Forbrugerens egen fødevarekontrol

Forbrugerens egen fødevarekontrol Måling af indholdsstoffer og sprøjtemiddelrester med Ramanteknologi Eva Rosenqvist og Carl-Otto Ottosen Afdeling for Havebrugsproduktion, Danmarks Jordbrugsforskning, Årslev John Erland Østergaard, Søren Hassing og Kit Drescher Jernshøj. Syddansk Universitet, Odense

Måling af indholdsstoffer og sprøjterester med Raman-teknologi 2 Kortfattet slutrapport 1 : Forbrugerens egen fødevarekontrol Måling af indholdsstoffer og sprøjterester med Ramanteknologi Eva Rosenqvist og Carl-Otto Ottosen Afdeling for Havebrugsproduktion, Danmarks Jordbrugsforskning, Årslev John Erland Østergaard, Søren Hassing og Kit Drescher Jernshøj. Syddansk Universitet, Odense Resume Projektet har været fokuseret på en indledende eksperimentel undersøgelse af naturlige og ikke-naturlige indholdsstoffer i grøntsager, frugt og rodfrugt ved hjælp af spektrofotometri og Ramanspektroskopi. De ikke-naturlige indholdsstoffer er repræsenteret af pesticiderne pirimicarb og lambda-cyhalothrin og de naturlige indholdsstoffer udgøres af glukose, sukrose og stivelse, som har betydning for kvaliteten af frugt og grønsager. Hensigten med dette forprojekt var at undersøge, om det ved hjælp af den eksisterende Ramanspektroskopi opsætning var muligt direkte at bestemme indholdet af pesticider på overfladen af eller i grøntsager eller frugt med en hurtig ikke destruktiv metode. Dette kan være vigtigt for at vurdere muligheden for sprøjtemiddelrester på overfladen af frugt og grønsager eller restindhold af sprøjtemidler. Desuden ville vi undersøge mulighed for at bestemme et naturligt indhold af sukker og stivelse i henholdsvis frugt og rodfrugter. Med henblik på at undersøge muligheden for at anvende resonansramanspektroskopi på frugt/grønsager er der gennemført målinger af UV-VIS absorptionsspektre af både pesticid- og sukkeropløsninger. Ramanundersøgelsen, der er foretaget med en excitationsbølgelængde på 532 nm, er foretaget på såvel pesticider i koncentreret form som på brugsopløsninger, men i sidste ende ikke på sprøjtede frugter, da signalerne fra brugsopløsninger var for svage. Desuden er der optaget Ramanspektre af forskellige sukkerarter henholdsvis på pulverform og i opløst form. Ramanmålingerne er foretaget på et endnu ikke færdigudviklet Ramanspektrometer tilkoblet et mikroskop (Ramanmikroskop). Formålet med at anvende et mikroskop er senere at kunne foretage 2D 1 En mere omfattende teknisk rapport er vedlagt som bilag 1.

Måling af indholdsstoffer og sprøjterester med Raman-teknologi 3 Ramanmålinger og derved opnå såvel rumlig som spektral opløsning. Konklusionen er, at med den nuværende opsætning er måleteknikken ikke tilstrækkelig præcis til at opnå signaler af en acceptabel kvalitet fra indholdsstoffer i form af brugsopløsninger pesticider og sukkerstoffer og stivelses. Årsagerne skal både søges i, at visse af stofferne ikke reagerer optimalt med den nuværende laserfarvesætning og at stofferne har meget specifikke raman spektre. Teknikken er som sådan en lovende mulighed for kontaktfri ikke destruktiv måling, men viser sig at kræve en del mere grundlæggende forskning og udvikling inden målet er nået. Baggrund Fødevarekvalitet er en afgørende salgs- og markedsføringsparameter for både producenter og i stigende omfang også detailleddet. Både leverandører, slutbrugere samt forskellige kontrolfunktioner har interesse i hurtigt og sikkert at kunne kontrollere kvaliteten af f.eks. grønsager og frugter - både hvad angår produkternes kemiske sammensætning (f.eks. indhold af potentielt sundhedsgavnlige planteindholdsstoffer), modenhed (sukkerindhold og -sammensætning) og deres indhold af kemiske sprøjtemidler uanset om det er over eller under den acceptable restindhold. Pesticidrester kan komme fra kemiske, der er systemiske, dvs. optaget i frugt og grønsager, mens de fleste stoffer stammer fra rester af sprøjtemidler, bruges på overfladen enten som svampebekæmpelse eller for at forebygge skader under lagring. Formål Idéen bag projektet var at udvikle håndholdte målemetoder, som såvel forbrugere, leverandører og kontrolfunktioner kan anvende til måling af sprøjtemiddelrester og indholdsstoffer i plantedele. Dette kunne på længere sigt fungere som tværfaglige samarbejder og bidrage til at profilere Danmark som producent af højkvalitetsfødevarer. Metoder og resultater Ramanspektroskopi er en veldokumenteret optisk målemetode, der anvendes til såvel kvalitativ såvel som kvantitativ analyse af molekylære systemer. Målingerne udføres ved at belyse det molekylære system med en laser med passende bølgelængde og analyserer derpå spektralfordelingen i det spredte (reflekterede) lys. Ramanspektroskopi kan udføres på præparerede præparater (opløsninger, faste stoffer) og in situ ved anvendelse af overfladeprobe eller i kombination med et optisk mikroskop. Teknikken er ligesom IR-spektroskopi en vibrationsspektroskopisk metode. Ved IR-

Måling af indholdsstoffer og sprøjterester med Raman-teknologi 4 spektroskopi anslås vibrationer i molekylet ved absorption af infrarødt lys. Ved Ramanprocessen anslås molekylets vibrationer ved spredning af det indkommende laserlys. Da energien af det indkommende laserlyser lig summen af energien af det Ramanspredte lys og den anslåede vibration, vil bølgelængden af det Ramanspredte lys kun afvige lidt fra bølgelængden af laserlyset. Ramanspektrene har et højt indhold af molekylær information. Derved opnås et "unikt" fingeraftryk for de undersøgte molekyler. Det betyder på dan anden side, at for at opnå det optimale resultat skal laserens spektrallinier være meget tilpasset til det aktuelle præparat ellers bliver signalet for svagt. Laserens farve er derfor kritisk for at kunne måle forskellige indholdsstoffer med forskellige karakteristika. Ramanmålingerne er foretaget på eksisterende udstyr, der er under udvikling. På alle Ramanspektrene ses en generende sinuslignende baggrund, som skyldes interne refleksioner i udstyrets optik. Baggrunden, der er mest udtalt ved måling på lave signalværdier, vanskelig gør tolkningen af spektrene, idet Ramansignalerne, der ikke er ret kraftige, let forsvinder. Pesticider Indledningsvis blev udført Ramanspektroskopi på pesticiderne på granulatform for at få en indikering af overgangenes placering. Årsagen hertil er, at det ikke i anden litteratur eller i databaser har været muligt at lokalisere Ramanspektre af pesticiderne, der kunne anvendes som referencespektre. Spektrene viser, at det er muligt med det nuværende udstyr at optage Ramanspektre af pesticiderne på koncentreret form. Pesticiderne forekommer typisk på frugter og grøntsager i en meget svagere koncentration end undersøgt her i dette forprojekt, hvilket gør detektionen af pesticiderne vanskelig med udstyret og de valgte metoder anvendt i undersøgelsen alene. En efterfølgende optimering af metoden med henblik på at opnå en højere intensitet af Ramansignalet bør bestå i: 1. at anvende overfladeforstærket Raman (SERS) 2. at anvende resonans-ramanspektroskopi, dvs. den exciterende laserbølgelængde placeres i det ultraviolette område Dog kræver løsningen under punkt to, at det forinden undersøges og overvejes nøje, hvor tæt på resonans laserbølgelængden kan placeres. Valg af en anden lasertype er også en mulighed. Årsagen hertil er, at pesticiderne absorberer stærkt i dette område, hvilket vil kunne initiere en kemisk omdannelse, således at undersøgelsen foretages på ukendte molekylære strukturer og ikke det oprindelige kemiske stof.

Måling af indholdsstoffer og sprøjterester med Raman-teknologi 5 Sukker Alle sukkerarterne og stivelsen blev i første omgang undersøgt på fast form. I eksperimentet med glukose er anvendt druesukker og i eksperimentet med sukrose er anvendt hvidt sukker. Der vil naturligvis forekomme andre molekylære forbindelser i alle emnerne, dog formodes de at være til stede i meget små mængder. I eksperimentet med stivelse er anvendt kartoffelmel, som har et højt indhold af stivelse. Ved iagttagelse af absorptionsspektrene ses det, at den anvendte bølgelængde ligger i et område, hvor pesticiderne samt glukose og sukroseopløsningerne absorberer meget lidt eller slet ikke. Når metoden skal anvendes til en bestemmelse af sukkerforbindelser i f.eks. frugt eller rodfrugter er det hensigtsmæssigt, ud fra refleksions- og transmissionsmålinger af henholdsvis skræl og skind, at optimere transmissionsvinduet for den exciterende laserbølgelængde. Der bør derfor i den videre undersøgelse optages refleksions- og transmissionsspektre med henblik på at fastlægge et passende vindue. Konklusion og perspektivering Ramanmålingerne, der er udført på både granulater, frugter og rodfrugter er meget vellykkede. Det ses generelt af Ramanspektrene for både pesticider og sukkeropløsninger, at der er tale om meget svage signaler. Så for at nå det optimale resultat skal laserens spektrallinier være meget tilpasset til det aktuelle præparat og så langt er vi ikke kommet med dette forprojekt. Den sinuslignende baggrund, der kan ses på alle spektrene, vil selvfølgelig blive elimineret ved færdigudvikling af udstyret. Endvidere vil resonans-ramanspektroskopi ligeledes kunne forsøges anvendt i detekteringen af sukkerforbindelser, hvilket betyder en placering af den exciterende laserbølgelængde i det ultraviolette område. Der er i dette forprojekt lagt vægt på med Ramanudstyret at foretage en kvalitativ analyse. Ved en fortsættelse af projektet bør dette udvides med en kvantitativ analyse. Der er således med denne indledende undersøgelse skabt basis for en videreudvikling og optimering af Ramanudstyr og metode til in vitro og in vivomålinger på frugter, rodfrugter og grøntsager. Specielt skal optimeringen rumme en videreudvikling af 2D-Ramanmikroskopet med for at opnå rumlig og spektral information på en gang.

Odense d. 4. juli 2006 Bilag 1 Naturlige og ikke-naturlige indholdsstoffer i fødevarer undersøgt ved hjælp af Ramanspektroskopi og spektrofotoskopi af Eva S. K. Rosenqvist, Carl Otto Ottesen, John Erland Østergaard, Søren Hassing og Kit Drescher Jernshøj. Abstract Denne rapport omhandler en fortrinsvis eksperimentel undersøgelse af naturlige og ikke-naturlige indholdsstoffer i grøntsager, frugt og rodfrugt foretaget ved hjælp af spektrofotometri og Ramanspektroskopi. De ikke-naturlige indholdsstoffer er repræsenteret ved pesticiderne pirimicarb og lambda-cyhalothrin og de naturlige indholdsstoffer udgøres af glukose, sukrose og stivelse. Hensigten med dette forprojekt er, at undersøge om det ved hjælp af Ramanspektroskopi er muligt direkte at detektere pesticider på grøntsager eller frugt samt om det er muligt at detektere et naturligt indhold af sukker og stivelse i henholdsvis frugt og rodfrugter. Med henblik på at undersøge muligheden for at lave resonansramanspektroskopi er der optaget UV-VIS absorptionsspektre af både pesticid- og sukkeropløsninger. Ramanundersøgelsen, der er foretaget med en excitationsbølgelængde på 532 nm, er foretaget på såvel pesticider i koncentreret form (granulat) som på brugsopløsninger. Desuden er der optaget Ramanspektre af de forskellige sukkerarter henholdsvis på pulverform og i en opløsning. Ramanmålingerne er foretaget på et endnu ikke færdigudviklet Ramanspektrometer tilkoblet et mikroskop (Ramanmikroskop). Formålet med at anvende et Ramanmikroskop er senere at kunne foretage 2D Ramanmålinger og derved opnå såvel rumlig som spektral opløsning.

Introduktion til undersøgte pesticider og sukkerforbindelser 2 1 Introduktion til undersøgte pesticider og sukkerforbindelser Enkelte relevante kemiske data præsenteres indledningsvis for de undersøgte indholdsstoffer. 1.1 Pesticider Følgende findes en opremsning af forskellige kemiske karakteristika for to forskellige pesticider, der tilhører gruppen af insekticider. 1. Pirimor G - grønligt granulat Anvendes til insektbekæmpelse (lus) i bl.a. korn, æbler, blommer, kirsebær, ærter, kål, agurk, peber og tomat. C 11 H 18 N 4 O 2 Molvægt, MW = 238,3 g/mol Brugsopløsning: 50 g pr. 100 l H 2 O hvilket svarer til en 2,1 10 3 molær opløsning. 2. Karate 2,5 WG - hvidt granulat Anvendes til insektbekæmpelse i bl.a. korn, raps, æbler, hindbær, solbær, ribs, stikkelsbær, jordbær, ærter, kål og kratofler. C 23 H 19 ClF 3 NO 3 Molvægt, MW = 449,9 g/mol Brugsopløsning: 20-40 g pr. 100 l H 2 O hvilket svarer til en 6,67 10 4 molær opløsning. Pirimor G og Karate 2,5 WG er handelsnavne, forbindelserne benævnes ligeledes efter den aktive, i biologisk sammenhæng, part af molekylet. Pirimor G benævnes derfor også pirimicarb og tihører gruppen af carbamate insekticider. Denne gruppe er igen underinddelt, hvor pirimicarb er et dimethyl carbamate insekticid. Den kemiske betegnelse for pirimicarb er 2-(dimethylamino)-5,6- dimethyl-4-pyrimidinyl dimethylcarbamate. Karate 2,5 WG benævnes lambda-cyhalothrin og tilhører gruppen af pyrethroid insekticider og undergruppen pyrethroid ester insekticider. Den kemiske betegnelse er rel-(r)-cyano(3-phenoxyphenyl)methyl(1s,3s)-3-[(1z)- 2-chloro- 3,3,3-trifluoro-1-propenyl]-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate. Stofferne er molekylært opbygget som vist på figurerne 1, 2 og 3. Molekylerne har den samme konstitutionsformel men er strukturelt opbygget forskelligt. Lambda-cyhalothrin indeholder begge isomere. Kromoforen i pirimicarb er pymiridinringen, der udgøres af den aromatiske

1.1 Pesticider 3 ring med to nitrogenatomer. Fig. 1: Molekylær opbygning af lambda-cyhalothrin, (S)-alcohol (Z)-(1R)-cis-acid [5]. Fig. 2: Molekylær opbygning af lambda-cyhalothrin, (R)-alcohol (Z)-(1S)-cis-acid [5]. Fig. 3: Molekylær opbygning af pirimicarb [5].

1.2 Glukose, fruktose, sukrose og stivelse 4 1.2 Glukose, fruktose, sukrose og stivelse Glukose C 6 H 12 O 6, der er et monosakkarid, tilhører gruppen aldose. Desuden er glukose en hexose, idet molekylet er bygget op omkring 6 C-atomer. Glukose eksisterer i både en D- og en L-konfiguration, dog forekommer kun D-glukose naturligt. D-glukose benævnes ligeledes dextrose. De molekylære opbygninger af D-glukose og L-glukose udgør spejlbilleder af hinanden. Den molekylære opbygning af den åbne D-glukosekonfiguration kan iagttages på figur 4. Fig. 4: Molekylær opbygning af D-glukose. Desuden kan åbne glukosemolekyler i en vandig opløsning danne to forskellige lukkede ringforbindelser. Disse benævnes pyranose, når der er tale om en ring bygget op omkring seks C-atomer. De to forskellige molekylære ringstrukturer α/β forekommer i forholdet 36:64. Den molekylære opbygning af de lukkede D-glukosekonfigurationer kan iagttages på figur 5 og 6. Fig. 5: Molekylær opbygning af α-d-glukose. Fruktose C 6 H 12 O 6, der ligeledes er et monosakkarid, tilhører den anden af to grupper, som udgør monosakkariderne, nemlig ketose. Den molekylære opbygning af fruktose kan iagttages på figur 7. Fruktose er ligeledes en hexose og forekommer også i henholdsvis en åben og lukket forbindelse. Molvægten for fruktose er 180,2 g/mol. Sukrose C 12 H 22 O 11, der kendes som almindeligt hvidt sukker, er et dis-

1.2 Glukose, fruktose, sukrose og stivelse 5 Fig. 6: Molekylær opbygning af β-d-glukose. Fig. 7: Molekylær af fruktose. opbygning akkarid. Den molekylære opbygning af sukrose kan ses på figur 8. Et disakkarid er to monosakkarider kædet sammen ved hjælp af en kovalent binding. Sukrose udgøres af en kovalent binding af et glukose- og fruktosemolekyle. Molvægten for sukrose er 342,3 g/mol. Fig. 8: Molekylær opbygning af sukrose [4]. Stivelse, der er et polysakkarid, findes i to forskellige udgaver: amylose (20-30 %) og amylopectin (70-80 %).

1.2 Glukose, fruktose, sukrose og stivelse 6 Fig. 9: Molekylær opbygning af amylose [6]. Fig. 10: Molekylær opbygning af amylopectin [6].

UV-VIS spektre 7 2 UV-VIS spektre Absorptionsspektrene er optaget på et spektrofotometer af typen Perkin Elmer, Lambda 900. Der er opstået en fejl i spektrofotometret, som kræver service fra Perkin Elmer, hvilket ikke har kunne nåes indenfor tidsrammerne for dette forprojekt. Fejlen har imidlertid kun betydning såfremt bølgelængdeområdet i intervallet ca. 1400 til 2000 anvendes. Derfor ses på absorptionsspektrene for glukose og sukrose en del støj i omtalte område og de spektrale variationer i dette område bør efterfølgende valideres andetsteds. Data, der præsenteres i det efterfølgende afsnit, er lavpasfiltreret i det omfang, som det er skønnet nødvendigt. 2.1 Pesticider Efterfølgende ses absorptionsspektrene for de i nærværende rapport undersøgte pesticider. 2.5 2.0 pirimicarb Absorbans, AU 1.5 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 800 Bølgelængde, nm Fig. 11: Absorptionsspektret for pirimicarb optaget i området 185-800 nm. Det ses af absorptionsspektret på figur 11, at pirimicarb hovedsalig absorberer i det ultraviolette område, dog forekommer der en mindre absorptionstop omkring 620 nm. Det ses af absorptionsspektret på figur 12, at lambda-cyhalothrin ligeledes absorberer i det ultraviolette område.

2.2 Naturlige indholdsstoffer 8 0.6 0.5 lambda cyhalothrin Absorbans, AU 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 200 300 400 500 600 700 800 Bølgelængde, nm Fig. 12: Absorptionsspektret for lambda-cyhalothrin optaget i området 185-800 nm. 2.2 Naturlige indholdsstoffer I dette afsnit præsenteres absorptionsspektrene for glukose (druesukker) og sukrose (hvidt sukker). 0.25 glukose 0.20 Absorbans, AU 0.15 0.10 0.05 0.00 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 Bølgelængde, nm Fig. 13: Absorptionsspektret for glukose optaget i området 185-2000 nm. Det ses af absorptionsspektrene på figur 13 og 14, at glukose og sukrose

Ramanspektroskopi 9 1.0 0.8 sukrose Absorbans, AU 0.6 0.4 0.2 0.0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Bølgelængde, nm Fig. 14: Absorptionsspektret for sukrose optaget i området 185-2000 nm. hovedsalig absorberer i det ultraviolette samt i det nærinfrarøde område. 3 Ramanspektroskopi 3.1 Hvad er Ramanspektroskopi? Ramanspektroskopi er en veldokumenteret optisk målemetode, der anvendes til såvel kvalitativ såvel som kvantitativ analyse af molekylære systemer. Målingerne udføres ved at belyse det molekylære system med en laser med passende valgt bølgelængde og analysere spektralfordelingen i det spredte (reflekterede) lys. Ramanspektroskopi kan udføres på præparerede samples (molekylære opløsninger, faste stoffer) og in situ ved anvendelse af fiberprobe eller i kombination med et optisk mikroskop. Ramanspektroskopi er ligesom IR-spektroskopi en vibrationsspektroskopisk metode. Ved IR-spektroskopi anslås vibrationer i molekylet ved absorption af infrarødt lys. Ved Ramanprocessen anslås molekylets vibrationer ved spredning af det indkommende laserlys. Da energien af det indkommende laserlys er lig summen af energien af det Ramanspredte lys og den anslåede vibration, vil bølgelængden af det Ramanspredte lys kun afvige lidt fra bølgelængden af laserlyset. Ramanspektrene har et højt indhold af molekylær information, idet de er karakteriseret ved meget smalle spektrallinier. Derved opnås et unikt fingeraftryk for de undersøgte molekyler.

3.2 Forsøgsopstilling- og parametre 10 Ved passsende valg af laserbølgelængde er det muligt at opnå IR-information om det indre af et materiale, f.eks æblekøddet. En anden fordel ved Ramanspektroskopi er, at spredningsprocessen ikke er afhængig af den valgte laserbølgelængde. Valget af laserbølgelængde kan derfor fastlægges ved analyse af refleksions- og transmissionspektre af emnet, f.eks skindet fra æblet. Vælges laserbølgelængden så den matcher eller ligger tæt på en elektronisk overgang for de undersøgte molekyler, er der tale om resonans-ramanspektroskopi. Med denne udgave af Ramanspektroskopi er det muligt at forøge intensiteten af det spredte lys væsentligt (ca. 10 5 gange). Ved at optage UV-VIS absorptionsspektre er det muligt at fastlægge, hvor de elektroniske overgang i molekylet er placeret bølgelængdemæssigt. Endelig er det muligt at forøge intensiteten af det spredte lys ved at anvende overfladeforstærket Raman (SERS). Ved SERS bringes stoffet, der undersøges, i tæt kontakt med en nanostruktureret metaloverflade (ofte sølv). Ved SERS-processen kan opnås en kraftig forstærking af Ramansignalet på op til 10 14 gange. Intensiteten af Ramansignalet bliver herved sammenligneligt med intensiteten opnået ved fluorescens samtidig med, at Ramansignalets molekylespecificivitet bevares. Den store forstærkning bevirker endvidere, at det er muligt at detektere meget små koncentrationer. SERS-processen er derfor genstand for meget stor forskningsinteresse i disse år. 3.2 Forsøgsopstilling- og parametre Den anvendte Ramanopstiiling består i hovedtræk af en laser, et mikroskop, et spektrometer, hvori dispersionen af signalet finder sted, og en CCDdetektor tilkoblet en computer. Ramaneksperimenterne er udført ved anvendelse af en Nd:YAG (frekvensdoblet) diodepumpet laser (ventus 532), med en bølgelængde på 532 nm og mikroskopopstillingen, der kan iagttages på figur 15 og 16, i et 180 setup. Herved skal forstås, at excitations- og observationsretning ligger i samme plan, men er modsat rettede. Spektrometret er fra Princeton Instruments og af typen Acton SpectraPro 2500i, CCD-kameraet er et PIXIS camera 100 og mikroskopet er et Olympus BX60. Det er observeret under eksperimenterne, at lasereffekten reduceres ca. 10 gange ved passage af mikroskopopstillingen. Under forsøgene med pesticider og sukkerarter i opløsninger har disse været anbragt i en cylindrisk lukket prøveholder. Der har desuden været anvendt følgende indstillinger af Ramanudstyret ved

3.2 Forsøgsopstilling- og parametre 11 Fig. 15: På figuren ses udstyret, der har været anvendt til optagelse af Ramanspektrene. Fig. 16: På figuren ses udstyret, der har været anvendt til optagelse af Ramanspektrene.

Ramanspektroskopi på pesticider 12 måling på pesticiderne. Lasereffekt ved prøven: ca. 10 mw på granulat både 10 og 50 mw på brugsopløsning Antal akkumuleringer: 5 Integrationstid: 10 s på granulat 20 s på brugsopløsning Objektiv: x 10 og 20 CCD-temperatur: 65 C Den nøjagtige lasereffekt ved prøven varierer ikke nævneværdigt fra det angivne i nogen af forsøgene. Data, der præsenteres i de efterfølgende afsnit, er ligeledes lavpasfiltreret i det omfang, det er skønnet nødvendigt. Desuden er data, som stammer fra fejl i udstyret, fjernet. 4 Ramanspektroskopi på pesticider Ramanmålingerne i efterfølgende afsnit er foretaget på udstyr, der er under udvikling. På alle Ramanspektrene ses en generende sinuslignende baggrund, som skyldes interne refleksioner i udstyrets optik. Ved færdigudviklingen af udstyret fjernes denne fejl hardwaremæssigt. Baggrunden, der er mest udtalt ved måling på lave signalværdier, vanskeliggør tolkningen af spektrene, idet Ramansignalerne, der ikke er ret kraftige, let forsvinder. Indledningsvis blev udført Ramanspektroskopi på pesticiderne på granulatform for at få en indikering af overgangenes placering. Årsagen hertil er, at det ikke i anden litteratur eller i databaser har været muligt at lokalisere Ramanspektre af pesticiderne, der kunne anvendes som referencespektre. På figur 17 ses et Ramanspektrum af pirimicarb på granulatform. Spektret er optaget ved anvendelse af et x20 objektiv. På figur 18 ses et udsnit af spektret vist på figur 17, med de fundne overgange og deres respektive placeringer indikeret. På figur 19 ses et Ramanspektrum af lambda-cyhalothrin på granulatform. Spektret er i første omgang optaget med en effekt ved prøven på 10 mw. Det ses af spektret på figur 19, at det ikke har været muligt at påvise overgange med det anvendte udstyr. Eksperimentet er gentaget med en effekt

3293.21873 Ramanspektroskopi på pesticider 13 12000 10000 pirimicarb, granulat 8000 6000 4000 2000 0 1000 1500 2000 2500 3000 Fig. 17: På figuren ses Ramanspektret af pirimicarb på granulatform. 12000 pirimicarb, granulat 2400.25609 2341.25678 10000 2525.231 8000 6000 1983.47376 2579.64591 4000 1718.37547 1785.54699 2000 1803.88462 1750 2000 2250 2500 2750 Fig. 18: På figuren ses et udsnit af spektret fra figur 17, med overgange indikeret. ved prøven på 20 mw, hvilket giver et stort set identisk spektrum. Det er derfor ikke forsøgt, at optage spektre af lambda-cyhalothrin i en brugsopløsning. På figur 20 ses et Ramanspektrum af pirimicarb opløst i vand fra hanen til

Ramanspektroskopi på pesticider 14 7000000 6000000 lambda cyhalothrin, granulat 5000000 163.90644 4000000 3000000 2000000 1000000 0 1000 1500 2000 2500 3000 Fig. 19: På figuren ses et Ramanspektrum af lambda-cyhalothrin på granulatform. en brugsopløsning. Effekten ved prøven var i dette tilfælde 10 mw. 800 700 600 1071.97702 pirimicarb brugsopløsning 500 400 300 200 100 0 2596.7 2840.58775 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 Fig. 20: På figuren ses et Ramanspektrum af pirimicarb i en brugsopløsning, effekten ved prøven var 10 mw. På figur 21 ses et Ramanspektrum af pirimicarb i en brugsopløsning, hvor effekten ved prøven var 50 mw. Som det fremgår af spektrene på figur 20 og 21 opnås ikke yderligere information ved anvendelse af højere effekt ved prøven. På figur 22 ses et Ramanspektrum til identifikation af overgangene hidrørende fra vand.

Ramanspektroskopi på pesticider 15 18000 16000 14000 pirimicarb brugsopløsning 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 Fig. 21: På figuren ses et Ramanspektrum af pirimicarb i en brugsopløsning, effekten ved prøven var 50 mw. 800 vand 600 400 1081.4 2592.8 200 2845.2 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Fig. 22: På figuren ses et Ramanspektrum af vand fra hanen. Det kan af spektrene præsenteret i dette afsnit konkluderes, at det er muligt med det nuværende udstyr at optage Ramanspektre af pesticiderne på koncentreret form. Det ses dog af figurerne 20, 21 og 22 at overgangene på spektrene optaget på en brugsopløsning hidrører fra vand. Det er derfor, ved anvendelse af udstyret til en detektering af pesticider på f.eks overfladen af frugt, nødvendigt

Ramanspektroskopi på naturlige indholdstoffer 16 at udvikle målemetoden yderligere. Dette kunne f.eks indebære en udvikling af et system, der gør brug af enten resonansraman eller overfladeforstærket Ramanspektroskopi. 5 Ramanspektroskopi på naturlige indholdstoffer Der har været anvendt følgende indstillinger af Ramanudstyret ved måling på de forskellige sukkeropløsninger og fødevarer. Lasereffekt ved prøven: ca. 20 mw Antal akkumuleringer: 5 for æble, vand og sukrose på fast form 3 for kartoffel, glukose og stivelse henholdsvis som opløsning og på fast form og sukrose som opløsning. Integrationstid: 20s 10 s for æble, vand og sukrose på fast form 20 s for kartoffel, glukose og stivelse henholdsvis som opløsning og på fast form og sukrose som opløsning. Objektiv: x10 CCD-temperatur: 65 C På spektrene 23, 24 og 25 ses henholdsvis Ramanspektre af glukose, sukrose og stivelse samt udvalgte områder herfra. Alle sukkerarterne og stivelsen blev i første omgang undersøgt på fast form. I eksperimentet med glukose er anvendt druesukker og i eksperimentet med sukrose er anvendt hvidt sukker. Der vil naturligvis forekomme andre molekylære forbindelser i alle emnerne, dog formodes de at være til stede i meget små mængder. I eksperimentet med stivelse er anvendt kartoffelmel. På figur 26 ses et Ramanspektrum af en glukoseopløsning. Opløsningen udgøres af dextrose (druesukker), der er knust og opløst i vand. På figur 27 ses et Ramanspektrum af en sukroseopløsning. Opløsningen udgøres af hvidt sukker opløst i vand. Herefter vil der blive præsenteret Ramanspektre af æbler og kartofler henholdsvis med og uden skind og skræl. På figur 28 ses et spektrum optaget igennem æbleskindet. Skiven var lavet således, at der desuden var æblekød på skindet, som vendte imod glaspladen.

Ramanspektroskopi på naturlige indholdstoffer 17 14000 12000 stivelse, pulver glukose, pulver sukrose, pulver 10000 8000 6000 4000 2000 0 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Fig. 23: På figuren ses Ramanspektre af glukose, sukrose og stivelse. 15000 12500 10000 7500 5000 2500 654.7 677.5 stivelse, pulver glukose, pulver sukrose, pulver 785.2 808 928.3 938.8 870.6 860.8 877.5 935.2 956 956.2 1032 1050.1 1085.7 1065.7 1093.8 1171.3 1139.1 1137.8 1173.2 1186.6 1142.5 1161.9 1249.4 1275 1289.4 1306.1 1336.5 1359.3 1378.4 1274.5 1341.8 1372.3 1346.3 1389.7 1466 1472.1 1470.9 1765.5 1795.4 1782.1 528.5 800 1000 1200 1400 Fig. 24: På figuren ses relevant udsnit af spektret på figur 23. Det er ikke muligt, at konstatere overgange på spektret. På figur 29 ses et spektrum optaget direkte på æblekøddet. Saften i æblet fungerer som naturlig køling, det er derfor ikke muligt, at iagttage brænd-

Ramanspektroskopi på naturlige indholdstoffer 18 2256.1 2262.3 2281 2342.4 8000 6000 4000 2000 2893.6 2905 2911.3 2922.5 2251.9 2268.2 2946.6 2973.2 2983 3000.1 3221.9 3242.8 3259.6 3283.2 stivelse, pulver glukose, pulver sukrose, pulver 2953 2968.5 2980.9 2994.3 3003.9 3023.1 3229.6 3247.1 3263 3297.3 3314.5 3333.5 3392.9 2700 2800 2900 3000 3100 Fig. 25: På figuren ses relevant udsnit af spektret på figur 23. 1000 1072.8 glukoseopløsning 800 3288.5 600 400 2594.1 200 2840.3 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Fig. 26: På figuren ses et Ramanspektrum af en glukoseopløsning. mærker efter laseren. Af spektrene på figur 30 og 31 ses det, at det er glukose og vand i æblet, der bidrager med linier.

Ramanspektroskopi på naturlige indholdstoffer 19 3279.2 800 sukroseopløsning 600 1067.2 400 200 2847.9 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Fig. 27: På figuren ses et Ramanspektrum af en sukroseopløsning. 60000 50000 æble m. skind 40000 30000 20000 10000 0 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Fig. 28: På figuren ses et Ramanspektrum af et æble med skind. Der var efter forsøget et synligt lille brændmærke efter laseren. På figur 32 ses et Ramanspektrum af en kartoffel optaget igennem skrælen. Det var her, i modsætning til ved æblet, ikke muligt at konstatere nogen ødelæggelse af overfladevævet efter påvirkning med laseren. På figur 34 ses et Ramanspektrum af en kartoffel, som er optaget på det hvide kød. Der er ligeledes tilstrækkeligt stort væskeindhold i kartoflen til, at dette kan fungere som køling.

Ramanspektroskopi på naturlige indholdstoffer 20 1200 1167.2 æble 1000 1082.3 800 600 1019 1530.3 400 2591 200 2860.8 0 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Fig. 29: På figuren ses et Ramanspektrum af æblekøddet. Det var ikke muligt at iagttage synlige mærker efter laseren ved undersøgelse af prøven under mikroskopet. 14000 12000 10000 8000 6000 4000 stivelse, pulver glukose, pulver sukrose, pulver æble 2000 0 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Fig. 30: På figuren ses et Ramanspektrum af æblekøddet. Ved at betragte spektrene på figur 34 og 35 ses det, at forbindelserne, der bidrager til spektret for kartoflen er glukose og vand. Ramanspektrene optaget på både æble og kartoffel igennem henholdsvis skræl og skind indikerer, at der her er brug for yderligere tiltag. Det er ikke muligt på spektrene, at iagttage overgange. Optagelse af refleksions- og

Ramanspektroskopi på naturlige indholdstoffer 21 528.5 15000 12500 10000 7500 5000 2500 654.7 677.5 785.2 808 stivelse, pulver glukose, pulver sukrose, pulver æble vand 928.3 938.8 870.6 860.8 877.5 935.2 956 956.2 1032 1050.1 1085.7 1065.7 1093.8 1171.3 1139.1 1137.8 1173.2 1186.6 1142.5 1161.9 1167.2 1249.4 1275 1289.4 1306.1 1336.5 1359.3 1378.4 1274.5 1341.8 1372.3 1346.3 1389.7 1081.4 800 1000 1200 1400 1466 1472.1 1470.9 1530.6 1765.5 1795.4 1782.1 2251.9 2268.2 2220.5 2239.7 2256.1 2262.3 2281 2342.4 2262.3 2279.5 2302.1 2334 Fig. 31: På figuren ses et Ramanspektrum af æblekøddet. Det var ikke muligt at iagttage synlige mærker efter laseren ved undersøgelse af prøven under mikroskopet. 8000 kartoffel m. skræld 6000 4000 2000 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Fig. 32: På figuren ses et Ramanspektrum af en kartoffel med skræl. Det var ikke muligt at iagttage synlige mærker efter laseren ved undersøgelse af prøven under mikroskopet. transmissionspektre af henholdsvis skræl og skind fra kartoffel og æble vil afsløre om et mere optimalt valg af bølgelængde kan finde sted.

Ramanspektroskopi på naturlige indholdstoffer 22 1000 1074.6 1169.7 kartoffel 750 500 1527.1 2593.8 2842 250 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Fig. 33: På figuren ses et Ramanspektrum af en kartoffel uden skræl. Det var ikke muligt at iagttage synlige mærker efter laseren ved undersøgelse af prøven under mikroskopet. 14000 12000 10000 kartoffel stivelse, pulver glukose, pulver sukrose, pulver vand 8000 6000 4000 2000 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Fig. 34: På figuren ses et Ramanspektrum af en kartoffel uden skræl samt til sammenligning spektrene for glukose, sukrose, stivelse og vand.

Ramanspektroskopi på naturlige indholdstoffer 23 15000 12000 kartoffel stivelse, pulver glukose, pulver sukrose, pulver vand 1139.1 1171.3 1341.8 1372.3 1466 2251.9 2268.2 528.5 9000 6000 3000 654.7 785.2 808 870.6 860.8 877.5 928.3 938.8 935.2 956.2 956 1032 1050.1 1085.7 1065.7 1093.8 1081.4 1137.8 1173.2 1186.6 1142.5 1161.9 1074.6 1169.7 1249.4 1289.4 1275 1306.1 1336.5 1359.3 1378.4 1274.5 1346.3 1389.7 1472.1 1470.9 1527.1 750 1000 1250 1500 1765.5 1795.4 1782.1 2220.5 2239.7 2256.1 2262.3 2281 2342.4 2262.3 2279.5 2302.1 2334 Fig. 35: På figuren ses et udsnit af spektrene vist på figur 34.

Konklusion og perspektivering 24 6 Konklusion og perspektivering Det ses generelt af Ramanspektrene for både pesticider og sukkeropløsninger, at der er tale om meget svage signaler. Ved iagttagelse af absorptionsspektrene ses det, at den anvendte bølgelængde ligger i et område, hvor pesticiderne samt glukose og sukroseopløsningerne absorberer meget lidt eller slet ikke. Ramanmålingerne, der er udført på både granulater, frugter og rodfrugter er meget vellykkede. Detektering af pesticider Pesticiderne forekommer typisk på frugter og grøntsager i en meget svagere koncentration end undersøgt her i dette forprojekt, hvilket gør detektionen af pesticiderne vanskelig med udstyret anvendt i undersøgelsen alene. En efterfølgende optimering af metoden med henblik på at opnå en højere intensitet af Ramansignalet bør bestå i: 1. at anvende overfladeforstærket Raman (SERS) 2. at anvende resonans-ramanspektroskopi, dvs. den exciterende laserbølgelængde placeres i det ultraviolette område Dog kræver løsningen under punkt to, at det forinden undersøges og overvejes nøje, hvor tæt på resonans laserbølgelængden kan placeres. Årsagen hertil er, at pesticiderne absorberer stærkt i dette område, hvilket vil kunne initiere en kemisk omdannelse, således at undersøgelsen foretages på ukendte molekylære strukturer. Detektering af sukkerforbindelser Når metoden skal anvendes til en detektering af sukkerforbindelser i f.eks frugt eller rodfrugter er det hensigtsmæssigt, ud fra refleksions- og transmissionsmålinger af henholdsvis skræl og skind, at optimere transmissionsvinduet for den exciterende laserbølgelængde. Der bør derfor i den videre undersøgelse optages refleksions- og transmissionsspektre med henblik på at fastlægge et transparent vindue. Endvidere vil resonans-ramanspektroskopi ligeledes kunne forsøges anvendt i detekteringen af sukkerforbindelser, hvilket betyder en placering af den exciterende laserbølgelængde i det ultraviolette område. Der er i dette forprojekt lagt vægt på med Ramanudstyret at foretage en kvalitativ analyse. Ved en fortsættelse af projektet bør dette udvides med en kvantitativ analyse. Den sinuslignende baggrund, der kan iagtages på alle spektrene, vil selvfølgelig blive elimineret ved færdigudvikling af udstyret.

Litteratur 25 Der er således med denne indledende undersøgelse skabt basis for en videreudvikling og optimering af Ramanudstyr og metode til in vitro og in vivo målinger på frugter, rodfrugter og grøntsager. Specielt skal optimeringen indbefatte en videreudvikling af 2D-Ramanmikroskopet med henblik på at opnå rumlig og spektral information på en gang. Litteratur [1] Zhang, P.X.; Zhou, Xiaofang; Cheng, Andrew Y.S.; Fang, Yan: Raman Spectra from Pesticides on the surface of Fruits, Journal of Physics: Conference Series 28 (2006)7-11. [2] Armenta, S; Quintás, G.; Garrigues, S.; Guardia, M. de la: Mid-infrared and Raman spectrometry for quality control of pesticide formulations, Trends in analytical Chemistry, Vol.24, No.8, 2005. [3] Sato-Berrú, R. Ysacc; Medina-Valtierra, Jorge; Medina-Gutiérrez, Cirilo; Frausto-Reyes, Claudio: Quantitive NIR-Raman analysis of methylparathion pesticide microdroplets on aluminium substrates, Spectrochimica Acta Part A 60 (2004)2231-2234. [4] http://chemistry.about.com [5] http://www.alanwood.net, f.eks http://www.alanwood.net/pesticides/pirimicarb.html [6] http://www.lsbu.ac.uk