ORIGINALARTIKEL Sammenligning af to forskellige testmetoder til diagnosticering af Giardia hos hund - begge testmetoder var fejlbehæftede, og der opnås forskellige resultater ved brug af forskellige testmetoder [ Hanne Kirk Nielsen 1 og Asger Lundorff Jensen 2 ] 1 Fagdyrlæge, Frederiksværk Dyrehospital, Hermannsgade 16, 3300 Frederiksværk 2 Professor, DVM, ph.d., Dr.Vet. Sci, DiplECVCP, DiplECVIM-Ca, Institut for Mindre Husdyrs Sygdomme/Medicin, Klinisk Patologi, KU LIFE, Grønnegaardsvej 3, stuen, 1870 Frederiksberg C Indledning Giardia er en flagelbærende protozo, der tilhører klassen zoomastigophora, ordenen diplomonadida og familien hexamitidae (1). Giardia spp. findes hos alle vertebrater over hele verden. Mennesket synes at være det primære reservoir (2). Parasitten findes i en trophozoitform og en cysteform (2). Trophozoiten er det patogene stadie. Den er ikke invasiv, men lever frit i tyndtarmen, hvor den reproducerer sig ved deling (3). Tropho- zoiterne encysterer sig i ileum eller colon, og cysterne udskilles med fæces. Udskillelsen af cyster begynder 5-12 dage efter optagelsen. Der er intermitterende cysteudskillelse (4), og negative perioder på 20-30 dage er beskrevet hos mennesker (5). Cysteudskillelse kan forekomme i måneder til år (4). Giardiasmitten forekommer ved fæcal-oral kontakt (3). En Giardiainfektion forårsager villusatrofi med malabsorbtion og maldigestion (6). Symptomerne > Summary An ELISA test (IDEXX Snap Giardia) (SNAP) for use within veterinary small animal practice was crosschecked against an immunofluorecense assay (Merifluor Cryptosporidium/Giardia Direct Immunfluorescens Assay) (IFA). This study showed that there was no correlation between the results of the SNAP test and the results of the IFA test. The probability of getting a positive result was 6 times greater using the SNAP test than using the IFA test. Further data used for this study came from two different laboratories: Vet Med Lab (VML) and the Central Laboratory at KU LIFE (KVL). VML tests for Giardia using an ELISA test: ProSpecT Giardia Microplate Assay (ProSpecT). KVL uses the IFA test. The results were not paired, but were from samples sent by Danish veterinarians during the last 5 years. There was a significant difference in the proportion of positive results found by the Pro- SpecT test compared with the IFA test. The study concluded that both test methods seemed to be imperfect and that different test results occurred when using different test methods. Sammendrag En ELISA test, IDEXX Snap Giardia (SNAP) til brug i smådyrspraksis blev afprøvet mod en immunfluorescens test (Merifluor Cryptosporidium/Giardia Direct Immunfluorescens Assay (IFA)). Undersøgelsen viste, at der ikke var nogen sammenhæng mellem de resultater, som SNAP testen frembragte og de resultater, der blev fundet på de samme prøver ved hjælp af IFA testen. Sandsynligheden for at få et positivt resultat var 6 gange større ved brug af SNAP testen end ved IFA testen. Resultater af prøver indsendt til to forskellige laboratorier: Centrallaboratoriet på KU LIFE (KVL) og Vet Med Lab (VML) indgik desuden i undersøgelsen. Prøvene fra VML blev undersøgt ved hjælp af en ELISA test: ProSpecT Giardia Microplate Assay (ProSpecT). KU LIFE bruger IFA testen. Resultaterne var ikke parrede, men var fra prøver indsendt af danske dyrlæger over de sidste 5 år. Der var signifikant forskel på proportionen af positive tests, fundet ved ProSpecT test i forhold til IFA testen. Undersøgelsen viste, at begge testmetoder var fejlbehæftede, og at der opnås forskellige resultater ved brug af forskellige testmetoder.
kan være konstante eller intermitterende. Der kan forekomme mavesmerter og intestinal hypermotilitet. Feber og vomitus eller hæmorragisk diarré er ikke typisk ved giardiose (7,8) Kronisk diarré og vægttab eller nedsat tilvækst forekommer ofte hos hvalpe og killinger (8). Sygdommen kan være asymptomatisk, men kan udvikle sig til kronisk malabsorptionssyndrom (4). Voksne dyr optræder ofte som symptomløse cysteudskillere (7). Histologisk ses infiltration af lymfocytter og plasmaceller i tarmen (4). Giardiose menes at være en zoonose (2). Infektioner hos mennesker og husdyr skyldes G. duodenalis (syn. G. lamblia/ G. intestinalis) (1). Parasitten vil i det følgende kun blive benævnt Giardia. Med Giardia menes Giardia duodenalis med undergrupper. Diagnostik For at stille diagnosen kan immunologiske metoder eller direkte mikroskopi benyttes. Der er desuden PCR undersøgelser under udvikling. I det følgende introduceres de metoder, der drøftes i denne artikel. Ova- og parasitmetoder, direkte mikroskopi (O&P) Giardia trophozoiter kan ses i dråbepræparat af fæces ved høj forstørrelse. Cysterne ses bedst ved opkoncentrering. Almindelige flotationsmedier til diagnosticering af andre tarmparasitter destruerer cysterne. Der bør opsamles 3 fæcesprøver grundet den intermitterende cysteudskillelse (7). IFA testen udføres på fæces, der er opbevaret i 10 % neutral formalin, da cysterne ellers går i opløsning. Testen er designet til human brug. ELISA ELISA tests reagerer på overfladeantigener. Antigenet er GSA65, der både findes på cysten og trophozoiten eller CWP1, som findes på cysternes overflade, men også frigives ved encystering. Der er tale om et stabilt vandopløseligt protein (10). Testen kan uføres på frisk fæces eller fæces, der er opbevaret i formalin. Testen er designet til human brug. IDEXX Snap Giardia (SNAP) Denne test kan udføres i klinikken. Det er en ELISA test, der skal laves på frisk fæces. Dette kan dog opbevares på køl i op til 7 dage. Testen er designet til brug på hund og kat. Formål Formålet med denne undersøgelse var at undersøge anvendeligheden af SNAP testen ved sammenligning med en kendt test (IFA) Materialer og metoder Eget materiale Fæcesprøver blev indsamlet fra hunde, der indgår i Frederiksværk Dyrehospitals patientmateriale. To prøver blev indsendt fra Maribo Dyrehospital og fire prøver fra Otterup-Søndersø dyrlægerne. Prøverne blev indsamlet fra 44 hunde med diarré. Desuden indgik en kontrolgruppe på 29 raske hunde. I alt indgik der 73 prøver i undersøgelsen. Diarré blev defineret som afvigelse fra normal fæceskonsistens. Der blev ikke skelnet mellem forskellige typer diarré. Fæcesprøverne blev undersøgt ved hjælp af SNAP. Resten af fæcesprøven blev lagt i 10 % neutralt formalin og indsendt til Klinisk Centrallaboratorie på KVL. Her blev der foretaget en undersøgelse ved hjælp af IFA. De 2 testresultater blev sammenlignet ved hjælp af en McNemar test. Sammenhængen mellem smitte med Giardia og forekomsten af diarré blev undersøgt ved hjælp af en χ 2 test. På samme måde blev det undersøgt, om dyr under 1 år var hyppigere smittede end dyr over 1 år. Eksternt materiale Øvrigt materiale, der indgik i undersøgelsen, var VMLs resultater for Giardia fra Danmark for 2003 og 2004. Desuden indgik KVLs resultater for Giardia for 2000 til 2005. Disse eksterne resultater er både for hund og kat. En anslået prævalens for Giardia blev udregnet for resultaterne. Resultater Sammenligning af SNAP testen med IFA testen Der blev fundet 12 Giardiapositive hunde ud af de 73 undersøgte ved brug af SNAP testen. På de samme 73 prøver blev der fundet 2 Giardia positive ved undersøgelse på KVL ved hjælp af IFA testen. Der var ikke sammenfald mellem de positive resultater. Ved udførelse af McNemars test for forskelle mellem 2 korrelerede proportioner fandtes en χ 2 på 8,6. Det vil sige, Immunfluorescens Ved immunfluorescens synliggøres cysterne ved tilsætning af monoklonale antistoffer udviklet mod cysteoverfladeantigener. Disse antistoffer er bundet til et fluorescerende stof (fluorescein isothiocyant). Præparatet undersøges ved hjælp af fluorescensmikroskopi (9). TABEL 1 IFA positive IFA negative I alt SNAP positive 0 12 12 SNAP negative 2 59 61 I alt 2 71 73 Sammenhæng mellem IFA testen og SNAP testen. 18 Dansk Veterinærtidsskrift 2007 1. december Nummer 23 Årgang 90
TABEL 2 Positive Negative I alt Anslået prævalens IFA-test 9 185 194 4,6 % ELISA-test 51 309 360 14,2 % Resultater for hunde på prøver indsendt af danske dyrlæger. TABEL 3 Positive Negative I alt Anslået prævalens IFA-test 11 187 198 5,5 % ELISA-test 23 151 174 13,2 % Resultater for katte på prøver indsendt af danske dyrlæger. at der var stor forskel på de 2 testresultater. OR var 6, hvilket fortæller, at der var 6 gange så stor sandsynlighed for at få et positivt resultat ved SNAP testen end ved IFA testen. Ved brug af SNAP-testen fandtes en prævalens på 12/73 svarende til 16,4 %, mens prævalensen ved brug af IFAtesten var 2/73 svarende til 2,7 %. Øvrige resultater Sammenhæng mellem forekomsten af diarré og et positivt testresultat for Giardia målt på IFA testen eller SNAP testen En af de 2 IFA positive hunde, der blev fundet i undersøgelsen havde diarré. De øvrige 9 positive hunde med diarré er fundet ved SNAP testen. Der blev ikke påvist nogen statistisk sammenhæng mellem det at have diarré og det at være positiv for Giardia. χ 2 (Yates)= 0,42 p= 0,52 OR var 1,84. Konfidensintervallet for OR= (0,45-7,8). Der var dog en tendens til en overhyppighed af Giardiapositive hunde med diarré i forhold til Giardiapositive hunde, der var raske. De Giardiapositive hunde udgjorde 23 % af hundene med diarré, og i gruppen med raske hunde udgjorde de Giardiapositive hunde 14 %. Sammenhæng mellem smittestatus og alder (egne resultater) Af de 2 IFA positive var den ene under 1 år og havde diarré. De øvrige unghunde blev fundet positive ved hjælp af SNAP testen. Der var en overhyppighed af testpositive dyr under 1 år. χ 2 (Yates)= 4,13 p= 0,02 OR var 5,36. Konfidensintervallet for OR= (0,97-27,54). Diskussion Sammenligning af egne resultater med resultater fra IFA og ELISA Der var ingen sammenhæng mellem de resultater, der blev fundet ved undersøgelse med IFA testen og SNAP testen. Når mængden af positive fund gjort på de 3 forskellige prøvetyper (SNAP, IFA, ProSpecT) sammenlignes, bemærkes en stor forskel på proportionen af positive fund (tabel 1 og 2). IFA testen TABEL 4 Diarré Rask I alt Giardia positiv 10 4 14 Giardia negativ 34 25 59 44 29 73 Raske hunde sammenlignet med hunde med diarré (egne resultater). TABEL 5 Under 1 år Over 1 år I alt Positiv 5 7 12 Negativ 6 45 51 21 52 73 Smittestatus i forhold til alder (egne resultater). havde det lavest antal positive, mens de SNAP og ProSpecT begge reagerede positivt langt hyppigere. Forskellen mellem ELISA testene (SNAP og ProSpecT) og IFA var signifikant (p=0,001). Derimod var der ikke forskel i proportionen af positive tests fundet på henholdsvis SNAP og ProSpecT (p= 0,61). Der var heller ikke signifikant forskel mellem proportionen af positive fund, som IFA testen havde fået på andres tilsendte prøver, og på de resultater IFA-testen gav på prøver indsendt i forbindelse med denne undersøgelse. (p=0,73). Ved sammenligning af resultaterne for katte ses lignende forhold (tabel 3). Dette tyder på, at man hyppigere vil opnå et positivt testresultat, hvis man tester med en ELISA test, end hvis man tester med IFA testen, hvilket sandsynligvis afspejler forskelle i testmetoderne. Årsagen til forskel mellem testmetoderne kan skyldes, at de tester forskellige egenskaber. Ved et positivt fund på IFA testen er der synlige cyster i fæces. Dette svarer til et positivt fund på en direkte mikroskopi, men eliminerer de fejlkilder, der er ved denne metode ved at gøre cysterne synlige. Testen kan ikke reagere på trophozoiter eller vandopløselige antigener fra encysterende trophozoiter, således som ELISA testen kan, hvorfor der kan forekomme falsk negative svar. Omvendt kan de to ELI- SA-metoder tænkes at give falsk-positive testresultater som følge af krydsreagerende antistoffer. Testmetodernes sensitivitet og specificitet vurderes ud fra andre testmetoder. Det skyldes, at parasitten er svær at diagnosticere. Derfor er det vanskeligt at finde et sandt billede at vurdere testmetoderne ud fra. I litteraturen er der ikke enighed om testenes sensitivitet. ProSpecT vurderes til at have en sensitivitet på mellem 90,6-100 %. IFA testen vurderes af forskellige forfattere til at have en sensitivitet fra 55-100 % (11,12,13,14,15). SNAP er vurderet af en enkelt forfatter til at Dansk Veterinærtidsskrift 2007 1. december Nummer 23 Årgang 90 19
have en sensitivitet på 90 %, når den sammenlignes med en immunfluorescens test (DIFM; Cyst-A-Glo Kit Waterbourne, Inc), og på 92 %, når den sammenlignes med ProSpecT (16). Muligvis påvirkes testenes sensitivitet af, hvorvidt der udtages prøver fra smittede individer, eller om det er et led i en screening af en population. Pro- SpecT testens sensitivitet vurderes højest i en undersøgelse, hvor mennesker med symptomer undersøges for Giardia. I samme undersøgelse ses en lav sensitivitet på immunfluorescens (12). I en anden undersøgelse er det vist, at IFA testen er bedre til at finde smittede individer med lav parasitbyrde end ProSpecT (11). Der er betydeligt større enighed i litteraturen om specificiteten af de enkelte tests. ProSpecT vurderes til en specificitet på 98-100 %, IFA til 99,8-100 % (11,12,13,14) og SNAP til 96-99,8 %. SNAP vurderes kun i en undersøgelse, hvor den sammenlignes med ProSpecT og DIFM; Cyst-A-Glo Kit Waterbourne, Inc (16). Vurdering af prævalensen for parasitten Den anslåede prævalens af Giardia hos danske hunde, undersøgt ved hjælp af IFA testen, ProSpecT og SNAP, var henholdsvis 4,6, 14,2 og 16,4. Ved en tidligere undersøgelse på danske hunde er prævalensen af Giardia 17,1 %. Hos hunde fra kenneler var prævalensen 20 % (4). I forsøget var der stor overvægt af hunde på under 4 måneder, hvilket kan føre til forhøjet prævalens (4). Prøverne i den danske undersøgelse er undersøgt ved hjælp af flotation i zink-sulfat. Undersøgelsens sensitivitet er øget ved at indsamle prøver hver anden dag 3 gange (4). En tysk undersøgelse, der er foretaget over 3,5 år og under anvendelse af ProSpecT testen (17) angiver en prævalens på 16,5 % hos familiehunde, hvilket svarer til prævalensen fundet i denne undersøgelse ved anvendelse af de to ELISA-metoder. En prævalens undersøgelse fra Canada viser en prævalens på 7,2 % hos familiehunde. Undersøgelsen er foretaget med ProSpecT testen, og et positivt resultat bekræftes ved hjælp af formalin/ether sedimentation og direkte mikroskopi (18). En undersøgelse fra USA finder en prevalens på 7,2 % hos hunde. Her undersøges kun 1 prøve ved hjælp af flotation i zink-sulfat (19). Ved undersøgelse på eget materiale blev der ikke fundet en sammenhæng mellem det at have diarré og det at være Giardiapositiv. Dette resultat var dog forventet, idet det beskrives, at der ikke er sammenhæng mellem smittestatus og fæceskonsistens (4,18). Dog blev der fundet en tendens til en overhyppighed af testpositive med diarré. På det samme materiale blev der fundet en overhyppighed af testpositive hunde, der var under et år. Dette er som forventet ifølge litteraturen (4). Det beskrives i en undersøgelse fra USA, at 17,5 % af de undersøgte hunde under 2 år er positive for Giardia. Hos hunde over 2 år falder mængden af smittede til 2,1 % (19). Resultatet for sammenhæng mellem smittestatus og diarré og resultatet med overhyppighed af testpositive unghunde skal tolkes med forsigtighed, idet denne undersøgelse er udført på et lille materiale. Ydermere er der ikke entydige angivelser af, hvor præcise IFA og ELISA-testene er, hvorfor der muligvis kan være problemer med både falsk-negative testresultater (IFA) og falsk-positive testresultater (ELISA-testene). Det må dog konkluderes, at resultaterne fordeler sig som forventet ifølge litteraturen. Konklusion Idexx SNAP Giardia test er blevet afprøvet mod en kendt test. Dens egnethed er ikke afklaret, men kræver yderligere undersøgelser. Begge testmetoder synes at være fejlbehæftede. Et mere tilfredsstillende resultat ville kunne findes, hvis der blev indsamlet 3 fæcesprøver, udtaget hver anden dag. Dette ville givet minimere antallet af falsk negative prøver som følge af den intermitterende cysteudskillelse. Der er brug for en gold standard til vurdering af testmetoderne. Sandsynligvis vil en PCR test kunne bruges til dette i fremtiden. Det er sandsynliggjort, at man opnår forskellige resultater, alt efter om man vælger at undersøge med en ELISA test eller en IFA test. De 2 testtyper kan eventuelt kombineres, da de 2 prøvetyper muligvis tester for forskellige egenskaber ved parasitten. Tak Tak til Vet Med Lab og Centrallaboratoriet på KVL for lån af deres prøvesvar på Giardia og Cryptosporidium. Tak til Kruuse fordi de har stillet Idexx SNAP Giardia testen til rådighed for denne undersøgelse. Tak til PDAs fond for økonomisk støtte til betaling af indsendte prøver. Tak til Mariann Criél for grundig rådgivning omkring statistikken. Litteratur 1 Thompson R.C.A. Towards a better understanding of host specificity and the transmission of Giardia: the impact of molecular epidemiology. Olson, Olson, Wallis (ed) Giardia the cosmopolitan parasite CABI publishing 2002 55-69 2 Pung O.J. Other noteworthy zoonotic protozoa: Richardson, Krause (ed): World class parasites: Kluwer Academic Publishers 2003, (6) 165-183 3 Erlandsen S.L, Weissner S., Ottenwaelter C.Investigation into the life cycle of Giardia using videomicroscopy and field emission 20 Dansk Veterinærtidsskrift 2007 1. december Nummer 23 Årgang 90
SEM Olson, Olson, Wallis (ed) Giardia the cosmopolitan parasite CABI publishing 2002 3-14 4 Hansen E. H., Nielsen A.L., Monrad J.,Vibe- Petersen G. (2000) Giardiose hos hunde i Danmark. DVT, 83, (16), 13-17 5 Dupont H. L Sullivan P.S. Giardiasis: the clinical spectrum, diagnosis and therapy.. Pediatric Infectious Disease. 1986 5, (1): 131-138 6 Buret A.G., Scott K.G.-E., Chin A.C. Giardiasis: pathophysiology and pathogenesis. Olson, Olson, Wallis (ed) Giardia the cosmopolitan parasite CABI publishing 2002 109-125 7 Kirkpatrick C.E. Giardiasis. The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice 1987 17. 6. 1377-1387 8 Olson M.E., Ceri H. Morck D.W. Giardia immunoprofylaxis and immuntherapy. Olson, Olson, Wallis (ed) Giardia the cosmopolitan parasite CABI publishing 2002 139-155 9 Perez M.J., Aetio R., Martin E.. Giardia tests: an evaluation of a commercial enzyme linked immunoassay and a commercial immuno-fluorescence assay. Thompson, Reynoldson, Lymbery (ed)giardia: From molecules to disease. CAB International 1994 357-358 10 Boone J.H., Wilkins T.D.,Nash T. E. Brandon J.E., Macias E.A., Jerris R.C., Lyerly D. M, TechLab and Alexon Giardia enzymelinked immunosorbent assay kits detect cyst wall protein 1 Journal of Clinical Microbiology, 1999 611-614 11 Johnston S. P., Ballard M.M., Beach M. J., Causer L., Wilkins P.P., evaluation of three commercial assays for detection of Giardia and Cryptosporidium organisms in fecal specimens. Journal of Clinical Microbiology. 2003 41(2) 623-626. 12 Aldeen W.E., Hale D. Robison A.J. Carroll K. Evaluation of a commercially available ELISA assay for detection of Giardia Lamblia in fecal specimens. Diagn Microbiol Infect Dis. 1995;21:77-79 13 Garcia L. C, Shimizi R. Y., Evaluation of nine immunoassay kits (enzyme immunoassay and direct fluorescence) for detection of Giardia Lamblia and Cryptosporidium parvum in human fecal specimens. Journal of Clinical Microbiology, 1997. 35 (6). 1526-1529 14 Zimmerman S.K., Needham C.A. Comparison of conventional stool concentration and preserved- smear methods with Merifluor Cryptosporidium/Giardia EZ mikroplate assay for detection of Giardia Lamblia, Jounal of Clinical Mikrobiology, 1995, 33, ( 7) 1942-1943 15 Remel. ProSpecT Giardia Microplate Assay Datablad 16 Groat R., Monn M., Flynn L. Curato J. Survey of clinic practices and testing for diagnosis of Giardia infections in dogs and cats. IDEXX Laboratories, Inc., Research and Development, Westbrook, Maine. Fremlagt ved 141st American Veterinary Medical Association Annual Convention 2004 for Joint Meeting of The American Association of Veterinary Parasitologists 49 th Meeting and The American Society f Parasitologists 79th Meeting. 17 Barutzki D. Prevalence of Giardia spp. In Dogs in Germany. Olson, Olson, Wallis (ed) Giardia the cosmopolitan parasite CABI publishing 2002 91-95 18 Jacobs S.R., Forrester C.P.R., Yang J.,: A survey of prevalence of Giardia in dogs presented to Canadian veterinary Practices. Olson, Olson, Wallis (ed) Giardia the cosmopolitan Parasite CABI publishing 2002 81-85 19 Kirkpatrick C.E. Epizootiology of Endoparasitic infections in pet dogs and cats presented to a veterinary teaching hospital. Veterinary Parasitology 1988 (30) 113-124. Dansk Veterinærtidsskrift 2007 1. december Nummer 23 Årgang 90