Kromosom 16 PV92 PCR Kit

Transkript

1 as indicated. 1 uplication of any part of this document is permitted for classroom use only Please visit explorer.bio-rad.com to access our selection of language translations for Biotechnology Explorer kit curricula. Kromosom 16 PV92 PCR Kit Oversat af Birgit Sandermann Justesen Revideret februar 2010 service, call your local Bio-Rad office or, in the U.S. call BIORAD (1- Bemærk: Kittet indeholder temperaturfølsomme dele. Åbn derfor straks kassen og læg de pågældende dele til opbevaring ved den anbefalede temperatur. Kopiering kun tilladt ved brug i undervisningen

2 2 Tjekliste I nedenstående liste findes en oversigt over de dele, der følger med kittet. Desuden findes en oversigt over det udstyr, der er nødvendigt for at gennemføre forsøget. Tjek venligst udstyrslisten før forsøget udføres. Kittets indhold: Dele, der skal opbevares ved -20 o C (temperaturfølsomme komponenter) PV92 homozygot (+/+) kontrol 100 µl 1 glas PV92 homozygot (-/-) kontrol 100 µl 1 glas PV92 heterozygot (+/-) kontrol, 100 µl 1 glas PCR mastermix 2x, 1,2mL 1 glas Forward og revers primermix, 50x, 25 µl 1 glas EZ Load TM molekyle masse lineal (DNA standard) 100 µl 1 glas Dele, der skal opbevares i køleskab (4 o C) 50x TAE buffer, 100 ml 1 Agarosepulver, 5g 1 Fast Blast TM DNA farve, 500x, 100mL 1 flaske InstaGene TM matrix, 20mL 1 flaske PV92 XC markørfarve (loading dye), 5x, 1mL 1 glas Dele, der skal opbevares ved stuetemperatur PCR-rør 50 Skruelågsmikrocentrifugerør, 1,5mL 50 Mikrocentrifugerør uden låg, 1,5mL 50 PCR-rør med låg, 0,5 ml 60 Skum-holdere til mikrocentrifugerørene 16 Bakker til gelfarvning 4 Manual på engelsk 1 Nødvendigt tilbehør/udstyr, som ikke er indeholdt i selve kittet Til eleverne: Mikropipetter 2-20 µl Spidser til mikropipetter Elektroforeseapparat vandret Strømforsyning Bakker med knust is Tuscher til at mærke med Affaldsbeholdere Bægre med 10 ml 0,9 % NaCl-opløsning Pincetter Sakse Fællesudstyr i laboratoriet Mikropipetter 0-20 µl, µl og µl Pipettespidser til ovennævnte Termocykler eller 3 vandbade til manuel styring

3 3 Mikrobølgeovn Vandbad 56 o Vandbad 100 o Protease (til forsøget med hårfolliklen), 1,3 ml 0,9% saltvand 500mL Destilleret eller demineraliseret vand 500 ml 1000 ml erlenmeyerkolbe eller BlueCap flaske til agarosefremstilling 1 Tape Mikrocentrifuge Udstyr det vil være rart at have Rystebord/vippebord Vortexer (reagensglasmikser) Bemærk: Det er vigtigt, at de forskellige dele opbevares ved den angivne temperatur (se de enkelte kemikalier!). Der kan rekvireres refill til kittet. Hvis man vælger hårfollikel-forsøget skal der rekvireres protease separat. I den medfølgende manual såvel som i adskillige lærebøger kan man læse om PCR-teknikken. Her vil kun dele af teorien blive taget med, hvorfor der henvises til manualen og andre kilder.

4 4

5 5 Lidt om PCR PCR teknikken blev udviklet i 1983 af Kary Mullis ved Cetus Corporation. PCR, der betyder polymerase chain reaction, har virkelig sat skub i molekylærbiologien som et videnskabeligt redskab. Inden man opfandt PCR-teknikken var det ofte svært at få materiale nok, når man arbejdede med DNA. PCR-teknikken har især haft betydning inden for de fire områder: Genkortlægning, kloning, DNA-sekventering og DNAanalyser. I dag bruges PCR som et medicinsk diagnostisk redskab, bl.a. ved undersøgelser af specifikke mutationer, som kan være årsag til genetiske sygdomme, ved kriminelle retsgenetiske sager og ved analyser af det humane genom. PCR og bioteknologi hvad er det? Og hvorfor har metoden revolutioneret et helt videnskabeligt område? Ved PCR-teknikken kan man producere en særlig stor mængde af et specifikt DNA, blot man har en lille smule udgangsmateriale, en skabelon. Udgangsmaterialet kan være alle former for dobbeltstrenget DNA. Selv små mængder fx en dråbe blod, en enkelt hårfollikel eller en kindcelle er nok til at blive mangedoblet ved hjælp af PCR. Netop det, at man kun behøver så ufattelig små mængder af udgangsmaterialet, har betydet et stort skridt fremad ikke mindst inden for retsgenetikken. I dette kit bruges elevernes/kursisternes egne celler som udgangsmateriale. I sig selv er PCRteknikken simpel og relativ billig. Alt, hvad der er brug for, er en reaktionsbuffer, de fire baser, DNA-polymerase, to primere og små mængder af det udgangsmateriale, som man ønsker at undersøge. Ud fra dette mangedobles et specifikt segment af DNA et. I PCR benyttes to principper fra molekylærgenetikken: 1. Hybridisering af komplementære DNA-strenge 2. Syntetisering af DNA-strenge ved hjælp af DNA-polymerase Man udnytter altså det, at to komplementære strenge vil gå sammen. Det DNA, der skal kopieres, udvælges vha. primers. Primers (eller proberne) består af syntetisk fremstillet oligonucleotider (korte DNA-stykker). Proberne sætter sig på de to DNA strenge og afgrænser det DNA-stykke eller segment, der skal mangfoldiggøres. Man siger, at de to DNA strenge fungerer som skabelon for syntesen af en komplementær DNA streng. PCR trin for trin PCR involverer en række gentagne cykler, der hver består af følgende tre trin: Denaturering, primer påsættelse og forlængelse af den påhæftede primer ved hjælp af Taq DNA polymerase. Før selve DNA amplifikationen påbegyndes, tages der prøve af genetisk materiale fra de enkelte elever. Det kan være et hår eller skrab fra indersiden af kinden. Efter at eleverne prøver er gjort klar, blandes skabelon DNA, primers (oligonucleotider), termostabil DNA-polymerase (Taq), de fire baser (T, A, G og C) og reaktionsbuffer i et mikrocentrifugerør. Mikrocentrifugerøret placeres i termocykleren, eller de nødvendige vandbade klargøres. Termocykleren indeholder en aluminiumsblok, hvori prøverne placeres. Denne aluminiumsblok kan lynhurtigt afkøles og opvarmes til meget forskellige temperaturer dette kaldes termal cykling. I en cyklus opvarmes først til 94 o C, hvorved DNA-strengene vil denaturere eller adskilles. Dette kaldes denatureringstrinnet.

6 6 Derefter afkøles lynhurtigt til 60 o C, hvorved primeren bindes til de enkelte skabelon-dna-strenge. Dette kaldes vedhæftningstrinnet. De to oprindelige DNA-strenge vil eventuelt samle sig igen eller konkurrere med primerens komplementære bindingssteder. Der tilsættes i dette forsøg så megen primer, at den originale DNA-streng udkonkurreres. Til sidst opvarmes til 72 o C, hvorved Taq DNA polymerase forlænger de komplementære DNA strenge med start fra primeren, og den endelige færdige kopi af DNA-dobbeltstrengen kan dannes. Dette trin kaldes forlængelsestrinnet. Taq polymerasen arbejder mest effektiv ved 72 o C, hvorfor det er vigtigt at ramme præcis denne temperatur. En cyklus = denaturering + vedhæftning + forlængelse De to nye sæt dobbeltstrenget DNA, der er dannet nu, danner dernæst udgangspunkt for næste cyklus og på denne måde mangedobles DNA-strengeantallet efterhånden. Ved 40 cykler dannes over en milliard kopier af det originale DNA stykke. Denature strands at 94 C Anneal primers at 60 C (Taq polymerase recognizes ends of primers) Primer Taq polymerase Primer Extend at 72 C (Synthesize new strand) Repeat cycle 40 times Fig. 4. A complete cycle of PCR. Usually, thermal cycling continues for about 40 cycles. After each thermal cycle, the number of template strands doubles, resulting in an exponential increase in the number of template DNA strands. After 40 cycles there will be 1.1 x more copies of the original number of template DNA molecules. PCR generates DNA of a precise length and sequence. On the first cycle, the two primers anneal to the original genomic template DNA strands at opposite ends and on opposite strands. After the first complete temperature cycle, two new strands are generated that are shorter than the original template strands but still longer than the length of the DNA that the researcher wants to amplify. It isn t until the third thermal cycle that fragments of the precise length are generated (Figure 5).

7 7 Normalt køres der 40 cykler. Ved hver cyklus fordobles antallet af DNA-strenge. Efter 40 cykler vil der således være 1,1x10 12 ekstra kopier af den oprindelige stump DNA. PCR laver DNA med eksakte længder og sekvenser. I den første cyklus vedhæftes de to primere til DNA-udgangsmaterialet i hver sin ende på de to komplementære strenge. Efter den første fuldendte cyklus er der dannet to nye strenge, der er kortere end det oprindelige DNA, men længere end det specifikke DNA-stykke, som man ønsker at mangedoble. Først efter 3. cyklus er man oppe på fuld længde se figur 5. C Y C L E 1 Extension step cycle 1 Denature at 94 C C Y C L E 2 New intermediate templates Anneal primers at 60 C Extend new strands at 72 C Denature at 94 C Precise length fragments C Y C L E 3 Anneal primers at 60 C Extend new strands at 72 C Total 40 cycles Fig. 5. Generation of precise-length fragments. Når man således har fået den præcise længde på DNA påbegyndes ved de næste cykler den eksponentielle It is the fordobling template strands (X n, hvor of the X precise er antallet length af that udgangsmaterialet are amplified exponentially og n er (X antallet af cykler). n, where Der vil X = altid the number være et of sæt original originalt template udgangs-dna-materiale, strands and n = the number som of ikke cycles). er fuldt There kopieret. is always Dette betyder dog ikke noget, når der køres et tilstrækkeligt antal cykler. one set of original long-template DNA molecules which is never fully duplicated. After each thermal cycle, two intermediate-length strands are produced, but because they can only be generated from the original template strands, the intermediate strands are not exponentially amplified. It is the precise-length strands generated from the intermediate strands that amplify exponentially at each cycle. Therefore, if 20 thermal cycles were conducted from one double-stranded DNA molecule, there would be 1 set of original genomic template DNA strands, 20 sets of intermediate template strands, and 1,048,576 sets of precise-length template strands. After 40 cycles, there would be 1 set of original genomic template DNA strands, 40 sets of intermediate template strands, and 1.1 x sets of precise-length template strands (Figure 6).

8 8 Forslag til undervisningsforløb i forbindelse med PCR: Lektion 1a Isolering af kindceller Forberede udgangsgenom fra kindceller (stop-punkt) Lektion 1b Lektion 2 Lektion 3 Lektion 4 Lektion 5 Isolering af hår follikler DNA fra hårfolliklerne (forberedelse af udgangsmateriale) PCR-amplifikation Start og kørsel af PCR-cykler Støbe agarosegeler Gelektroforese og farvning af geler Elektroforese af geler Farvning Analyse af gelerne og fortolkning af resultaterne Diskussion Hardy-Weinberg beregning Fortolkning af resultaterne Bioinformatik Analyse af resultaterne vha. PV92 Allel-Serveren (stor database se den Engelske manual) Lærerens forberedelse: I de næste afsnit beskrives punkt for punkt hvad lærere skal forberede før de enkelte lektioner. De angivne tider er omtrentlige angivelser. Hvornår Aktivitet Tidsforbrug Straks Læs denne vejledning 2 timer Før til lektion 1 Forberedelse af kindskrabceller 30 minutter Gøre elevarbejdspladserne klar Resuspendering og fordeling af Matrix mix Før til lektion 2 Forberede master-mix Blanding og fordeling 1 time Opstilling til kontrol-pcr Klargøring af TAE-bufferen Smelte agarosen Gøre termocykleren eller de nødvendige vandbade klar Klargøre elevarbejdspladserne Før til lektion 3 Gøre klar til DNA-farvning 20 minutter Klargøre elevarbejdspladserne Før til lektion 4 Klargøre elevarbejdspladserne 10 minutter

9 9 Før lektion 1: Trin for trin: Nødvendige materialer: Skruelågsmikrocentrifugerør InstaGene TM matrix 2-20µL mikropipette 2-200µL mikropipette Spidser Vortexer Mikrocentrifugerør Pincetter (til 1b) Sakse (til1b) Plastikkopper (til 1a) Protease (til 1b) Kindskrab øvelse 1a 1. Fordeling af InstaGene TM matrix (øvelse 1a (kindskrab)) A. Bland InstaGene TM matrix grundigt ved at ryste eller bruge vortexeren adskille gange for at resuspendere matrixen. Det er vigtigt at matrixen er godt blandet, når fordelingen finder sted. Perlerne bundfælder hurtigt ud i opløsningen, hvorfor det er nødvendigt at ryste adskillige gange under fordelingen. B. Med en pipette overføres 200µL InstaGene matrix til hvert skruelågsmikrocentrifugerør. Der skal være et rør til hver elev/kursist. 2. Blanding og fordeling af saltopløsning A. Lav en 0,9 % saltopløsning. Tag 500 ml postevand og tilsæt 4,5g ikkeiodholdigt salt (bordsalt). Bland til alt saltet er opløst B. Hver elev skal have en kop med 10mL saltopløsning Hårfollikel øvelse 1b: 3. Forbered og fordeling af InstaGene matrix med protease (øvelse1b hårfollikel) Lav en opløsning af InstaGene matrix med 66µg/mL protease. Proteasen har koncentrationen på 20mg/mL. For at få en fortynding på 66µg/mL fortyndes proteasen 1:300 med InstaGenematrix. Hvis man vil lave 5 ml af blandingen (hvilket rækker til 20 elever/kursister): - overfør 5mL InstaGenematrix (husk at ryste det!) til et nyt rør - tilsæt 17µL koncentreret protease til de 5mL B. Med en pipette overføres 200µL InstaGenematrix til hvert skruelågsmikrocentrifugerør. Der skal være et rør til hver elev/kursist. Før lektion 2 PCR-amplifikation Materialer: Mikrocentrifugerør (med hængslet låg) Skruelågsmikrocentrifugerør Mastermix Primermix PV92 homozygot kontrol (+/+) PV92 homozygot kontrol (-/-) PV92 heterozygot kontrol (+/-)

10 10 12 PCR-rør Elektroforesekar, støbekar og kam Elektroforesebuffer (50x TAE) Agarose Mikropipetter (20µL og 200µL) Mikropipettespidser Isbad For at opnå de bedste resultater, tilrettelægges forsøgsgangen, så elevernes prøver bliver klar 5-30 minutter før PCR-amplifikationen startes. Prøverne tager skade af at stå for længe. Fremgangsmåde: Bemærk: Før rørene med reagenser åbnes centrifugeres de kortvarigt for at sikre at indholdet er i bundet af røret. Det er almindeligt at indholdet under forsendelsen sætter sig op under låget. 1. Klargør mastermix ved at tilsætte primerne. Bemærk: For at opnå det bedste resultat udføres dette punkt først minutter før PCR-reaktionen. A. Med en pipette overføres 1100µL mastermix til et mærket mikrocentrifugerør. Er holdet kun på 16 elever eller derunder deles mastermixen i 2 gange 550µL i hver sit mikrocentrifugerør. Det ene mikrocentrifugerør bruges straks det andet kan genfryses til senere brug. B. Marker et mikrocentrifugerør pr. gruppe og placer rørene på is. C. Tilsæt 22µL primermix til de 1100µL mastermix (eller 11µL til de 550µL, der skal bruges ved halvering af mængden). Det er meget vigtigt at mastermix og primermix blandes grundigt. Opløsningen bliver gul. Primeren leveres som en koncentreret gul opløsning i Tris buffer. Eftersom primere er meget mere stabile i koncentreret form end i fortynding, er det meget vigtigt, at denne tilsætning først finder sted lige før PCR-amplifikationen. D. Fordel 95µL af den færdigblandede mastermix med primer i ét mikrocentrifugerør pr. gruppe. Gem den resterende del af mastermix blandingen til kontrolforsøgene, idet de opbevares på is. 2. Gør klar til PCR-reaktionen. A. Mærk kontrolrørene: +/+, -/- og +/-. Hvis hele kittet skal bruges laves der 4 af hver kontrolprøve, og tilsvarende laves der 2 kontrolrør af hver, hvis kun halvdelen af kittet skal benyttes. Ubenyttede opløsninger opbevares i fryseren. B. Tilsæt 20µl af den færdigblandede mastermix med primer til hvert kontrolrør. Husk at skifte pipettespids. C. Rørene placeres på is, indtil de skal bruges. Kontrolprøverne skal amplificeres samtidig med elev-prøverne. 3. Gelstøbning: Gelerne støbes enten af eleverne eller af læreren. Gelerne kan støbes 1-2 dage i forvejen. A. Fremstilling af elektroforesebuffer: Bufferen leveres som en 50x koncentreret buffer. Til støbning af gelen, skal der bruges en 1x TAE buffer, ligesom det er en 1x TAE buffer der skal bruges under selve elektroforesen. Fremstil 3L 1x TAE buffer: Tag 60 ml 50x koncentrat og tilsæt 2,94L demineraliseret vand. B. Fremstilling af 1 % agaroseopløsning:

11 11 Til 1g agarose tilsættes 100mL 1x TAE buffer. Til 8 geler bruges der ca. 350 ml agaroseblanding. Gelen kan enten fremstilles i en 1L s erlenmeyerkolbe på en varmeplade, eller gelen kan fremstilles i mikrobølgeovnen. Sørg for at al agarosen er opløst blandingen skal være helt klar! Bemærk: Varm agaroseopløsning kan let skolde. Brug handsker e.l. til beskyttelse. Ønsker man ikke selv at støbe gelerne, kan der købes færdigstøbte geler hos BioRad (katalognr EDU). Støbning af geler: Forsegl enderne af gel-holderen med tape. Vær sikker på at tapen er tæt og glat. Malertape kan fint benyttes. Sørg for at gel-holderen står vandret. Sæt kammen i ca. 2cm fra den ene ende. Tag 1 % agaroseopløsningen. Lad den afkøle til ca. 60 o C. Hæld den varme gel op og lad den størkne i ca. 20 minutter. Fjern forsigtigt kammen fra gelen ved at vippe den frem og tilbage, mens den løftes lodret op. Fjern tapen. Sæt gel-holderen med gelen i elektroforesekarret. Manuel PCR Hvis man ikke har en termocykler, gøres der 3 vandbade klar med hhv. 60 o C, 72 o C og 94 o C varmt vand. Man kan derefter lave en manuel PCR. Her er det vigtigt at bruge PCR-rør med skruelåg eller PCR-rør, som er sikrede mod at springe op ved høj temperatur ( boil-proof ) (luk eventuelt rørene med parafilm eller malertape, som ekstra sikring). PCR-rørene duppes med en dråbe mineralsk olie for at undgå fordampning. Tidsskemaet er det samme som for PCR-maskinen. Det kan være slidsomt, men det virker! Lad eventuelt eleverne tage 10 minutter ad gangen, - så føles det ikke så slidsomt. Der køres følgende cykler: Trin 0 Pre-denaturering 94 o C 2 minutter Trin 1 Denaturering 94 o C 1 minut Trin 2 Vedhæftning af primer 60 o C 1 minut Trin 3 Forlængelse 72 o C 2 minutter Trin 1-3 gentages 40 gange! Afslutningstrin Endelig forlængelse 72 o C 10 minutter

12 12 Før lektion 3 Elektroforese og farvning af gelerne 1. Forbered de positive kontrolprøver 2. Afpipetter PV92 XC markørfarve 3. Afpipetter DNA standarderne (EZ Load Molecular mass ruler) 4. Klargør DNA-farven 5. Gør elevarbejdspladserne samt fællesmaterialerne klar Tidsforbrug: ca.40 minutter Materialer: 8 mikrocentrifugerør Mikropipetter 0-20µL og 2-200µL Spidser til mikropipetterne 8 skruelågs-mikrocentrifugerør Demineraliseret eller destilleret vand til at fortynde DNA-farven med 500 ml flaske Evt. gel supportfilm (hvis hurtigfarvningsmetoden benyttes) Forberedelse af kontrolprøverne: Tilsæt 10µL PV92 XC markørfarve (loading dye) til hver af de amplificerede kontrolprøver (+/+, -/-, +/-). Ved elektroforesen sørger man for, at de tre kontrolprøver også kører på hver gel, således at der dermed er referencer, når båndene skal sammenlignes. Afpipettering af DNA-størrelsesstandarder. Afpipetter 11µL DNA-standard (EZ Load molecular mass ruler) til 8 mikrocentrifugerør og mærk disse MMR. Båndstørrelserne på DNA-båndene er 1000bp (basepar), 700bp, 500 bp, 200 bp og 100 bp. Se nedenstående billede:

13 13 Afpipettering af PV92 XC markørfarve: Mærk 8 skruelågsmikrocentrifugerør MF for markørfarve og afpipetter 50µL til hvert rør. Hver gruppe har et fælles rør med markørfarve. Forberedelse af DNA-farve: Farven leveres som en 500x koncentreret opløsning, som det er nødvendigt at fortynde før brug. Farven kan, såfremt den kun er fortyndet til 100x opløsning (100 ml 500xopløsning fortyndes med 400 ml demineraliseret vand) bruges til hurtig farvning af gelerne. Her kan resultatet ses allerede efter ca. 15 minutter. Alternativt kan man fortynde farven til 1x-opløsning (1mL 500xopløsning fortyndes med 499 ml demineraliseret vand) og lade farveprocessen vare natten over. Når gelen dækkes med farveopløsningen, vil de positivt ladede farvemolekyler binde sig til de negativt ladede fosfatgrupper i de DNA-molekyler, der er bundet i gelen. Dermed bliver DNAbåndene synlige og elevernes båndmønstre kan identificeres og sammenlignes med DNAstandarderne. Den farve, der benyttes er let at arbejde med, ikke giftig og et mere sikkert alternativ end ethidiumbromid, som man traditionelt har arbejdet med. DNA farves dybt blå og efterfølgende kan gelen rimelig nemt gemmes. ADVARSEL Selv om den benyttede farve ikke er giftig eller carcinogent anbefales det, at der bæres handsker for at undgå at blive farvet blå. Tilsvarende er det en fordel at bære kittel, så der ikke kommer blå farve på ens tøj. Skulle der komme farve på tøj eller bordplader e.l., tørres dette let af med sprit. Bemærkninger: Til en gel på 7x10 cm bruges ca. 120mL farveopløsning. Det vigtigste er, at gelen er helt dækket med farveopløsning. Inden farvningen tages gelen ud af elektroforeseapparatet og lægges forsigtigt over i et lille kar. Gelen er meget glat, hvorfor dette punkt skal udføres med forsigtighed, så gelen ikke går i stykker. Ved langsom farvning, hvor gelen står natten over, kan det anbefales at benytte et rystebord, da de mindste bånd har en tendens til at diffundere væk, hvis der ikke rystes. Affarvningen sker med varmt vandhanevand, men kan forbedres med affarvning ca. 5 sekunder med 70 % sprit. Såfremt man benytter den langsomme farvning, er affarvning ikke nødvendig. Før lektion 4 Analyse og fortolkning af resultaterne. Hvis man vil gemme gelerne og dermed skal tørre disse, kan man benyttes Gel supportfilm. Tag et billede af gelen, lav en tegning eller fotokopier gelen. Undgå at udsætte gelen for direkte lys, da det vil afblege båndene.

14 14 Før lektion 5 Inden dette modul/denne lektion, hvor der skal arbejdes datainformation fra en allel-server database. Det er vigtigt, at læreren har sat sig grundigt ind i dette. Kom godt i gang med på allelserveren: Bemærk: Allelserveren ligger på The Dolan DNA Learning Center, som er en webside, der konstant opdateres, hvorfor der kan forekomme ændringer i det følgende. 1. Åbn internettet og gå til 2. Find Allele Server og klik på Register. Det er gratis at være registreret og det er nemt at have sin egen profil der. 3. Når du er logget på følges instruktionerne i det vindue, der popper op. 4. Følg instruktionerne nøje. Som registreret bruger kan du gemme alle de grupper du har registreret i din Allele Server og analyserer dem efter behov. Det betyder også, at man efterhånden kan få en rimelig stor database at arbejde med, hvis man eksempelvis laver Hardy-Weinberg beregninger. I øvrigt er der rigtig meget materiale omkring DNA, tests, PCR m.m. at finde på Om at benytte Alu-sekvensen i en Hardy-Weinberg analyse Det område, Alu, der testes for i dette forsøg er et ikke-kodende område. Hvis man vil studere alleler og genotypefrekvenser hos mennesket kan det passende gøres med Alu-sekvensen, idet denne er tilfældigt placeret i PV92-locus på kromosom 16 hos mennesker. Ved at bestemme genotype frekvensen af Alu-sekvensen i klassen kan man beregne allel-frekvensen. Ydermere er det muligt at sammenholde klassen fordeling med en større populations fordeling ved at sammenholde med en allel-database. Alt i alt vil man dermed opnå resultater fra en tilpas stor population til at der kan foretages fornuftige Hardy-Weinberg beregninger. Ydermere kan brugen af allel-databasen fungere som en introduktion til disciplinen bioinformatik. Den allel-database, der benyttes, ligger hos Cold Spring Harbor Laboratory s Dolan DNA Learning Center og indeholder genotypedata fra befolningsgrupper rundt omkring på kloden. Desuden kan man på websiden finde statistiske redskaber til at analysere resultaterne. Eleverne vil således kunne lave en Chi-i-anden test og dermed sammenligne deres klasses hyppighed og fordeling af Alu-sekvensen med den hyppighed som forventes i forhold til Hardy- Weinberg ligningen.

15 15 Elevvejledning PCR PV92 fra Bio-rad Oprensning af DNA fra kindceller (1 lektion) Materialer Skruelågsmikrocentrifugerør InstaGene TM matrix 2-20µL mikropipette 2-200µL mikropipette Spidser Vortexer Mikrocentrifugerør Plastikkopper med saltvand Bæger til brugte spidser Quick Guide Lesson 1 Cheek Cell DNA Template Preparation 1. Mærk et 1,5 ml mikrocentrifugerør med hængslet låg med 1. Label one 1.5 ml micro test tube with your dine initialer. Mærk derefter et skruelågsinitials. Label one screwcap tube containing mikrocentrifugerør Quick 200 med Guide µl of InstaGene matrix with med your initials. dine initialer. Quick Guide Lesson 1 Cheek Cell DNA Template Preparation 1. Label Lesson 2. Obtain one 11.5 a Cheek cup ml micro containing Cell test DNA tube saline Template with solution your Preparation from Quick initials. Guide 1. Label your Label instructor. one one 1.5 screwcap Pour ml micro the saline tube test containing tube into your with mouth your 200 µl and of InstaGene rinse vigorously matrix for with 30 your seconds. initials. Expel the Lesson 1 Cheek initials. Cell Label DNA one Template screwcap Preparation tube containing 200 saline µl back of InstaGene into the cup. matrix with your initials. 1. Label one 1.5 ml micro test tube with your initials. 2. Obtain Label 3. Transfer one a cup screwcap containing 1 ml of your tube saline containing solution rinse into from the micro your 2. instructor. Obtain test tube a cup (NOT Pour containing the saline screwcap into saline your tube) solution mouth with from your and rinse your initials. vigorously instructor. If a P-1000 for Pour 30 micropipet the seconds. saline is into Expel not your available, themouth and carefully rinse vigorously pour ~1 ml for of 30 your seconds. saline rinse Expel into the 2. Obtain a cup your containing micro test saline tube (use solution the graduations from on the your 3. instructor. Transfer side Pour 1 of ml the of the your micro saline saline test into tube rinse your to into mouth estimate the micro 1 ml). and rinse test vigorously tube (NOT for the 30 screwcap seconds. Expel tube) the 3. Transfer 1 ml of your saline rinse with into your the micro saline back initials. 4. into Spin If the a your P-1000 cup. test tube (NOT tube micropipet in the a balanced screwcap is not centrifuge tube) available, with at your full carefully initials. speed pour for If a ~1 2 P-1000 minutes. ml of your micropipet When saline the is rinse centrifuge not available, into has 3. Transfer your 1 ml micro completely of your test saline tube stopped, (use rinse the into remove graduations the micro carefully pour ~1 ml of your saline your on tube. rinse the You into test tube side (NOT of should the the micro see screwcap a test match-head tube tube) to estimate with sized your your micro test tube (use the graduations pellet 1 ml). of whitish on the initials. If a P-1000 cells at micropipet the bottom is of not the available, side of the micro test tube tube. to estimate If you don t 1 ml). see carefully 4. Spin pour your a pellet ~1 tube ml of of this in your a size, balanced saline decant rinse centrifuge the into saline, at refill full your your micro speed test tube for tube 2 with minutes. (use more the of graduations When your oral the rinse, centrifuge on the 4. Spin your tube in a balanced centrifuge and repeat has at the full side of completely the micro spin. test stopped, tube remove estimate your 1 ml). speed for 2 minutes. When the tube. centrifuge You has should see a match-head sized pellet of whitish completely stopped, remove your tube. You 4. Spin your cells 5. tube at After the in a pelleting bottom balanced of your the centrifuge tube. cells, If pour you at full don t off the see should see a match-head sized pellet of saline. whitish speed for a pellet 2 minutes. Being of this careful size, When decant not the to centrifuge lose the saline, your has pellet, refill your cells at the bottom of the tube. If you don t blot your see completely tube with stopped, tube more briefly of remove your on a oral paper your rinse, tube. towel and You or repeat tissue. the a pellet of this size, decant the saline, refill It s your OK should see a tube for match-head a with small more amount sized pellet of your of saline of whitish oral rinse, (< 50 and µl, repeat about the the cells at the bottom same of size the as tube. your If you pellet) don t to see remain in the a pellet 5. After of this pelleting size, decant your the cells, saline, pour refill off your the saline. tube with Being more careful of your not oral to rinse, lose and your repeat pellet, the blot your 5. After pelleting your cells, pour off the saline. tube briefly on a paper towel or tissue. It s OK Being careful not to lose your pellet, blot your for 6. a small Resuspend amount the of pellet saline by (< vortexing 50 µl, about or flicking the tube briefly on a paper towel or tissue. It s OK the 5. After pelleting same tube size your so as cells, that your no pour clumps pellet) off the to of cells remain saline. remain. the Being careful for a small amount of saline (< 50 µl, about the bottom not of the to lose tube. your pellet, blot your tube briefly on same a paper size towel as your or tissue. pellet) It s to OK remain in the for a small bottom of the tube. 7. amount Using a of 2 20 saline µl (< adjustable-volume 50 µl, about the micropipet same 6. size Resuspend as set your to the 20 pellet) µl, transfer by to vortexing remain all of your in or the flicking resuspended the bottom tube of the so cells tube. that to no clumps the screwcap of cells remain. tube containing 6. Resuspend the pellet by vortexing or flicking the InstaGene. 2. Tag en kop 200 µl med of InstaGene saltvand matrix i. Tag with saltvandet your initials. i munden og rens munden grundigt i 30 sek. Spyt saltvandet saline ned back i koppen. into the Saltvandet cup. indeholder nu celler saline fra back kindhulen into the cup. 3. Overflyt 1 ml af dit saltvand til det første mikrocentrifugerør (med hængslet låg). 4. r i 1 minut ved 12000rpm. Tag mikrocentrifugerøret ud af centrifugen. spin. Du skulle nu gerne være i stand til at se et hvidt bundfald på størrelse spin. bottom of the med tube. et tændstikshoved. Hvis du ikke kan se det hvide bundfald, spin. gentages punkt 3. og 4.

16 saline back into the cup. initials. If a P-1000 micropipet is not available, 4. Spin your tube in a balanced centrifuge at full 3. carefully Transfer pour speed 1 ml for of ~1 2 your ml of minutes. saline your When rinse saline the into rinse centrifuge the into microhas your test micro completely tube test (NOT tube stopped, the (use screwcap the graduations remove tube) your with on the tube. your You side initials. of the should If micro a see P test a match-head micropipet tube to estimate sized is not 1 pellet available, ml). of whitish carefully cells at pour the bottom ~1 ml of of your the tube. saline If rinse you don t into 4. Spin see your your a micro tube pellet test in of this tube a balanced size, (use decant the graduations centrifuge at the saline, on full refill the speed your side tube of for the 2 minutes. with micro more test When of your tube the oral to estimate centrifuge rinse, and 1 ml). has completely stopped, remove your tube. You repeat the spin. 4. should Spin your see a tube match-head in a balanced sized pellet centrifuge of whitish at full cells speed at the 5. After for bottom pelleting 2 minutes. of the your When tube. cells, the If you pour centrifuge don t see off the has a pellet of this size, decant the saline, refill your saline. completely tube with Being more careful stopped, of your not remove oral to rinse, lose your your and repeat pellet, tube. the blot You your should tube see briefly a match-head on a paper sized towel pellet or tissue. of whitish It s OK cells for at a the small bottom amount of the of tube. saline If (< you 50 don t µl, about see the a pellet 5. After pelleting same of this size size, your as decant cells, your pour pellet) the saline, off to the remain refill your saline. in the tube with more of your oral rinse, and repeat the Being careful not to lose your pellet, blot your tube briefly on a paper towel or tissue. It s OK 5. for After a small pelleting amount your of saline cells, (< pour 50 off µl, about the saline. the same 6. Resuspend size as your the pellet) by to vortexing remain or in flicking the the Being careful not to lose your pellet, blot your tube so that no clumps of cells remain. tube briefly on a paper towel or tissue. It s OK for a small amount of saline (< 50 µl, about the same size as your pellet) to remain in the 6. Resuspend 7. Using the a 2 20 pellet µl by adjustable-volume vortexing or flicking micropipet the tube so set that to 20 no clumps µl, transfer of cells all of remain. your resuspended cells to the screwcap tube containing 5. Fjern supernatanten (det øverste lag) ved forsigtigt at vende bunden i vejret på mikrocentrifugerøret og lade saltvandet spin. blive suget ud på et stykke køkkenrulle eller ved forsigtigt at suge supernatanten op med en pipette. bottom of the tube. Pas på at pellet (bundfaldet) spin. ikke kommer med ud. Der må godt være en lille smule (< 50µL) saltvand tilbage i røret. bottom of the tube. 6. Resuspender pellet i den sidste sjat saltvand bottom of the tube. ved at bruge vortexeren eller ved at knipse med fingeren. InstaGene. Der må ikke være klumper i pellet. 6. Resuspend the pellet by vortexing or flicking the 7. Using tube a so 2 20 that no µl adjustable-volume clumps of cells remain. micropipet set to 20 µl, transfer all of your resuspended cells 8. Screw to the the screwcap cap tightly tube on the containing tube. Shake or 7. InstaGene. Using vortex a 2 20 to mix µl adjustable-volume the tube contents. micropipet set to 20 µl, transfer all of your resuspended cells to the screwcap tube containing 8. Screw InstaGene. the cap tightly on the tube. Shake or vortex to mix the tube contents. 7. Overfør 20µL af de resuspenderede celler til skruelågsmikrocentrifugerøret med InstaGene mix. 8. Luk røret tæt. Ryst eller knips på røret for at få indholdet blandet godt. 8. Screw the cap tightly on the tube. Shake or vortex to mix the tube contents. 9. Når alle i gruppen er klar, sættes jeres mikrocentrifugerør i en skumholder i vandbadet. Inkuber 9. When ved 56 all o C members i 10 minutter. of your team have Efter 5 collected minutter their tages samples, skumholderen place the tubes op, in the foam micro test-tube holder, and incubate at og der knipses på rørene. 56 C for 10 minutes in a water bath. At the Ved denne halfway opvarmning point (5 skilles minutes), cellerne shake ad, or vortex hvorved lyseringen i næste punkt lettes. Ved 56 o the C 9. When tubes all gently, members then place of back your in team the 56 C have water inaktiveres den DNAse,der naturligt er til stede i en collected bath for their samples, remaining place 5 minutes. the tubes in the cellesuspensio foam micro og test-tube som ville holder, kunne and ødelægge incubate DNA at og hæmme 56 C PCR-reaktionen. for 10 minutes in a water bath. At the 10. halfway Remove point the (5 tubes, minutes), shake shake or vortex, vortex and the place tubes the gently, tubes then in a place boiling back water in the bath 56 C (100 C). water bath Incubate for the remaining at 100 C 5 for minutes. 5 minutes. 10. Fjern skumholderen fra det første vandbad. Ryst/knips alle rørene. Overflyt til det 100 o Incubate C varme at 100 C vandbad for 5 og minutes. inkuber i 5 minutter Remove Remove the the tubes, tubes shake from or the vortex, boiling and water placebath the and tubes shake in a or boiling vortex the water contents bath to (100 C). resuspend. Pellet the matrix by spinning at 6,000 x g for 5 minutes (or 2,000 x g for 10 minutes) in a centrifuge. Ved 100 o C ødelægges cellemembranerne og 11. Remove the tubes from the boiling water bath Cellens 12. and indhold Store shake your or frigøres vortex screwcap the inklusiv contents tube in den the to DNA, refrigerator resuspend. der until skal virke Pellet the som the next skabelon matrix laboratory by for spinning period PCR-reaktionen (or at proceed 6,000 x g to for step 2 5 minutes of Lesson (or 2). 2,000 x g for 10 minutes) in a centrifuge. 12. Store your screwcap tube in the refrigerator until the next laboratory period (or proceed to step 2 of Lesson 2) Water bath Water bath Water bath Water bath 56 C, 10 min 56 C, 10 min 100 C, 5 min 100 C, 5 min

17 10. Remove the tubes, shake or vortex, and place the tubes in a boiling water bath (100 C). 17 Incubate at 100 C for 5 minutes. Water bath 100 C, 5 min 11. Tag rørene op af vandbadet. Ryst/knips og centrifuger derefter i 5 minutter ved 6000rpm, for at få pellet til at samle sig i bunden af røret centrifuge. Gå derefter videre til punkt 2 i PCRamplifikationen. eller 12. Opbevares i køleskab indtil næste punkt. Kan opbevares i op til flere dage i køleskab. Oprensning af DNA fra hårfolliket(1 lektion) Materialer Skruelågsmikrocentrifugerør InstaGene TM matrix 2-20µL mikropipette 2-200µL mikropipette Spidser Vortexer Bøtte til affald Mikrocentrifugerør Pincetter (til 1b) Sakse (til1b) Protease (til 1b) 11. Remove the tubes from the boiling water bath and shake or vortex the contents to resuspend. Pellet the matrix by spinning at 6,000 x g for 5 minutes (or 2,000 x g for 10 minutes) in a 12. Store your screwcap tube in the refrigerator until the next laboratory period (or proceed to step 2 of Lesson 2). 1. Mærk et skruelågsmikrocentrifugerør indeholdende 200µL InstaGene matrix plus protease med 34 dine initialer. 2.Tag 2 hår fra dig selv. Sørg for at der er hårrod på. Klip håret til så der er ca. 2 cm tilbage af den nederste del af håret. Læg hårene i det mærkede skruelågsmikrocentrifugerør.

18 hairs into the screwcap tube with your initials. Screw the cap tightly on the tu Sæt dit skruelågsmikrocentrifugerør i skumholderen og inkuber i vandbadet ved 56 o c i 10 minutter. Efter 5 minutter knipse der let til røret, så indholdet blandes. Ved denne opvarmning skilles cellerne ad, hvorved lyseringen i næste punkt lettes. Ved 56 o C inaktiveres den DNAse, der naturligt er til stede i en cellesuspension og som ville kunne ødelægge DNA og 4. Remove your tube, gently shake or vortex it, then place it in a boiling water b hæmme PCR-reaktionen.. 4. Remove (100 C) 5 your minutes. tube, gently shake or vortex it, then place it in a boiling (100 C) 5 minutes. 4. Tag skumholderen op. Ryst røret forsigtigt og sæt derefter skumholderen over i det 100 o C varme vandbad. Inkuber ved 100 o C i 5 minutter. Ved 100 o C ødelægges cellemembranerne og cellens indhold frigøres inklusiv den DNA, der skal virke som skabelon for PCR-reaktionen 5. Fjern holderen med rørene fra vandbadet. Ryst og bland indholdet grundigt. r i 5 minutter ved 6000rpm, således at pellet samles i bunden. Sheath Sheath Bulb Bulb 3. Place your tube in the foam micro test tube holder and incubate it at 5 3. Place your tube in the foam micro test tube holder and incubate it at 56 C for in in a a water water bath. At At the the halfway halfway point point (5 minutes), (5 minutes), shake shake or vortex or vortex the tube the ge place it it back in the 56 C water water bath bath for for the the remaining remaining 5 minutes. 5 minutes. Water bath Water bath Water bath Water bath C, 10 min 56 C, 10 min Gå derefter videre til punkt 2 i PCRamplifikationen Store your screwcap tube in the refrigerator until the next laboratory eller to step 2 of Lesson 2). Hair Hair 100 C, 5 min 100 C, 5 m 5. Remove your tube from the boiling water bath and shake or vortex t contents. Pellet the matrix by spinning at 6,000 x g for 5 minutes (or minutes). 6. Opbevares i køleskab indtil næste punkt. Kan opbevares i op til flere i dage i køleskab.

19 19 PCR-amplifikation Materialer Mikrocentrifugerør (med hængslet låg) Skruelågsmikrocentrifugerør Mastermix Primermix PV92 homozygot kontrol (+/+) PV92 homozygot kontrol (-/-) PV92 heterozygot kontrol (+/-) 12 PCR-rør Isbad Mikropipetter Spidser Lesson 2 PCR Amplification (Lab Protocol) Bøtte til affald Fælles: Lesson 2 PCR 1. Obtain Amplification your screwcap (Lab tube Protocol) that contains your genomic DNA template from the PCR-maskine refrigerator. your tubes for 2 minutes at 6,000 x g or for 5 minutes at 2,000 x g in a centrifuge. 1. Obtain your screwcap tube that contains your genomic DNA template from the refrigerator. your tubes for 2 minutes at 6,000 x g or for 5 minutes at 2, Tag x g dit in a DNA-rør centrifuge. fra køleskabet. r i 2 minutter ved 6000 rpm. 2. Each member of the team should obtain a PCR tube and capless micro test tube. Label each PCR tube on the side of the tube with your initials and place the PCR tube into the capless micro test tube as shown. Place the PCR tube in the foam micro test tube holder. 2. Each member of the team should obtain a PCR tube and capless micro test tube. Label each 2. Mærk PCR tube et PCR-rør on the side samt of the et mikrocentrifugerør tube with your initials and place the PCR tube into the capless micro test tube as shown. Place the PCR tube in the foam micro test tube holder. uden låg med dine initialer og sæt rørene i skumholderen PCR tube Capless tube PCR tube Capless 3. Overfør 3. 20µL Transfer fra 20 skruelågsmikrocentri- µl tube of your DNA template from the supernatant in your screwcap tube into fugerøret the til PCR-rørets bottom of the bund. PCR tube. Do not transfer any of the matrix beads into the PCR VÆR FORSIGTIG! reaction because they will inhibit the PCR reaction. 3. Transfer 20 µl of your DNA template from the supernatant in your screwcap tube into the bottom Undgå of at the få PCR matrixperlerne tube. Do not fra transfer bunden any med. of the matrix beads into the PCR reaction Da de because vil hæmme they PCR-reaktionen(Se will inhibit the reaction. tegningen) Supernatant Supernatant Matrix DNA template PCR tube Matrix 4. Locate the tube of yellow PCR master mix (labeled Master ) in your ice bucket. DNA Transfer template 20 µl of the master mix into your PCR PCR tube. Mix by pipetting up and down 2 3 times. Cap the PCR tube tightly and keep it on ice until instructed to proceed to the 4. Locate the tube next of yellow step. Avoid PCR bubbles, master mix especially (labeled in Master ) the bottom in your of the ice tubes. bucket. Transfer 20 µl of the master mix into your PCR tube. Mix by pipetting up and down 2 3 times. Cap the PCR tube tightly and keep it on ice until instructed to proceed to the next step. Avoid bubbles, especially in the bottom of the tubes.

20 20 DNA template Matrix PCR tube 4. Locate the tube of yellow PCR master mix (labeled Master ) in your ice bu Transfer 20 µl of the master mix into your PCR tube. Mix by pipetting up an 2 3 times. Cap the PCR tube tightly and keep it on ice until instructed to pr next step. Avoid bubbles, especially in the bottom of the tubes. 4. Stil røret med den gule mastermix på is og overfør 20µL mastermix til PCR-røret. Bland ved at pipettere op og ned. Luk PCR-røret og stil det på is Blandingen vil være gul. 5. Der køres 40 PCR-cykler enten i en termalcykler eller ved hjælp af vandbade. Din lærer vil instruere nærmere om dette. HUSK: Til sidst afsluttes med 10 minutter i 72 o C vandbadet. Master mix 54 Elektroforese Materialer PCR-prøverne MMR (DNA standard) PV92 loading dye Elektroforesekar, støbekar og kam Elektroforesebuffer (50x TAE) Agarose Fast Blast DNA farve Mikropipetter (20µL og 200µL) Mikropipettespidser Isbad PVXC markørfarve Bøtte til affald Farvekar Fælles: PV92 ++ standard PV standard PV92 +- standard 1. Tag dit PCR-rør og stil det i et mikrocentrifugerør uden låg. r i 3 sekunder ved 3000 rpm. 2. Tilsæt 10µL PV92 XC markørfarve til dit PCR-rør

21 og bland forsigtigt. Place the casting tray with the solidified gel in it, onto the platform in the g wells should be at the cathode ( ) end of the box, where the black lead Very carefully remove the comb from the gel by pulling it straight up, slow 2. Add 10 µl of PV92 XC loading dye to each PCR tube and mix gently Obtain an agarose gel (either the one you poured or one pre-poured by you 4. Pour ~275 ml of electrophoresis buffer into the electrophoresis chamber, covers the wells. 3. Den støbte agarosegel lægges i elektroforeseapparatet. Tjek at brøndene er nær den negative pol (den sorte ende) Fyld elektroforesebuffer i karret således at gelen er dækket. 5. Fyld 8µL prøve i hver brønd efter følgende skema: Lane Sample Load Volume Brønd nr. Prøve 1 MMR (DNA Mængde standard) 10 µl 1 DNA-standard 2 Homozygous 10 µl (+/+) control 10 µl 2 Homozygot +/+ kontrol 3 Homozygous 10 µl ( / ) control 10 µl 3 Homozygot -/- kontrol 4 Heterozygous 10 µl (+/ ) control 10 µl 4 Heterozygot +/- kontrol 5 Student 110 µl 20 µl 6 Student 2 20 µl 5 Elev 1 20 µl 7 Student 3 20 µl 6 Elev 2 20 µl 8 Student 4 20 µl 7 Elev 3 20 µl 6. Secure the lid on the gel box. The lid will attach to the base in only one orientatio 8 Elev 4 to red and black to black. Connect 20 the µl electrical leads to the power supply. 6. Sæt låget på elektroforesekarret og forbind ledningerne med strømforsyningen 7. Tænd for strømmen og lad elektroforesen køre i 30 minutter ved 100V. and pulse-spin the tubes (~3 seconds at 2,000 x g) to bring the condensa formed on the lids to the bottom of the tubes. 5. Using a clean tip for each sample, load the samples into the 8wells of the following order: 7. Turn on the power supply. Set it to 100 V and electrophorese the samples for 6. Secure the lid on the gel box. The lid will attach to the base in only one orientatio 30 minutes. to red and black to black. Connect the electrical leads to the power supply. 7. Turn on the power supply. Set it to 100 V and electrophorese the samples for 30 minutes. 8. When electrophoresis is complete, turn off the power and remove the lid from the box. Carefully remove the gel tray and the gel from the gel box. Be careful, the ge Farvning af gelerne very slippery. Nudge the gel off the gel tray with your thumb and carefully slide it 8. your When plastic electrophoresis staining tray. is complete, turn off the power 61 and remove the lid from the 1. Når elektroforesen er slut slukkes box. strømmen, Carefully remove the gel tray and the gel from the gel box. Be careful, the g ledningerne fjernes fra strømforsyningen, very slippery. og Nudge the gel off the gel tray with your thumb and carefully slide it your plastic staining tray. karret med gelen flyttes forsigtigt fra elektroforesekarret. Pas på! Gelen glider nemt af. Lad forsigtigt gelen glide ned i det kar, der skal bruges til farvningen. 2. Farv enten med den a)hurtige metode ca. 15 minutter eller b) Staining of Agarose Gels Lad gelen farve natten over. The moment of truth has arrived. What is your genotype? Are you a homozygote heterozygote? To find out, you will have to stain your agarose gel. Since DNA is natu Staining of Agarose Gels colorless, it is not immediately visible in the gel. Unaided visual examination of gel af electrophoresis The moment indicates of truth has only arrived. the positions What is of your the loading genotype? dyes Are and you not a the homozygote positions DNA heterozygote? fragments. To DNA find fragments out, you will are have visualized to stain by your staining agarose the gel. with Since a blue DNA dye is natu ca Fast colorless, Blast it DNA is not stain. immediately The blue visible dye molecules in the gel. are Unaided positively visual charged examination and have of gel a hig af affinity electrophoresis for the DNA. indicates These only blue the dye positions molecules of the strongly loading bind dyes to the and DNA not the fragments positions a allow DNA DNA fragments. to become DNA visible. fragments These are visible visualized bands by of staining DNA may the then gel be with traced, a blue photogra dye ca Fast Blast DNA stain. The blue dye molecules are positively charged and have a hig + +

22 22 Metode a: Hurtig farvning a. Tilsæt 120 ml 100x farveopløsning til gelen. Sørg for at den er helt dækket. b. Farv gelen i 2-3 minutter. Vip forsigtigt med karret. Hæld farven tilbage på flasken. Farven kan genbruges 7 gange. c. Skyl forsigtigt gelen i 10 sekunder med varmt (40-55 o C) vand fra vandhanen. d. Fyld derefter karret med varmt vand fra vandhanen i 5 minutter. Vip karret frem og tilbage. e. Gentag punkt d med nyt vand. f. Læg gelen på en lys baggrund og tegn med en tusch gelens brønde og bånd på en OH-transparant e.l. Tag eventuelt en fotokopi af gelen. g. Find ud, hvilken genotype du har. h. Lad gelen lufttørre og gem gelen. Undgå at udsætte gelen for direkte lys, idet det vil afblege båndene. Metode b: Langsom farvning (gelen farver natten over) a. Tilsæt 120 ml 1x farveopløsning til gelen. Gelen skal være dækket af farveopløsningen. b. Lad gelen stå natten over. Det bedste resultat opnås, hvis gelen rystes roligt undervejs fx på et rystebord. c. Næste dag hældes farveopløsningen fra. Farven kan ikke genbruges. d. Læg gelen på en lys baggrund og tegn med en tusch gelens brønde og bånd på en OHtransparent e.l. Tag eventuelt en fotokopi af gelen.

23 23 e. Find ud, hvilken genotype du har f. Lad gelen lufttørre og gem gelen. Undgå at udsætte gelen for direkte lys, idet det vil afblege båndene.