A-PDF MERGER DEMO ה דבעמ הימיכויב ה קיטניק ל ש זאטרבניא ם ירמשמ ה דבעמ ח"וד

Transkript

1 ביוכימיה מעבדה APDF MERGER DEMO קינטיקה של אינברטאז משמרים דו"ח מעבדה

2 ביוכימיה מעבדה מס' קינטיקה של אינברטאז משמרים מטרות הניסוי : א. ב. ג. הפקת האנזים. קביעת הפעילות האנזימאטית של אינברטאז בשיטת סאמנר. השפעת טמפרטורה על פעילות האנזים. חלק א הפקת האנזים ביצוע הניסוי בוצע כנדרש, ערכים נרשמו בפרק ריכוז התוצאות חלק ב קביעת הפעילות האנזימאטית של אינברטאז בשיטת סאמנר טבלה מס. : עקומת כיול לסוכר מחזר בשיטת סאמנר. מיהול תמיסה מרוכזת O.D של תמיסה לאחר מיהול ריאגנט O.D. ס אמנר 55 nm [] מס' מבחנה תמיסה סטנדרטית של סוכר מחזר / [] תמיסה סטנדרטית של גלוקוז / [] תמיסה סטנדרטית של פרוקטוז / [] מים וקקים מז [] ריכוז סוכר מחזר [/] ' ' ' ' '.657 : : ' ' ' 7 : : '.6 : : ' בהתאם לשאלה בחוברת ) עמ' 68 סעיף ( 6 :הגלוקוז אמור להיות הסוכר שייתן תגובה חיובית בריאקצית סאמנר. פרוקטוז איננו סוכר מחזר. אך מכיוון שאנו ערכנו את ניסוי, 3 למבחנות עקומת הכיול הוספנו, NaOH ולכן בתנאים בסיסיים מתרחשת טאוטומריה, נצפה לראות גם תגובה חיובית במבחנות הפרוקטוז.

3 חלק ג' השפעת הטמפרטורה על מידת פעילות האנזים הכנת מיהול אנזים :: הכנת מיהול האנזים לניסוי 3 דוגמת חישוב כמות אנזים במבחנה : ריכוז האנזים מהמיהול. 55 :: לכן יש למהול מיהול זה פי כדי להגיע למיהול המבוקש (:)! חישוב הריכוז החדש : CV. 55 Ml C = = =. 7 V Ml נפח מים להשלמה 9 מ"ל. כמות אנזים במבחנות הריאקציה האנזימטית, בכל מבחנה הכנסנו מ"ל של תמיסת אנזים, לכן כמות האנזים במבחנה : m= Ci V = C =. 7 =. 7 m l טבלה מס' : השפעת הטמפרטורה על מידת פעילות האנזים סובסטרט אנזים זמן אנזים טמפ' טמפ' O.D. מס' מבחנה רצויה מעשית [מ"ל] מ[ "ל] אינקובציה מ[ "ל] [מעלות צלזיוס] [מעלות צלזיוס] דקות אינקובציה בטמפ' המתאימה בקרה.87

4 3 חלק א הפקת האנזים ריכוז התוצאות ריכוז האנזים יחושב ע"פ משקל השמרים!. 5 5 [ ] g m g E = = 5. 5 C CV V Ml = = = 5. 5 Ml. 55 משקל השמרים 5. g נפח המים : ריכוז התמצית המקורית: ריכוז המיהול :: O.D. ממוצע חלק ב קביעת הפעילות האנזימאטית של אינברטאז בשיטת סאמנר טבלה מס. 3: עקומת כיול לסוכר מחזר ותגובת סאמנר עם חד סוכרים O.D. כמות סוכר 55 nm מחזר [] מס' מבחנה תמיסה סטנדרטית של סוכר מחזר / [] תמיסה סטנדרטית של גלוקוז / [] תמיסה סטנדרטית של פרוקטוז / [] ריכוז סוכר מחזר [/] ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' שוב נציין כי בגלל התנאים הבסיסיים חלה טאוטומריה ונצפה לראות תגובה חיובית גם במבחנות הפרוקטוז! כמויות הסוכר נקבעו בהתאם לנפח העבודה ) מ "ל ).

5 O.D. ממוצע.5 חלק ג' השפעת הטמפרטורה על מידת פעילות האנזים להלן טבלת התוצאות כנדרש בתדריך : טבלה מס' : השפעת הטמפרטורה על מידת פעילות האנזים O. D מס' טמפ' אנזים אנזים O.D. [מעלות צלזיוס] [מ"ל] [מ"ל] 55 nm מבחנה בקרה o c ניתן לראות כי הפרש העכירות הגדול ביותר התרחש בטמפ' של חלק ב קביעת הפעילות האנזימאטית של אינברטאז בשיטת סאמנר חישבנו את כמות הסוכר בכל מבחנה וחישבנו ערכי בליעה ממוצעים לדופליקטים. טבלה מס. 5: נתונים סופפים עבור עקומת כיול לסוכר מחזר כמות סוכר מחזר [] תמיסה סטנדרטית של סוכר מחזר / ריכוז סוכר מחזר [/] מס' מבחנה [].. ' ' '.. ' '. 6. 6' תמיסה סטנדרטית של גלוקוז / [] '. 8. 8' תמיסה סטנדרטית של פרוקטוז / [] '.. '

6 מ[ C =. m l 5 דוגמת חישוב לכמות סוכר : נפח כולל במבחנה מ "ל כמות אנזים במבחנות הריאקציה האנזימטית, בכל מבחנה הכנסנו מ"ל של תמיסת אנזים, לכן כמות האנזים במבחנה : m= Ci V = C =. =. m l נשרטט גרף של עכירות התמיסה כנגד כמות הסוכר המחזר, הגלוקוז, והפרוקטוז. להלן הגרף שמתקבל : עבור סוכר מחזר עבור גלוקוז עבור פרוקטוז עבור סוכר מחזר עבור גלוקוז עבור פרוקטוז O.D.55nm y =.767x R = y = 83x + 75 R = גרף מס' : עקומת כיול לסוכר מחזר y =.665x.9 R = כמות סוכר [מ"ג] חלק ג' השפעת הטמפרטורה על מידת פעילות האנזים מגרף מס' נוכל לחשב את כמות הסוכר שהופקה ע"י האנזים ע"י שימוש במשוואות קווי המגמה, ובנתוני.D.O של טבלה מס', כאשר.D.O מציין את ההפרש בעכירות בין מבחנות שבהם עבר האנזים האינקובציה לבין המבחנות בהן לא עבר האנזים אינקובציה., ערך זה מציין למעשה את מידת פעילות האנזים, ערך שמתקבל שלילי מוגדר כחוסר פעילות, דהיינו אפס. טבלה מס' 6: חישובי מהירות ריאקציה ופעילות ספציפית אנזימטית O. D. טמפ' הדגרה ] מעלות צלזיוס] כמות סוכר מחזר מעקומת הכיול [מ"ג] מהירות ראקציה [כמות מ"ג סוכר מחזר בדקה] פעילות ספציפית (SA) "ג סוכר מחזר למ"ג שמרים] i מס"ד y=. 665* x. 9 m sugar[ ] = [ O. D. +. 9]. 665 דוגמת חישוב ) עבור טמפ' ( o : C משוואת הגרף שהתקבלה עבור סוכר מחזר : לכן נסדר את המשוואה ונוסחת העבודה תהיה :

7 6 m sugar[ ] [ O. D. +. 9] [. +. 9] = = = : o C ועבור טמפ' [ m ]. 8 sugar v= = =. 8 t [min] min min m. 8 sugar msugar [ SA] = = =. 68 t m 5 min Yeast min myeast 5 msugar myeast כלומר בטמפ' הזו נוצרו.8 מ"ג ב דקות. מהירות הריאקציה : פעילות ספציפית ) SA ( : נשרטט גרף של הפעילות הספציפית של האנזים בתלות בטמפרטורה [ציר ה Y בגרף הוא בפקטור של 5 לצורך נוחות מתמטית], להלן הגרף שהתקבל : (SA)[(s)/(yeast)*t(min)]* T[degC] גרף מס' : פעילות ספציפית כתלות בטמפרטורה אנו רואים כי בטווח הטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, לגרף יש צורה ליניארית, נחשב את השיפוע בתחום זה כאשר שיפוע זה יהיה למעשה קצב הריאקציה : SA SA K = = o o C C sugar o Yeast min Tc נחשב כמות סוכר מצטברת עבור טווחי הטמפרטורה השונים : טבלה מס' 7: כמות סוכר מחזר מצטברת כתלות בטמפרטורה טווח טמפרטורה ] מעלות צלזיוס] כמות סוכר מצטברת [מ"ג]

8 מ[ 7 נשרטט גרף ע"פ טבלה מס' : 7 37 o c msugar[] T[degC] גרף מס' : כמות סוכר מחזר מצטברת כתלות בטמפרטורה ניכר בבירור כי שיפוע הגרף המקסימאלי, כלומר קצב פעילות האנזים ) פירוק הסוכר (, הוא בטמפ' של נבצע מניפולציה מתמטית לגרף כמתואר בתדריך [כאשר נתעלם מהטמפ' o שכן אין לה משמעות מתמטית C וגם לא ביוכימית]: טבלה מס' 8: חישוב ערכים לוגריתמיים לצורך חישוב אנרגית שפעול Ln[SA] T[ ] o K o T[ K] טמפ' הדגרה ] מעלות צלזיוס] מהירות ראקציה [כמות מ"ג סוכר מחזר בדקה] פעילות ספציפית (SA) "ג סוכר מחזר למ"ג שמרים] i מס"ד o [K ]T כדי לחשב את אנרגית האקטיבציה כאשר הערכים שמעניינים אותנו הן הערכים נשרטט גרף של Ln[SA] כתלות ב o o בטמפרטורות של שם יש ליניאריזציה שמתנהגת ע"פ כלל ארהניוס, שכן בטמפ' גבוהות יותר האנזים עובר דה נטורציה. C C להלן הגרף שהתקבל : y = 39.9x ln[sa] R = גרף מס' 5: לוגריתם טבעי של SA כתלות בערך ההופכי של הטמפרטורה /T[/k]

9 8 K = Ae G RT G נוסחאות העבודה : A ln k = + ln RT חישוב אנרגיית האקטיבציה: נציב נק' מן הגרף ) בטמפ' 37 מעלות צלזיוס ( ונחלץ את האנרגיה : אנרגיה חופשית מהספרות: ++ G ln k = + ln A RT ++ G = RT ++ G = RT G = RT = hydrolysis of sucrose Sucrose + H O > glucose + fructose G ++ = 7. Kcal=.673 KJ J KJ חישוב אחוז סטייה: 3. 8 (. 673) 7%. 673 התקבלה סטייה גדולה, אך לנוכח תנאי הניסוי, טעויות מיהול אפשריות והעובדה כי בניסוי שהשתמשנו בנייר פראפילם במקום בגולות שמחק לנו את הרישום מהמבחנות, דבר שיצר בלבול רב, עצם העובדה כי קיבלנו ערך אנרגית שפעול שהוא באותו סדר גודל של הערך מהספרות, מוכיח כי הגענו לערך אמפירי מקורב של אנרגית השפעול של הידרוליזת סוכרוז ע"י אינברטאז. עקומת כיול לסוכר מחזר דיון ומסקנות ניתן לראות כי העקומה עבור סוכר מחזר ועבור גלוקוז הם בעלות שיפוע דומה.שיפוע עבור פרוקטוז שונה, שכן העקום הפוי היה אמור להיות מקביל לציר האופקי שכן פרוקטוז איננו מחזר ולכן לא היה מגיב עם ראגנט סאמנר, אך מכיוון שעשינו את ניסוי 3 והוספנו בסיס, התרחשה טאוטומריה, והפרוקטוז הותמר לסוכר מחזר וכן התרחשה תגובה, אך בשיעור קטן יותר מהגלוקוז והסוכר המחזר. העקומות ליניאריות, רק עקומת הסוכר המחזר מאבדת את הליניאריות מעבר לכמות סוכר של.6 מ"ג, ככל הנראה התמיסה עכורה מדי וקריאת בליעת האור כבר איננה אינדיקציה לצורך עקומת כיול. כדי לקבוע את רמת הדיוק נוכל להשתמש בפונקצית ה LINEST של הגיליון האלקטרוני עבור קן המגמה של עקומת הכיול של הסוכר המחזר : להלן התוצאות : שיפוע נקודת חיתוך ערך שגיאה.67 8 = (. 7± כלומר הדיוק בקביעת העקומה הוא (5.. 5 = 8 % שגיאה באחוזים :. 7 אם היינו משמיטים את הנקודה של שבה כמות הסוכר היא מ"ג, היינו מקבלים תוצאה טובה יותר....3

10 9 בדיקת פעילות אנזים כתלות בגורמים קינטיים שונים מבחנה מס' 5 שימשה כבקרה, בליעת האור הייתה נמוכה מאוד שכן לא הייתה בה פעילות אנזימטית. כמות הסוכר ההתחלתית היא בעודף, זה איננו מקרה שכן אנו צריכים למהול ריכוז התחלתי זה פי, ומרווח הטעויות כאן די גדול, כך שאם כמות הסוכר ההתחלתי לא הייתה מעט בעודף, סביר להניח שלא היינו מבחינים בשינויים, עוד פרמטר לעודף הסוכר הוא לעודד את תהליך הפירוק לפעול ע"פ עקרון לה שטליה. שכן אינברטאז רק מהווה זרז לתהליך. ריכוז האנזים מתאים לתהליך, שכן אכן קיבלנו תוצאות פעילות אנזימטית בדיוק כפי שציפינו, הפעילות האנזימטית הייתה נמוכה בטמפ' קרות, מקסימאלית בטמפ' הגוף, ודעכה ככל שהטמפ' עלתה מעבר לכך, ובטמפ' רתיחה, לא הובחנה פעילות אנזימטית השפעת טמפרטורה על פעילות האנזים 37 o C צורת הגרף של הפעילות האנזימאטית תואמת את הציפיות, ואת התיאוריה, כאשר הפעילות המקס' היא בטווח טמפ' הגוף, טמפ' מעבר לכך מעידות על פעילות נמוכה יותר, וטמפ' גבוהות מראות על חוסר פעילות כתוצאה מדהנטורציה. טמפ' מקס' עבור פעילות אנזים.3 טמפ' מינ' o C. גרף הצטברות הסוכר מראה כי הסוכר ממשיך להצטבר ככל שהטמפ' עולה, קצב ההצטברות עולה ומגיע לשיא בתחום טמפ' של 37 o מעבר לטמפ' זו הקצב הולך ודועך. C 5. כאמור, כאשר קצב היווצרות התוצר הוא מקסימאלי, זו הנקודה בה נמצאת הטמפ' האופטימאלית של האנזים. 76.תשובות לחלק זה ניתנו בריכוז התוצאות.

11 ביוכימיה מעבדה הפקה ובידוד אינברטאז משמרים דו"ח מעבדה

12 מטרות הניסוי.. הפקה וניקוי אינברטאז משמרים, תוך שימוש בשיטות הבאות: א. ניקוי ראשוני ע"י שיקוע האנזים בן ריכוזי 6% ריווי אמוניום סולפט. ב. הפרדת אינברטאז מאמוניום סולפט ע"י כרומטוגרפיית מסננת מולקולארית עם ספדקס G.5 השוואה בין יעילות שיטות הפרדה אלו. ריכוז תוצאות טבלה מס' : הפקת אינברטאז משמרים כמות השמרים [מ"ג] נפח המים [מ"ל] ריכוז שמרים בתמיסה נפח התמצית [מ"ל] ריכוז שמרים בתמצית 37. [/] 5. [/]. = g = m l משקל השמרים שנמדד: חישוב ריכוז השמרים בתמיסה : הפרדת התערובת המכילה אמוניום סולפט ואנזים פרקצייה מספר 8 בהפרדה בכרומטוגרפיית מסננת מולקולארית הפסקנו את ההפרדה בשל הופעת אורתו ניטרופנול ) צבע צהוב ). בדיקות ספקטופוטומטריות טבלה מס' :קביעת ריכוז חלבון בפרקציות שונות בעזרת שיטת בראדפורד A B C D E F BSA בופר אלוציה בופר אלוציה פרקצייה תמיסת אנזים 6% 9 תמיסה מקורית BSA טבלה מס' 3 :ערכי ה O.D של הפרקציות השונות בשיטת בראדפורד A B C D E F ריכוז החלבון בשיטת בראדפורד בוצע בעזרת מכשיר.Eliza הפרקציות המודגשות בצהוב הן אלו שנבחרו ע"י המרצה להמשך עבודה.

13 קביעת פעילות אנזימתית של אינברטאז בשיטת סאמנר טבלה מס :קביעת פעילות אינברטאז ע"י הידרוליזה אנזימתית של סוכרוז O.D [5nm] סופי O.D O.D [5nm] מס' מבחנה אפיון תכולת המבחנה ביקורת ריאגנטים ביקורת אנזים תמצית מקורית בקורת סובסטרט תמיסת אנזים מקורית תמיסת אנזים לאחר שיקוע ב 6% AS פרקצייה פרקצייה פרקצייה 3 פרקצייה סוכר מחזר סוכר מחזר מים מזוקקים [מ"ל] אנזים [מ"ל] סובסטרט [מ"ל] מיהול לפני קריאה שנייה [5nm] (קריאה שנייה) :5 : : :..8.3 גדול מ גדול מ..95 גדול מ גדול מ הערות : * מבחנות ו 3 לא הוכנו, נעשה שימוש בגרף כיול מוכן ממעבדה קודמת. * במבחנות בהן קריאת ה. O.D הייתה גבוהה מ, בוצע מיהול כנדרש, ובוצעה קריאה חוזרת. * בתדריך המעבדה לא כתוב כמה מ"ל ריאגנט סאמנר יש להוסיף, ולכן שמענו לעצת הזוג שלידינו ) אורן ושרית ( ושמנו מ"ל ריאגנט סאמנר במקום מ"ל, אך מכיוון שמדובר בפרופורציה למידת העכירות, לא ציפינו לקבל תגובות שונות מהצפוי ובתמיכת המרצה כמובן!

14 3 להלן גרף עקומת הכיול שהוכן בהתאם למעבדה מס' : O.D.55nm.7 y =.665x.9 R = כמות סוכר [מ"ג] גרף מס' : עקומת כיול לסוכר מחזר סיכום התוצאות טבלה מס' 5: סיכום התוצאות מס' מבחנה התמיסות הנבדקות ריכוז סוכר מחזר סוכרוז שהתפרק ריכוז אנזים יחידות למ"ל כמות אנזים יחידות ריכוז כלל חלבון בדגימה כמות כלל חלבון בדגימה פעילות ספציפית יעילות ניקוי ניצולת הפקת אנזים enzyme units [ ] protein [ ] [ ] [ µmole] [ ] mole תמיסת אנזים מקורית תמיסת אנזים לאחר שיקוע ב 6% AS פרקצייה פרקצייה פרקצייה 3 פרקצייה 3 5 כל דוגמאות החישוב עבור פרקצייה מס' : O. D. = O. D. ( sample) [ protein] [ B. S. A.] ( standard ). [ protein ] = =.86..ריכוז התמיסה הסטנדרטית של BSA בה השתמשנו הוא / חישוב ריכוז החלבון בתמיסות הנבדקות יעשה לפי הנוסחה : [Protein] מציין את ריכוז החלבון בדגימה דוגמה לחישוב ריכוז חלבון :

15 הערך. הינו ממוצע קריאות ה O.D בין שתי דגימות הסטנדרט (טבלה מס' 3). נפח הדגימה הינו מ"ל בכל המבחנות לכן חישוב כמות החלבון בתמיסות הנבדקות יבוצע ע"י מכפלת הריכוז בנפח הדגימה..86 =.6 דוגמה לחישוב כמות חלבון : חישוב כמות הסוכר המחזר בתמיסות הנבדקות תחושב בעזרת גרף הכיול., O. D=.665 W sugar נוסחת קו המגמה הינה:.9 O. D. +.9 Wsugar = כמות הסוכר המחזר במ"ג :.665 בחילוק התוצאה ב נקבל את הריכוז. במקרה בו היינו צריכים למהול את התמיסה, נכפול את ערך ה O.D בפקטור המיהול. דוגמה לחישוב ריכוז הסוכר המחזר :.+.9 W sugar = ריכוז הסוכר :.9 [ sugar ] = =.7 m l כמות הסוכר המחזר שהשתחרר בריאקציה ביחס ישר לכמות הסוכרוז שהתפרקה. כדי לחשב את כמות הסוכרוז במיקרומול, נשתמש בנתון כי: M.W. = 3 = 3 = דוגמה לחישוב כמות הסוכרוז במיקרומול :.9 (sucrose) =.75 µ mole µmole g mole mole µmole חישוב יחידות אנזים כמות האנזים המפרקת מיקרומול סוכרוז בדקה בתנאי הריאקציה: חישוב ריכוז יחידות האנזים נחלק בנפח הדגימה.75 µ mol min =.75 µ mol min "ל: מ חישוב פעילות ספציפית חילוק כמות האנזים בכמות החלבון: חישוב מידת הניקוי לפי הנוסחא: חישוב הניצולת לפי הנוסחא: µ mol min Enzyme units protein = µ mol min Enzyme units protein פעילות ספציפית בפרקציה מידת הניקוי = פעילות ספציפית בתמצית כמות חלבון בפרקציה ניצולת= כמות חלבון בתמצית.77 = %

16 5 דיון ומסקנות סיכום מהטבלה ניתן לראות כי מידת הניקוי הגבוהה ביותר התקבלה בפרקצייה מס', 6 בשיטת ההפרדה בעזרת כרומטוגרפיית מסננת מולקולארית מידת ניקוי נמוכה ביותר התקבלה לאחר שיקוע ב 6% אמוניום סולפט מכאן ששיטת ההפרדה בעזרת כרומטוגרפיית מסננת מולקולארית יעילה יותר לניקוי האנזים. תגובת השיקוע אפקטיבית יותר בבידוד האנזים אינברטאז משאר החלבונים בתמיסה ולא למטרת קבלתו בצורה נקייה. כמו כן ניתן לראות בטבלה מס' 5 כי פרקצייה מס' 5 היא בעלת הפעילות הספציפית, יעילות הניקוי והניצולת בין הגבוהות ביותר. פרקצייה זו מכילה את האנזים בצורתו האפקטיבית והנקייה ביותר מבין כל הפרקציות שהתקבלו. ניצולת מקסימאלית התקבלה בשיטת השיקוע באמוניום סולפאט דבר זה אינו מפתיע, כי בדגימה זו לא כל החלבון בפרקצייה הוא האנזים אינברטאז. ניתן להפיק אנזים אינברטאז משמרים ותוך כדי כך ) גם לשמור על פעילותו ( ע"י שימוש במס' שיטות שבחלקן השתמשנו בניסוי זה. עם זאת, מתוך התוצאות ניתן לראות, קבלת ערכים לא מדויקים ו/או שגויים ) למשל : ניצולות גבוהות מ ), % ככל הנראה מקור שגיאות אלו במכלול של גורמים, שביניהם, הוספת מ"ל ריאגנט סאמנר ולא מ"ל עקב טעות שצוינה קודם, אי עמידה בזמנים בהוספת האנזים למבחנות אלה וכד'. שיטה יעילה לבידוד חלבונים שיקוע באמוניום סולפאט שיטה יעילה לניקוי חלבון ספציפי כרומטוגרפיית מסננת מולקולארית

17 ביוכימיה מעבדה מס' 6 ריכוז השפעת הסובסטרט מעכב ונוכחות הפעילות על טריפסין של דו"ח מעבדה

18 מעבדה מס' 6 נושא המעבדה: השפעת ריכוז הסובסטרט ונוכחות מעכב על הפעילות של טריפסין מטרות הניסוי השפעת ריכוז הסובסטרט על פעילות האנזים טריפסין וחישוב ערכי Km ו.Vmax השפעת ריכוזים שונים של הסובסטרט בנוכחות המעכב PABA על מהירות הריאקציה, קביעת אופי העיכוב וחישוב.Ki.. ריכוז תוצאות טבלה מס' : השפעת ריכוז הסובסטרט על פעילות הטריפסין O.D. nm טריפסין 3µg/ () HCl. M () בופר טריס ph 7.8.M () ריכוז LPNA (M) מס' מבחנה נפח סובסטרט חומצת חומץ 3% () 5 דקות פרהאינקובציה ב 3ºC דקות אינקובציה ב 3ºC ()

19 'סמ הלבט : ןיספירטה תוליעפ לע בכעמה תעפשה 'סמ הנחבמ זוכיר LPNA (M) חפנ טרטסבוס () PABN. M () HCl. M () ןיספירט 3µg/ () תצמוח ץמוח 3% () O.D. nm ºC ב היצבוקניאהרפ תוקד 5 3ºC ב היצבוקניא תוקד.8 'סמ הלבט :3 תואצותה זוכיר 'סמ הנחבמ O.D nm [S] (mm) SA (µmol/e min) /[S] (/mm) /SA (E min/ µmol) SA/[S] (liter/e min) O.D nm.הלש הרקבה תנחבמו תקדבנה הנחבמה ןיב שרפהה

20 טבלה מס' : ריכוז ממוצעי קריאות דופליקטים לצורך הצגה גראפית SA/S (liter/e min) /SA (E min/ µmol) SA S O.D nm מס' ממוצע מבחנה O.D nm (µmol/e min) (mm) O.D nm ההפרש בין המבחנה הנבדקת ומבחנת הבקרה שלה. דוגמאות חישוב עבור מבחנה : /[S] (/mm) A = C ε l ε = 8.8 µmol/ cm ; l = cm 5 = C 8.8 C =.67 µmol/ Q sf = C V Q =.67 µmol/ µmol Q E = C V = 3 µg/ =9 µg =.9 חישוב ריכוז תוצר : חישוב כמות תוצר ) במולים ( : כמות האנזים במבחנה הייתה : פעילות ספציפית מוגדרת ככמות הסובסטרט ביח' µmol שהתפרק ע"י מ"ג אנזים בדקה, זמן הריאקציה היה דקות לכן הפעילות הספציפית : SA =.63 µmol /.9 min =.35 µmol/e min C C V = C V C.35=. 5.3 M.3mM חישוב ריכוז סובסטרט בתערובת הריאקציה במבחנות = = /S,/SA הם פשוט הערכים ההופכיים של SA,S ו SA/S היא פשוט המנה המתמטית של S,SA ולכן לא תוצגנה דוגמאות חישוב ל 3 ערכים אלו.

21 הצגה גראפית של תלות הפעילות הספציפית בריכוז הסובסטרט, בנוכחות ובהעדר מעכב, בשלושת השיטות הבאות: שיטה מס' עקומת מיכאליס מנטין עם מעכב עקומת מיכאליס מנטין עבור אנזים ללא מעכב SA[µmol/E min]. ללא מעכב עקומת מיכאליס מנטין עבור אנזים ומעכב S[µM] גרף מס' : עקומת מיכאליס מנטין עבור פעילות טריפסין ללא מעכב ובנוכחות מעכב Vmax S הגרף מתואר ע"י משוואת מיכאליס מנטין = V Km+ S בעקומה שהתקבלה בשיטה זו אין מעבר לסדר אפס, ריכוזי הסובסטרט בהם השתמשנו לא אפשרו קבלת מהירות מקסימאלית ולכן לא ניתן לחשב את ערכי K m ו max V בשיטה זו. שיטה מס' עקומת לינוואייר ברק /SA (E min/ µmol) ללא מעכב עם מעכב עם מעכב ללא מעכב y = x R =.663 y =.65x +.8 R = /[S] (/mm) גרף מתואר ע"י משוואת לינוואייר ברק : חישוב ערכי K m ו גרף מס' : עקומת לינוואייר ברק Km = + V V S V max max V max ללא מעכב : חישוב המהירות המקסימאלית ) הערך ההופכי של נקודת החיתוך של משוואת הגרף עם ציר ה Y ( :

22 V =.8 max V max = 8.6µ mol / E min חישוב קבוע מיכאליס מנטין (הערך ההופכי השלילי של נקודת החיתוך של משוואת הגרף עם ציר ה X ) : y.8 y =.65x +.8 x=.65.8 x (y=) = = ( ) =.93 K.65 K m m =.7 mm V max חישוב ערכי K m ו בנוכחות מעכב : V חישוב המהירות המקסימאלית ) הערך ההופכי של נקודת החיתוך של משוואת הגרף ( : = max V max 5µ mol /( E min ) חישוב קבוע מיכאליס מנטין (הערך ההופכי השלילי של נקודת החיתוך של משוואת הגרף עם ציר ה X ) : y y = x x= x (y=) = = ( ) K m Km.8 mm עפ"י משוואת לינוואייר ברק ניתן לראות כי ערכי V max ו m K קטנים בנוכחות מעכב ולא באותו היחס, מכאן ניתן להסיק כי אופי המעכב הנבדק,,PABA הינו עיכוב תחרותי. שיטה מס' עקומת אדיהופסטט עם מעכב ללא מעכב עם מעכב ללא מעכב SA (µmol/e min)..5. y =.379x + 6 R =.985 y = 56x + R = SA/S (liter/e min) V V V = + S K K m max m הגרף מתואר ע"י משוואת אדי הופסטט : גרף מס' 3: עקומת אדי הופסטט

23 V = max µ mol / E min K V m = = = 6 max µ mol / E min mm חישוב ערכי K m ו max V ללא מעכב : V max חישוב ערכי K m ו בנוכחות מעכב : K m 6 = = mm V max הינו לאחר הצגת התוצאות במשוואת לינוואיירברק, ניתן להסיק כי המעכב הינו מעכב תחרותי, מאחר ו ערך קבוע, בקירוב, ורק ערכו של Km משתנה בהתאם לריכוז המעכב. ע"פ המבנה הכימי של המעכב PABA ניתן להסיק כי קיימת התאמה מבנית בין אופי עיכוב לבין מבנה הכימי של המעכב. למעכב קיימת טבעת בנזנית כמו לסובסטרט,LPNA השוני כימי היחידי הוא בשייר הצדדי. המעכב PABA יכול להקשר במקום הסובסטרט עכב הדמיון הרב במבנה הכימי.לכן המעכב הינו מעכב תחרותי. טבלה מס' 6: ריכוז תוצאות K m ו V max בשיטות השונות K m [ mm ] שיטה מיכאליס מנטין לינוואייר ברק אדי הופסטט ללא מעכב.7.76 עם מעכב.8.9 V µ mol max E min ללא מעכב עם מעכב I C V = C V. = C M.85mM = C = = מציאת ריכוז סופי של המעכב: חישב את ערכו של הקבוע : K i בכדי לחשב את ערכו של הקבוע K i נמצא תחילה את ערכו של α : k a= α V max m α.8 = 5 a שיפוע הגרף, ערכי K m ו V max ידועים וכבר חושבו. נחשב לפי עקומת לינוואיירברק: α.8

24 [ I] α = + K i.8= + K i =.856 [.85] mm K α 6.379= 369 α =.7.7= + K i =.96 mm i [.85] K K i =.856M K m =.686 (µmol/e min) I =.85 M i [.85] K mapp = K =.36 mapp M K i =.96 I =.85 M K =.9 m M M [.85] K mapp = K =.8 mapp M כעת נציב את הערכים המתקבלים: נחשב לפי עקומת אדיהופסטט: כעת נציב את הערכים המתקבלים: חישוב K m app התבצעה לפי הנוסחא הבאה: חישוב לפי עקומת לינוואיירברק: חישוב לפי עקומת אדיהופסטט: חישוב מספר המחזור של הריאקציה : מספר המחזור ) 3 K) הינו מספר מולקולות סובסטרט שהתפרקו ע"י מולקולת אנזים בשנייה שזוהי גם המהירות המקסימאלית. µ mol trypsin X.9 E K T = X =.375 V µ moltrypsin V max max cat = = E.375 T sec sec V max = K 3 = 5 (µmol/e min) K cat = 5 (µmol/e min) /µmol =.67 units/min =. units/sec בשיטת לינוואייר ברק ללא מעכב:

25 V max = K 3 = 5 (µmol/e min) K cat = 5 (µmol/e min) /µmol =.67 units/min =. units/sec V max = K 3 = (µmol/e min) K cat = 6.33 units/min =. units/sec V max = K 3 = 6 (µmol/e min) K cat = 5. units/min = 6 units/sec בשיטת לינוואייר ברק בנוכחות מעכב: בשיטת אדי הופסטט ללא מעכב: בשיטת אדי הופסטט בנוכחות מעכב: דיון בתוצאות, סיכום ומסקנות: תשובות לשאלות בחוברת : מבחנות הבקרה בניסוי הן המבחנות שלהן לא הוסף האנזים טריפסין ובהן לא התרחשה הריאקציה, לכל זוג מבחנות זהות הייתה מבחנת בקרה (מבחנות מס' 3,6,9,,5,8,,,7,3). תפקידן של מבחנות הביקורת לצורך הפרש ערך ה. O.D של המבחנות הנבדקות מהבליעה של מבחנת הבקרה. השוואת התוצאות שנתקבלו עבור ערכי V max ו m K בשיטות השונות תעשה ע"י חישוב אחוז סטייה : K I µ mol K cat[units/sec] K m µ mol שיטה %. 6.7% % מיכאליס מנטין לינוואייר ברק אדי הופסטט שגיאה בעקומה מיכאליס מנטין שהתקבלה בשיטה זו אין מעבר לסדר אפס, כלומר המהירות לא הגיעה לערכה המקסימאלי ולכן לא ניתן לחשב דרכה את ערכי Km ו.Vmax אופי העיכוב של PABA שנמצא בניסוי הינו עיכוב תחרותי. ידוע כי המעכב PABA הינו מעכב תחרותי, ע"ב הנתונים של הניסוי אותו ביצענו אכן הגענו למסקנה כי הוא אכן מעכב תחרותי, לכן הריכוזים שבהם השתמשנו מתאימים. המעכב מכיל טבעת ארומאטית בעלת קב' אמינו בסיסיות וידוע כי האנזים טריפסין ספציפי לחומצות אמיניות בסיסיות ובמבנה ה"כיס" שיירים טעונים שלילית ולכן המעכב, המקבל מטען חיובי בתמיסה, יוכל להיקשר ל"כיס" של האנזים ולעכב את הריאקציה. מכאן שקיימת התאמה בין מבנה המעכב לאופי העיכוב. השוואה בין Ki לבין : Km אם נעשה ממוצע של ערכי ה K m ב השיטות ונשווה אותו לממוצע של ערכי ה K I נקבל : = = = =.886 מתברר שערכו של K m גבוה יותר ולכן לאנזים יש יותר אפיניות לו אך מכיוון שערכו של K I אינו רחוק ממנו, מכאן נובעת התחרות האופיינית של המעכב. K m mm K I mm סיכום ומסקנות : למדנו להכיר מנגנון עיכוב אנזימטי. התנסינו בחישובי מהירות ריאקציה, קבועי מיכאליס מנטין, קבועי מעכב ומספרי מחזור. בדקנו השפעות ריכוזי מעכב על מהירות הריאקציה, וקבענו את אופי העיכוב.

26 ביוכימיה מעבדה מס' 7 של התא פרקציונציה ומידור פעילויות אנזימאטטטטיות של בכבד חיים בעלי דו"ח מעבדה

27 מ[ מ[ מ[ נושא המעבדה: מטרות הניסוי : ביוכימיה מעבדה מס' 7 פרקציונציה של התא ומידור פעילויות אנזימאטיות בכבד של בעלי חיים O.D. (5 nm) הפקת אברונים שונים מרקמת כבד. בדיקת פעילות האנזימים במיקומם בתא. ריכוז תוצאות : טבלה מס' : בדיקת פעילות אנזימתית של האנזימים MDH ו LDH בפרקציות השונות HCl "ל [.. מס' מבחנה ציטוזול [מ"ל] מיטוכונדריות [מ"ל] מיטוכונדריות מומסות [מ"ל] מאלט "ל] לקטט [מ"ל] מים "ל] קוקטייל [מ"ל] מקרא מספרי מבחנות המסומנים באפור ביקורת מספרי מבחנות המסומנים בשחור איפוס נתוני התחלה : משקל הכבד : 6.8 ג' משקל דגימת הכבד שנלקחה להמגון :. ג'= מ"ג נפח הנוזל העליון :.5 מ"ל נפח פרקציית החלקיקים : 7 מ "ל נפח פרקציית החלקיקים המומסים : מ "ל C V.. = =.m l C V חישוב נפח הסובסטרט בכל מבחנה:. מ"ל ) חוץ ממבחנת האיפוס ( חישוב ריכוז הכבד בפרקציות שונות: טבלה מס' : תוצאות חישוב ריכוז כבד בפרקציות השונות פרקצייה אחרי מיהול פרקצייה לפני מיהול ציטוזול מיטוכונדריות מיטוכונדריות מומסות ציטוזול מיטוכונדריות מיטוכונדריות מומסות דוגמת חישוב עבור ריכוז הכבד בנוזל הציטוזול: משקל הכבד מ"ג נפח נוזל הציטוזול.5 מ"ל ריכוז כבד [מ"ג/מ"ל] m C= C= =. V.5 m l

28 C V C V = C V C = V C =. m l C. = =.8 5 V =.,.8 C= m l דוגמת חישוב ריכוז הכבד בנוזל הציטוזול המהול: החישוב בוצע לפי הנוסחא: C =ריכוז כבד התחלתי, C =ריכוז כבד סופי, V =נפח התחלתי, V =נפח סופי, V = m l, V = 5 m l m l חישוב כמות הכבד בכל אחת ממבחנות הריאקציה: טבלה מס' 3: תוצאות חישוב כמות כבד במבחנות הריאקציה כמות כבד מ[ "ג] ) ללא כבד ( מבחנות ריאקציה ) 3 ציטוזול ( ) 6 מיטוכונדריות ( ) 79 מיטוכונדריות מומסות ( (איפוס ( דוגמת חישוב עבור מבחנות 3 החישוב בוצע ע"פ הנוסחא: נוזל מהציטוזול: m C= m=..8=.8896 V m C= V טבלה מס : ריכוז תוצאות חישובי פעילות האנזימים בפרקציות השונות פעילות אנזים פעילות ספציפית משקל כבד מבחנה A A g liv er m in A( 5nm) [ g liver ] מס' מלאט לקטט מלאט לקטט A= O. D. מבחנה O. D. _ מבחנה A=.9.3= 9 A = t t = 5 min 9 5 =.8 A min דוגמאות חישוב לפי מבחנה : חישוב A : חישוב פעילות אנזים ) עבור זמן אינקובציה של 5 דקות ): ביקורת

29 חישוב פעילות ספציפית: חישוב סך כל הפעילות הספציפית של כל אנזים בתא : A 9 = = 66.3 g liver gliver לחישוב זה בחרנו את פרקציית נוזל הציטוזול ואת פרקציית נוזל המיטוכונדריות המומסות. בחרנו את פרקציית המיטוכונדריות המומסות כיוון שרצינו לכלול גם את הפעילות שמתרחשת בתוך המיטוכונדריה. חישוב עבור :LDH חישוב עבור :MDH התחלקות יחסית של האנזימים בתא = 5.5 A gliver = A gliver האנזימים מתחלקים לשלוש קבוצות עיקריות, האנזימים שמרחפים בציטוזול, האנזימים שעל ממברנת התא, והאנזימים הנמצאים במטריקס המיטוכונדריאלי. חישוב התחלקות יחסית: טבלה מס' 5: ריכוז תוצאות חישוב התחלקות יחסית התחלקות יחסית [%] פרקצייה אנזים 7.65 ציטוזול 3.89 מיטוכונדריות MDH 5.6 מיטוכונדריות מומסות 88.3 ציטוזול 3.5 מיטוכונדריות LDH 8.3 מיטוכונדריות מומסות דוגמת חישוב עבור MDH בפרקציית הציטוזול: =% ן E E T 66.3 = 7.65% חישוב סך כל הפעילות הספציפית של האינזימים MDH+LDH בכל אחת מהפרקציות: טבלה מס' 6: תוצאות חישוב סה"כ פעילות אנזימטית בפרקציות השונות פרקצייה ציטוזול מיטוכונדריות מיטוכונדריות מומסות דוגמת חישוב עבור פרקציית הציטוזול: ריכוז יחסי A gliver = 63. A gliver

30 חישוב הריכוזים היחסיים של האנזימים בציטוזול ובמטריקס : אנזים טבלה מס' 7: תוצאות חישוב ריכוזי אנזים יחסיים פרקצייה ציטוזול מטריקס מיטוכונדריאלי MDH ציטוזול מטריקס מיטוכונדריאלי LDH דוגמת חישוב עבור MDH בפרקציית הציטוזול: ריכוז יחסי [%] = 5.5% ( ) דיון : מבחנות הביקורת מבחנות הביקורת מתחלקות לשתי קבוצות, קבוצה אחת מכילה את מבחנות,,7. וקבוצה שנייה מבחנה. תפקידן של מבחנות,,7 הינו להראות את כמות הNADH אשר הייתה בתא לפני תחילת הריאקצייה, וכך ניתן להסביר איך נוצר NADH גם בהעדר האנזים המתאים. תפקידה של מבחנה הינו להראות את כמות הבליעה של המאלט/לקטט והקוקטייל, או במילים אחרות זוהי מבחנת האיפוס שבה השתמשנו. תוצאות הבליעה במבחנות הביקורת הינן נמוכות, וזאת כיוון שבמבחנות אלה ריכוז הNADH הינו נמוך מאד. השפעת הטריטון: הטריטון הינו דטרגנט הגורם להמסת ממברנת המיטוכונדריה, הדבר מתבטא בירידת ערכי ה O.D. והצטללות התמיסה. עם ה כאשר ממברנת המיטוכונדריה מומסת, האנזים מלאט דהידרוגנאז יוצא מהמטריקס המיטוכונדריאלי ומגיב + NAD מסקנות: מהקוקטייל ולא רק עם ה + NAD המיטוכונדריאלי. ניתן לראות כי כל אנזים פועל בחלק אחר של התא. MDH פועל בעיקרו במיטוכונדריה (75%) הLDH פועל בעיקר בציטוזול (9%) אין נגישות לחלק ממשתתפי מעגל הגליקוליזה אל תוך המיטוכונדריה, ולכן היא מתבצעת אך ורק בציטוזול, ריאקצית מעגל החומצה הציטרית ) מעגל קרבס ( מתרחש במיטוכונדריה, תוצאות הניסוי שלנו תואמות את הנ"ל הידוע לנו מהספרות.