Sven Frøkjær, dekan. Ønskes yderligere trykte eksemplarer af Lægemiddelforskning? Send din bestilling til

Transkript

1

2 Til gavn for alle Den offentlige og private forskning inden for lægemiddelområdet er et område, hvor danske forskere og virksomheder klarer sig rigtig godt også efter en international målestok. Universiteternes grundforskning inden for naturvidenskab, teknisk videnskab og sundhedsvidenskab komplementerer i mange tilfælde industriens mere målrettede forskning med udvikling af nye lægemidler. I et tæt samarbejde med andre universiteter, den farmaceutiske og bioteknologiske industri, apotekervæsnet, hospitalsvæsnet og den øvrige offentlige sundhedssektor arbejder vi på Det Farmaceutiske Fakultet konstant på at udvikle de farmaceutiske videnskaber til gavn for studerende, ansatte og den samlede sundhedssektor. Det er mit håb, at nærværende udgave af Lægemiddelforskning illustrerer nogle af vigtige udfordringer, der ligger inden for lægemiddelområdet og giver et indblik i nogle af de spændende forskningsprojekter, der udspringer fra Det Farmaceutiske Fakultet. Sven Frøkjær, dekan Gymnasieklassebesøg Det Farmaceutiske Fakultet - FARMA - tilbyder en besøgsordning, der giver gymnasieelever mulighed for at se, hvordan kemi og biologi i gymnasiet anvendes i lægemiddelforskningen. Det sker i et møde med både studerende, forskere og undervisere, og derved håber vi at kunne give inspiration til den daglige undervisning. Et besøg kan bestå af foredrag eller øvelser. Seneste skud på stammen er øvelser i farmaci, hvor eleverne får et hands on-indtryk af lægemiddelfremstilling, når stoffet ibuprofen fremstilles i laboratoriet. Det er muligt at vælge mellem forløb, som primært er rettet enten mod kemi- eller biologiundervisningen. Se de mange muligheder på Studieretningsprojekt Gymnasieelever har mulighed for at besøge FARMA og udføre laboratorieøvelser i forbindelse med deres studieretningsprojekt. Der udbydes 6 forskellige øvelsesprojekter, som afvikles over 2 dage fra kl Læs mere på farma.ku.dk/studieretningsprojekt Studiepraktik Det Farmaceutiske Fakultet deltager i den landsdækkende ordning for studiepraktik for gymnasieelever, som finder sted i løbet af efteråret. I løbet af praktikopholdet, der strækker sig over tre dage, vil eleverne opleve livet som farmaceutstuderende. Eleverne vil blive præsenteret for flere faglige områder og derigennem erfare bredden i farmaceutuddannelsen. De vil komme med til forelæsninger, klassetimer og laboratorieøvelser sammen med fakultetets studerende og deltage i timer skræddersyet til praktikanterne. Der skulle således være optimale muligheder for både at få et indtryk af livet som universitetsstuderende og få fagligt indhold med hjem i bagagen. Nærmere oplysninger om studiepraktik og tilmelding fås på og på studiepraktik.nu På kan man hente inspiration i de tidligere årgange af Lægemiddelforskning. Her kan du også finde en emnefortegnelse og foretage fuldtekstsøgning på tværs af tidligere årgange af Lægemiddelforskning. Ønskes yderligere trykte eksemplarer af Lægemiddelforskning? Send din bestilling til bestil@farma.ku.dk

3 Indhold 1 Nu kan forfalskede lægemidler afsløres 4-6 Af Julie Kesting, Anne Adsersen og Lene Gudiksen 2 Histonhaler et nyt mål inden for kræftbehandling 7-9 Af Jesper L. Kristensen, Brian Lohse og Rasmus P. Clausen 3 Kan nanopartikler bruges i behandlingen af hudsygdomme? Af Louise Bastholm Jensen, Nina Østergaard Knudsen, Camilla Foged og Hanne Mørck Nielsen 4 Strukturer af membranproteiner: Nøglen til rationelt lægemiddeldesign Af Helle Hald og Osman Mirza 5 Ny viden om antimon ny indsigt i glemt tropesygdom Af Claus Hansen, Bente Gammelgaard, Stefan Stürup og Helle Rüsz Hansen 6 Planternes slægtskab som skattekort til nye lægemidler Af Nina Rønsted, Birger Brodin, Søren B. Christensen, André Huss Eriksson og Anna K. Jäger 7 Hjernens forsvarsmur kortlagt og kopieret Af Hans Christian Helms, Helle Sønderby Waagepetersen, Carsten Uhd Nielsen og Birger Brodin 8 Antidepressive lægemidler nu i 3D Af Jacob Andersen, Lena Sørensen, Kristian Strømgaard og Anders S. Kristensen 9 Kemogenomik: Receptoren set fra ligandens synspunkt Af David E. Gloriam, Petrine Wellendorph, Lars D. Johansen, Daniel Sejer Pedersen og Hans Bräuner-Osborne 10 GABA-syntese en vigtig brik for kontrol af epilepsi Af Anne B. Walls, Arne Schousboe og Helle S. Waagepetersen 11 Genetik kan forudsige følsomhed for smerte Af Arafat Nasser, Ole J. Bjerrum, Anne Marie Heegaard og Lisbeth Birk Møller 12 Stress kan fordoble risikoen for at bruge smertestillende medicin Af Vibeke Koushede og Ebba Holme Hansen 13 Stressfremkaldende hjerneaktivitet kan nu undersøges i realtid Af Morten Kristensen 14 Proteiner i lægemidler de sætter sig alle de forkerte steder Af Stefania Baldursdottir, Signe Hougaard Nielsen, Maria Fullerton og Lene Jørgensen 15 UV-imaging visualiserer frigivelse af lægemiddelstoffer Af Fengbin Ye, Emil Meng-Lund, Anan Yaghmur, Susan Weng Larsen, Claus Larsen, Henrik Jensen og Jesper Østergaard 16 Forkert medicinering og unødige indlæggelser Af Søren Ilsøe-Kristensen, Steffen Thirstrup og Mette Rasmussen 17 Veterinære lægemidler i natur og miljø: Er miljørisikovurderingen god nok? Af Kristine A. Krogh, Gitte G. Anskjær og Bent Halling-Sørensen 3

4 Nu kan forfalskede lægemidler afsløres I takt med den voksende internethandel er der sket en stigning i antallet af forfalskede lægemidler, naturlægemidler og kosttilskud, som i værste fald kan medføre alvorlige bivirkninger. En sammenkobling af avancerede analysemetoder kan afsløre forfalskningerne til gavn for både forbrugerne og myndighederne. Af Julie Kesting, Anne Adsersen og Lene Gudiksen Med den voksende internethandel og øgede rejseaktivitet er køb af forfalskede lægemidler, naturlægemidler og kosttilskud blevet et stort problem, som giver sundhedsmyndighederne alvorlige bekymringer. Forfalskede lægemidler er i nogle tilfælde uvirksomme, men i værste fald kan de være farlige og medføre alvorlige og uoprettelige bivirkninger, som det er svært at opdage årsagen til, fordi folk ikke ved, hvad de har indtaget. Et forfalsket lægemiddel defineres af WHO som et lægemiddel, der har en forsætlig og ulovlig mærkning med hensyn til indhold og oprindelse med det formål at narre køberen. Det kan fx være medicin, som indeholder et korrekt angivet aktivt stof, men i for høj eller for lav dosis. Der kan også være tale om lægemidler uden aktive indholdsstoffer, medicin, som indeholder andre aktive stoffer end de angivne, eller læge midler, som er tilsat ikke-deklarerede indholdsstoffer. Mange typer medicin forfalskes, men de lægemidler, der oftest snydes med, er slankemidler og potensmidler. Det er baggrunden for Lægemiddelstyrelsens kampagner: Pas på dig selv køb godkendte slankemidler og Jagten på et bedre sexliv kan skade dit helbred. Naturmedicin, lægemidler og kosttilskud Naturlægemidler og kosttilskud markedsføres ofte som sunde, naturlige alternativer til de almindelige syntetiske præparater. Naturprodukter fra Mellemøsten og Asien har imidlertid ofte vist sig langt fra at leve op til europæisk kvalitet og i mange tilfælde at være direkte forfalskede. Der er afsløret præparater med et meget højt indhold af tungmetaller, og man har fundet adskillige naturlige potenspræparater, der udover eller i stedet for det deklarerede plantemateriale indeholder store doser af de samme virksomme stoffer, som indgår i de receptpligtige læge midler Skematisk oversigt over HPLC-MS-PDA-SPE-NMR. Kromatogrammerne og spektrene stammer fra studiet af det kinesiske naturpræparat. 4 lægemiddelforskning 2010

5 Falsk deklaration: Disse kapsler indeholder angiveligt et kinesisk naturpræparat til behandling af forhøjet blodtryk. Præparatet virker, men kun fordi det indeholder tre kendte, syntetiske blodtrykssænkende lægemiddelstoffer. Der er ingen aktive naturstoffer i præparatet. eller virksomme stoffer, som anvendes til behandling af helt andre lidelser. Det samme gør sig gældende for slankepræparater, gigtpræparater, præparater mod forhøjet kolesterolindhold i blodet og præparater mod forhøjet blodtryk. Ifølge den danske Lægemiddelstyrelse har tolden i et andet EU-land sågar fundet et forfalsket lægemiddel mod hjertekar-sygdomme, som indeholdt støv fra mursten overtrukket med gul maling og møbellak! En undersøgelse foretaget af Lægemiddelstyrelsen har vist, at mindre end halvdelen af de personer, som har købt medicin over internettet, kender reglerne for køb af medicin på nettet, og at mindre end halvdelen har overvejet, om der kunne være bivirkninger ved det købte. Lidt over en fjerdedel af køberne angiver, at medicinen ikke virkede som forventet. En cocktail af stoffer Et naturlægemiddel er ofte et ekstrakt af plantedele og indeholder derfor i modsætning til de fleste syntetiske lægemidler ikke ét enkelt aktivt indholdsstof, men adskillige stoffer ligesom en kop te, som også er et planteekstrakt. For at afgøre, om et naturlægemiddel indeholder andet end det deklarerede, er det nødvendigt, at alle indholdsstofferne adskilles og identificeres. Adskillelsen foregår som oftest ved hjælp af væskekromatografi, baseret på stoffernes elektriske ladning og polaritet. En detektionsmetode, der hyppigt anvendes til kontrol af naturlægemidler og andre lægemidler, er massespektrometri, hvor indholdsstofferne identificeres ud fra deres eksakte masse via en sammenligning med databaser, som indeholder referencedata for kendte indholdsstoffer. Hvis et naturlægemiddel indeholder et kendt stof, vil stoffet således blive genkendt, når der er adgang til referencedata. Imidlertid er der desværre observeret en stigende tendens til, at producenter af forfalskede lægemidler ændrer på den kemiske struktur af de indholdsstoffer, de tilsætter, så en sammenligning med kendte stoffer i en database ikke giver nogen hits. Dette er en meget alvorlig situation, fordi det normalt er umuligt at forudsige, hvilken effekt en ændring af et molekyles sammensætning har på virkning og bivirkninger. En moderne sammenkobling af flere analysemetoder kan imidlertid afsløre forfalskede lægemidler ved at vise, hvilke stoffer de indeholder. Her anvendes kromatografi til MODERNE ANALYSEMETODER HURTIG OG SIKKER IDENTIFIKATION AF INDHOLDSSTOFFER Vores metode til at afsløre forfalskede lægemidlers indholdsstoffer kaldes HPLC-MS-PDA-SPE-NMR. Først adskilles indholdsstofferne i lægemidlet ved hjælp af væskekromatografi (HPLC). Efter separationen ledes en lille del af hvert af indholdsstofferne ind i et massespektrometer (MS), som har en meget høj følsomhed, hvorved det er muligt at opnå gode data baseret på en lille mængde stof. MS måler molekylvægten af stoffet, hvilket gør det muligt at bestemme bruttoformlen. Derudover kan molekylet fragmenteres i massespektrometret, og ud fra fragmenteringsmønstret opnår man information om strukturen af stoffet. Den øvrige del af indholdsstofferne ledes videre til en enhed for fastfaseekstraktion (SPE). I denne enhed sidder der en række små kolonner, som fastholder stoffer på samme måde som en HPLC-kolonne. Når en kromatografisk top kommer til SPE-enheden, fortyndes den med vand og ledes igennem en af disse kolonner, hvor indholdsstoffet bindes, mens væsken skylles bort. På denne måde kan et vilkårligt antal kromatografiske toppe tilbageholdes på hver sin kolonne. Det er endvidere muligt at gentage den kromatografiske separation så mange gange som ønskeligt for derved at øge mængden af stof på hver kolonne. Til sidst tørres kolonnerne med nitrogengas for at fjerne HPLC-opløsningsmidlet. Herefter er det muligt med en lille mængde opløsningsmiddel at skylle det opsamlede stof fra en kolonne ud i et rør, som er beregnet til optagelse af NMR-spektre. Følsomheden ved NMR er langt mindre end ved MS, men spektrene giver til gengæld information om alle hydrogenatomer og carbonatomer i det analyserede stof samt om deres indbyrdes placering i molekylet, hvilket gør det muligt at identificere stoffet. Desuden giver NMR information om den tredimensionelle struktur af det undersøgte molekyle. Ved kombinationen af de anvendte metoder er det således muligt hurtigt at afklare, hvorvidt et naturlægemiddel eller almindeligt lægemiddel er forfalsket, uanset hvilke stoffer producenten har tilsat uden deklaration. det farmaceutiske fakultet, københavns universitet 5

6 HVAD ER ALMINDELIGE LÆGEMIDLER? Lægemidler er produkter, som anvendes til behandling eller forebyggelse af sygdomme. De aktive stoffer er syntetiske stoffer, semisyntetiske stoffer eller isolerede rene naturstoffer. Lægemidler er godkendt af Lægemiddelstyrelsen, som stiller krav til fremstilling, kvalitet, virkning og sikkerhed af produkterne. HVAD ER FORFALSKEDE LÆGEMIDLER? Et forfalsket lægemiddel defineres af WHO som et lægemiddel, som har en forsætlig og ulovlig mærkning med hensyn til indhold og oprindelse med det formål at narre køberen. Det kan fx være medicin, som indeholder et korrekt angivet aktivt stof, men i for høj eller for lav dosis. Der kan også være lægemidler uden aktive indholdsstoffer, medicin som indeholder andre aktive stoffer end de angivne eller lægemidler, som er tilsat ikke deklarerede indholdsstoffer. HVAD ER NATURLÆGEMIDLER? Naturlægemidler er produkter, som er beregnet til at behandle lettere sygdomme, dvs. sygdomme, hvortil det ikke er almindeligt at søge læge. De aktive stoffer er pulveriserede plantedele eller planteekstrakter. Naturlægemidler er godkendt af Lægemiddelstyrelsen. Lægemiddelstyrelsen stiller krav til fremstilling, kvalitet, virkning og sikkerhed af produkterne. HVAD ER KOSTTILSKUD? Kosttilskud er produkter, der supplerer den normale kost, og som påvirker kroppen ernæringsmæssigt og/eller fysiologisk. De aktive stoffer kan fx være vitaminer, mineraler, pulveriserede planter eller planteekstrakter. Kosttilskud skal anmeldes til fødevaremyndighederne, hvilket ikke er ensbetydende med at produktet er godkendt. Kosttilskud markedsføres i dosisform, fx kapsler eller tabletter. Kosttilskud er ikke lægemidler og må ikke markedsføres som egnede til behandling eller forebyggelse af sygdomme. HVILKE REGLER GÆLDER FOR INDKØB AF LÆGEMIDLER OVER INTERNETTET? Lægemidlerne skal være købt eller afsendt fra et land inden for EU eller EØS. De skal være godkendt af myndighederne. Medicinen skal være til eget brug. Lægemidlerne må ikke være doping eller indeholde euforiserende stoffer. Reglerne findes på Før du handler på nettet adskillelse, mens identifikationen af indholdsstofferne opnås ved at kombinere massespektrometri, fastfaseekstraktion og magnetisk resonans spektroskopi. Naturlægemiddel med syntetiske stoffer Vi anvender denne sammenkobling af metoder til hurtigt at identificere kendte såvel som ukendte stoffer i planteekstrakter og svampeekstrakter, men teknikken er også oplagt til kvalitetskontrol af både naturlægemidler og almindelige lægemidler. I samarbejde med forskere på Merck Frosst Ltd. har vi undersøgt et kinesisk naturpræparat til behandling af forhøjet blodtryk. Præparatet, som ifølge deklarationen indeholder forskellige dele fra dyr og planter, viste sig at være særdeles effektivt til behandling af forhøjet blodtryk. Derfor undersøgte vi præparatet i håb om at finde et ukendt naturstof, som måske kunne danne grundlag for udvikling af et nyt lægemiddel. Det viste sig dog hurtigt, at kapslerne ikke indeholdt, hvad der var deklareret. En kromatografisk undersøgelse afslørede nemlig, at der kun var tre indholdsstoffer og ikke den mangfoldighed af naturstoffer, der kunne forventes ud fra deklarationen. Under anvendelse af HPLC-MS-SPE-NMR blev det hurtigt tydeligt, at de tre stoffer i kapslerne var amlodipin, indapamid og valsartan, som alle er registrerede aktive lægemiddelstoffer til behandling af forhøjet blodtryk. For at eliminere enhver tvivl om at virkningen af præparatet kun skyldtes disse tre stoffer, blev indholdet i kapslerne kvantificeret. Herefter blev der foretaget et dyreforsøg, hvor rotter med forhøjet blodtryk fik doseret enten kapsler eller en blanding af de tre stoffer svarende til indholdet i kapslerne. Forsøget viste, at den observerede effekt af kapslerne svarede fuldstændig til effekten af blandingen af de tre stoffer. Det kunne derfor konkluderes, at der ikke var noget naturstof, som bidrog til effekten af kapslerne. Undersøgelsen viser, hvordan den anvendte kombination af moderne analysemetoder vil kunne afsløre forfalskede lægemidler til gavn for både forbrugerne og myndighederne. Cand.pharm. Julie Kesting er ph.d.-studerende på Institut for Medicinalkemi Cand.pharm. Anne Adsersen er lektor på Institut for Medicinalkemi Cand.pharm. Lene Gudiksen er lektor på Institut for Medicinalkemi 6 lægemiddelforskning 2010

7 Histonhaler et nyt mål inden for kræftbehandling Et nyopdaget enzym kan bane vej for en helt ny type kræftmedicin, som er mere skånsom over for raske celler end almindelig kemoterapi. Enzymet er med til at regulere, om kroppens gener tændes eller slukkes, og enzymets aktivitet er markant højere i kræftceller. Stoffer, som specifikt hæmmer enzymet, kan blive til lægemidler, som hindrer kræftcellerne i at vokse uhæmmet. Af Jesper L. Kristensen, Brian Lohse og Rasmus P. Clausen Kræftsygdomme kendetegnes ved, at kroppen mister kontrollen over sine egne celler. Den normale regulering af cellernes vækst sættes ud af spil, og kræftcellerne deler sig uhæmmet. Med tiden fører den ukontrollerede vækst til, at det omgivende væv nedbrydes, hvilket i sidste ende kan medføre døden. En af de store udfordringer ved udviklingen af lægemidler til behandling af kræft er, at det er kroppens egne celler, man skal angribe. Kunsten er derfor at sikre sig, at det kun er kræftcellerne, som rammes af cellegiftene, og ikke de raske celler. Nutidens lægemidler er desværre ikke specifikke, og nogle gange er bivirkningerne så alvorlige, at lægerne må benytte meget små doser, som ikke er tilstrækkelige til at slå kræftcellerne ihjel. En forbedret kræftbehandling er derfor et spørgsmål om at finde egenskaber, der adskiller kræftceller fra raske celler, så man kan nedkæmpe kræftcellerne uden at ramme det sunde væv i kroppen. Kræftcellernes ukontrollerede vækst skyldes, at den normale regulering af, hvilke gener, der skal aktiveres i cellerne, ikke længere fungerer. Vores forskning fokuserer derfor på at forhindre kræftcellerne i at undslippe de mekanismer, som normalt regulerer og bremser væksten i raske celler. Cellerne bruger ikke alle gener Menneskekroppen er sammensat af mere end 200 forskellige typer celler. Fælles for dem er, at de alle indeholder hele det humane genom i form af DNA. Det er med andre ord den samme universelle kogebog med opskriften på alle cellulære byggesten, der findes i vidt forskellige celletyper som fx nerveceller eller muskelceller. Den enkelte celle får sin egenart ved at udvælge, hvilke gener dvs. opskrifter på protei- ner som er relevante for, at cellen kan opretholde præcis de funktioner, den skal udføre. De forskellige typer celler bruger derfor kun en brøkdel af alle de opskrifter, der findes i genomet. Hvis man kunne tage en DNA-streng ud fra cellekernen i en celle og folde strengen ud, ville den være to meter lang, men det er selvfølgelig umuligt at rulle strengen ud inde i cellen, når bestemte gener skal aflæses. Derfor er genomet pakket sammen på en meget struktureret og velordnet måde, hvor DNA-dobbeltspiralen er viklet to gange rundt om en slags garnnøgler, man kalder for histoner. Fra histonerne udgår der lange kæder af aminosyrer, og disse peptider kaldes for histonhaler. Halerne kan være kemisk modificeret på flere forskellige måder, og præcis hvordan, er med til at afgøre, hvorvidt et gen på den pågældende del GENER, PROTEINER OG ENZYMER Det humane genom rummer omkring gener. Et gen er en DNA-sekvens, som indeholder opskriften på et protein, og når cellen har brug for proteinet, åbnes DNA-dobbeltspiralen, og cellen fremstiller en RNA-kopi af genet. Kopien aflæses nu i cellernes proteinfabrikker, som fremstiller det ønskede protein. Proteiner er kroppens byggesten og arbejdsheste. Nogle proteiner har strukturelle funktioner og opbygger fx cellens skelet. Andre spiller en central rolle i cellernes kommunikation og fungerer bl.a. som receptorer for hormoner og signalstoffer. En meget vigtig gruppe af proteiner er enzymerne. De er kroppens maskiner og sørger for, at alle de processer, som konstant kører i kroppen, fungerer efter hensigten. Enzymerne katalyserer biokemiske reaktioner, og de er drivkraften bag så forskellige ting som vore sanser, fordøjelsen af føden, musklernes bevægelser og lagring af hukommelsesindtryk i hjernen. Enzymer er også med til at tænde eller slukke for forskellige gener i forskellige typer celler. det farmaceutiske fakultet, københavns universitet 7

8 Sådan tændes og slukkes gener i cellekernen: Den humane arvemasse udgør en to meter lang DNA-dobbeltspiral, som er pakket sammen i cellekerner med en udstrækning på blot ti mikrometer. DNA-dobbeltspiralen er viklet rundt om spoler på samme måde, som en snor er viklet rundt om en yoyo. Spolerne er dannet af proteiner, der kaldes histoner, og de omviklede spoler sidder på række som perler på en snor. Perlekæden snor sig til en tyk fiber, som vindes rundt omkring kromosomernes proteinskelet. DNA midt inde i garnøglet er utilgængelig for de enzymer, som aktiverer vore gener, men histonerne har haler af aminosyrer, som stikker ud. Når der sættes acetylgrupper på en histonhale, folder en del af DNA-strengen sig ud, så enzymerne kan aktivere det pågældende gen. Når histonhalen får påsat methylgrupper, forhindres adgangen for enzymerne, og genet inaktiveres. EPIGENETIK REGULERER GENERNES AKTIVITET Alle menneskers arvemasse er meget ens. Forskellene imellem os skyldes i høj grad epigenetik, som er reversible kemiske modifikationer af DNA, der bestemmer, hvilke gener der aktiveres og danner proteiner i kroppens celler. Selve genomet ændres ikke livet i gennem, men epigenomet forandres voldsomt under fosterudviklingen i takt med, at de oprindelige stamceller, der kan udvikle sig til alle typer væv, specialiserer sig og danner mangfoldigheden af forskellige celler i kroppen en proces, som i øvrigt hænger sammen med kemiske modifikationer af histonerne. Enhver specialiseret celletype har sit eget epigenetiske mønster. Mønstret ændrer sig nogle gange i takt med, at mennesket bliver ældre og måske også som følge af miljøpåvirkninger og livsstil. Det er endda muligt, at epigenetiske tilpasninger i én generation kan nedarves til den næste. Sygdomme som kræft skyldes, at uhensigtsmæssige epigenetiske ændringer gør cellerne syge. Derfor kan øget viden om epigenetik bane vej for nye behandlingsformer, som griber ind i reguleringen af generne i de syge celler. I 2010 blev der på internationalt plan dannet International Human Epigenome Consortium (IHEC), hvis mål er at kortlægge tusinde humane epigenomer i løbet af et årti. af DNA-strengen bliver udtrykt eller ej. Modifikationerne af histonhalerne udgør på den måde et nyt kodelag ovenpå den genetiske DNA-kode. Man kalder den ekstra kode for den epigenetiske kode. Hvis man kan ændre på de epigenetiske modifikationer, vil det i teorien være muligt at gå ind og tænde og slukke for forskellige gener efter ønske. Kræftbehandling via genregulering Man kender i dag flere enzymer, som kan modificere histonhaler og påvirke, hvilke gener, der aktiveres i en celle. Men ved udvikling af en fremtidig kræftbehandling er det vigtigt kun at påvirke udvalgte enzymer, som er specifikke for kræftceller. På den måde kan man undgå, at lægemiddelstoffet modificerer histonhalerne i alle typer celler og dermed medfører bivirkninger. På Biotech Research and Innovation Centre (BRIC) ved Københavns Universitet har en gruppe forskere for nylig opdaget et enzym, GASC1, som er i stand til at fjerne en af de kemiske modifikationer af histonhalerne. Enzymet blev fundet ved at studere, hvilke forskelle der er på de biokemiske processer i kræftceller sammenlignet med raske celler. 8 lægemiddelforskning 2010

9 Aktiviteten viste sig at være markant højere i kræftceller, og derfor er enzymet formodentlig involveret i nogle af de processer, der adskiller kræftceller fra almindelige celler. Et stof, som specifikt hæmmer enzymet, kan derfor potentielt udvikles til et nyt lægemiddel mod kræft det er det, vi arbejder hen imod. Enzymet kan fjerne methylgrupper fra en bestemt aminosyre, lysin, på en af histonhalerne. Man ved, at placeringen af disse methylgrupper på histonet samt antallet af dem er direkte relateret til, hvilke gener der bliver udtrykt og derfor i sidste ende, hvordan cellerne udvikler sig. Forsøg med kunstige histonhaler På Det Farmaceutiske Fakultet har vi fremstillet en serie af afkortede histonhaler for at undersøge og forstå, hvordan enzymet og histonhalerne vekselvirker med hinanden. I forsøgene præsenteres enzymet for de kunstige histonhaler, og efterfølgende undersøger vi, om enzymet har fjernet methylgrupper fra halerne. På den måde opnår vi meget detaljeret information om, hvordan enzymet fungerer. Jo mere viden, jo bedre kan vi målrette udviklingen af nye stoffer, som kan forhindre enzymet i at ændre på histonhalerne, og dermed potentielt bremse væksten af kræftceller i kroppen. Histonhalerne består af omkring 40 aminosyrer. Vi har systematisk forkortet halerne og vist i laboratoriet, at enzymet ikke behøver mere end fem aminosyrer fra histonhalen for at kunne genkende halen og fjerne methylgrupperne. Med udgangspunkt i den information er vi gået i gang med at designe nye inhibitorer, der binder til det samme område på enzymet. Tanken er, at disse stoffer skal gå ind og blokere enzymet, så det forhindres i at fjerne methylgrupperne fra histonhalerne og dermed hindre kræftcellerne i at vokse uhæmmet. Ph.d. Jesper L. Kristensen er lektor på Institut for Medicinalkemi Ph.d. Brian Lohse er postdoc på Institut for Medicinalkemi Ph.d. Rasmus P. Clausen er lektor på Institut for Medicinalkemi det farmaceutiske fakultet, københavns universitet 9

10 Nanopartikler Behandling af beskadiget hud Huden består af forskellige lag, overhuden (epidermis), læderhuden (dermis) og underhuden (subcutis). Den yderste del af overhuden kaldes hornlaget (stratum corneum), og det består af døde celler. Hornlaget udgør hudens primære beskyttelsesbarriere mod indtrængning af fremmede stoffer og bakterier, og laget holder på hudens fugtighed ved at reducere fordampningen af vand fra de underliggende hudlag. Sygdomme som psoriasis og børneeksem behandles ofte med salver eller cremer, og her skal lægemiddelstofferne passere gennem hornlaget og udøve deres effekt dybere nede i huden i den levende overhud og læderhud hvor de syge celler findes. Samtidig skal man undgå, at lægemidkan forbedre behandlingen af hudsygdomme Hudsygdomme som psoriasis og børneeksem er vanskelige at behandle. Ved at indlejre lægemiddelstofferne i nanopartikler kan man opnå, at stofferne forbliver i huden, hvor de skal virke, og ikke spreder sig til blodet eller til de omgivende væv, hvor medicinen i værste fald kan medføre bivirkninger. Af Louise Bastholm Jensen, Nina Østergaard Knudsen, Karsten Petersson, Jens Hansen, Camilla Foged og Hanne Mørck Nielsen uden effekt og i værste fald kan medføre bivirkninger. Et eksempel er påvirkning af kroppens egen hormonproduktion efter anvendelse af binyrebarkhormon, som typisk bruges til behandling af mange hudsygdomme. Gennem en målrettet behandling baseret på nanoteknologi kan man reducere mængden af lægemiddelstof, som smøres på huden, hvilket formindsker risikoen for bivirkninger. Desuden kan cremer med nanopartikler bidrage til at forstærke hudens barriere mod vandfordampning og indtrængning af mikroorganismer. Huden er normalt en essentiel barriere mod indtrængning af mikroorganismer, allergifremkaldende stoffer og andre kemiske stoffer, men hudsygdomme forringer ofte den beskyttende barriere og fører til øget fordampning af vand, så huden bliver tør. Fx fremkalder psoriasis og børneeksem ændringer i barrierens egenskaber, hvilket svækker hudens forsvarsmur mod uønskede stoffer og gør huden tør og mindre tæt. Ved hjælp af nanoteknologi og viden om den syge huds forringede barriereegenskaber kan lægemiddelstoffer nu styres mere præcist hen til målcellerne et stykke nede i huden. Det er således muligt at designe nanopartikler, som sørger for, at lægemiddelstofferne fastholdes i huden og ikke diffunderer ud i de omgivende væv eller til blodbanen, hvor stofferne er 10 lægemiddelforskning 2010

11 Til venstre et eksempel på psoriasis, til højre et eksempel på børneeksem. PSORIASIS OG BØRNEEKSEM 2-3 procent af befolkningen har psoriasis. Det er en kronisk autoimmun hudsygdom, som er karakteriseret ved en øget og unormal vækst af hornceller i overhuden, hvilket viser sig i form af røde, skællede pletter typisk på albuer og knæ, men også mange andre steder på kroppen, fx. i hovedbunden. Sygdommen er kronisk, selv om der kan være symptomfrie perioder. Psoriasis kan optræde i alle aldersgrupper, men det første udbrud kommer typisk i års alderen. Børneeksem (atopisk dermatitis) er et kløende eksem, hvor patienten har symptomfri perioder afbrudt af sygdomsudbrud af forskellig sværhedsgrad. Omkring en femtedel af alle danske børn lider af børneeksem, og 30 procent af patienterne har fortsat eksem som voksne. Personer med børneeksem har tendens til tør hud, lav kløetærskel og en øget risiko for at udvikle astma og allergi. delstoffet trænger hele vejen gennem huden til blodbanen. I to specifikke projekter undersøger vi, hvordan formulering af lægemiddelstoffer i to forskellige typer nanopartikler kan forbedre behandlingen af henholdsvis psoriasis og børneeksem. Der findes i dag flere slags nanopartikler, som er interessante til behandling af hudsygdomme, men nanopartikler baseret på fedtstoffer er mest lovende, fordi de anvendte fedtstoffer er naturligt forekommende i huden og derfor som udgangspunkt sikre at bruge. I et samarbejde mellem Det Farmaceutiske Fakultet og LEO Pharma A/S fokuserer vi på liposomer til behandling af psoriasis samt på faste lipidnanopartikler til behandling af børneeksem. Psoriasisbehandling i overhuden En række hydrofobe lægemiddelstoffer anvendes i salver til behandling af psoriasis. Ved at indlejre disse fedtopløselige lægemiddelstoffer i liposomers membraner bliver medicinen kontrollerbar via liposomernes fysisk-kemiske egenskaber og mindre afhængig af lægemiddelstoffernes egne egenskaber. Det kan udnyttes til at styre lægemiddelstofferne hen til de syge hudceller. Laboratorieforsøg med grisehud har vist, at det er muligt at kontrollere, hvor langt liposomerne og lægemiddelstoffet trænger ned i huden ved at justere liposomernes kemiske sammensætning, både for intakt hud og ved en barriereskade. Optagelsen af liposomer i de sygdomsramte celler kan H20 Vandfordampning Faste lipidnanopartikler Liposomer Lægemiddelstof Hudsygdomme forringer ofte den beskyttende barriere øverst i huden og fører til øget fordampning af vand, så huden bliver tør. Både psoriasis og børneeksem fremkalder ændringer i barriereegenskaberne, hvilket svækker hudens forsvarsmur mod uønskede stoffer og gør huden tør og mindre tæt. Faste lipidnanopartikler kan fastholde mere lægemiddelstof i huden end en almindelig salve, og en depoteffekt kan opnås, specielt hvis huden er intakt. Nanopartiklerne trænger ikke hele vejen igennem huden, men kan lægge sig som en beskyttende film ovenpå huden, så mindre vand fordamper, og huden bliver mindre tør. Liposomer fastholder mere lægemiddelstof i huden end en almindelig salve, og en depoteffekt kan opnås. Liposomerne trænger længere ned huden end faste lipidnanopartikler, især hvis huden er beskadiget. det farmaceutiske fakultet, københavns universitet 11

12 LIPOSOMER KAN TRANSPORTERE BÅDE FEDTOPLØSE- LIGE OG VANDOPLØSELIGE LÆGEMIDDELSTOFFER Liposomer er små hule kugler af fedtstoffer med en typisk diameter på omkring 100 nm. Fedtstofferne har vandopløselige hoveder og fedtholdige haler, og i vand danner de spontant liposomer. Liposomernes vægge består et dobbeltlag af lipider, hvor fedthalerne er samlet i midten af membranen, mens hovederne vender ud mod vandet og indad mod det centrale hulrum. Hydrofile (vandopløselige) lægemiddelstoffer kan indkapsles i den indre vandige kerne eller associeres til overfladen af liposomerne, mens hydrofobe (fedtopløselige) lægemiddelstoffer kan indlejres i selve membranstrukturen. Liposomernes egenskaber kan nøje kontrolleres via deres kemiske sammensætning, som bestemmer deres smeltepunkt og dermed deres fleksibilitet samt deres fysiske egenskaber såsom størrelse og antallet af dobbeltlag. Liposomer er oftest opbygget af fosfolipider og kolesterol. Ordet liposom kommer af de græske ord lipo, som betyder fedt, og some, der betyder krop; dvs. fedtkrop. FASTE LIPIDNANOPARTIKLER ET DEPOT I HUDEN Faste lipidnanopartikler (Solid Lipid Nanoparticles, SLN) er fremstillet af lipider med et smeltepunkt over kroppens temperatur. Den faste struktur gør nanopartiklerne mere stabile i huden og fastholder en større mængde lægemiddelstof i huden end ved brug af traditionelle cremer eller salver. Nanopartiklerne har typisk en diameter på nm og lægemiddelstoffet inkorporeres i partiklen eller associeres til partiklens overflade. Partiklernes egenskaber kan kontrolleres via sammensætningen af lipiderne. øges ved at udstyre liposomernes overflade med et stof, som binder til en receptor på hudcellerne. Ved hjælp af denne metode kan man muligvis fastholde lægemiddelstoffet på det rigtige sted i huden, hvorved man præcist kan ramme de syge celler og hindre stoffet i at nå helt ind til blodbanen. Disse liposomer er under afprøvning i en dyremodel for psoriasis i mus. Nanopartikler forstærker huden Forsøg med grisehud har vist, at ca. 25 procent mere af det applicerede lægemiddelstof fastholdes i huden ved brug af faste lipidnanopartikler sammenlignet med en almindelig salve. Det betyder, at det er muligt at reducere den totale mængde påført lægemiddelstof samt at behandle mindre hyppigt. Man kan især opnå en god depoteffekt i huden, hvis hudens barriere er intakt eller forbedres under behandlingen. Der er også lavet forsøg, som viser, at fedtstoffer fra faste lipidnanopartikler findes oven på huden eller i hornlaget, hvilket sandsynliggør, at partiklerne kan virke forstærkende på hudens barriereegenskaber. Yderligere forsøg i en dyremodel for børnekesem i mus skal sammenligne faste lipidnanopartiklers egenskaber med en markedsført formulering til behandling af børneeksem. Mange hudsygdomme er kroniske og indebærer en livslang medicinering. Det gør det ekstra vigtigt at minimere eventuelle bivirkninger ved behandlingen. Anvendelse af fedtbaserede nanopartikler har derfor et stort potentiale for udvikling af behandlinger, som er bedre og mere risikofri end de nuværende metoder. Cand.pharm. Louise Bastholm Jensen er ErhvervsPh.d.-studerende på Institut for Farmaci og Analytisk Kemi og LEO Pharma A/S Cand.scient. Nina Østergaard Knudsen er ErhvervsPh.d.-studerende på Institut for Farmaci og Analytisk Kemi og LEO Pharma A/S Ph.d. Karsten Petersson er Senior Scientist på LEO Pharma A/S Ph.d. Jens Hansen er Corporate Vice President på LEO Pharma A/S Ph.d. Camilla Foged er lektor på Institut for Farmaci og Analytisk Kemi Ph.d. Hanne Mørck Nielsen er lektor på Institut for Farmaci og Analytisk Kemi 12 lægemiddelforskning 2010

13 Strukturer af membranproteiner: Nøglen til rationelt lægemiddeldesign De fleste lægemidler virker ved at binde sig til proteiner i cellemembranen. Derfor er kendskab til humane membranproteiner en uvurderlig hjælp, når man designer nye lægemidler, men desværre er det ekstremt svært at bestemme deres strukturer. Små krystaller med tilsvarende membranproteiner fra bakterier kan afsløre strukturen ved brug af intens røntgenstråling. Af Helle Hald og Osman Mirza Membranproteiner er cellernes omstillingsbord forbindelsen mellem omverdenen og cellernes indre og opklaring af deres strukturer er i den absolutte frontlinie af biokemisk forskning. I dag kan man ved hjælp af røntgenkrystallografi bestemme den tredimensionelle opbygning af de store proteinmolekyler helt ned til en detaljeringsgrad, der afslører de indbyrdes positioner af de enkelte atomer i proteinet. Oplysningerne er nyttige for forståelsen af membranproteiners virkningsmekanismer, og de kan anvendes i praksis ved udvikling af nye lægemidler. Størstedelen af alle lægemiddelstoffer virker nemlig ved at binde sig til et membranprotein, og derfor er kendskab til membranproteiners strukturer en stor hjælp, når man skal designe nye lægemidler. Det er simpelt hen nemmest at fremstille en nøgle til en lås, når man kender låsens form. Imidlertid er det ekstremt svært at opklare strukturen af humane membranproteiner, og på verdensplan har man endnu kun bestemt den atomare opbygning af 12 af menneskets i alt 7000 membranproteiner. Problemet er, at proteinerne kollapser og ændrer form, når de fjernes fra deres naturlige miljø i den fedtholdige cellemembran, Derfor skal de pakkes ind i sæbemolekyler, når de tages ud af membranen og dyrkes som krystaller, og ofte lykkes det kun at fremstille krystaller, som er så små, at det er umuligt at bestemme proteinets struktur selv med intens røntgenstråling fra store acceleratorer. I de seneste par år har området imidlertid været inde i en rivende udvikling, og nye metoder til proteinfremstilling og krystallisation har øget antallet af kendte strukturer af membranproteiner fra et halvt hundrede stykker i 2000 til omkring 250 i dag. De fleste strukturer stammer fra bakterier. Peptidtransportør i tarmen Vi fokuserer på et membranprotein i tarmcellerne, som spil- Opklaring af proteinstrukturer: En gradvist roterende proteinkrystal bestråles med intens røntgenstråling. Krystallen spreder røntgenstrålen, og der dannes spredningsmønstre. Ud fra spredningsmønstrene fremstilles et tredimensionelt kort over elektronernes placering i krystallen. Kortet bruges til at bygge en model af proteinets struktur, som viser de enkelte atomers art og indbyrdes positioner i proteinmolekylet. det farmaceutiske fakultet, københavns universitet 13

14 MODEL AF PEPTIDTRANSPORTØREN Virkningsmekanismen af den humane peptidtransportør er ikke opklaret eksperimentelt, men der er udviklet en teoretisk model, som er baseret på strukturel viden om andre typer transportører: I hvilepositionen befinder peptidtransportøren sig i en strukturel form, hvor de aktive områder vender udad på cellens overflade. Områderne, som består af aminosyrer, er bevarede gennem evolutionen og er derfor uændrede mellem bakterielle og humane peptidtransportører. Det er kendskabet til disse aminosyrers tredimensionelle placering, der kan udnyttes til at designe lægemidler, som genkendes af peptidtransportøren. Opformering af gensplejsede bakterier i laboratoriet. Bakterierne producerer det humane membranprotein, som derpå krystalliseres. KRYSTALDYRKNINGENS SVÆRE KUNST Krystaller er opbygget af millioner af ens molekyler arrangeret i lange rækker af symmetriske formationer. For at lave en krystal af et protein kræves der store mængder af proteinet, som typisk fremstilles i genmodificerede organismer såsom bakterier eller gær. Vi opformerer bakterierne i laboratoriet, hvor de producerer den bakterielle peptidtransportør, inden vi slår dem i stykker og isolerer proteinet fra celleresterne. Når man arbejder med membranproteiner, er det ofte et problem, at værtsorganismen kan dø, hvis man tvinger den til at producere for store mængder protein. Den største udfordring er imidlertid fremstillingen af selve proteinkrystallen. Det er meget vanskeligt at krystallisere membranproteiner, fordi de består af en vandafvisende og en vandelskende del, som henholdsvis befinder sig inde i cellemembranen og udenfor cellen. Proteinets kombinerede hydrofobe og hydrofile egenskaber vanskeliggør den tætte pakning af molekyler, der kræves for at opbygge en krystal, fordi de to dele afviser hinanden på samme måde som ensrettede poler på to magneter. Løsningen er at tilsætte en mild sæbeopløsning til opløsningen med proteinet. Sæben består af små molekyler med en vandafvisende og en vandelskende del, og når sæbemolekylerne blander sig med proteinmolekylerne, formindskes den indbyrdes frastødning mellem proteinerne. 14 lægemiddelforskning 2010

15 Når transportørens substrater en proton samt et peptid er til stede, vil den gensidige tiltrækningskraft mellem de aktive områder og substraterne føre til dannelsen af et kompleks, hvor protonen og peptidet bindes til transportøren. Som følge af peptidbindingen ændres transportørens form, så der opstår et mellemstadium. Dernæst dannes et stadium, hvor protonen og peptidet vender indad i cellen. Dette medvirker til, at både protonen og peptidet frigøres fra peptidtransportøren. Denne tomme peptidtransportør ændrer derefter form tilbage til hvilepositionen. ler en central rolle, når medicin indtages i tabletter, hvilket er tilfældet med langt de fleste lægemidler. Forudsætningen for, at medicinen virker, er, at tabletten først bliver nedbrudt i mave-tarm-systemet. Derefter skal det aktive lægemiddelstof transporteres fra tarmen over i blodet, som fører stoffet hen til det organ, hvor det skal udøve sin effekt. Transporten fra tarmen til blodbanen finder ofte sted med hjælp fra membranproteiner, som sidder på cellerne i tarmvæggen. De kaldes for transportører og sender små molekyler, som ellers ville være blevet tilbageholdt i tarmen, ind i blodet. Vi forsker i den humane peptidtransportør hpept1, som fragter små peptider med to eller tre aminosyrer gennem tarmvæggen. Peptiderne er typisk nedbrydningsprodukter fra føden, men da transportøren er ret uspecifik, kan den også sende peptidlignende lægemiddelstoffer ind i blodet, og det gør membranproteinet yderst interessant i forbindelse med design af lægemidler. Til trods for peptidtransportørens vigtige funktion kender man ikke strukturen, fordi det er meget vanskeligt at arbejde med menneskelige membranproteiner i laboratoriet. Derfor har vi valgt at undersøge en række peptidtransportører, som evolutionært er relateret til hpept1. Et eksempel er et membranprotein fra kolibakterier, som kaldes YjdL, og som er bakteriens version af transportøren. Bakteriers membranproteiner er ofte mere stabile end de tilsvarende humane proteiner, og derfor er de som regel nemmere at arbejde med. Strukturel information om kolibakteriens transportør kan bruges til at designe en model af menneskets peptidtransportør med hjælp fra en computer, fordi den overordnede struktur af de to evolutionært beslægtede proteiner må forventes at være meget ens. Røntgenkrystallografi på accelerator Vi har udviklet en metode til at producere store mængder af peptidtransportøren YjdL i genmodificerede bakterier, der fungerer som små proteinfabrikker, og vi har fremstillet små krystaller af membranproteinet, som vi har undersøgt på en stor partikelaccelerator i Schweiz. Swiss Light Source er en ringformet synkrotron, hvori bundter af elektroner cirkulerer ved nær lysets hastighed. Flere steder i ringen passerer elektronerne særlige konfigurationer af magneter, der kaldes undulatorer. De får elektronerne til at løbe slalom, og når elektronernes baner krummes, udsender de meget intens røntgenstråling. Den stærke stråling er fokuseret i en ekstremt tynd stråle, hvilket gør det muligt at bestemme proteinstrukturer ud fra langt mindre krystaller end normalt. Til bestemmelse af et proteins tredimensionelle struktur bruger vi en metode, som kaldes røntgenkrystallografi. Ved eksperimenterne bestråles en gradvist roterende krystal af proteinet med røntgenstråling. Røntgenstrålen spredes af de elektroner, som omgiver atomerne i krystallen, hvilket resulterer i spredningsmønstre, hvis udseende afhænger af proteinmolekylets struktur. Ud fra mønstrene beregner man på en computer et tredimensionelt kort over positionerne af elektronerne i proteinet. Med dette kort som udgangspunkt bygger man så en model over proteinets rumlige facon og atomstruktur, som viser de enkelte atomers art og indbyrdes positioner i proteinet. Vore undersøgelser af krystallerne med bakteriens peptidtransportør tegner lovende, men resultaterne er endnu ikke gode nok til, at vi kan bestemme strukturen. Derfor arbejder vi med at optimere forskellige trin i processen, og vi håber på snart at få resultater af en kvalitet, som kan føre til strukturbestemmelse af YjdL. På den måde vil vi få nyttige oplysninger om den tilsvarende humane peptidtransportør, som kan udnyttes til design af nye lægemidler til indtagelse gennem munden. Ph.d. Helle Hald er postdoc på Institut for Medicinalkemi Ph.d. Osman Mirza er lektor på Institut for Medicinalkemi det farmaceutiske fakultet, københavns universitet 15

16 Ny viden om antimon ny indsigt i glemt tropesygdom Lægemidler baseret på grundstoffet antimon er gennem 80 år blevet brugt til at behandle tropesygdommen leishmaniasis. Alligevel er virkningsmekanismen ukendt. Nye opdagelser om antimons kemi kan bane vej for bedre lægemidler. Drømmen er tabletter frem for injektioner eller drop. Det vil overflødiggøre indlæggelse og være en stor fordel i udviklingslandene. Af Claus Hansen, Bente Gammelgaard, Stefan Stürup og Helle Rüsz Hansen Tropesygdommen leishmaniasis rammer to millioner mennesker om året, og dog har de færreste i Danmark hørt om den. Det er en parasitsygdom, som kan være dødelig, hvis den ikke behandles. Leishmania-parasitten overføres ved bid af en sandflue. Når parasitten er kommet ind i kroppen, vil immunforsvarets celler makrofagerne opsluge den for at uskadeliggøre den. Makrofagerne dræber normalt alle fremmede organismer, som kommer ind i kroppen, men desværre har parasitterne tilpasset sig til dette, så de dør ikke, når makrofagerne æder dem. Tværtimod er det kun ved at blive spist af makrofagerne, hvori de lever og deler sig, at parasitterne kan overleve i mennesket. Alvorligheden af sygdommen afhænger af parasitternes art. De milde former giver kun læsioner i huden, mens den alvorligste form angriber organer som lever, milt og knoglemarv. Det fører til døden i 95 procent af tilfældene, hvis sygdommen ikke behandles. Af de to millioner årlige sygdomstilfælde er med den alvorligste form, og omkring mennesker dør hvert år af leishmaniasis. Antimonlægemidler Heldigvis findes der lægemidler mod sygdommen, og de mest anvendte er baseret på grundstoffet antimon. Antimonlægemidler har været brugt mod leishmaniasis i over 80 år og anvendes stadig i dag, fx på Rigshospitalet, hvis danskere er blevet smittet under rejser i troperne. De nuværende lægemidler har dog mange ulemper, og deres virkningsmekanisme er stort set ukendt. Forskning på Institut for Farmaci og Analytisk Kemi har nu bragt os et par skridt nærmere på en forståelse af mekanismen. Analyseproblemer undervejs førte endda til, at vi opdagede helt nye egenskaber ved antimons opførsel i biologiske prøver. Antimon har det kemiske tegn Sb, og grundstoffet kan ek- 16 lægemiddelforskning 2010

17 sistere opløst i to forskellige former Sb(III) og Sb(V). De oprindelige antimonholdige lægemidler var baseret på Sb(III), men for 50 år siden gik man over til Sb(V)-forbindelser, som fortsat bruges i dag. Sb(III) var effektivt i lavere doser, men desværre også temmelig giftigt, så det gav mange bivirkninger. Sb(V) giver færre bivirkninger, men alligevel udvikler patienterne ofte symptomer på forgiftning. Ved behandlingen skal lægemidlet indgives dagligt i mindst tre uger og i nogle tilfælde gennem adskillige måneder enten som indsprøjtninger eller i drop. Det er meget upraktisk i udviklingslandene, hvor der er langt mellem hospitalerne. I løbet af en kur på tre uger kan en patient komme op på at få 17 gram antimon sprøjtet ind i kroppen. Virkningsmekanismen er ukendt. Man regner dog med, at det faktisk er Sb(III), som er aktivt så når man giver Sb(V), skal dette først omdannes til Sb(III). Der har længe været delte meninger om, hvor omdannelsen foregår. Nogle mener, at det sker, når Sb(V) kommer ind i parasitten, mens andre mener, at omdannelsen finder sted inde i de makrofager, hvor parasitterne lever og formerer sig. Ingen havde imidlertid målt, om der faktisk foregår en omdannelse i makrofagerne, så derfor besluttede vi at undersøge dette. Model for makrofager I samarbejde med Erik Wind Hansen på Institut for Farmakologi og Farmakoterapi dyrkede vi en cellelinje som en model af kroppens makrofager. Cellelinien er oprindeligt opformeret ud fra en human kræftcelle, men cellerne har egenskaber, som i høj grad ligner normale makrofagers egenskaber. For at være sikker på, at det kemiske miljø i cellerne var som i rigtige makrofager, testede vi først, om cellerne kunne danne reaktive iltforbindelser som brintoverilte. Det gør makrofager nemlig, når de har optaget en fremmed organisme, som skal slås ihjel; og de kemiske processer i forbindelse med brinoverilte-produktionen kan være vigtige for, om Sb(V) omdannes til Sb(III). Dannelse af brintoverilte måles ved at tilsætte stoffet luminol til cellerne. Når luminol reagerer med brintoverilte, udvikles der lys. Derfor kan man måle, om cellerne begynder at lyse, når de bliver provokeret med fremmede mikrobiologiske stoffer, ganske som når immunforsvarets makrofager stimuleres og går til angreb på en fremmed organisme i kroppen. I forsøgene dyrkede vi cellelinien sammen med Sb(V)-lægemidlet Pentostam og stimulerede cellerne med cellevægge fra gær. Derpå lavede vi ekstrakter af makrofager til analyse af, om Sb(V) var blevet omdannet til Sb(III). Ekstraktion og måling Ekstrakterne blev analyseret ved hjælp af højtryksvæskekromatografi (HPLC). Her sprøjtes nogle få µl prøve i en væskestrøm, der pumpes igennem en kolonne, som er et rør pakket med porøst materiale. Sb(V) og Sb(III) binder til kolonnematerialet i forskellig grad og bevæger sig derfor gennem kolonnen med hver deres hastighed, så de kommer ud af kolonnen på to forskellige tidspunkter. Derved får man de to former adskilt, så man kan detektere dem hver for sig. For at bestemme mængderne af henholdsvis Sb(V) og Sb(III) brugte vi induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICPMS). Her forstøves væsken fra kolonnen i en dyse og suges ind i en 6000 C varmt plasma. Den høje temperatur nedbry- Leishmania-parasittens livscyklus: En blodsugende sandflue overfører parasitten til et menneske. Immunforsvarets makrofager sluger parasitten for at dræbe den. Parasitten overlever og formerer sig inde i makrofagerne. Lægemiddelstoffet antimon indgives i blodet som Sb(V). Sb(V) omdannes til den mere potente form Sb(III) inde i makrofagerne, hvor stoffet slår parasitterne ihjel. det farmaceutiske fakultet, københavns universitet 17