Fysisk Biokemi. Typeopgaver 3, Løsninger

Transkript

1 Fysisk Biokemi Typeopgaver 3, Løsninger Hydrodynamic methods: 1. Does molecular mass or molecular shape or both have an impact on a. specific viscosity measurements? shape b. sedimentation velocity measurements? both c. sedimentation equilibrium measurements? mass 2. Flow cytometry a. What types of signals are detected? Forward and right angle scattered light, and fluorescence. b. On what type of biological units are the measurements usually done? Cells. c. What type of signal-dependent treatment can be done to these units? They can be sorted. 3. Filtration and dialysis can be used to separate molecules. a. On what physical ground does separation occur in these methods? The ability to pass through a membrane with pores of a certain size. b. What is the principal difference between the two methods? In dialysis the solution diffuses through the membrane while in filtration it is forced through. c. Mention one advantage for each method. Filtration is faster. Dialysis is gentler. NMR-spektroskopi og røntgendiffraktion: 4. Kernemagnetisk resonansspektroskopi er en af de vigtigste metoder til opnåelse af information om struktur og dynamik af bl.a. organiske og bioorganiske molekyler i opløsning. Der er nogle fundamentale egenskaber, der er nyttige at kende før man sætter en væskefase NMR analyse i værk. a. Der er naturligvis nogle krav til prøven. Hvilken koncentration kræves? Hvis vi antager at analysen køres på en 0.5 ml opløsning, hvor mange mol kræves typisk til en NMR analyse? Hvad med ph og temperatur? Og endelig hvad med renhed af prøven? Koncentration: 0.5-2mM. Antal mol: 250 nmol. Temperatur: 15 C. PH 4-8, for høj ph giver amid proton udveksling. Renhed: > 95% b. Er der nogle begrænsninger på hvor store/små proteiner man kan analysere og i så fald hvilke typer af NMR er egnet til hvad? < 10 kda umærkede proteiner kda 15N, 13C berigede proteiner. ( kda TROSY). Faststof NMR: alle størrelser kun begrænset af følsomhed. 5. For at kunne lave en NMR analyse kræves et NMR spektrometer a. Skitser de overordnede elementer i et NMR spektrometer. Hvad gør de enkelte elementer godt for, hvor anbringes prøven og hvad gør man ved den? Tegning i bogen og i powerpoints gives på tavlen. Løsningen indeholder en beskrivelse af magnet, rf spoler, detektor og computer. Hjemmeside: nmr.imsb.au.dk/fysisk_biokemi Side 1/5

2 b. Biologiske makromolekyler kan naturligt analyseres ved hjælp af 1 H, 13 C og 15 N NMR. Hvad er karakteristiske egenskaber ved disse kerner og hvordan adskiller de sig rent spektroskopisk? Hvilken/hvilke kerner vil i anvende hvis (1) i har et protein med lav molekylvægt eller (2) et relativt stort protein? Vil disse analyser stille specielle krav til prøven? Alle spin I=1/2. 1 H stort set 100% forekommende, 13 C ca. 1%, og 15 N ca. 0.37%. De har gyromagnetiske forhold i forholdet 1:1/4:1/10. Lav vægt: 1 H, Høj vægt: 1 H + 15 N + evt. 13 C 6. Man kan trække strukturel information ud fra NMR analyse via forskellige effekter. Du skal her beskrive de tre vigtigste. a. Beskriv det kemiske skift og hvilken information, der kan trække ud af dette. Hvor langtrækkende er denne effekt? Elektronerne inducerer et modfelt, der reducerer det effektive felt i forhold til B 0. Man opnår information om de elektroniske omgivelser af kernen på < 3-8 Å skala. b. Beskriv J kobling, hvordan den måles og hvad information der kan opnås herfra. J kobling er en elektron-medieret spin-spin kobling. For kobling mellem spin I=1/2 kerner vil man se en multiple opsplitning med n+1 linier hvis en kerne har n naboer der kobler med samme koblingskonstant. Man kan via Karplus ligningen for information om torsionsvinkler c. Beskriv hvordan man opnår information om internukleare afstande, hvor store afstande kan man måle? Via dipol-dipol krydsrelaxation i et NOESY eksperiment. Intensiteter prop. m. 1/r 6. Typisk < 5 6 Å. 7. Beskriv 1 H NMR spektret for Skal tegnes... inheholder kvartet ved 4-5 ppm (1:3:3:1; relativ intensitet 2) og en triplet ved 1 ppm (1:2:1, relativ intensitet 3). 8. Forklar NMR spektret nedenfor og beskrive molekylets opbygning (CH 3 O) 2 CHCH 3 med CH en længst til venstre OCH 3 i midten og CH-CH 3 til højre Hjemmeside: nmr.imsb.au.dk/fysisk_biokemi Side 2/5

3 9. Røntgendiffraktion er en nyttig metode til bestemmelse af biologiske makromolekylers 3-dimensionelle struktur. Også her er der naturligvis nogle krav til prøven. a. Hvad er de fundamentelle krav til prøvens konsistens og hvor stor mængde (volumen) stof kræves. Kræver krystaller. For et normalt laboratorie diffraktometer: krystal dim. 0.5 mm, synkrontron: <100 µm b. Hvad måler man ved røntgen diffraktion? Hvad er tydeligt og hvad ses ikke? Elektrontætheder => spredning afh. af elektrontæthed og dermed atomtal. H diffrakterer meget svagt eller ikke; C, N, O, S spreder fint, men er uskelnelige; metaller spreder bedst. c. Hvilken type eksperiment vil du foreslå, hvis du havde meget lidt stof mængde. Eksperimenter på en synchrotron d. Er der nogle fundamentale begrænsninger i molekylstørrelse og hvilken? Kun at der er tilstrækkeligt mange atomer af samme type til opnåelse af intense diffraktionspletter. Og diffraktionsmønstrenene skal kunne opløses og fortolkes. MDa størrelser har været demonstreret. Anormal fasning kan sætte en begrænsning mht. etablering af faseinformation 10. Tegn et røntgendiffraktometer og forklar, hvordan det virker. Besvarelsen skal omfatte beskrivelse af røntgen stråling, deres fremstilling, deres vekselvirkning med krystallen og hvad der måles og hvordan. Fig Røntgenstråling med bølgelængde 1.5Å frembragt bestråling af en kobber anode med elektroner bestråler en krystal med resultat af stor direkte transmission og mere vigtigt noget stråling der spredes af elektronerne i krystallen. Diffraktionspletterne indeholder information om strukturen i form af intensitet (amplituden af strukturfaktor funktionen) og deres position (afspejler reciprokke afstande i krystalgitret). Spredningsfunktionen (eller strukturfaktoren) Fourier transformeres hvorved man opnår en beskrivelse af elektrontætheder. Hertil kræves faseinformation opnået ved gæt/beregning eller eksperimentelt ved multiple-isomorphous replacement (ekstra prøver med tungmetaller 11. Med udgangspunkt i Braggs lov skal du forklare diffraktionsmønstret, hvordan er pletternes position relateret til molekylets struktur? Hvorfor drejer man krystallen og hvilken indvirkning har det på diffraktionsmønstret? Braggs lov: 2dsinθ = nλ danner relationen mellem gitterplans afstanden d, den faste bølgelængde λ og den variable vinkel θ. Denne ligning skal være opfyldt for at man ser en diffraktionsplet. Dvs. ved en given vinkel ser man diffraktionspletter hørende til specifikke planer, karakteriseret ved miller indeces hkl, der netop opfylder relationen. Ved at ændre θ bringer man nye afstande til at opfylde betingelse => får ved fuldt θ sæt alle diffraktionspletter. Der er en invers sammenhæng mellem afstand og vinkel => stor vinkel svarer til små afstande (høj opløsning), mens lille vinkel svarer til store gitterplans afstande. Man detekterer så at sige det reciprokke gitter. 12. Fortæl på et overordnet plan hvilke metoder, der kan anvendes til 3D strukturbestemmelse af proteiner. Beskriv fordele og ulemper ved disse metoder i relation til hinanden. Væskefase NMR: < 30 kda (typisk), i opløsning (kan være nativ form) i høj koncentration, kan opnå information om struktur og dynamik. Sidstnævnte er vigtig for funktion. Information de fleste atomer incl. protoner. Faststof NMR. Ikke begrænset til små molekyler men fuld strukturbestemmelse vanskeligere end for væskefase NMR pga. større liniebredder. Hjemmeside: nmr.imsb.au.dk/fysisk_biokemi Side 3/5

4 XRD: Små molekyler op til MDa proteiner. Skal krystalliseres og frembringes i heavy metal analog. Information om elektronisk struktur, der senere omsættes til atomarstruktur. EM: 2D krystaller, lavere opløsning Neutrondiffraktion: Kræver større krystaller, information om kerne positioner => også protoner, god til præcise internukleare afstande Magnetic Resonance Imaging (MRI): 13. Slice selection. a. How may spins at different locations be distinguished in MRI? In magnetic resonance imaging we use magnetic field gradients to create a spatial frequency difference. b. How is the slice selection (selective excitation of a slice) performed? When applying a magnetic field gradient, the sample will have different resonance frequencies from one end to the other. A frequency selective rf pulse may be used to excite a particular frequency region only corresponding to a particular slice of the sample. c. How can the slice thickness and position be controlled? The slice thickness may be controlled by the bandwidth of the rf pulse. Position is controlled by the carrier frequency of the pulse. 14. Multi-slicing. a. Multi-slice imaging is a technique used to speed up the imaging time. How? Since a slice excitation only affects the particular slice, it is not necessary to wait for the magnetization to relax back to thermal equilibrium before acquiring the next slice. The idea of multi-slicing is to acquire the images for multiple slices within one relaxation delay. b. Give a well-argued answer to whether you think multi-slice imaging may be used in combination with localized spectroscopy. Point-resolved spectroscopy (PRESS) acquires the NMR spectrum for a single voxel at the time. If this is carried out in a manner that does not affect other voxels, it should be possible to acquire multiple slices within one relaxation delay. In practice, PRESS uses three orthogonal slice selections implying that multi-slicing should avoid reusing any of the three slices. Chemical shift imaging uses normal slice selection and is thus straightforwardly compatible with multi-slicing. 15. Magnetic resonance angiography (MRA). a. How does MRA differ from standard MRI? MRA observes moving matter and not static matter. b. What is the background signal that one typically tries to minimize in MRA? In MRA we would like to suppress the signal from static matter as much as possible. Hjemmeside: nmr.imsb.au.dk/fysisk_biokemi Side 4/5

5 Biocalorimetry: 16. Reaction kinetics a. Write down the Arrhenius equation. k = Ae E A b. Explain its different components and its overall message. k is the reaction rate. The frequency factor, A, is the number of reactant collisions per time unit. The activation energy, E A, is the height of the energy barrier of the reaction. R is the gas gonstant. K is the absolute temperature. e E A is the fraction of the collisions where the kinetic energy is large enough to overcome the activation energy barrier and result in a reaction. The overall message is that reactions rates typically increase with temperature. c. What may slow down biological activity at higher temperatures? Loss of macromolecular or higher order biological structure, or increasing rates of competing reactions. d. The rate constant of a process is 5 s -1 at 5 C and 35 s -1 at 35 C. What is the activation energy if the process follows Arrheius equation and the frequancy factor can be considered constant in this temperature interval? (R=8.314 J mol -1 K -1 ) E A E E A ln k = ln A ln k2 ln k1 = ln A ln A A + E A ln k2 ln k1 = R 1 1 T T 1 2 = 46.2 kj mol Calorimetry. a. What quantity is directly measured in a calorimeter? Changes in heat, directly related to enthalpy change, H, or specific heat, C p. b. Which are the two main calorimetric methods? Isothermal titration calorimetry (ITC) and differential scanning calorimetry (DSC) c. Briefly describe these methods. ITC measures released or absorbed heat, i.e. the enthalpy change, H, when reagent, e.g. a ligand, is added to a solution at constant temperature.dsc measures the relation between absorbed heat and temperature increase as a function of temperature, i.e. the heat capacity C p as a function of T. d. Mention one application for each. ITC: Determination of H, and C p of binding. DSC: Determination of H, and C p of unfolding. Hjemmeside: nmr.imsb.au.dk/fysisk_biokemi Side 5/5