bestemt ved gel-eletrophoresis. En opløsning af prøven blev påsat SDA-polyacylamidegel. Ud over prøveopløsninger blev der påsat 5 μl farvet proteinmolekylvægtsmarkør (NuPAGE MES). Denne markør dækkede området fra kda. Efter adskillelse blev SDS-gelen fremkaldt med coomassie blue, vasket og scannet. Figur 4. Molekylvægtsfordeling af prøve 1-4 samt supernatant og bundfald af 1. Der er 10 µg protein pr. bane. 9

10 Molekylevægt (kda) 5μl NuPAGE MES Teknologisk Institut Undersøgelsen af molekylvægtsfordeling viste, at proteinet har en størrelse fra omkring 40 kda til 200 kda i limvand og soluble fra fraskær (1, 2; Figur 4). Der er nogle gennemgående bånd ved 100, 75 og 40 kda. Desuden blev 1 centrifugeret, hvilket afslørede, at proteinerne befinder sig i vandfasen og ikke i bundfaldet. Følgelig er proteinerne i limvand vandopløselige. Prøve 3 og 4 har svage bånd i SDS-gelen (Figur 4), hvilket gør det vanskeligt at drage konklusioner derfra. Derfor er analysen af disse to prøver gentaget, sammen med analysen af blåhvilling, som ses i Figur Figur 5. Molekylvægtsfordeling af prøve 3-6. Der er loaded 32 µg limvand og 25 µg solubles ud fra den antagelse, at proteinindholdet for limvand og solubles er hhv. 8 % og 25 %. Generelt indeholder prøverne fragmenter af proteiner og peptider på <200 kda. SDS-gelen viser, at prøverne 3-6 indeholder de karakteristiske fragmenter omkring 100, 75 og 40 kda, som også observeres i prøverne

11 Prøve 4 er medtaget som soluble og spraytørret soluble, og det ses, at molekylvægtsfordelingen er den samme for begge, hvilket indikerer, at prøven ikke bliver påvirket af spraytørringsprocessen. Limvand 5 er svagt fremkaldt. Denne prøve er også analyseret i en spraytørret version, som er sammenlignelig med 6. Fælles for prøverne i Figur 5 er, at de indeholder et mindre fragment omkring 10 kda, som ikke blev observeret i prøverne fra fraskær Aminosyreanalyse Til aminosyreanalysen blev anvendt Dionex UltiMate 3000 system med LPG-3400 pumpe, WPS-3000T SL autosampler, TCC-3000 SD column compartment, DAD-3000 photodiode array detektor og FLD-3100 fluorescensdetektor. Kolonnen er en Zorbax Eclipse-AAA (150 x 3,0 mm, 3,5 µm) fra Agilent som termostateres ved 40 C. Der gennemføres pre-kolonne-derivatisering i autosampleren. Metoden følger applikations note fra Agilent. 1 De frie aminosyrer analyseres for solubles (2, 4, 6). Analysen udføres i duplikat, og prøverne filtreres inden analyse. Koncentrationen af aminosyrer bestemmes i µg/ml og µmol/ml, herunder angivet som antal aminosyrer per 1000 aminosyrer i væske. Tabel 5. Fri aminosyreanalyse. Enhed aminosyrer/1000 aminosyrer aa/1000 aa Fraskær (2) Tobis (4) Blåhvilling (6) Aspartic Acid Glutamic Acid Serine n.d Histidine Glycine Threonine Arginine Alanine Tyrosine Cystine n.d. n.d. n.d. Valine Methionine Hydroxylysine n.d. n.d. n.d. Phenylalanine Isoleusine Leusine Lysine Hydroxyproline Proline Analyse er gennemført i duplikat og RSD<10 % Det er vanskeligt at drage overordnede tendenser for aminosyrer i solubles, da nogle er konstante og andre varierer afhængigt af råvarekilden. F.eks. er indholdet af aminosyren alainen sammenlignelig med et nivieau på ca. 210 pr aminosyrer inden for de 3 udgangsstoffer. Derimod varierer aminosyren glycin med 210, 64 og 133 glycin pr

12 aminosyrer for fraskær, tobis og blåhvilling respektive. Derfor må indholdet af frie aminosyrer kortlægges for de enkelte råvarekilder. Det totale indhold af aminosyrer blev bestemt ved at hydrolysere peptider og proteiner under sure betingelser. De hydrolyserede prøver blev derefter genopløst og analyseret vha. HPLC. Resultatet ses i Tabel 6. Tabel 6. Total aminosyreanalyse. Enhed aminosyrer/1000 aminosyrer aa/1000 aa Fraskær (2) Tobis (4) Blåhvilling (5) Aspartic Acid Glutamic Acid Serine Histidine Glycine Threonine Arginine Alanine Tyrosine Cystine n.d. n.d. n.d. Valine Methionine Hydroxylysine n.d. n.d. n.d. Phenylalanine Isoleusine Leusine Lysine Hydroxyproline Proline Analyse er gennemført i duplikat og RSD<10 % Koncentrationerne af de enkelte aminosyrer er bestemt ved total aminosyreanalyse. Koncentrationerne er mere ensartet for udgangsstofferne for den totale end for den frie aminosyre-profil. Der er dog mere glycin i 2, hvilket kan tyde på, at der er et højere indhold af gelatine i fraskær frem for industrifisk. Da glycin udgør omkring 1/3 af aminosyerne i fiskegelatine. Oprindelsen af udgangsstoffet har mindre betydning vurderet ud fra den totale aminosyresammensætning, da niveauet for de enkelte aminosyrer er sammenlignelige. 12

13 4.2. Inddampning af limvand - viskostiet af soluble Den vandige fraktion fra kogning af råvaren inddampes på fiskemelsfabrikken. Når limvand går ind til inddamperen, er fraktionen ca. 90 C varm. Der er 3 trin i inddampningsprocessen. Afdampningstemperaturen i første trin er 70 C. I andet trin er temperaturen 63 C og i sidste trin 76 C. Efter aftale gennemføres disse eksperimenter ved en temperatur på 70 C. Limvand inddampes under tilsætningen af syre ved 70 C. Der udvælges tre forskellige syrer, og desuden inddampes limvand uden tilsætning af syre for at have et udgangspunkt (blind). Der er 7 % tørstof i limvand og 33 % tørstof i soluble. Limvand skal derfor reduceres til 20 %, hvilket vil sige, at de afvejede 40 g af 1 skal reduceres til 8 g. I Tabel 7 angives koncentration, ph samt inddampningen af de fire opløsninger. Tabel 7. Inddampning af limvand Prøve Syre c [M] ph Inddampet Farve Figur Eddikesyre 0,04 5,2 22 % Blå-Lilla 1.2 HCl 0,04 5,9 21 % Rød 1.3 H2SO4 0,1 2,1 20 % Lyseblå 1.4 blind 0 6,7 22 % Grøn Baggrunden for de valgte syrekoncentrationer relateret til udvindingen af fiskegelatine: Fiskeskind Collagen Gelatine Collagen udvindes fra fiskeskind under sure betingelser. Hertil kan benyttes en 0.1M svovlsyreopløsning, som 1.3 bliver inddampet med. Ekstraktionen af gelatine sker under mildere betingelser, f.eks. neutrale eller let sure betingelser. Det væsentlige i denne proces er temperaturen, da dette er en termisk reaktion. Prøve 1.1 og 1.2 bliver behandlet under sure betingelser, som minder om ekstraktion af gelatine. 13

14 Viskositetsmåling Viskositeten bestemmes af de surt inddampede limvandsprøver ( ) samt 2 (reference). Resultaterne af viskositetsmålingerne ses i Figur 6. Generelt er viskositetsforløbet af de fire inddampede opløsninger ensartede, da hældningen af kurverne er sammenlignelige. Viskositeten falder, når pumpehastigheden stiger. Soluble (2) fra Hanstholm Fiskemelsfabrik, som er den gule kurve, har et andet forløb. Denne prøve er ikke så hastighedsfortyndende som 1.4, men 2 har gennemgået en anden inddampningsproces, og den er blevet fedtreduceret ved centrifugering, hvorfor processer og prøver ikke er direkte sammenlignelige. Figur 6. Viskositetsmåling (2-gul, 1.1-blå/lilla, 1.2-rød, 1.3-lyseblå, 1.4-grøn). Der er forskel mellem de forskellige syrer ( ). Der er dog flere variable parametre i dette forsøg, herunder inddampningsgrad og tid. Det er derfor vanskeligt at konkludere udelukkende på baggrund af viskositetsmålingen. Det ses dog, at 1.3, som indeholder 0.1M H2SO4, er den tyndeste opløsning, selvom denne er inddampet mest (20 %). Det er derfor sandsynligt, at det ville nedsætte viskositeten af soluble, hvis limvand blev inddampet under sure betingelser (ph 2). Dette forsøg må betragtes som et indledende eksperiment, og det bør undersøges nærmere for at drage ydereligere konklusioner på baggrund af disse viskositetsmålinger. 14

15 Molekylvægtsfordeling Molekylvægtsfordelingen af de inddampede prøver blev undersøgt via SDS-gel for at afdække påvirkningen på proteiner og peptider i opløsningen. Analysen blev gennemført som beskrevet under Der blev påsat 10 µg af hver prøve ( , 2) på SDS-gelen. Resultatet ses i Figur 7. Figur 7. SDS-gel af inddampede limvandsprøver påsat 10 μg prøve/bane Ud fra SDS-gelen (Figur 7) ses, at molekylvægtsfordelingen i den oprindelige limvandsprøve (1) og prøve 2, 1.2, 1.2 og 1.4 er sammenlignelige med de samme karakteristiske bånd ved 100 og 75 kda. Båndet omkring 40 kda varierer i intensitet for de fire prøver. Prøve 1.3 inddampet med svovlsyre afslører, at proteiner er blevet nedbrudt, og de karakteristiske bånd er fraværende. Denne observation stemmer overens med det faktum, at viskositeten var nedsat for netop denne prøve. 15

16 5. Konklusion Rapporten giver et indblik i sammensætningen af de vandige procesfraktioner limvand og soluble fra afskær, tobis og blåhvilling. Flere parameter er blevet undersøgt. Der kan udledes følgende delkonklusioner: ph blev defineret til mellem 6 og 8. Generelt er ph højere i limvand end i tilsvarende soluble. Det er muligt at spraytørre limvand såvel som soluble. Processen ser ikke ud til at påvirke molekylvægtsfordelingen. Proteiner i limvandsfraktionen er vandopløselige. Molekylvægtsfordelingen afdækkede, at alle prøver indeholder karakteristiske fragmenter omkring 100, 75 og 40 kda. Desuden indeholder prøverne fra industrifisk et mindre fragment omkring 10 kda. Indholdet af frie aminosyrer varierer afhængigt af den enkelte råvarekilde. Oprindelsen af udgangsstoffet har mindre betydning vurderet ud fra den totale aminosyresammensætning. Det er muligt at reducere viskositeten af solubles ved tilsætning af stærk syre. I denne proces hydrolyseres proteiner. Det bør undersøges nærmere, hvilke specifikke proteiner limvand og soluble indeholder, for at vurdere deres potentiale som marine ingredienser. 16