TOKSICITETS-TEST med ferskvandsalger VÆKSTHÆMNINGSTEST MED Pseudokirchneriella subcapitata

Transkript

1 TOKSIITETS-TEST med ferskvandsalger VÆKSTHÆMNINGSTEST MED Pseudokirchneriella subcapitata K. Ole Kusk Oktober 2009 Testen udføres (med modifikationer) i henhold til: Water quality - Fresh water algal growth inhibition test with unicellular green algae. ISO Standard (Pseudokirchneriella subcapitata er andet navn for Selenastrum capricornutum, som er det mest almindeligt brugte navn for denne art. Den er også tidligere blevet kaldt nkistrodesmus subcapitata og Raphidocelis subcapitata.) Formål: Denne metode anvendes til bestemmelse af de toksiske virkninger af kemikalier på væksten af en planktonisk ferskvandsgrønalge. På dette kursus bruger vi arten Pseudokirchneriella subcapitata. Testen kan bruges til vandopløselige forbindelser, der ikke forsvinder fra vandfasen under testen. Hvis stoffet ikke har høj vandopløselighed bør det overvejes om stoffet vil sorbere til glas og alger (f.eks. høj K ow ) eller fordampe (høj Henry s konstant, K H ). De vigtigste processer, der kan ændre koncentrationerne af testkemikalier under testperioden er bionedbrydelighed, fotonedbrydning, hydrolyse, fordampning, bioakkumulering og adsorptionen (på biomasse, på glas eller andre materialer, der indgår i test-systemet). Kort beskrivelse af metoden: lgerne dyrkes i forskellige koncentrationer af teststoffet. iomassen af alger måles ved begyndelsen og slutningen af testen. aseret på disse målinger, beregnes vækstraterne i algekulturer på de forskellige koncentrationer og anvendes som end point (testparameter) for at beregne E10 og E50. I denne type test vil algerne dele sig med en konstant 1

2 generations tid, hvilket betyder eksponentiel vækst. Derfor vil vækstkurven for kontrollen være en ret linje på semilogaritmisk papir med biomasse på log skala (y-akse) og tid på x- aksen. Hvis en naturlig logaritme bruges på biomasse-aksen, vil hældningen på vækstkurven faktisk være lig med vækstraten kaldet µ. iomasse: iomasse tæthed kan udtrykkes som: 1) elletæthed: ntal celler pr volumen (målt på en partikel-tæller) 2) bsorbans ved 663 nm: (max abs. for klorofyl) på et spektrofotometer 3) Fluorescens af ekstraheret klorofyl (målt på en flourometer) bsorbans og fluorescens er korreleret til celletæthed, og kan derfor tages som et direkte mål for biomasse. Ved måling af fluorescens, sendes lys med en bølgelængde på 420 nm (blåt energirigt lys) ind på den ekstraherede klorofyl og aktiverer det i nogle millisekunder. Fordi klorofyl ikke længere er i en celle, hvor den absorberede lys normalt anvendes til start af biokemiske processer, vil klorofylet indfangede energi blive frigivet igen, dels som lys og dels som varme. Det betyder at det lys som sendes ud igen er mindre energirigt. Det frigivne lys har et maksimum ved 671 nm, og det er det lys, der bliver målt som fluorescens på flourometeret. Den målte fluorescens (relative enheder) kan anvendes direkte som biomasse-mål (dvs. der er ingen grund til at regne tilbage til en celle-densitet). Vækstrate: iomassens vækstrate (normalt kaldt µ): µ = (ln N n - ln N O )/t d hvor og N O er den initiale biomasse (inoculum som antal blade) N n er slutbiomassen (antal blade ved slut) t d er længden af testperioden (her 2 eller 3 dage) Hæmning af vækstraten (i %): I µi (%) = (1 - µ i /µ c ) x 100 hvor I µi er den procentvise hæmning af vækstraten i koncentration i µ i er gennemsnitsvækstraten i koncentration i 2

3 µ c er gennemsnitsvækstraten i kontrollen rug et semi-logaritmisk papir eller et Excel-regneark til at kontrollere, at væksten i kontrolgruppen er eksponentiel (vækstkurver med biomasse som funktion af tiden [tid på lineær x-akse, biomasse på logaritmisk y-akse]). Definitioner: Test opløsning: landing af vand, næringsstoffer, og teststoffet, hvor algeceller inkuberes. Kontrol: landing af vand, næringsstoffer, og algeceller inkuberes uden teststof. Medium: Vand og næringsstoffer (N, P, a, Mg, Fe, NaHO 3 og så videre). E50 (=Effect oncentration): eregnet koncentrations, som forårsager 50% hæmning, (undertiden kaldet gennemsnitlig effektiv koncentration) i forhold til kontrol vækstraten. Man være opmærksom at stoffet skal være vandopløseligt i det område man ønsker at finde toksicitet. lgetesten tolererer et indhold på ca. 0,2 % af organisk opløsningsmiddel (mest anvendt er acetone). Koncentrationsområdet, der testes, skal være så bredt at koncentrationer med ingen eller lav effekt og koncentrationer med stor effekt (>80 % hæmning) er inkluderet i koncentrationsrækken. Hvis der arbejdes med farvede eller fluorescerende prøver skal der yderligere sættes en koncentrationsrække op uden algetilsætning, som køres under de samme parametre og hvorfra der ligeledes udtages prøver til fluorescensmålinger, der anvendes som baggrundsmålinger. Procedure: (Se også figur 1) 1) Der fremstilles en stamopløsning af teststoffet 2) Mål ph i stamopløsningen, og overveje, om der er brug for at justere ph (til kontrol af ph). Hvis stamopløsning og kontrol har den samme ph-værdi, vil alle fortyndinger (koncentrationer) af de to få samme ph-værdi. 3) eregn inoculum - hvor meget af algeforkulturen skal bruges til 25-mL eller 50 mltestopløsning (dette afhænger af, hvornår du vil STOPPE testen - læs om dette nedenfor) 4) Find ud af, hvilken koncentrationer du ønsker at teste og beregne hvor meget stamopløsningen skal bruges for at forberede 25 eller 50 ml testopløsning. Faktoren mellem de forskellige koncentrationer i testen bør ikke overstige 3,3. Vælg 5-7 3

4 forskellige koncentrationer. 5) Mærk dine 25-mL (eller 50-mL) målekolber med de valgte koncentrationer (herunder en kontrol) 6) Tilsæt til målekolberne den mængde af stamopløsningen som er nødvendig til fremstilling af de forskellige testkoncentrationer (intet i kontrol) 7) Tilsæt vand til fortynding (medium), men fyld ikke kolberne helt op (du skal bruge plads til algekulturen) 8) tilsæt den nødvendige mængde af forkultur til målekolberne. 9) Fyld kolber til line 10) land indholdet af kolberne grundigt (ryst dem). 11) Tre replikater (5-6 af kontrollen) fremstilles af hver koncentration - 4 ml af testopløsningen tilsættes til hver af de tre (5-6 for kontrol) vials (hætteglas). Sæt låg på testvials og sæt vials i lyset på en shaker 12) Tag 0,4 ml af hver test-koncentration (med alger) + 1,6 ml acetone (mættet med MgO 3 ). En prøve af hver koncentration. Prøver opbevares i mørke. Husk at lukke rør omhyggeligt - hvis ikke, vil acetone fordampe og det vil ødelægge testresultaterne. Medtag en blind (kun medium uden algeceller og teststof) til baggrundskorrektion. 13) Mål ph i kontrol og den højeste koncentration 14) Ryd op på din arbejdsplads - og afvent til næste prøveudtagning efter 24 og 48 timer slutningen. 15) efter 24 timer og ved slutningen: Udtag prøver af HVER replikat af alle koncentrationer og ekstraher med acetone (se senere for yderligere informationer om, hvor meget der skal udtages). De vials, som benyttes til testen, skal lægges i 1N Hl bad i ca. 24 timer. Herefter skylles de grundigt i destilleret H 2 O og tørres ved 105 º. 4

5 Dag 0 (start): For-kultur i dyrkningsvial: Figur 1: Flowdiagram for algetest elle-tæthed: (F.eks.) 10 6 celler/ml Forbered stam-opløsning mål ph og juster om nødvendigt til ph som i kontrol-medium (± 0.3) Måleflaske 25 eller 50 ml Kontrol Stam-opløsning Stigende koncentrationer eregn mængden af inoculum (start-biomasse) der skal tilsættes hver måleflaske eregn mængden af stam-opløsning, der skal tilsættes hver koncentration Tilsæt stam opløsning Tilsæt fortyndingsvand (medium) Fyld IKKE måleflaskerne helt Tilsæt inoculum Fyld flaskerne til stregen med fortyndingsvand mix ved rystning Lav 5-6 replikater af kontrollen og 3 af hver koncentration Kontrol Rør til biomassemålinger v. midt og slutn. af test Test kulturer ( 4 ml ) Kontrol Stigende koncentrationer 1 rør af iomasse hver målinger: koncentration land 0.4 ml prøve fra måleflaskerne med 1.6 ml acetone Inkluder 1 blind med kun medium og actone Midt og slutning af testperiode: (24 og 48 timer) Stigende koncentrationer Lav ét rør fra hver vial timerstest: Mix 0.4 ml algekultur ml acetone timerstest: Mix 0.2 ml algekultur ml acetone Opbevar rør i mørke luk låget omhyggeligt cetone er et flygtig væske!! Dag slut+1: lle rør måles på et flourometer iomasse målinger: brug aflæsningsværdierne fra flouorometer direkte som biomasse-mål. lind Fra start Fra midt og slutn. af test 5

6 Forberedelse af inoculum: En forkultur skal være klar til brug i laboratoriet. Hvis testen kører 1 dag Start celledensitet: 5 x 10 4 celler/ml Hvis testen kører 2 dage (fra mandag til onsdag for eksempel): Start celledensitet: 1 x 10 4 celler/ml (beregning af celletæthed skal indgå som et bilag i rapporten) for indstilling af start-densiteten se side 8. Hvis testen varer 3-4 dage (f.eks. fra torsdag til mandag): Start celledensitet: 5 x 10 3 celler / ml (beregning af celletæthed skal indgå som et bilag i rapporten). Klorofyl-ekstraktion: Ved start: Tag 0,4 ml af hver test-koncentration (med alger) + 1,6 ml acetone (mættet med MgO 3 ). Èn 0,4-mL-prøve af hver koncentration. Prøver opbevares i mørke. Husk at lukke rør omhyggeligt - hvis ikke, vil acetone fordampe og det vil ødelægge dine testresultater. Medtag en blind (kun medium uden algeceller og teststoffet) til baggrundskorrektion. Ved midt og slutning: (alle replikater samples) Efter 2 dages-tests: land 0,4 ml algekulturen fra hver testvial + 1,6 ml acetone. Efter 3-4 dage-tests: land 0,2 ml algekulturen fra hver testvial + 1,8 ml acetone. (Husk, at hvis du tog 0,4 ml kultur i starten, er du nødt til at korrigere for denne forskel) Har du huske at medtage en blind i starten (kun medium uden algeceller og teststoffet) til baggrundskorrektion - hvis ikke, kan du gøre det nu. Luk glassene omhyggeligt for at undgå fordampning af acetone. 6

7 lle ekstrakter efterlades i mørke i mindst 24 timer før fluorescens måles. Målinger: ph: Måles ved start: Kontrol, stamopløsningen og (senere) de højeste koncentrationer Ved afslutningen: lle koncentrationer Fluorescens måling: lle acetone-ekstraherede prøver fra start (1 pr koncentration), og midt og slut (alle replikater) + en blind. Validitets-kriterier: Testen er gyldig, hvis følgende betingelser er opfyldt: a) Kontrolvækstrate skal være mindst 0,9 dag -1, hvilket betyder, at efter 72 timer skal der være en 16-ganges stigning i biomassen. Normale vækstrater er i intervallet 1,5-1,9 d -1. b) kontrol-ph skal ikke have varieret mere end 1,5 enheder under testen. Husk at kontrollere (og rapportere), hvis gyldigheds-kriterierne var opfyldt. eregning: eregn vækstraten i hver replikat (brug værdierne fra fluorometeret direkte - eventuelt korrigeres for forskellige mængder taget ud ved start, midt og slut) og brug værdierne til at fremstille en koncentrations-respons-kurve. Hvis stimulering af væksten blev observeret ved den lave koncentration [s] (hormese) dette kan testes statistisk ved brug af en t-test på et 95%-signifikansniveau ved at sammenligne responsene ved en bestemt koncnetration med de tilsvarende respons i kontrolreplikaterne. Kun hvis forskellen er statistisk signifikant, kan stimulering kaldes hormese. En T-test-program er tilgængelig som en standardfunktion i Excel. E10 og E50 beregnes som beskrevet: "Statistisk databehandling af toksicitetstestresultater" ved brug af 459LogDK.xls og LOG459.exe. 7

8 Rapportering: Rapporten skal bl.a. indeholde: En tabel med primær (målte) data En koncentrations-respons kurve (koncentration som X-akse og hæmning som Y-akse) fra det statistiske program E-værdier fra det statistiske program. Overveje og drøfte (blandt andet): Var validitets-kriterierne er opfyldt? Har vi opnået en fuldstændig koncentrations-respons-kurve? Har vi en litteratur værdi at sammenligne med? ndet: Eksempel på en test med referencestof (K 2 r 2 O 7 ): Der fremstilles en stamopløsning på 300 mg/l (15 mg/50 ml) i algemedie (som stamopløsning I). E 50 er 0,80 ± 0,3 mg/l for K 2 r 2 O 7, så der vælges en konc. række med (ca.) 0,80 mg/l centralt placeret. D.v.s: 3,0; 1,5; 0,75; 0,38; 0,19 mg/l. Der er, som det fremgår af nedenstående tabel, brugt en faktor 2 mellem koncentrationerne. Faktoren skal ligge mellem 1,8-3,2 for et acceptabelt resultat. Det anbefales at lave en mellemfortynding af stamopløsning I til 30 mg/l kaldet stamopløsning II. iomassemåling ved hjælp af spektrofotometer: I henhold til kalibreringskurve mellem spektrofotometriske værdier (5 cm-kuvette) og celletæthed findes denne sammenhæng: Og med 1 cm-kuvette: elletæthed (celler/ml) = S 663nm elletæthed (celler/ml) = S 663nm 10 6 Ved indstilling af start-densitet: Mål forkulturens S 663nm og beregn celledensiteten; beregn dernæst hvor meget forkultur, som skal bruges til at opnå den ønskede startdensitet (måling af absorptionen ved start vil være for usikker startdensiteten skal derfor beregnes ud fra forkulturens absorption) 8

9 5 målekolber a 25 ml fyldes halvt med algemedie. Kolbe nr : Koncentration Tilsætning fra stam II : ( til 25 ml-kolber) 1 3,0 mg/l 2,5 ml af stam II 2 1,5 mg/l 1,25 ml af stam II 3 0,75 mg/l 0,625 ml af stam II 4 0,38 mg/l 0,313 ml af stam II 5 0,19 mg/l 0,156 ml af stam II Det nødvendige volumen af alge-forkultur (inoculum) tilsættes, og målekolberne fyldes op, rystes grundigt, og indholdet kan derefter tilsættes til vials. Materiale-liste: lge : Pseudokirchneriella subcapitata i god vækst lge medium: ISO Standard 8692 Glasvials 21 ml. (Syrevaskede i 1N saltsyre) Div. pipetter og spidser. 25 ml målekolber Div. måle- og bægerglas. Teststof opløsning (fremstilles i medium) Lyskilde cetone mættet med magnesiumklorid (Mgl 2 ) til ekstraktion af klorofyl Flourometer-prøveglas v. flourometri ellers 1-cm-glaskuvette. Lommeregner pparater. Flurometer eller Spektrofotometer. ph-meter oulter ounter (celletælling) Referenceliste: International Organization for Standardization (ISO). Water quality - Fresh water algal growth inhibition test with unicellular green algae. ISO Standard

10 RÅDT-SKEM Koncentration (mg/l) Replikat D 0 E 0 F Dag 0 iomasse Dag iomasse Dag iomasse Dag iomasse Vækstrate (µ) Kontrolgennemsnit µ Hæmning I µi (%) (i relation til kontrolgennemsnit) 10