Elektroforese. Navne: Rami Kassim Kaddoura Roman Averin Safa Sarac Magnus Høegh Jensen Frederik Gaarde Lindskov

Transkript

1 Elektroforese Navne: Rami Kassim Kaddoura Roman Averin Safa Sarac Magnus Høegh Jensen Frederik Gaarde Lindskov Klasse: 1.4 Fag: Biologi Vejleder: Brian Christensen Skole: Roskilde tekniske gymnasium, Htx Dato:

2 Indledning I biologi har vi beskæftiget os med at undersøge DNA-profil virus, og det gjorde vi ved at fremstille DNA-profilet for virusset. Vi var meget nøjagtige da vi udførte forsøget. Inden vi gik i gang med at lave forsøget, havde vi en forventning af at vi kunne udføre forsøget uden problemer, og at vi kunne komme frem til de forventede resultater. Da vi havde læst øvelsesvejledningen, var vi klar over at vi skulle være opmærksomme på udførelsen af forsøget med en nøjagtighed, dels fordi materialerne skulle behandles med en hygiejne og dels fordi vi skulle arbejde med virus. Vi har i gruppen udført forsøget uden problemer Resultatet af forsøget var som forventede. Formål Formålet med elektroforese øvelsen er, at finde ud af hvor restriktion enzymerne klipper i DNA et. Vi har ingen kvalificerede bud på, hvor de vil skære DNA et, udover fra den figur i det udleverede kompendium, der viser hvor de forskellige restriktions enzymer skærer DNA et. Ud fra de resultater vi vil få, vil vi kunne opnå en større indsigt i hvad man kan bruge elektroforese til, og vi vil også være i stand til at gentage forsøget, dog med andre restriktions enzymer. Materialer 10 mikro-gram tørret lambda dna tilsat farve, i en lille beholder der frastøder indholdet. Tre slags restriktionsenzymer, hendholdsvis: BamHI EcoRI HindIII Destilleret vand Gel TBE buffer Maling til farvning af DNA Lille kar med tilhørende kam til at lave brønde i gelen. kulfiber-plader strømforsyning mikro-liter pipettet 2 af 11

3 Fremgangsmåde Vi startede med at få udleveret de fleste remedier, her i blandt dna'et og restriktionsenzymerne. vi gik i gang med at opløse den tørrede dna klump, hvilke vi gjorde ved at hælde 10 mikro-liter i den lille tube hvor dna'et lå i bunden. Vi satte prop på og rystede et par minutter til det var opløst. Da det var opløst hældte vi 20 mikro-liter af det ned i fire lidt mindre farvede tuber. De tre af dem var der ét af hver restriktionsenzym, mens den sidste var til kontrol. Vi lod det blive opløst og stilte dem derefter i ovnen ved ca 30 grader da det er dér enzymerne arbejder bedst. Efter en lille uge skulle vi i laboratorie igen, og denne gang startede vi med at få udleveret kammen og karret Vi satte kammen i og hældte gel i til første kant, hvorefter vi lod det stå i køleskabet. Så hældte vi bufferen i, og blandede enzymerne (som nu ikke rigtig er enzymer, men derimod små dna stykker) og hældte farve i, således at man kunne se hvor langt de røg hen. Det hældte vi så ekstremt forsigtigt ned i de små brønde. Hver restriktionsenzym fik en brønd hver. Vi noterede ned hvor hvilke lå, og klippede kulfiber-pladerne ud så de passede ned i karret. Sidst men ikke mindst satte vi 36v til og ventede i to timer. 3 af 11

4 Fremgangsbilleder Dag 1 i laboratoriet Her tilsatte vi 100µL destilleret vand ned i bægret ned til det tørrede lambda DNA. Vi tilsatte det destilleret vand omhyggeligt, og det foregik på den måde at vi sugede 10µL 10 gange op og hældte det i det lille bægre. Billedet er lidt utydeligt Vi rystede forsigtigt bægret med DNA et så det hele blev blandet sammen. Her har vi så et billede af vores fire små bægre med fire forskellige enzymer i, hvori vi havde tilsat 20µL af vandet med lambda DNA et. Så havde vi fyldt vores elektroforesekar op med gele, og lavede små brønde vha. et redskab der mindede om en kam med store tænder. Derefter tilsatte vi TBE buffer til bægrene med enzymerne og hældte dem omhyggeligt i vores brønde. 4 af 11

5 Så lagde vi elektroder ned i karet, en i hver ende så der kunne ledes strøm igennem. Dag 2 i laboratoriet Vi tilsatte et farveopløseligmiddel (0,04% Azure A og 20% Ethanol) Det havde vi på i fire minutter inden vi skulle skylde det af igen. Billedet er lidt utydeligt Her har vi så det endelige resultat, hvor man kunne se hvordan DNA et havde lagt sig. 5 af 11

6 Resultater og teori I dette afsnit vil vi redegøre for teorien bag stoffet, og vi vil forklare bla. dna'ets og restriktionsenzymernes opbyggning og deres funktioner. Hvis vi skal starte helt fra bunden består et DNA af en lang snørklet spiral af 4 forskellige baser (Adenin, Guanin, Thymin og Cytosin) sat sammen i en nøje forudbestemt rækkefølge overfor hindanden. Det er nemlig rækkefølgen der bestemmer rækkefølgen af aminosyrer i det protein som DNA'et koder for. Det et restriktionsenzym så gør, er at den deler de to strenge i dobbelt-spiralen. Alt afhængig af hvad det er for et, finder og skær det lige den del af DNA'et der har den rækkefølge af de 4 baser, som den er programmeret til. F.eks. klipper restriktionsenzymet BamHI når den ser base rækkefølgen (Forkortet med forbogstav) GATCC, og det bliver den så ved med ind til der ikke er flere steder den rækkefølge er i det pågældende DNA. Det kan man bla. bruge i medicinalindustrien, hvor de har nogle restriktionsenzymer der klipper lige de steder de godt vil have. De tager så det stykke DNA ud som den har klippet og sætter fast på f.eks. en bakterie På den måde har bakterien (hvis det ellers passer med baserne og den har optaget det nye DNA) fået de egenskaber lige præcis den sammensætning af baserne koder for. Det er det samme princip vi arbejder efter når vi laver elektroforese. Vi har de tre forskellige restriktionsenzymer, og vi har et stykke lambda-dna. Efter vi har klippet det i stykker, lagt det ned i gelen og sat strøm til, kan vi observere at det bevæger sig. Det gør det fordi strømmen bevæger sig igennem gelen, og eftersom de fosfatgrupper der binder baseparrene er negativt ladet, bevæger de klippede DNA stykker sig hen mod plus. Grunden til at man kan se noget er fordi de store stykker bevæger sig langsomt gennem gelen, mens de små bevæger sig hurtigt. På den måde kan man se hvilket restriktionsenzym der har klippet de mindste stykker. Det bliver samtidig delt ind i klumper, med samme længde DNA. Grunden til at vi hældte farve i (såkaldt loading dye ) er for at kunne se hvor langt de forskellige størrelser af DNA er nået. Ellers er DNA'et normalt gennemsigtigt (i vores tilfælde var der faktisk allerede tilsat en anelse farve for at vi kunne se om det var ordentlig opløst i vandet). 6 af 11

7 Det er efter samme princip man laver DNA-profiler af folk. Der findes nemlig (så vidt vides) ikke to personer der har præcis den samme sammensætning af baserne. Derfor vil restriktionsenzymerne klippe forskellige steder, og på den måde får vi forskellige størrelser, hvilke selvfølgelig medvirker at DNA'et fra to mennesker ikke vil bevæge sig ens. Fejlkilder Der kan begås mange fejl i denne øvelse. Den hyppigste er at komme til at røre ved pipetterne så de ikke længere er sterile. Vi begik den fejl at komme til at røre ved pipetten, men ud fra vores endelige resultat, så det ikke ud til at have påvirket. I hvert fald ikke synligt. 7 af 11

8 Konklusion og diskussion (individuelt) Magnus Høegh Jensen: Diskussion Vores gruppe udviste stor nøjagtighed og præcision omkring forsøget, og vi fik som belønning et rigtig godt kar tilbage. Vi foretog ikke nogle målinger på, men sammenlignede dog med billedet i kompendiet. Så vidt vi kunne se var der ingen af dem der havde bevæget sig nær så langt (eventuel fejlkilde omkring strøm/tid med strøm), men det var alligevel tydeligt hvordan de havde bevæget sig i forhold til hinanden. Alt i alt synes vi det passede meget godt med hvad vi regnede med. Konklusion Det lykkedes os med stort held at klippe lambda-dna'et i stykker med de udleverede restriktionsenzymer, og vi fik nogenlunde de resultater vi havde regnet med. Da det er så småt er det ikke så nemt at aflæse. Vi har fået større indsigt i sammensætningen af DNA, og specielt lært rent laboratorisk hvordan de arbejder med DNA i f.eks. medicinalindustrien. Frederik Gaarde Lindskov Konklusion Vores DNA havde flyttet sig som det skulle, men vi havde også været forsigtige, både da vi behandlede pipetterne og da vi hældte buffer i. Vores resultat var mindre tydeligt end jeg havde regnet med, men jeg havde også en forestilling om at det ville være meget tydeligt. Vi fik dog at vide at vores så god ud, så jeg er tilfreds. Diskussion Vores øvelse gik godt. Det eneste man kunne have gjort for at perfektionere øvelsen, var at bruge gummihandsker hele tiden, for at forhindre at man pletter pipetterne med sit eget DNA. 8 af 11

9 Rami Kassim Kaddoura Konklusion Efter min vurdering synes jeg at selve forsøget gik udmærket eftersom alle grupperne fulgtes ad. Vi fik undervejs nye informationer om hvad der skulle laves, og efter min mening så var det en strålende idé at gøre det på den måde. Team-worket i gruppen var rigtig god, da vi alle delte arbejdet lige op og lavede næsten lige meget hver, sådan så vi alle deltog i hvad der skete. Alle I gruppen var ekstra forsigtige i at tage spidsen til sprøjterne op af glasset, for det måtte helst ikke blive beskidt da det kunne påvirke vores forsøg. Jeg fik tilegnet mig viden omkring de enzymer der var med i forsøget, om hvad deres egenskaber var og sådan. Så fik jeg også dannet et overblik over hvordan DNA strengene ville bevægede sig og ligge sig i elektroforesekaret efter der blev tilsluttet strøm til. Diskussion Resultatet blev udmærket, men det var nu heller ikke os der fik tilsluttet strøm til elektroforesekaret, men det blev stadig et fint resultat. Jeg vidste i forvejen godt at DNA strengene ikke måtte nå at komme ned i brøndene da det kunne have indflydelse på vores forsøg, og da vi så havde kigget på det færdige resultat, så var der ingen af strengene der nåede at komme tæt på brønden, så det må være positivt. Vores resultat lignede også alle andres, så det betød jo også at det blev et godt resultat. Det der så kunne have været gjort bedre, var at vi burde have været meget mere omhyggelige med spidserne til sprøjterne, også selvom vi var det fra start af, men vi havde under forsøget ingen anden alternativ idé til at tage dem op af glasset uden hænder. Roman Averin Diskussion: Ved elektroforese øvelsen er, at finde ud af hvor restriktion enzymerne klipper i DNA et. Det der bekymrede mig var, om forsøget ville blive rigtigt lavet. Fordi vi lavede nogle små fejl, ville forsøget ikke gå op. Ville det have en stor påvirkning på forsøget. Og ville måske ikke komme frem til de rigtige resultater. 9 af 11

10 Konklusion: Vi kan efter dette forsøg konkludere at DNA-elektroforese gik godt. Vi fandt ud af, at der ikke findes to personer der har præcis den samme sammensætning af DNA. Fordi restriktionsenzymerne klippes i forskellige steder, og på den måde får vi forskellige størrelser, og hvilke selvfølgelig medvirker at DNA'et fra to mennesker ikke vil bevæge sig ens. Vores resultater fulgte klart det mønster der var forventet. Vi lavede nogle små fejl under forsøget, men jeg må konkludere at dette forsøg er vellykket. Safa Sarac Konklusion Vi har opnået vores mål ved at fremstille virus. Vi arbejdet meget grundigt med forsøget, hvor vi var nøjagtige og i disse sammenhænge arbejdet vi ret god sammen i gruppen. Vores resultater var som vi forventede, og vi nåede frem til nogle ret gode resultater (resultaterne er dog ikke tal, men det vi kunne se), det var så ikke os der satte karret med enzymerne nede i ovnen, men jeg tror ikke at det har været det største problem (det var Brian der havde sat dem). Vores dna stykker blev synlig som vi forventede, eftersom én af vores gruppemedlem hældt farven ned i karet, samtidig med at én anden fra gruppen tog tid på det. Vi kunne i den sidste ende sé DNA-stykkerne, og det synes jeg var fortryllende fordi det er noget meget interessant at man kan se- og fremstille de bitte små dna-stykker (synes jeg personligt), og på den måde lærte vi at fremstille det i en laboratorium. Diskussion Som sagt har vores gruppe arbejdet med en stor nøjagtighed, og eftersom vi var nøjagtige med forsøget, havde vi fået et ret godt kar. Med blåt øje kunne vi se at dna-strengene havde bevæget sig. Den eneste fejlkilde kan jo være hvor langt de har bevæget sig, men det så ud til at strenge havde bevæget sig som forventede. 10 af 11