Besvarelse til opgave 1 januar 1999 Spm. A: Spm. B:

Transkript

1 Besvarelse til opgave 1 januar 1999 Spm. A: Vi må lave et genomisk bibliotek i en lambdafag, cosmid, BAC eller YAC plasmid. Til dette vil vi skære det genomiske DNA partielt med Sau3A, så vi får stykker der passer i længden til den valgte vektor. Hvis vi vælger lambda vil vi intro pakke vores lambda med ligeringsblandingen, inficere nogle E. coli celler og få et masse plaque, der udgør vores bibliotek. Dettte bibliotek kan vi screene med vores mærkede cdna, der så vil fungere som probe. De positive kloner vil vi sekventere. Hvis ikke hele genet er med må vi lede i biblioteket igen, evt. med en probe, der ligger i starten af genet. Spm. B: Når vi vil indsætte et DNA fragment et bestemt sted i kromosomet, må vi forlade os på homolog rekombination mellem kromosomet og vores DNA fragment. Det betyder i dette tilfælde, at det fragment, vi vil indsætte i genomet, skal flankeres af DNA sekvenser, som er identisk med noget kromosomalt DNA. Derfor indeholder vores targeting vektor i Figur 2 exon 1 og noget af intron 1 fra musens Hprt lokus på den ene side af det humane haptaglobin gen og noget af musens Intron 2, Exon2 og intron 3 på den anden side. Det HindIII site der normalt ligger i Exon 3 er fjernet (for nemmere at kunne identificere de transgene dyr). Neo kassetten ligger også mellem de flankerende sekvenser. De rigtige rekombinationer vil således erstatte noget af musens Hprt gen med det humane haptaglobin gen. Resultatet af rekombinationen vil se ud som vist nedenfor. 1

2 B E1 R HIII HIII HIII ΔHIII Neo R P HSTK P hhp2 Hprt hhp 2 E1- E7 Hprt I2 E3 I3 E4 I4 E5 I5 E6 I6 o.s.v. Den viste struktur kræver at overskrydsningen er sket efter ΔHIII. M.h.t. integration af plasmidet i figur 3 må resultatet af et dobbelt overkryds se ud som vist nedenfor. E1 E2 E3 E4 E7 E1 E4 E3 P hhp2 P HSTK Neo R Apoa-1 hhp 2 Apoc-3 Spm. C: Det ønskede dobbelte overkryds i Hprt lokus vil inaktivere Hprt genet og derfor gøre cellerne 6-thioguanin resistente. Ved at selektere i medium indeholdende 6-thioguanain kan vi selektere for den ønskede genotype. Spm. D: Fidusen er, at thymidin-kinase-kasetten vil forsvinde, hvis plasmid B integreres ved homolog rekombination. Derved bliver cellerne resistente mod 2

3 gancyklovir. Da neomycin resistens-kasetten samtidig integreres bliver cellerne neomycin resistente. Spm. E: Her har vi to muligheder, PCR eller Southern blot. Vil vi lave PCR må vi lægge en primer i NeoR kasetten som løber ud af Neo kasetten og en primer upstrøms for BamHI sitet. Disse to primere vil kun give et bånd af den rigtige længde hvis integrationen er sket korrekt i den ende. På samme måde kan vi lægge en primer der læser ud af intron 7 i hhp2 genet og en der ligger i exon 4 i Hprt genet og læser ind i starten af genet. (se figurerne for primernes lokalisering). Tilsvarende for integrationen i Apoa1-Apoc-3 locus. En anden mulighed er at lave et Southern blot med de i Figur 1 viste prober. For integrationen i Hprt lokus kan vi skære ES cellernes genom med HindIII. Den anvendte probe vil så give et hybridiseringssignal på 7.1 kb, hvis ES cellen ikke er transgen, men et fragment på = 9.8 hvis ES cellen er transgen og det dobbelte overkryds har fjernet HindIII sitet i exon 3. For integrationen i Apoa1-Apoc-3 locus kan vi skære ES cellens genom med HindIII og anvende den viste probe. Vildtype ES celler vil så give et bånd på 12.0 kb, medens den transgene ES celler vil give et bånd på 3.8 kb + ( )kb = 7.2 kb. Spm. F: 7.1 kb båndet stammer fra vildtype mus, medens 9.8 kb båndet stammer fra transgene mus. Da integrationsstedet er X-kromosomet betyder det at musen i lane 1 er homozygot vildtype, musen i lane 2 er homozygot transgen, musen i lane 3 er homozygot wildtype, medens musen i lane 4 er heterozygot for den transgene allel. 12 kb fragmentet i Figur 5 stammer fra vildtype allellen medens 7.2 kb fragmentet stammer fra den transgene allel. Musen i lane 1 er således homozygot vildtype, musene i lane 2, 3 og 5 er heterozygot transgene medens musene i lane 4 og 6 er homozygot transgene. Spm. G: Det ses at transkiptionen af det humane hhp2 gene er høj i mus hvor integrationen er sket i et DNA område der normalt er transkritionelt aktivt i lever. Det ses også at ekspressione i dette locus er rimelig uafhængig af tilstedeværelse af LPS. Generelt er transkriptionen fra hhp2 promotoren lokaliseret i Hprt lokus lav. Der induceres ikke ret meget transkription af Hp2 og Neo transkriptet er næsten ikke 3

4 tilstede. Mængden af hhp2 transkript fra Hprt lokus er dog nogenlunde den samme som mrna mængden fra musens endogene Hp2 gen. Vi kan også se at Apoc-3 transkriptet er fraværende i den homozygote transgene mus der udtrykker hhp2 fra Apoa-1/Apoc-3 lokus. Dette kunne skyldes interferens fra den stærke transkription af Neo genet. Spm. H: Her kan vi se, at det ikke kun er promotoren, der bestemmer hvor meget transkript, der forefindes i forskellige typer væv. Det er jo det samme reportergen, vi har indkorporeret to forskellige steder i musens genom. Starter vi med Figur B, kan vi se, at transkriptionen fra den leverspecifikke promotor giver den rigtige vævsspecificitet (dog ser ekspressionen lidt for høj ud i tyndtarmen), hvis reporteren er indkorporeret i genomet i et lokus, der normalt er aktivt i leveren. Derimod er der ikke rigtig nogen tydelig vævsafhængig ekspression, når promotoren er integreret i Hprt lokus. Transkriptionen er tilmed meget lav fra Hprt lokus. Vi kan stort set se det sammen for vores neor kasette. Transkriptionen af neo kasetten følger det lokus hvor kasetten er indsat. Så selv om promotoren foran neokassetten er konstitutiv, så udviser den alligevel en vævsspecificitet. Så konklusionen er, at det er DNA strukturen, der bestemmer om en promotor kan transkriberes og promotoren der afgør om den så også bliver det. 4

5 Løsning på opgave 1, november 2004 Spm. A: Her må vi igang med site directed mutagenese. Vi kan anvende overlap extension PCR som angivet i værktøjskassen. Serinen i opgaven kodes af tcg. Opslag i den genetiske kode viser at alanin kan kodes af gcg. Up-primer: 5 atgccggggctaagttgta 3 (Tm = 4 x x 2) = 58 o C Do-primer: 5 ttaatcttcagctttggcttc 3 (Tm = 4 x x 13) = 58 o C Mut-up: 5 tcttagtgaattagcgagacgac 3 (Tm = 4 x x 2 2) = 60 o C Mut-do: 5 gtcgtctcgctaattcactaaga 3 (Tm = 60 o C) Det nukleotid, der skal ændres, er angivet med fed skrift. Vi laver nu PCR på en cdna klone med eif2α med primerne Up-primer + Mut-do og med Do-primer + Mut-up. Lidt af de to PCR produkter blandes samme og der laves PCR med Up-primer + Do-primer. Fragmentet klones og sekventeres. Spm. B: Fordi mus og menneske er tæt på hinanden evolutionært kan vi fremstille et muse-genombibliotek og screene dette med exon 2 fra menneske. En positiv klon vil vi sekventere, og se om vi har fået fat i exon 2 og tilpas meget af de flankerende regioner. Spm. C: Transficere de embryonale stamceller med fragmentet der er vist i Figur 2B. Vi må som altid forlade os på homolog rekombination når vi skal ændre i genomet. Vi kan udnytte at vektoren har en neomycin kasette, hvilket betyder at vi kan selektere for ES-celler der har fået integreret vores DNA fragment fra Figur 2B. For at berige for de homologe rekombinanter, kan vi selektere for gancyklovir resistens, idet homolog rekombination vil fjerne HSV-tk genet. Tilstedeværelse af HSV-tk genet vil nemlig gøre ES-cellerne sensitive overfor gancyklovir. Så i ES-celler med en neomycin resistent og gancyklovir resistent fænotype vil der med stor sansynlighed være foregået homolog rekombination. Spm. D: Ved hjælp af den viste probe, kan vi restriktionsmappe området omkring der hvor den homologe rekombination gerne skulle være sket. Skærer vi DNA fra en vildtype ES-celle, en ES-celle hvor der er sket homolog rekombination og en hvor 5

6 rekombinationen er sket et tilfældigt sted, med HindIII og laver et Southern blot med den i figur 2 viste probe vil vi få følgende fragmenter: Vild type ES: et fragment på = 6.8 kb En korrekt ES-celle: = 6.0 kb En tilfældig integration: vil være magen til vildtype blotte. Hvis vi skar med PstI ville vi få følgende bånd: Vild type ES: = 11.5 kb En korrekt ES-celle: = 10.7 kb En tilfældig integration: som vildtypen. Spm. E: Det kunne være at transkriptionen af neokassetten kunne interferere med ekspressionen af vores eif2α gen (interferere med transkriptionen eller eventuelt med splejsning af RNA). Vi vil jo gerne have at expresssionen af mutant eif2α er den samme som for vildtyp eif2α. Derfor vil man tit krydes den selektive markør ud før ES-cellerne bliver til mus. Spm. F: PCR med de to viste primere vil give et produkt, der ikke kan skæres med MscI, medens produktet med med de viste primere på en korrekt ES-celle vil give 3 bånd, hvis længde vi vil kende, da vi selv har lavet vores vektorer. Spm G: At thapsigargin og leucinsult begge øger mængden af ATF4 protein kraftigt. At koncentrationen af CHOP stiger senere en ATF4 (måske er ATF4 vigtig for ekspressionen af CHOP). At PERK kinasen er essentiel for cellens evne til at respondere på thapsigargin og at GCN2 er essentiel for cellens evne til at respondere på leucinsult. At eif2α proteinmængden er konstant. Spm H: I dette forsøg standses transkriptionen før stresssituationen induceres. Når der således i figuren sker en opregulering af ATF4 proteinkoncentrationen må det betyde at det mrna, der var tilstede før induktion af stress, bliver translateret meget mere end før stress. Det er den eneste mulighed da transkriptionen jo er stoppet. Vi kan også se på northern blottet at ATF4 mrna mængden ikke stiger p.g.a. stress (mrna mængden falder hen i gennem forsøget, da mrna jo henfalder og der ikke 6

7 bliver syntetiseret noget nyt). mrna mængden før stress er høj, men proteinet er helt fraværende. Vi kan se at billedet er nogenlunde det samme, hvad enten vi stresser foldningen i ER eller vi sulter for leucin. Vi kan se at CHOP må være reguleret på transkriptionel niveau, da hverken CHOP RNA eller protein akkumulerer i tilstedeværelse af Actinomycin. Spm. I: Forudsætningen for at cellerne kan blive grønne er, at de har optaget det plasmid, de er transficeret med. Fraktionen af grønne celler i forhold til de blå giver altså transfektionseffektiviteten. Spm. J: For vildtypen kan vi se røde celler når vi har tilsat thapsigargin, som tegn på at CHOP bliver produceret, når vi stresser cellen med thapsigargin. Celler transficeret med ATF4:CD2 giver også røde celler når vi stresser med thapsigargig selv om cellerne mangler den PERK kinase, vi i Figur 3 så var essentiel for dannelse af CHOP. Grunden hertil er, at der ingen regulation er på expressionen af det plasmid der er brugt til transfektion (ATF4:CD2). Når de ubehandlede celler så ikke er røde må det betyde, at ATF4 alene ikke er nok til at inducere CHOP ekspression. Vi kan i de sidste to forsøg se, at ATF4 er essentiel for at kunne opregulere CHOP4, hvilket sammen med data i figur 3 tyder på, at ATF4 er en transkriptionsfaktor. 7