Udbredelse af Dehalococcoider i danske. grundvandsakviferer. Charlotte Scheutz, Eline Begtrup & Poul L. Bjerg

Transkript

1 Udbredelse af Dehalococcoider i danske grundvandsakviferer Charlotte Scheutz, Eline Begtrup & Poul L. Bjerg

2 Udbredelse af Dehalococcoider i danske grundvandsakviferer Forfattere: Charlotte Scheutz, Eline Begtrup og Poul L. Bjerg Font: Times New Roman Grafik: Forfatterne og Torben Dolin Omslag: Julie Camilla Middleton ISBN Institut for Miljø & Ressourcer, DTU Bygningstorvet, Bygning115, Danmarks Tekniske Universitet DK-2800 Kgs. Lyngby Tlf: (+45) Fax: (+45) Publikationen kan downloades på: sara.er.dtu.dk

3 UDBREDELSE AF DEHALOCOCCOIDER I DANSKE GRUNDVANDSAKVIFERER Et samarbejdsprojekt mellem Institut for Miljø & Ressourcer, DTU og Københavns Amt Udarbejdet af: Lektor Charlotte Scheutz Forskningsassistent Eline Begtrup Professor Poul L. Bjerg Institut for Miljø & Ressourcer, Danmarks Tekniske Universitet December

4 INDHOLD RESUMÈ 3 1. INDLEDNING OG FORMÅL Indledning Formål 5 2. UDVÆLGELSE AF LOKALITETER OG ANALYSEPARAMETRE 5 3. RESULTATER Udbredelsen af på danske lokaliteter Sammenhæng mellem tilstedeværelse af nedbrydningsprodukter og på forurenede lokaliteter Sammenhæng mellem redoxforhold og på forurenede lokaliteter KONKLUSIONER ANBEFALINGER REFERENCER 17 BILAG 1. Oversigt over lokaliteter BILAG 2. Prøvetagning, analysemetoder og apparater BILAG 3. Vejledning til prøvetagning og analyse for BILAG 4. Sammenligning af udtagning af vandprøve versus filterprøve i forbindelse med analyse af Dhc og Vcr BILAG 5. Samlede oversigt over resultater BILAG 6. Oversigt over resultater fra SiREM BILAG 7. Sammenhæng mellem koncentrationsniveau og tilstedeværelse af Dhc og Vcr BILAG 8. Sammenhæng mellem NVOC og tilstedeværelse af Dhc og Vcr 2

5 RESUMÈ Ved anvendelse af stimuleret reduktiv dechlorering (SRD) som afværgeteknologi til oprensning af grunde forurenet med chlorerede opløsningsmidler er forekomsten af bakterier af typen (Dhc) afgørende, idet de er de eneste kendte bakterier, der kan dechlorere perchlorethen (PCE) og trichlorethen (TCE) helt til ethen. I nærværende undersøgelse er udbredelsen af Dhc på en række danske forurenede og uforurenede lokaliteter søgt belyst. Undersøgelsen har vist, at der på flere danske lokaliteter forurenet med chlorerede opløsningsmidler findes Dhc men generelt i lave antal (<10 5 celler/l). Endvidere er det fundet, at ikke alle typer af de tilstedeværende Dhc besidder generne til at udtrykke vinylchloridreduktase (Vcr) og dermed evnen til at dechlorere vinylchlorid (VC) til ethen. De udførte undersøgelser tyder på, at tilstedeværelsen af Dhc er betinget af, at der på lokaliteten er jern-/sulfatreducerende eller methanogene forhold. Signifikant dechlorering af cis-dichlorethen (cis-dce) og VC til ethen ses kun i boringer med methanogene forhold, og kun hvor der er Dhc, som har genet for Vcr, i væsentlige koncentrationer. Til vurdering af anvendelse af SRD som afværge på lokaliteter forurenet med PCE og TCE anbefales det, at der ud over bestemmelse af antal Dhc udføres en analyse af, hvorvidt de tilstedeværende Dhc besidder Vcr og dermed kan dechlorere VC til ethen. Endvidere anbefales det, at der som standard måles ethen og ethan, da tilstedeværelsen af ethen og ethan er gode indikatorer for, om der sker fuldstændig dechlorering. 3

6 1. INDLEDNING OG FORMÅL 1.1 Indledning Chlorerede opløsningsmidler som PCE og TCE hører som følge af deres intensive anvendelse som bl.a. rensevæske i renserier og metalværksteder til de mest udbredte miljøfremmede organiske forureninger i både jord og grundvand. Forurening med PCE og TCE udgør et sundhedsmæssigt problem, da PCE bl.a. er påvist værende kræftfremkaldende, mens TCE er mistænkt for at være kræftfremkaldende. Traditionelle oprensningsmetoder, som baserer sig på oppumpning af grundvand og efterfølgende behandling, har vist sig at være ineffektive og meget omkostningstunge pga. den ofte lange behandlingsperiode. De seneste år har man derfor haft fokus på at udvikle nye effektive og billigere in-situ teknologier til oprensning af forurenede grunde. Stimuleret reduktiv dechlorering er en lovende in-situ afværgeteknologi til oprensning af chlorerede opløsningsmidler, hvor målet er at omdanne de chlorerede opløsningsmidler til ethen via sekventiel nedbrydning af cis-dce og VC. I denne proces er det vigtigt at opnå fuldstændig omdannelse af PCE/TCE til ethen, da akkumulering af VC er uønsket på grund af dets kræftfremkaldende egenskaber. De naturlige mikrobiologiske nedbrydningsprocesser stimuleres ved tilsætning af elektrondonor i form af organisk stof og evt. bakterier /1/. Anaerob dechlorering af chlorerede ethener er en redoxproces, hvor visse bakterier benytter de chlorerede ethener som elektronacceptor til generering af energi i en respirationsproces kaldet (de)halorespiration. De fleste halorespirerende bakterier anvender hydrogen som den primære elektrondonor i nedbrydningen af chlorerede ethener. Flere halorespirerende bakterier kan dechlorere PCE eller TCE til cis-dichlorethen (cis-dce). Der er i dag dog kun isoleret en renkultur ethenogens 195, hvor det er dokumenteret, at der ved halorespiration kan ske fuldstændig dechlorering af PCE eller TCE til ethen. Om ethenogens 195 vides det, at det sidste trin i dechloreringsfølgen fra vinylchlorid til ethen forgår ved cometabolsk transformation, og således ikke er kædet sammen med dehalorespiration /2/. Der eksisterer dog flere bakteriekulturer indeholdende bakterier af typen Dhc, der kan dechlorere VC til ethen under energiudnyttelse /3,4,5/. Det er dog ikke alle typer af Dhc, der kan dechlorere VC til ethen. For nylig er genet vinylchloridreduktase (Vcr), der koder for enzymet vinylchlorid dehalogenase, som er ansvarlig for dechloreringen af VC til ethen, fundet. Endvidere er der i blandede bakteriekulturer set en sammenhæng mellem tilstedeværelse af Dhc, der indeholder Vcrgenet og evnen til at dechlorere VC til ethen /6/. Ved anvendelse af SRD som afværgeteknologi til oprensning af grunde forurenet med chlorerede opløsningsmidler er forekomsten af bakterier af typen Dhc derfor afgørende, da man ellers kan forvente at se akkumulering af cis-dce eller VC. Udbredelsen af Dhc i danske grundvandsmagasiner er dog forholdsvis ukendt. Dhc s meget usædvanlige og restriktive metabolisme giver anledning til undren over, hvordan disse bakterier, der kun kan vokse på chlorerede ethener og hydrogen under anaerobe forhold, er opstået, og hvorvidt de findes spredt naturligt i miljøet eller kun findes på steder, hvor der er chlorerede stoffer. 4

7 1.2 Formål Københavns Amt har sammen med Institut for Miljø & Ressourcer, DTU igangsat et udviklingsprojekt med det formål at undersøge udbredelsen af Dhc i danske grundvandsmagasiner. Undersøgelsen forventes at tilvejebringe ny viden om: Den generelle udbredelse af Dhc i grundvand på danske lokaliteter Sammenhængen mellem tilstedeværelse af nedbrydningsprodukter som VC og ethen og Dhc på forurenede lokaliteter Sammenhængen mellem redoxforhold og Dhc på forurenede lokaliteter Nødvendigheden af at tilsætte bakterier (bioaugmentation) ved anvendelse af SRD som afværgeteknologi Projektgruppen har bestået af: Charlotte Scheutz, Institut for Miljø & Ressourcer, Danmarks Tekniske Universitet Eline Begtrup, Institut for Miljø & Ressourcer, Danmarks Tekniske Universitet Poul L. Bjerg, Institut for Miljø & Ressourcer, Danmarks Tekniske Universitet Carsten B. Jensen, Københavns Amt Henriette Kerrn-Jespersen, Københavns Amt 2. UDVÆLGELSE AF LOKALITETER OG ANALYSEPARAMETRE I samarbejde med Københavns Amt er udvalgt 11 lokaliteter forurenet med chlorerede opløsningsmidler til undersøgelse for udbredelse af Dhc. På hver lokalitet er udtaget vandprøver fra mellem en til fem eksisterende boringer i alt er der udtaget 36 vandprøver fra de 11 lokaliteter. Lokaliteterne er udvalgt således, at der indgår lokaliteter med både aerobe og anaerobe forhold. Desuden indgår lokaliteter, hvor der ses dechlorering til VC og/eller ethen, samt lokaliteter, hvor der ikke ses dechlorering i væsentligt omfang. Flere af lokaliteterne er eller har tidligere været forurenet med andre organiske stoffer. På de enkelte lokaliteter er udvalgt boringer med forskellige forureningsniveauer og sammensætning. Desuden indgår to lokaliteter (to grundvandsovervågningsboringer), hvor der ikke tidligere er målt chlorerede opløsningsmidler, for at belyse baggrundsniveauet af Dhc i uforurenede grundvandsmagasiner. I Bilag 1 findes en samlet oversigt over de udvalgte lokaliteter. Vandprøverne er analyseret for både chlorerede stoffer inkl. nedbrydningsprodukter samt redoxparametre inkl. methan på Institut for Miljø & Ressourcer, DTU. Vandprøverne er endvidere analyseret for Dhc. Vandprøver, hvori der er fundet Dhc, er analyseret for antallet af Vcr-genkopier. På udvalgte prøver med Dhc er udført sekvensering af 16S rrna. Alle molekylærbiologiske analyser er udført på SIREM s laboratorium i Canada. Tabel 1 viser en oversigt over udførte analyser, anvendt analysemetode samt detektionsgrænser i forbindelse med prøvetagningen. 5

8 I Bilag 2 findes en detaljeret beskrivelse af proceduren for vandprøvetagning, udførte analyser samt anvendt analyseapparatur. Udtagning af vandprøver til analyse for Dhc og Vcr er generelt foretaget ved at pumpe 20L vand gennem et filter, hvorpå bakterier til analyse er opsamlet. Fra enkelte lavtydende boringer samt til verificering af filter-metoden er udtaget 1L-vandprøver til direkte analyse. I Bilag 3 findes en vejledning for proceduren for dels udtagning af vandprøver via filtrering til analyse for Dhc samt dels en vejledning for standardmetoden, hvor der udtages en 1L-vandprøve til efterfølgende analyse. Filtrering af vandprøver med efterfølgende analyse af Dhc og Vcr på materialet opsamlet på filtrene var en ny og ikke verificeret procedure i forhold til SIREMs tidligere procedure, hvor der som standard fremsendtes 1L-vandprøve. Fordelen ved fremsending af filterprøve er, at disse er lettere og billigere at fremsende, da filtrene fysisk er mindre men også vejer mindre end 1L-vandprøver. Desuden er risikoen for lækage af 1L-vandprøver elimineret. Endvidere var det forventeligt, at man kunne opnå en lavere detektionsgrænse, idet der kunne pumpes flere liter vand gennem et filter (op til 20 til 50L), og man derfor havde mere materiale (RNA) at analysere på. Modsat forventet viste resultaterne højere koncentrationer af både Dhc og Vcr i 1L-vandprøverne i forhold til filterprøverne. Dette skyldes matrixeffekt fra andet partikulært materiale opsamlet på filtrene i forbindelse med analyse. I forbindelse med resultatbehandlingen er alle data for filterprøverne korrigeret med formålet at kunne sammenligne resultaterne fra vandprøver med resultater fra filterprøver. I Bilag 4 findes en detaljeret beskrivelse af databehandling i forbindelse med sammenligning af resultater af Dhc og Vcr ved udtagning af hhv. vandprøver og filterprøver. På baggrund af nærværende undersøgelse anbefaler SIREM fremover, at der udtages vandprøver i forbindelse med kvantitativ bestemmelse af Dhc og Vcr, da filtermetoden på nuværende tidspunkt må betragtes at være semi-kvantitativ. Tabel 1. Udførte analyser, anvendt analysemetode samt detektionsgrænser. Analyseparameter Anvendt analysemetode Kvantitative detektionsgrænser Chlorerede opløsningsmidler (PCE, TCE, cis-1,2-dce, Gaskromatograf-MS m. trans-1,2-dce, 1,1-DCE, VC) inkl. ethen og ethan a headspace sampler Redoxparametre: Cl -, SO 4 2-, NO 3 -, Fe, Mn, og CH 4 a Cl -, SO 2-4, NO - 3 : Ionkromatograf Fe, Mn: AAS CH 4 : GC-FID PCE, TCE, DCE, VC: 2μg/L, Ethen: 3 μg/l, Ethan: 10 μg/l Cl -, SO 2-4, NO - 3 : 0,1 mg/l Fe og Mn: 0,01 mg/l CH 4 : 0,04 mg/l Feltmålinger: ph, Eh, temperatur, ilt a Flowcelle m. elektroder O 2 : 0,2 mg/l c NVOC a TOC Analyzer 0,5 mg C/L Flygtige organiske syrer: acetat, propionat, format a Modificeret HPLC 0,5 mmol/l (Quantitative Gene-Trac) b Vinylchloridreduktase (Gene-Trac-VC) b DNA-sekvensering (Gene-Trac-Sequence) b App celler/l App genkopier/l a : Prøver analyseret på Institut for Miljø & Ressourcer, DTU b : Prøver analyseret af SIREM (mere information findes på c : Detektionsgrænsen for O 2 afhænger af flowhastighed, slangetype og længde mm. d : Afhængig af oppumpet vandmængde 6

9 3. RESULTATER 3.1 Udbredelsen af på danske lokaliteter I tabel 2 er vist en oversigt over resultaterne fra de forskellige boringer (se også Bilag 5). På figur 1 er vist antallet af Dhc samt antallet af Vcr-genkopier i de udtagne vandprøver fra de forskellige boringer. Data er først sorteret efter antallet af Dhc, derefter efter antallet af Vcrgenkopier. Der er fundet Dhc på 7 ud af de 11 forurenede lokaliteter. Der blev ikke fundet Dhc i vandprøverne fra de to uforurenede grundvandsovervågningsboringer (GL40 og FA41). Ses samlet på alle boringerne, blev der fundet Dhc i 37% af vandprøverne. Generelt er fundet relativt lave koncentrationer af Dhc (<10 5 ) med undtagelse af fem boringer, hvor der måles koncentrationer på mellem 1, , celler/l. Antallet af Dhc i alle prøver udgør kun en meget lille andel af det samlede antal af bakterier (<0,1%). De fundne Dhc har ikke alle generne til at udtrykke Vcr, idet der kun i 64% af prøverne med Dhc blev fundet Vcr-gener. Der ses ikke umiddelbart nogen sammenhæng mellem antallet af Dhc og antallet af Vcr-genkopier. Resultaterne viser dog, at ikke alle de tilstedeværende Dhc har Vcr-generne, idet antallet af Vcr-genkopier i de fleste prøver er lavere end antallet af Dhc. De to prøver, hvori det højeste antal Dhc findes, ses ikke at indeholde nogen Vcr-gener. I nogle af prøverne med et relativt lavt indhold af Dhc ses, at antallet af Vcr-genkopier er højere end antallet af Dhc-genkopier, hvilket skyldes usikkerhed på analyserne samt forskellige detektionsgrænser for hhv. antallet af Dhc og antallet af Vcr-gener. Ifølge SiREM er det mest sandsynligt, at hver enkelt bakterie kun indeholder et Vcr-gen, således angiver antallet af Vcr-genkopier også antallet af Dhc, der kan nedbryde VC til ethen ved deklorering. Sekvensering af 16S rrna viste, at alle de fundne Dhc (med undtagelse af Dhc i prøve VA-32) er 100% identiske med kendte Dhc 16S rrna sekvenser fra en undergruppe af Dhc kendt som Pinellas gruppe /7/. Bakteriekulturen Pinellas er en blandet bakteriekultur oprindeligt hentet fra en industrigrund forurenet med chlorerede opløsningsmidler i USA (Department of Energy s Pinellas Site, Largo, Florida, US). Bakteriekulturen Pinellas indeholder flere typer af Dhc og er i stand til at dechlorere TCE til ethen /8,9/. Det er dog ikke alle typer af Dhc, der phylogenetisk tilhører Pinellas undergruppe, som kan dechlorere PCE/TCE over cis-dce og VC til ethen Et sådan eksempel er Dhc sp. CBDB1, der ikke kan dechlorere PCE og TCE, men i stedet anvender flere forskellige chlorerede benzener (1,2,3-trichlorbenzen, 1,2,4- trichlorbenzen, 1,2,3,4-tetrahlorbenzen m.fl.) som elektronacceptor ved halorespiration /10/. Resultaterne af 16S rrna sekvenseringen viser, at der på lokaliteterne findes Dhc af typerne: sp. clone S3 (DQ223077), sp. CBDB1 (AF230641, AJ965256), sp. KB-1/PCE (AY146780), sp. KB-1/VC (AY146779), sp. clone DHC-kafb (AF388537) og sp. BAV1 (AY165308) (se Bilag 6). Dhc af typen CBDB1 (AF230641) synes at være meget udbredt og er fundet på alle lokaliteter med Dhc. Derimod er der kun fundet bakterier af typen sp. KB-1/VC på to lokaliteter Regnvandsbassinet og Søborg. Dette er interessant, da disse bakterier er i stand til at nedbryde vinylchlorid til ethen, og det også er på disse to lokaliteter, hvor der ses den højeste dechloreringsgrad samt et højt antal af Vcr-gener. I vandprøven fra Vadsbyvej (VA-32) ses en anderledes sammensætning af 7

10 Dhc fx. ses Dhc af typen sp. BAV1, hvilket stemmer fint overens med den høje dechloreringsgrad samt det høje antal Vcr-gener, idet det vides, at sp. BAV1 kan dechlorere både cis-dce og VC til ethen under energiudnyttelse /11/. Der ses ikke umiddelbart nogen sammenhæng mellem typen af reservoir bjergart og udbredelsen af Dhc. Antallet af lokaliteter er dog meget begrænset for de enkelte reservoir bjergarter, så andre forhold kan også overskygge effekten af reservoirbjergarten. Der er ikke fundet Dhc i de boringer, der står i primære grundvandsmagasiner (se tabel 2, kolonne 3; Reservoir bjergart), som umiddelbart er dybere beliggende og i mange tilfælde vil være bedre beskyttet. Figur 1. Antallet af (Dhc) samt antallet af Vcr-genkopier i de udtagne vandprøver. Data er først sorteret efter antallet af Dhc, derefter efter antallet af Vcrgenkopier. 8

11 Tabel 2. Oversigt over lokaliteter, boringer samt udvalgte resultater Lokalitet Prøve nr. Reservoir bjergart a Akaciavej Baldersbækvej Herlev Hovedgade Naverland Herstedøstergade Regnvandsbassinet, Glosrup Ruskær Søborg Hovedgade Tornerosevej Redox DCP c DCG d forhold b (%) AK-1 K P A DCE 9 - AK-2 K P A DCE 0 - Dhc e Vcr f Andel Dhc ud af det totale antal bakterier (%) BA-3 S J/S DCE BA-4 S J/S DCE ,002-0,01 BA-5 S J/S DCE ,001-0,003 HE-6 K P A DCE 47 - HE-8 K P A DCE 45 - HE-9 ML N VC ,0005-0,001 HH-10 S P S VC 49 - HH-11 S P S VC 54 - HH-12 S P S VC 53 - NA-13 S+K P S/M VC 38 - NA-14 K P A/N DCE 19 - NA-15 K P N DCE 15 - NA-16 K P N DCE 10 - NA-17 K P A/N VC 13 - RE-18 Si+ML S/M VC ,001-0,004 RE-19 G+ML S/M E ,001-0,003 RE-20 G S/M VC 53 - RE-21 MS S/M E ,03-0,1 RE-22 MS S/M E ,01-0,02 RU-23 K P S RU-24 K P S RU-25 K P A/N DCE 1 - RU-26 K P A DCE 1 - SØ-7 S S/M VC ,0001-0,0003 SØ-27 S S/M E ,3-0,9 SØ-28 S S/M E ,02-0,05 TO-29 ML J/S DCE 41 - TO-30 MS J DCE ,02-0,1 Vadsbyvej VA-32 S M E ,3-0,8 Østerparken ØS-34 K P J/S DCE 38 - ØS-35 S+K P J/S DCE 32 - ØS-36 S J/S VC ØS-38? J/S VC ,003-0,009 ØS-39 MS S/M E ,06-0,2 Gladsaxe v. GL-40 S P A Farum Sø Øst FA-41 K P J/S a S: sand, K: kalk, ML: moræneler, MS: morænesand, G: gytje, Si: silt, P : primære magasin b A: aerob, N: nitratreducerende, J: jernreducerende; S: sulfatreducerende, M: methanogene forhold c Observerede dechloreringsprodukt (DCP) d Dechloreringsgrad (DCG) beregnet på baggrund af molære koncentrationer e Antal af (genkopier/l); +: <10 4, ++: , +++: >10 7 f Antal af Vcr-genkopier (genkopier/l); +: <10 4, ++: , +++: >10 7 9

12 3.2 Sammenhæng mellem tilstedeværelse af nedbrydningsprodukter og på forurenede lokaliteter Med undtagelse af to boringer er der fundet forurening med chlorerede ethener i samtlige boringer i koncentrationer fra 1 op til 3,5 mmol/l (summen af chlorerede ethener inkl. ethen og ethan). Forureningssammensætningen i de forskellige boringer er meget varierende fra boringer, hvor forureningen er domineret af PCE, til boringer, hvor der er sket kraftig dechlorering, således at forureningssammensætningen primært domineres af ethen (se figur 2). For at undersøge sammenhængen mellem graden af dechlorering og tilstedeværelsen af Dhc er lavet forskellige grafiske plot, hvor molfraktionen af de forskellige komponenter er optegnet mod antallet af Dhc samt antallet af Vcr-genkopier. Figur 2. Forureningssammensætning i de forskellige boringer beregnet på baggrund af molære koncentrationer. Data er først sorteret efter andelen af ethen, derefter andelen af PCE. På figur 3 er vist molfraktionen af vinylchlorid og ethen samt antallet af Dhc og Vcr-gener for de forskellige boringer. Data er sorteret efter molfraktionen af ethen dernæst VC og Dhc. Resultaterne viser, at der i alle prøver med ethen ses både Dhc og Vcr. Omvendt ses enkelte prøver at indeholde både Dhc og Vcr, uden at der dog ses dechlorering af cis-dce til VC eller af VC til ethen, hvilket kan skyldes, at Dhc og Vcr kun findes i meget lave koncentrationer i disse prøver. Kun i to prøver (boring HE-9 samt boring ØS-39) ses høje koncentrationer af Dhc (1, , celler/l) og VC med samtidig fravær af dechlorering til ethen, hvilket sandsynligvis skyldes, at disse Dhc ikke kan dechlorere VC, da der ikke er fundet Vcr i disse to prøver. Det ses endvidere, at flere prøver indeholder VC i væsentlige koncentrationer ( μg/l) uden dog at indeholde Dhc/Vcr, hvilket antyder, at andre bakterier end Dhc kan dechlorere cis-dce til VC. På figur 4 er dechloreringsgraden og antallet af Dhc og Vcr-gener for de forskellige boringer. Dechloreringsgraden udtrykker, hvor langt dechloreringen er forløbet og beregnes som andelen af chloratomer, der er fjernet ved dechlorering i forhold til det samlede antal chloratomer, der maksimalt kan fjernes ved dechlorering, hvis alle chlorerede komponenter dechloreredes fuldstændigt til ethen/ethan. Nedenstående formel angiver, hvorledes dechloreringsgraden beregnes. Antages dechloreringen at forløbe udelukket via trinvis dechlorering af PCE over TCE, cis-dce, VC til ethen og ethan vil en dechloreringsgrad på 10

13 over 25% teoretisk angive at PCE er omdannet til TCE, mens en dechloreringsgrad på over 75% vil angive at PCE er dechloreret forbi VC til ethen/ethan. DCG = [ TCE] + 2[ DCE] + 3[ VC] + 4[ ethen] + 4[ ethan] 4( [ PCE] + [ TCE] + [ DCE] + [ VC] + [ ethen] + [ ethan] ) 100 For alle prøverne gælder at dechloreringsgraden er relativ lav (13-54%), hvilket antyder, at dechloreringen af cis-dce til VC er lille (se figur 4). Det er muligt, at dechlorering af cis- DCE til VC i meget lille omfang kan tilskrives tilstedeværelse af Dhc i antal under detektionsgrænsen. Der er ikke fundet nogen sammenhæng mellem tilstedeværelsen af Dhc/Vcr og cis-dce, TCE og PCE, hvilket er forventeligt, da mange andre anaerobe bakterier ud over de halorespirerende bakterier kan dechlorere PCE og TCE til cis-dce, så som methanogene og acetogene bakterier /12/. Der ses heller ikke nogen sammenhæng mellem koncentrationsniveauet af forureningen (summen af chlorerede ethener samt ethen og ethan) og tilstedeværelsen af Dhc/Vcr (se Bilag 7). Undersøgelsen viser, at forekomsten af Dhc alene ikke er ensbetydende med, at anaerob dechlorering til ethen vil finde sted. Dette skyldes bl.a. at ikke alle typer af Dhc kan dechlorere VC til ethen. Tilstedeværelse af Vcr vil derimod være en god parameter til vurdering af potentialet for fuldstændig dechlorering til ethen. Er både Dhc og Vcr til stede, kan manglende dechlorering til ethen skyldes et lavt bakterieantal som følge af ikke optimale vækstforhold. Undersøgelsen viser også, at på trods af, at Dhc synes at være udbredte på danske lokaliteter, er antallet af Dhc og Vcr generelt relative lave ( genkopier/l), hvilket indikerer, at forholdene på lokaliteterne ikke er optimale for dechlorering. Kun på to lokaliteter (SØ-27 og VA-32) ses et højere antal af Dhc (3, , ) og Vcr (5, , ), hvilket også stemmer overens med, at der på disse to lokaliteter ses den højeste dechloreringsgrad (>80%) med en ethendannelse på mere end 35% (se figur 3 og 4). Generelt skal antallet af Dhc være over 10 7 celler/l, før man med rimelig sikkerhed kan forvente at se fuldstændig dechlorering til ethen. Undersøgelsen tyder til gengæld på, at manglende tilstedeværelse af Dhc er ensbetydende med, at anaerob dechlorering fra VC til ethen ikke finder sted. Tilstedeværelsen af Dhc, der har Vcr-gener, er derfor afgørende for, om der kan opnås fuldstændig dechlorering til ethen ved stimulering ved tilsætning af elektrondonor. Undersøgelsen viser, at Dhc er forholdsvis udbredt på danske lokaliteter forurenet med chlorerede stoffer, hvorimod der ikke er fundet Dhc (i kvantificerbare antal) i boringer, hvori der aldrig er detekteret chlorerede stoffer. Dhc s evulotionære oprindelse er stadig uafklaret,og man undres fortsat over, hvorledes disse bakterier, der lever på menneskeskabte miljøfremmede stoffer, der er spredt i miljøet igennem de sidste 50 år, er opstået. Nye undersøgelser af Dhc s genom antyder, at Dhc er en nyere bakterie, der har udviklet sig indenfor de sidste 50 år i takt med, at chlorerede stoffer er sivet ned i jorden. Antageligt var Dhc s forfader en nitrogen-fikserende autotrof bakterie, der, via mutation og udveksling af genetiske materiale med andre bakterier, har udviklet den særegne evne til at vokse på chlorerede stoffer og hydrogen /13/. På steder, hvor der findes chlorerede stoffer, vil bakterier, der kan anvende disse stoffer til vækst have en selektiv fordel frem for andre bakterier, og altså kunne opformeres i større antal. Hvorvidt chlorerede stoffer, der kan 11

14 anvendes af Dhc, findes naturligt i miljøet diskuteres også, men indtil videre tyder det dog på, at Dhc kun ses i tilknytning til lokaliteter forurenet med chlorerede opløsningsmidler. Figur 3. Molfraktionen af ethen og VC samt antallet af Dhc og Vcr-genkopier i de udtagne vandprøver. Data er først sorteret efter antallet af Dhc, derefter efter antallet af Vcrgenkopier. Figur 4. Dechloreringsgraden (DCG) samt antallet af Dhc og Vcr-genkopier i de udtagne vandprøver. Data er først sorteret efter dechloreringsgrad, derefter antallet af Dhc og antallet af Vcr-genkopier. 12

15 3.3 Sammenhæng mellem redoxforhold og på forurenede lokaliteter For at undersøge sammenhængen mellem redoxforhold og udbredelsen af Dhc er udarbejdet en række grafiske plot med de forskellige redoxparametre samt antallet af Dhc og Vcr. Figur 5 viser koncentrationen af ilt- og methan i de forskellige boringer sammen med antallet at Dhc og Vcr. Der ses en tydelig sammenhæng mellem ilt og tilstedeværelsen af Dhc, idet Dhc primært optræder i boringer, hvor der er anaerobe forhold, og oftest ses det største antal i boringer med methanogene forhold. Generelt gælder også, at der ikke ses Dhc i boringer, hvor nitrat er til stede. Der er dog ikke fundet nogen sammenhæng mellem antallet af Dhc og jern- eller sulfatkoncentrationen. Det kan blot konstateres, at der i flere boringer med jern- eller sulfatreducerende forhold findes Dhc. Dhc, der indeholder generne for Vcr, ses derimod kun i boringer, hvor der er stærkt reducerede forhold med methandannelse. Dette stemmer ligeledes godt overens med, at ethen kun ses i boringer med methanogene forhold, mens VC også ses i boringer med jern- og sulfatreducerende forhold (se tabel 2). Der ses en sammenhæng mellem koncentrationen af organisk stof målt som NVOC og redoxforhold samt tilstedeværelse af Dhc, idet de højeste NVOC-koncentrationer ses i boringer med stærkt reducerede forhold med methandannelse, hvor der også ses Dhc (se Bilag 8) Figur 5. Koncentrationen af ilt og methan samt antallet af Dhc og Vcr-genkopier i de udtagne vandprøver. Data er først sorteret efter koncentrationen af ilt, og derefter efter koncentrationen af methan. De halorespirerende bakterier må konkurrere om hydrogen med mange andre bakterier som denitrificerende bakterier, jern- og sulfatreducerende samt methanogene bakterier. Ud fra energimæssige betragtninger kan dechlorering placeres mellem jern(iii)- og nitratreduktion baseret på konkurrencen for hydrogen /14,15/. Laboratorieforsøg med sediment og grundvand fra danske lokaliteter viser, at anaerob dechlorering af PCE/TCE forløber under jern- og sulfatreducerende forhold, mens anaerob dechlorering af cis-dce og VC først ses efter endt sulfatreduktion og begyndende methandannelse (se figur 6) /16,17,18/. 13

16 De udførte undersøgelser passer godt med både de teoretiske energimæssige betragtninger samt iagttagelser gjort i laboratorieforsøg, idet Dhc med enkelte undtagelser kun ses i boringer, hvor der er jern-/sulfatreducerende til methanogene forhold. Ligeledes ses signifikant dechlorering (dvs. en dechloreringsgrad over 50%) kun i boringer med methanogene forhold (se tabel 2). Figur 6. Nedbrydning af TCE samt udvikling i redoxforhold i laboratorieforsøg med sediment og grundvand fra Rugårdsvej, Odense. Nogle af laboratorieforsøgene er tilsat elektrondonor i form af laktat (5K), mens der til andre forsøg er tilsat både elektrondonor men også bakteriekultur (KB-1) indeholdende Dhc (7K). Bakteriekultur er tilsat efter 57 dage /18/. 14

17 4. KONKLUSIONER På baggrund af de fundne resultater kan det konkluderes, at der på flere danske lokaliteter forurenet med chlorerede opløsningsmidler findes Dhc, men at ikke alle typer af de tilstedeværende Dhc besidder generne til at udtrykke vinylchloridreduktase og dermed evnen til at dechlorere vinylchlorid til ethen. Desuden synes antallet af Dhc generelt at være lavt ( celler/l) og kun at udgøre en meget lille andel af de tilstedeværende bakterier (<0,1%). Undersøgelsen viser, at forekomsten af Dhc alene ikke er ensbetydende med, at anaerob dechlorering til ethen vil finde sted, hvilket bl.a. skyldes, at ikke alle typer af Dhc kan dechlorere VC til ethen. Manglende ethendannelse kan desuden skyldes, at Dhc kun er til stede i lave antal. Undersøgelsen tyder således på, at koncentrationen af Dhc, der har Vcrgener, skal være over Dhc/L før der ses signifikant dechlorering til ethen. De udførte undersøgelser tyder på, at tilstedeværelsen af Dhc er betinget af, at der på lokaliteten er jern-/sulfatreducerende eller methanogene forhold. Signifikant dechlorering af cis-dce og VC til ethen (dvs. en dechloreringsgrad over 50%) ses kun i boringer med methanogene forhold. Undersøgelsen viser således, at den anaerobe dechlorering fra PCE/TCE til cis-dce kun kan ses som første del af processen, og at forekomsten af cis- DCE og VC i sig selv ikke beviser, at der kan ske fuldstændig dechlorering til ethen på en lokalitet. Undersøgelsen har ikke vist nogen sammenhæng mellem geologi og udbredelsen af Dhc. I dybere og mere velbeskyttede primære magasiner er der ikke fundet Dhc. 5. ANBEFALINGER Undersøgelser Til vurdering af anvendelse af SRD som afværge på lokaliteter forurenet med PCE og TCE anbefales det, at der ud over bestemmelse af antal Dhc udføres en analyse af, hvorvidt de tilstedeværende Dhc besidder Vcr og dermed kan dechlorere VC til ethen. På baggrund af nærværende undersøgelse anbefaler SIREM fremover, at der udtages vandprøver i forbindelse med kvantitativ bestemmelse af Dhc og Vcr. Filtrering af vandprøver og efterfølgende analyse af det partikulære filtrerede materiale giver anledning til matrixproblemer i forbindelse med analyse, hvorved den kvantitative bestemmelse af Dhc og Vcr formentlig underestimeres. Det anbefales, at der som standard måles ethen og ethan, da tilstedeværelsen af ethen og ethan er gode indikatorer for om der sker fuldstændig dechlorering. For at vurdere forureningssammensætning er det vigtigt, at der regnes i molære koncentrationer, og at den molære fraktion af de forskellige komponenter beregnes, idet dette vil vise hvorvidt forureningssammensætningen er influeret af reduktiv dechlorering. Beregning af dechloreringsgraden, som gjort i denne undersøgelse, er også et godt supplement til vurdering af potentialet for reduktiv dechlorering. 15

18 Bioaugmentation I tabel 3 er listet en række anbefalinger for, hvornår tilsætning af bakterier i forbindelse med oprensning af chlorerede opløsningsmidler bør overvejes. Disse anbefalinger er baseret på sammenhæng mellem dechlorering og forekomsten af bakterier i denne undersøgelse. På lokaliteter, hvor Dhc er til stede i koncentrationer højere end celler/l, og har generne for Vcr, er det sandsynligt, at dechlorering kan stimuleres ved tilsætning af donor alene. På lokaliteter, hvor de tilstedeværende Dhc ikke har generne for Vcr, eller hvis antallet af Dhc er lavere end celler/l, anbefales det at tilsætte bakterier (bioaugmentation) sammen med donortilsætning. Det anbefales også at udføre bioaugmentation på lokaliteter, hvor der ikke måles ethen, eller kun måles ethen i lave koncentrationer eller hvor den molære fraktion af ethen kun udgør en meget lille andel af summen af de chlorerede ethener. På lokaliteter med aerobe eller nitratreducerende forhold må en længere tidsperiode forventes, før der ses dechlorering efter donortilsætning som følge af en lagfase med opformering af Dhc. På sådanne lokaliteter kan det være nødvendigt at tilsætte bakterier, efter at der er opnået reducerede forhold som følge af donortilsætning, da oprensning ellers kan tage lang tid. Det skal bemærkes, at tilsætning af bakterier ikke blot er et spørgsmål om, hvorvidt processen kan forløbe ved stimulering med donor alene, men også om hvor hurtigt efter donortilsætning nedbrydning sker. I nogle tilfælde vil det måske kunne betale sig at tilsætte bakterier for at fremskynde nedbrydningsprocessen, men det er i øjeblikket uafklaret. I takt med at der opnås flere konkrete erfaringer med SRD med og uden bioaugmentation i Danmark og udlandet, kan disse erfaringer inddrages, og nedenstående anbefalinger forbedres. Tabel 3. Oversigt over hvornår det bør overvejes at tilsætte bakterier ved anvendelse af stimuleret reduktiv dechlorering i forbindelse med oprensning af grund forurenet med chlorerede opløsningsmidler. 1 På lokaliteter, hvor der ikke ses produktion af nedbrydningsprodukter under naturlige forhold, dvs uden tilsætning af donor 2 På lokaliteter, hvor der ses akkumulering af cis-dce eller VC samtidig med at der ikke ses tegn på videre dechlorering til ethen 3 På lokaliteter, hvor der ikke ses dechlorering til ethen efter behandling af donor 4 På lokaliteter, hvor der ikke ses at være Dhc til stede 5 På lokaliteter, hvor Dhc kun er til stede i lave antal (<10 4 celler/l) eller kun findes spredt til enkelte steder på lokaliteten 6 På lokaliteter, hvor de tilstedeværende Dhc ikke har generne for dechlorering af VC (Vcr) 7 På lokaliteter, hvor der er aerobe eller nitratreducerende forhold og Dhc grundet disse ugunstige redoxforhold må forventes fraværende 8 På lokaliteter, hvor der kræves en hurtig oprensning 16

19 6. REFERENCER /1/. Jørgensen, T.H., Scheutz, C., Durant, N.D., Cox, E., Bordum, N.E., og Bjerg, P.L., Stimuleret in situ reduktiv deklorering. Vidensopsamling og screening af lokaliteter. Miljøstyrelsen. Miljøprojekt nr /2/. Maymó-Gatell, X., Chien, Y.-T., Gossett, J.M., Zinder, S.H Isolation of a bacterium that reductively dechlorinates tetrachloroethene to ethene. Science. 276: /3/. Cuppels, A.M., Spormann, A.M., McCarty, P.L Growth of a -like microorganism on vinyl chloride and cis-dichloroethene as electron accceptors as determined by competitive PCR. Appl. Environ. Microbiol. 69: /4/. He, J., Ritalahti, K.M., Aiello, M.R., Löffler, F.E Complete detoxification of vinyl chloride by an anaerobic enrichment culture and identification of the reductively dechlorination population as a species. Appl. Environ. Microbiol. 69: /5/. Cuppels, A.M., Spormann, A.M., McCarty, P.L Comparative evaluation of chloroethene dechlorination to ethene by -like microorganisms. Environ. Sci. Technol. 38: /6/. Müller, J.A., Rosner, B.M., Abendroth, v.g., Meshulam-Simon, G., McCarty, P.L., Spormann, A.M. Molecular Identification of the catabolic vinly chloride reductase from sp. Strain VS and its environmental distribution. Appl. Environ. Microbiol. 70: /7/. Hendrickson, E.R., Payne, J.A., Young, R.M., Starr, M.G., Perry, M.P., Fahnestock, S., Ellis, D.E., and Ebersole, R.C Molecular analysis of 16S ribosomal DNA from chloroethene-contaminated sites throughout North America and Europe. Appl. Environ. Microbiol. 68: /8/. Harkness, M.R., Bracco, A.A., Brennan, M.J., DeWeerd, Jr.K.A., Spivack, J.L Use of bioaugmentation to stimulate complete reductive dechlorination of trichloroethene in Dover soil columns. Environ. Sci. Technol. 33: /. Ellis, D.E., Lutz, E.J., Odom, J.M., Buchanan, R.J., Lee, Jr.M.D., Bartlett, C.L., Harkness, M.R., DeWeerd, Jr.K.A., Bioaugmentation for accelerated in situ anaerobic bioremediation. Environ. Sci. Technol. 34: /10/. Adrian, L., Szewzyk, U., Wecke, J, Görisch, H Bacterial dehalorespiration with chlorinated benzenes. Nature. 408: /11/. He, J., Ritalahti, K.M., Yang, K.-L., Koenigsberg, S.S., Löffler, F.E Detoxification of vinyl chloride to ethene coupled to growth by an anaerobic bacteria. Nature. 424: /12/. Middeldorp, P.J.M., Luijten, M.L.G.C., Bram, A.v.d.P., van Eekert, M.H.A., Kengen, S. W.M., Schraa, G., Stams, A.J.M Anaerobic microbial reductive dechlorination of chlorinated ethenes. Bioremediation Journal. 3: /13/. Seshadri, R., Adrian, L., Fouts, D.E., Eisen, J.A., et al Genome Sequence of the PCEdechlorinating bacterium ethenogenes. Science. 307: /14/. Löffler, F.E., Tiedje, J.M., Sanford, R.A Fraction of electrons consumed in electron acceptor reduction and hydrogen thresholds as indicators of halorespiratory physiology. Appl. Environ. Microbiol. 65: /15/. Yager, R.M., Bilotta, S.E., Mann, C.L., Madsen, E.L Metabolic adaptation and in situ attenuation of chlorinated ethenes by naturally occurring microorganisms in a fractured dolomite aquifer near Niagara Falls, New York. Environ. Sci. Technol. 31: /16/. Undersøgelser til vurdering af stimuleret in-situ reduktiv deklorering og kemisk oxidation ved oprensning af grundvandsforurening. Sortebrovej, Tommerup. Fyns Amt. November /17/. Undersøgelser til vurdering af stimuleret in-situ reduktiv deklorering ved oprensning af grundvandsforurening. Middelfartvej, Odense. Fyns Amt. August /18/. Jørgensen, T.H., Scheutz, C., Durant, N.D., Cox, E., Jacobsen, R., og Bjerg, P.L Teknologiprojekt vedr. belysning af stimuleret in-situ reduktiv deklorering som afværgemetode. Fase 2. Arbejdsrapport. Miljøstyrelsen. 17

20 BILAGSOVERSIGT BILAG 1. Oversigt over lokaliteter BILAG 2. Prøvetagning, analysemetoder og apparater BILAG 3. Vejledning til prøvetagning og analyse for BILAG 4. Sammenligning af udtagning af vandprøve versus filterprøve i forbindelse med analyse af Dhc og Vcr BILAG 5. Samlede oversigt over resultater BILAG 6. Oversigt over resultater fra SiREM BILAG 7. Sammenhæng mellem koncentrationsniveau og tilstedeværelse af Dhc og Vcr BILAG 8. Sammenhæng mellem NVOC og tilstedeværelse af Dhc og Vcr

21 BILAG 1. OVERSIGT OVER LOKALITETER

22 Bilag 1. Oversigt over lokaliteter Prøve nr. Lokalitet Filter Filtersætning Pejlet bund GVS Magasin Reservoir bjergart Andet forurening Andre bemærkninger (m.u.t) (m.u.t) (m.u.f) AK-1 Akaciavej B22 10,0-14,0 14,0 9,95 Primær Kalk Pumpe sat lige i starten af filter grundet g.v.s Totalkulbrinter AK-2 B6 10,7-12,7 12,7 10,01 Primær Kalk BA-3 Baldersbækvej B15 3,75-5,75 5,5 1,25 Sekundær Sand Totalkulbrinter, BTEX, 1,1,1- BA-4 B11 4,0-6,1 5,8 1,90 Sekundær Sand trichlorethan Røde udfældninger på installeret slange BA-5 B6 4,0-6,0 6,0 1,04 Sekundær Sand Sorte udfældninger på installeret slange HE-6 Herstedøstergade B1 9,0-11,0 10,8 9,84 Primær Kalk G.v.s står lavere end filteret HE-8 B3,1 10,0-14,7 14,8 9,92 Primær Kalk (TCA, ukendt kulbrinte) HE-9 B77 0,8-4,8 4,8 2,51 Sekundær Moræneler HH-10 Herlev Hovedgade KB5 20,0-29,0 29,0 7,55 Primær Sand HH-11 KB3 20,5-29,5 29,4 7,48 Primær Sand Totalkulbrinter, TCM HH-12 KB1 20,0-29,0 29,0 4,15 Primær Sand NA-13 Naverland K8N 6,5-7,5 7,2 6,30 Primær Sand og kalk NA-14 K4N 8,0-15,0 14,3 7,58 Primær Kalk TCA, (benzen), NA-15 K11N Åben hul 7,65 Primær Kalk (totalkulbrinter) NA-16 K3N 9,0-10,0 9,9 7,88 Primær Kalk NA-17 K1N 7,0-8,5 8,4 7,61 Primær Kalk RE-18 Regnvandsbassinet B60 3,8-4,8 4,8 2,00 Sekundær Silt og moræneler Butanol, DEHP, RE-19 B52 4,5-5,5 2,55 Sekundær Gytje og moræneler acetone, 1-butanol, RE-20 G12 1,5-2,5 2,7 1,60 Gytje toluen, isopropanat, Meget lavtydende RE-21 B56 4,8-6,8 Sekundær Morænesand totalkulbrinter, 1-propanol, RE-22 B55 4,25-6,25 6,0 1,86 Sekundær Morænesand methylisobutylketon, mm. RU-23 Ruskær B5 nedre 16,0-18,0 18,0 7,29 Primær Kalk RU-24 B5 mellem 12,0-14,0 13,8 7,31 Primær Kalk RU-25 B6 7,0-10,0 10,0 6,94 Primær Kalk Nej (**) RU-26 B7 7,0-9,0 9,8 7,27 Primær Kalk Der blev pumpet 30cm fra bunden af filteret grunder g.v.s SØ-7 Søborg Hovedgade C11 7,0-13,0 13,0 10,45 Sekundær Sand G.v.s står lavere end filteret SØ-27 C14 6,0-13,0 12,4 10,10 Sekundær Sand BTEX, totalkulbrinter G.v.s står lavere end filteret SØ-28 AVF6 5,5-13,5 Sekundær Sand TO-29 Tornerosevej B6 øvre 7,5-9,5 9,8 2,14 Sekundær Moræneler TO-30 B5 øvre 8,8-10,8 10,8 4,69 Sekundær Morænesand Nej (*) VA-32 Vadsbyvej B106 14,0-17,0 16,9 6,90 Sekundær Sand Nej ØS-34 Østerparken B28 nedre 18,0-20,0 19,5 5,88 Primær Kalk ØS-35 B18 9,0-14,0 14,0 5,88 Primær Sand og kalk ØS-36 B11 6,0-9,0 7,0 5,85 Nedre sekundær Sand Totalkulbrinter, (toluen) ØS-38 B102 8,0 5,88 Nedre sekundær ØS-39 B3 1,0-3,0 2,9 1,57 Øvre sekundær Morænesand G.v.s står lavere end filteret GL-40 Gladsaxe, ved stadion ,5-22,5 19,19 Sand Nej FA-41 Farum Sø Øst ,5-77,0 4,12 Kalk Nej (*) der er formendtlig kun tale om en PCE foruening, men der er ikke analyseret for andre forureningskomponenter. (**) Der er i en geopropeboring (GP6) målt 34 mg/kg TS totalkulbrinter, hvilket er under kvalitetskriteriet

23 BILAG 2. PRØVETAGNING, ANALYSEMETODER OG APPARATER 1. Udtagning af vandprøver til analyse Alle de undersøgte filtre/boringer blev prøvetaget mellem mandag d. 15.august 2005 og mandag d. 22.august I filtre, hvor der på forhånd var installeret pumper, blev disse samt de installerede slanger benyttet. I de resterende blev enten en peristaltisk pumpe, en Whalepumpe eller en MP-1 pumpe benyttet. På disse var der påsat hårde nylonslanger. Inden prøvetagning blev grundvandsspejlet i boringerne pejlet. Ved renpumpning af boringen blev pumpen placeret lige under grundvandsspejlet. Der blev renpumpet først halvanden gang volumet af den mængde vand, der stod i filteret, filterrrør og gruskastning. Derefter blev der renpumpet indtil ph, ilt og ledningsevne var stabile. Ved prøvetagning blev pumpen flyttet og placeret lige over filteret. I nogle få boringer stod grundvandsspejlet lavere end filteret, og i disse tilfælde blev pumpen placeret i bunden af filteret. 2. Analyseparametre Der er i moniteringsperioden analyseret for følgende parametre: chlorerede ethener samt nedbrydningsprodukter; redoxparametre; ph; ledningsevne; bromid; chlorid; NVOC; kortkædede fede syrer. Derudover har SiREM udført kvantitative analyser for tilstedeværelsen af. For de prøver, hvor kunne kvantificeres over detektionsgrænsen, blev der yderlig lavet analyser for tilstedeværelsen af genet for vinylchlorid-reduktase samt en sekvensering af DNA et for. I tabel 1 ses en oversigt over de enkelte analyser, der er blevet udført, samt analysemetode og detektionsgrænser. I det følgende afsnit er de enkelte analysemetoder er nærmere beskrevet. Tabel 1. Udførte analyser, anvendt analysemetode samt detektionsgrænser. Analyseparameter Anvendt analysemetode Kvantitative detektionsgrænser Chlorerede opløsningsmidler (PCE, TCE, cis-1,2-dce, trans-1,2-dce, 1,1-DCE, VC) inkl. ethen og ethan a Gaskromatograf-MS m. headspace sampler Redoxparametre: Cl -, SO 4 2-, NO 3 -, Fe, Mn, og CH 4 a Cl -, SO 2-4, NO - 3 : Ionkromatograf Fe, Mn: AAS CH 4 : GC-FID PCE, TCE, DCE, VC: 2μg/L Ethen: 3μg /L, Ethan: 10μg /L Cl -, SO 2-4, NO - 3 : 0,1 mg/l Fe og Mn: 0,01 mg/l CH 4 : 0,04 mg/l Feltmålinger: ph, Eh, temperatur, ilt a Flowcelle m. elektroder O 2 : 0,2 mg/l c NVOC a TOC Analyzer 0,5 mg C/L Flygtige organiske syrer: acetat, propionat, format a Modificeret HPLC 0,5 mmol/l (Quantitative Gene-Trac) b Vinylchloridreduktase (Gene-Trac-VC) b DNA-sekvensering (Gene-Trac-Sequence) b App celler/l App genkopier/l a : Prøver analyseret på Institut for Miljø & Ressourcer DTU b : Prøver analyseret af SiREM (mere information findes på c : Detektionsgrænsen for O 2 afhænger af flowhastighed, slangetype og længde mm. d : Afhængig af oppumpet vandmængde

24 3. Beskrivelse af udførte analyser ph, ilt og ledningsevne i felt Til måling af ph, ilt og ledningsevne i felten blev følgende apparater fra WTW benyttet: ph 330/SET-1, OX 330/SET og LF 330/SET. Alle elektroderne blev placeret i en dertil hørende flowcelle, så der under målingen var et kontinuert vandflow forbi elektroderne uden udveksling med luften. Chlorerede stoffer samt nedbrydningsprodukter på GC/MS Chlorerede ethener samt deres nedbrydningsprodukter ethen og ethan blev analyseret ved at injicere henholdsvis 1 ml og 0,2 ml vandprøve i forseglede vials indeholdende intern standard i form af ca. 1 mg/l chloroform (Riedel-deHaën, Tyskland) samt salpetersyre som konserveringsmiddel. For at separere de chlorerede stoffer fra vandprøven blev alle vials opvarmet til 80ºC og gassen i headspace blev analyseret ved brug af gas chromatograf (GC, Agilent 6890N) udstyret med en massespektrometer (MS, Agilent 5973). Adskillelsen af de chlorerede komponenter blev udført med en 25m x 320µm x 1µm kapillar kolonne (J&W GSQ) ved brug ad helium som bærer gas. Systemet var påmonteret en Headspace Sampler TurboMatrix 40 fra PerkinElmer. Temperaturprogram og tryk: I headspacesampleren havde ovnen en temperatur på 80ºC, mens temperaturen i nål og transfer var 85ºC. Trykket blev holdt konstant på omkring 12psi. Den samlede cyklus i autosampler varede 20min., hvoraf pressurising-time var 1 minut og injektionstiden 0,3 minutter. I GC en startede temperaturen på 45ºC, hvorefter den steg med 35ºC per minut indtil 250ºC, som efterfølgende blev holdt i 1,6min. I MS en var temperaturen ved ionkilden 230ºC, mens temperaturen i quadropolerne blev holdt på 150ºC. Opholdstider og søgte ioner i MS en: De enkelte stoffer blev identificeret i MS en på baggrund af deres specifikke target og qualifier ioner samt deres opholdstid i GC en. I tabel 2 ses en oversigt over disse karakteristika. Target ionen er den ion, der normalt optræder i størst mængde, og derfor giver gode indikationer på, at et givent stof er til stede. Den samtidige tilstedeværelse af en qualifier ion kvalificerer denne observation. Tabel 2: Karakteristiske ioner og opholdstider for de relevante chlorerede ethener og nedbrydningsprodukter, der måles for ved brug af GC/MS. Komponent Opholdstid Target ion Qualifier ion PCE 8, TCE 7, cis-1,2-dce 6, trans-1,2-dce 6, ,1-DCE 5, VC 4, Ethen 1, Ethan 2, Chloroform 6,

25 Standarder: Der blev udarbejdet to standardkurver henholdsvis til 1 ml og 0,2 ml prøver. Standardkurven til 1mL prøve bestod af 5 standarder i koncentrationsintervallet 0,1-11 mg/l, hvilket er indenfor det lineære område. Til analyse af 0,2 ml prøverne blev benyttet 8 standarder i koncentrationsintervallet 0,2-32 mg/l. Grundet de høje koncentrationer blev standardkurverne ikke lineære, men i stedet kvadratiske. For at få den reelle koncentration af 0,2mL prøverne skal der tages højde for at prøverne er fortyndet 5 gange. Detektionsgrænsen for de klorerede ethener varierer mellem 1 og 2 ug/l, mens detektionsgrænsen for ethen og ethan er hhv. 3 og 10 ug/l (se tabel 1) Kemikalierne, der blev brugt til udførsel af standarder var følgende: TCE (>99,5% renhed, Merck); cis-dce (>97% renhed, Acros); 1,1-DCE (>99,5%, Fluka); trans-dce (>97%, Fluka), VC (>99,97%, Gerling, Holz & Co.). Ethen var ren gas (Mikrolab, Danmark) og Ethan (1,2%, bygas). Methan på GC Til analyse af methan blev i felten udtaget 3 ml prøve fra en ubrudt vandstråle og overført til 5 ml evakueret sterile tørglas fra Labco, der forinden var konserveret med koncentreret svovlsyre. Prøverne blev indtil kørsel opbevaret på hovedet på køl. Methananalysen blev udført på en gas chromatograf (Shimadzu GC-14A) med FID detektor ved injektion af 0,2 ml gasprøve. Kolonnen var en 1 meter pakket kolonne (3% SP1500, Carbopack B). Analysen blev kørt ved 100 C i 5 minutter. Standarderne blev fremstillet med 100% methan (Mikrolab, Denmark) på samme måde som feltprøverne. Efter tilsætning af gas blev prøverne rystet grundigt (3 min.) for at opnå ligevægt mellem gas- og vandfasen. Der blev fremstillet 5 standarder i koncentrationsintervallet 2,3-23,2 mg/l. Til opsamling af data samt videre behandling blev programmet GC Solution Analysis (version ) benyttet. Anioner (NO 3 -, Br -, Cl -, SO 4 2- ) på IC Prøverne blev i felten filtreret med 0,45µm nylon filter, hvorefter de blev frosset ned indtil analyse. Til analyse for anioner blev udtaget 0,4 ml vandprøve som blev analyseret på ion chromatograf (Dionex DX-120 IC) med Ion Pac AS 14 (4x250mm) kolonne i kombination med kolonne AG 14 (4x50mm). Desuden blev autosampleren 234 Autoinjection fra GILSON benyttet. Den benyttede eluent bestod af Na 2 CO 3 og NaHCO 3 i forholdet 3,5/1. Standarderne blev fremstillet udfra NaCl, KNO 3, KBr og Na 2 SO 4 i koncentrationer mellem 0,5 mg/l og 100 mg/l. Detektionsgrænsen for alle de målte anioner er 0,1 mg/l. Til opsamling af data samt videre behandling blev programmet GC Solution Analysis (version ) benyttet. Kortkædede fede syrer (laktat, acetat, propionat og format) på HPLC Vandprøverne blev i felten filtreret med 0,45µm nylon filter og konserveret med ca. 50µL H 3 PO 4 per ml prøve, hvorefter de blev frosset ned indtil analyse.

26 Analysen blev foretaget på en High Pressure Liquid Chromatograph (HPLC) bestående af en HPLC pumpe af typen HP 1100 series control module fra Hewlett Packard, en autosampler af typen 851-AS Intelligent Sampler fra Jasco, et CBM-102 Communications Bus Module fra Shimadzu og en Waters 432 Conductivity detector. Den benyttede eluent var heptafluorobutyric acid i en koncentration på 4 mm og suppressor opløsningen var en Tetrabutylammoniumhydroxide opløsning (40%). Ved analyse blev der benyttet 300 µl vandprøve, som blev tilsat 300 µl eluent i en koncentration på 8 mm. Til analysen blev der benyttet 6 standarder i koncentrationsinterval fra 0,05-10 mmol/l, som repræsenterede ækvivalente molære koncentrationer af laktat, format, propionat og acetat. Til opsamling af data samt videre behandling blev programmet GC Solution Analysis (version ) benyttet NVOC på TOC apparat Prøverne blev i felten filtreret med 0,45µm nylon filter, og konserveret med koncentreret saltsyre (HCl) til ph 2-3, hvorefter de blev sat på køl indtil kørsel. Analysen blev udført på apparatet TOC 5000A fra Shimadzu med en ASI-5000 autosampler. Ren oxygen blev benyttet som bærergas og tilsat burning champer med et flow på 150 ml/min. Sparge time var 6 min. Der blev til analysen udarbejdet en standardkurve i et lineære koncentrationsinterval fra 0,5-25 mg/l. Standarderne blev fremstillet udfra C 8 H 5 KO 4. Prøver udenfor dette interval blev fortyndet med milli-q vand. Opløst jern og mangan på AAS Vandprøverne blev i felten filtreret med 0,45µm nylon filter, og konserveret med koncentreret salpetersyre (HNO 3 ), hvorefter de blev sat på køl indtil analyse. Det antages derfor, at den opløste mængde jern og mangan i prøverne udgør henholdsvis jern(ii) og mangan(ii). Analyserne blev foretaget på Perkin Elmer Instruments AAnalyst 2000 Atomic Absorption Spectrometer (AAS) med flamme. Bølgelængderne var for jern 248,33nm og for mangan 279,83nm. Til analysen for jern blev der benyttet 5 standarder i koncentrationsintervallet 0,25-3 mg/l, mens der til analysen for mangan blev benyttet 6 standarder i intervallet 0,1-1,5 mg/l. Fortyndinger blev lavet med en 1% HNO 3 opløsning. Alle analyser i forhold til de tilstedeværende blev udført af SiREM. Prøverne blev udtaget ved at lade 20 liter vand (evt. mindre) løbe igennem et 0,45µm inline filter (Waterra FHT-45) ifølge SiREM s procedure for Microbial sampling using Inline filters (Se Bilag 3a). I boringer, der var meget lavt ydende blev prøverne i stedet udtaget i 1L s plastflasker ifølge SiREM s procedure: Sampling and shipping protocol for Gene-Trac testing (se Bilag 3b). Prøverne blev indtil afsendelse til SiREM opbevaret i 4 C s kølerum.