Cytology FISH Accessory Kit Kode nr. K 5499 2. udgave Til in situ fluorescenshybridisering (FISH) på cytologiprøver. Kittet indeholder reagens tilstrækkeligt til 20 tests.
Indhold Side Tilsigtet anvendelse...3 Indledning...3 Reagenser...3 Leverede materialer...3 Nødvendige materialer, der ikke medfølger...3 Forholdsregler...4 Opbevaring...4 BRUGSANVISNING A. Fremstilling af reagens...5 A.1 Vaskebuffer...5 A.2 3,7 % formaldehyd...5 A.3 Stringensbuffer...5 A.4 Ethanolserie...5 B. Farvningsprocedure...5 B.1 Procedurebemærkninger...5 B.2 Farvningsprotokol...5 Kvalitetskontrol...7 Fortolkning af resultater...7 Referencer...7 Fejlfinding...8 Appendiks 1...9
Tilsigtet anvendelse Anvendes til in vitro diagnostik. Cytology FISH Accessory Kit er beregnet til anvendelse i in situ fluorescenshybridiserings (FISH) -teknikken på cytologiprøver. Indledning Kittet anvendes i en procedure, der forløber over to dage. Den første dag udføres en forbehandling af de cytologiske prøver (leveret af brugeren) ved anvendelse af 3,7 % formaldehyd i 2 minutter inden dehydrering med ethanol. Efter forbehandlingen påsættes brugerleverede FISH-prober, og prøverne forsegles med Coverslip Sealant inden denaturering og hybridisering natten over. Den følgende dag udføres en stringnent vask, som sikrer fjernelse af ubundet og uspecifik bundet FISH-probe inden dehydrering med ethanol. Til slut monteres prøverne med Fluorescence Mounting Medium indeholdende en blå fluorescerende kontrastfarve og dækkes med dækglas. Resultaterne fortolkes ved anvendelse af et fluorescensmikroskop forsynet med passende filter (se appendiks 1). Reagenser Leverede materialer Materialerne angivet nedenfor er tilstrækkelige til 20 tests (en test er defineret som et 18 mm x 18 mm stort målområde). Flaske 1 Flaske 2 Flaske 3 Vaskebuffer (x 20) 500 ml, 20 x koncentreret Tris/HCl-buffer. Stringensbuffer (x 20) 150 ml, 20 x koncentreret SSC (saltvand-natriumcitrat) -buffer indeholdende et detergent. Fluorescence Mounting Medium 300 µl Brugsklart fluorescensmonteringsmedium indeholdende en blå kontrastfarve. Emne 4 Coverslip Sealant (dækglasforseglingsmiddel) 1 tube Brugsklar opløsning af aftageligt forseglingsmiddel til dækglas. BEMÆRK: Alle reagenserne er formuleret specielt til anvendelse med dette kit. Nødvendige materialer, der ikke medfølger Laboratoriereagenser Destilleret eller deioniseret vand Ethanol, 96 % Formaldehyd, 37 % Laboratorieudstyr Justerbare pipetter Kalibreret termometer til delvis nedsænkning (område 37-100 C) Kalibreret overfladetermometer (område 37-100 C)
Dækglas (18 mm x 18 mm) Pincetter Udsugningshætte Varmeblok eller hybridiseringsovn til denaturering (82 (±2) C) Fugtighedskammer til hybridisering Hybridiseringsovn eller -inkubator til hybridisering natten over (45 (±2) C) Objektglas, Dako Silanized Slides, kode nr. S 3003, poly-l-lysin-coatede objektglas eller superfrost-objektglas Farveskåle eller -bade Timer (i stand til 2-15-minutters intervaller) Vandbad med låg (der kan holde 65 (±2) C til 99 C) Mikroskopudstyr og tilbehør Filtre til fluorescensmikroskop: DAPI-filter og egnede filtre, der passer til det anvendte fluorokrom, f.eks. FITC/Texas Red dobbeltfilter eller FITC og Texas Red monofiltre til Dako FISH-prober - se appendiks 1 for detaljer Fluorescensmikroskop med en 100 watt kviksølvlampe anbefales til Dako FISH-prober Mikroskopobjektglasfolder (karton til 20 objektglas med hængslet låg eller lignende) Forholdsregler 1. Må kun anvendes af uddannet personale. 2. Vial 1, Wash Buffer (20x), contains 10-<25% sodium chloride, and 10-<20% trometamol. Vial 1 is labeled: H319 H315 P280 Fare P264 P302 + P352 + P362-2 + P363 P332 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 Forårsager alvorlig øjenirritation Forårsager hudirritation. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Vask hænderne grundigt efter brug. VED KONTAKT MED HUDEN: Vask forsigtigt med rigeligt sæbe og vand. Alt tilsmudset tøj tages af. Tilsmudset tøj skal vaskes, før det kan anvendes igen. Ved hudirritation: Søg lægehjælp VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. Ved vedvarende øjenirritation: Søg lægehjælp 3. Vial 2, Stringent Wash Buffer (20x), contains 10-<25% sodium chloride, and 10-<20% 2- amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Vial 2 is labeled: H319 H315 P280 Fare P264 P302 + P352 + P362-2 + P363 Forårsager alvorlig øjenirritation Forårsager hudirritation. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Vask hænderne grundigt efter brug. VED KONTAKT MED HUDEN: Vask forsigtigt med rigeligt sæbe og vand. Alt tilsmudset tøj tages af. Tilsmudset tøj skal vaskes,
før det kan anvendes igen. P332 + P313 Ved hudirritation: Søg lægehjælp. P305 + P351 + P338 VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. P337 + P313 Ved vedvarende øjenirritation: Søg lægehjælp 4. Del 4, Coverslip Sealant, indeholder 100% naphtha (råolie), hydrogenbehandlet let, og er mærket: Fare H225 H304 H411 P280 P210 P241 P242 P243 P233 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P405 P403 P235 P501 Meget brandfarlig væske og damp. Kan være livsfarligt, hvis det indtages og kommer i luftvejene. Giftig for vandlevende organismer, med langvarige virkninger. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Holdes væk fra varme, varme overflader, gnister, åben ild og andre antændelseskilder. Rygning forbudt. Anvend eksplosionssikkert elektrisk, ventilations- og lysudstyr samt til al håndtering af materialet.. Anvend kun værktøj, som ikke frembringer gnister.. Træf foranstaltninger mod statisk elektricitet. Hold beholderen tæt lukket. Undgå udledning til miljøet I TILFÆLDE AF INDTAGELSE: Ring omgående til en GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller en læge. Fremkald IKKE opkastning. VED KONTAKT MED HUDEN (eller håret): Alt tilsmudset tøj tages straks af. Skyl eller brus huden med vand. Opbevares under lås. Opbevares på et godt ventileret sted. Opbevares køligt. Indholdet/beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regulativer. 5. Inkubationstider og -temperaturer, eller fremgangsmåder anderledes end specificeret, kan give fejlagtige resultater. 6. Reagenserne er optimalt fortyndede. Yderligere fortynding kan føre til tab af ydeevne. Opbevaring Flaske 1, Vaskebuffer, Opbevares ved 2-8 C. Flaske 2, Stringensbuffer, Opbevares ved 2-8 C. Flaske 3, Fluorescence Mounting Medium, Opbevares mørkt ved 2-8 C. Emne 4, Coverslip Sealant, Opbevares ved 2-8 C. Fluorescence Mounting Medium (Flaske 3) kan påvirkes negativt, hvis det eksponeres mod kraftigt lys. Opbevar ikke disse komponenter, og udfør ikke analysen, i kraftigt lys, såsom direkte sollys. Anvend ikke kittet efter udløbsdatoen angivet på kittets æske. Hvis reagenserne opbevares under andre betingelser end de, der er specificeret på indlægssedlen, skal brugeren verificere reagensernes ydeevne (1). Der er ingen synlige tegn, der indikerer, at produktet kan være ustabilt. Det er derfor vigtigt at evaluere normale celler i de analyserede prøver. Kontakt vores tekniske service, hvis der observeres et uventet fluorescensmønster, som ikke kan forklares med variationer i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et problem med Cytology FISH Accessory Kittet.
BRUGSANVISNING A. Fremstilling af reagens Det er bekvemt at fremstille følgende reagenser inden farvning: A.1 Vaskebuffer Fortynd en tilstrækkelig mængde fra Flaske 1 (Vaskebuffer x 20) ved fortynding af koncentratet 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2-8 C i en måned. Kassér fortyndet buffer, hvis den er uklar. A.2 3,7 % formaldehyd Fremstil en tilstrækkelig mængde 3,7 % formaldehyd ved at fortynde 37 % formaldehyd 1:10 i fortyndet vaskebuffer (se BRUGSANVISNING, afsnit A.1). Opbevar de tildækkede skåle ved stuetemperatur og brug dem til maksimalt 100 objektglas. Kassér fortyndet opløsning, hvis den er uklar. A.3 Ethanolserie Ud fra en opløsning af 96 % ethanol fremstilles 3 skåle med henholdsvis 70 %, 85 % og 96 % ethanol. Opbevar de tildækkede skåle ved stuetemperatur eller ved 2-8 C og brug dem til maksimalt 200 objektglas. Kassér opløsningerne, hvis de bliver uklare. A.4 Stringensbuffer Fortynd en tilstrækkelig mængde fra Flaske 2 (stringensbuffer x 20) ved fortynding af koncentratet 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2-8 C i en måned. Kassér fortyndet buffer, hvis de n er uklar. B. Farvningsprocedure B.1 Procedurebemærkninger Brugeren skal læse denne vejledning grundigt igennem og blive fortrolig med alle komponenterne inden brug (se Forholdsregler). Alle reagenser skal ækvilibreres til den relevante temperatur inden brug. Flaske 1: Den fortyndede vaskebuffer skal ækvilibreres til stuetemperatur 20-25 C. Flaske 2: Den fortyndede stringensbuffer; én skål skal ækvilibreres til stuetemperatur, en anden skål til 65 (±2) C inden brug. Flaske 3: Fluorescence Mounting Medium kan anvendes ved en hvilken som helst temperatur fra 2-25 C. Emne 4: Coverslip Sealant kan påføres ved stuetemperatur. Alle trin skal udføres ved den angivne temperatur. Proceduren indbefatter dehydreringer efterfulgt af tørring af prøverne. Sørg for, at prøverne er helt tørre inden der fortsættes til næste trin. Prøverne må ikke tørre ud under de øvrige trin i proceduren. B.2 Farvningsprotokol DAG 1 Trin 1: Fremstilling af objektglas Ækvilibrer cytologiprøverne til stuetemperatur. Inkuber objektglassene i 3,7 % formaldehyd (se BRUGSANVISNINGEN, afsnit A.2) i 2 minutter ved stuetemperatur. Fjern objektglassene fra formaldehydet og læg dem i blød i fortyndet vaskebuffer (se BRUGSANVISNING, afsnit A.1) i 5 minutter ved stuetemperatur. Udskift den fortyndede vaskebuffer og lad objektglassene ligge i blød i yderligere 5 minutter.
Dehydrer cytologiprøverne via en serie af gradvist stigende ethanol: 2 minutter i 70 % ethanol, 2 minutter i 85 % ethanol og 2 minutter i 96 % ethanol (se BRUGSANVISNINGEN, afsnit A.3). Lad objektglassene lufttørre fuldstændigt. Trin 2: FISH-probe (brugerleveret) Følgende trin bør udføres i en udsugningshætte. Påsæt en passende mængde fluorokrommærket probe, f.eks. 10 µl af en Dako FISH-probe midt på prøven. Læg straks et 18 mm x 18 mm dækglas over proben og lad den spredes jævnt under dækglasset. Undgå luftbobler. Hvis der observeres luftbobler, bankes de forsigtigt væk med en pincet. Forsegl dækglasset med Coverslip Sealant ved at presse dette ud langs kanten af dækglasset. Lad dækglasforseglingsmidlet overlappe dækglasset og objektglasset, således et der dannes en forsegling omkring dækglasset. Sørg for, at dækglasforseglingsmidlet dækker hele dækglassets kant. Placer objektglassene på en jævn overflade af metal eller sten (varmeblok eller på en blok i en hybridiseringsovn) forvarmet til 82 (±2) C. Denaturer i 5 minutter så det sikres, at temperaturen af blokken ikke på noget tidspunkt falder til under 80 C. Placer objektglassene i et forvarmet fugtigt hybridiseringskammer. Læg låg over kammeret og inkuber natten over (14-20 timer) ved 45 (±2) C ved anvendelse af Dako FISH-prober. Instrumenter, såsom Dako Hybridizer (kode nr. S 2450 og S 2451), der tillader lignende betingelser som beskrevet ovenfor, kan anvendes til denaturering og hybridisering. DAG 2 Trin 3: Stringent vask Fyld to farveskåle, f.eks. Coplin-skåle, med den fortyndede stringensbuffer (se BRUGSANVISNING, afsnit A.4). Til 1-6 objektglas i en skål kræves et mindstevolumen på 100 ml fortyndet stringent buffer. Til mere end 6 objektglas bruges mindst 15 ml buffer pr. objektglas. Placer en af farveskålene indeholdende fortyndet stringensbuffer ved stuetemperatur i en udsugningshætte og den anden i et vandbad. Opvarm vandbadet og den fortyndede stringensbuffer til 65 (±2) C. Sørg for, at temperaturen er blevet stabil. Læg låg på skålen for at holde temperaturen og undgå fordampning. Mål temperaturen inde i skålen i vandbadet med et kalibreret termometer for at sikre den korrekte temperatur. Ved brug af en pincet eller handsker tages objektglassene ud af hybridiseringskammeret, dækforseglingsmidlet og dækglassene fjernes forsigtigt, og objektglassene placeres i forvaskeskålen, der har stuetemperatur, et ad gangen. Så snart alle dækglas er fjernet, overføres objektglassene fra forvaskeskålen ved stuetemperatur til skålen i vandbadet ved 65 (±2) C. Udfør stringent vask i nøjagtig 10 minutter ved 65 (±2) C. Fjern objektglassene fra den fortyndede stringensbuffer og læg vævssnittene i blød i fortyndet vaskebuffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20-25 C). Udskift den fortyndede vaskebuffer og lad vævssnittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. Dehydrer objektglassene via en serie af gradvist stigende ethanol: 2 minutter i 70 % ethanol, 2 minutter i 85 % ethanol og 2 minutter i 96 % ethanol (se BRUGSANVISNINGEN, afsnit A.3). Lad objektglassene lufttørre fuldstændigt. Trin 4: Montering Tilsæt 15 µl Fluorescence Mounting Medium indeholdende den blå fluorescerende kontrastfarve (Flaske 3) til målområdet på objektglassene og læg et dækglas over. BEMÆRK: Objektglassene kan aflæses efter 15 minutter eller inden for 7 dage efter montering. Imidlertid kan der forekomme falmning, hvis objektglassene udsættes for lys eller høje temperaturer. For at minimere falmning skal objektglas opbevares mørkt ved 2-8 C.
Kvalitetskontrol 1. Signalerne skal være klare, distinkte og lette at tolke. 2. Normale vævsceller giver mulighed for intern kontrol af analysen. 3. Normale celler skal indeholde klart synlige fluorescenssignaler, der indikerer, at FISHproberne har hybridiseret godt til målområderne. 4. Hvis der ikke kan ses signaler i normale celler, indikerer det en analysefejl, og resultaterne skal betragtes som ugyldige. 5. Kernemorfologien skal være intakt ved evaluering ved hjælp af et DAPI-filter. Talrige spøgelseslignende celler og en generelt dårlig kernemorfologi indikerer for kraftig denaturering af prøven, hvilket resulterer i tab af eller fragmentering af signalerne. Sådanne prøver skal kasseres. Fortolkning af resultater Scan adskillige områder af celler for at tage højde for mulig heterogenesitet. Vælg et område med god fordeling af kerner. Begynd analysen i øverste venstre kvadrant af det valgte område idet der scannes fra venstre mod højre. Tæl antallet af signaler inden for kerneafgrænsningen af hver evaluerede kerne ifølge retningslinierne nedenfor. Fokusér op og ned for at finde alle signalerne i den enkelte kerne. Tæl to signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand, der er lig med eller mindre end to gange diameteren af signalet, som kun ét signal. Tæl ikke kerner uden signaler med Antallet af kerner, der skal tælles for hver probe, skal bestemmes af brugeren. Referencer 1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR 7163, February 28, 1992. Fejlfinding Problem Mulig årsag Foreslået handling
Problem Mulig årsag Foreslået handling 1. Ingen signaler eller svage signaler 1a. Mikroskopet virker ikke korrekt - Forkert filterindstilling - Forkert lampe - Kviksølvlampen er for gammel - Forkerte og/eller revnede samlelinser - Uegnet immersionsolie 1b. Falmede signaler 1c. Fordampning af probe under hybridisering 1d. Forkerte denatureringsbetingelser 1e. Forkerte betingelser under stringent vask 1a. Kontroller mikroskopet og sørg for, at de anvendte filtre er egnede til anvendelse sammen med fluorokromerne, og at kviksølvlampen er den rigtige og ikke er blevet anvendt ud over den forventede levetid. (se appendiks 1). I tvivlstilfælde, kontakt Deres lokale leverandør af mikroskopet. 1b. Undgå lang tids undersøgelse under mikroskopet og minimer eksponeringen mod kraftigt lys. 1c. Sørg for tilstrækkelig luftfugtighed i hybridiseringskammeret 1d. Sørg for, at denatureringstemperaturen er 82 (±2) C 1e. Sørg for at anvende den anbefalede vasketemperatur og -tid for stringent vask og at fjerne dækglas inden udførelse af stringent vask 2. Områder uden signal 3. For kraftig baggrundsfarvning 4. Dårlig kernemorfologi eller svag farvning af kerner 2a. For lille probevolumen 2b. Luftbobler fanget under tilsætning af probe eller montering 3a. For lav temperatur for stringent vask 3b. For lang tids eksponering af hybridiseret vævssnit mod for kraftigt lys 4a. For høj denatureringstemperatur 2a. Sørg for, at probevolumenet er stort nok til at dække området under dækglasset 2b. Undgå luftbobler. Hvis sådanne observeres, bankes de forsigtigt væk med en pincet 3a. Sørg for, at temperaturen for stringent vask er 65 (±2) C 3b. Undgå lang tids undersøgelse under mikroskopet og minimer eksponeringen mod kraftigt lys. 4a. Sørg for, at denatureringstemperaturen er 82 (±2) C BEMÆRK: Hvis problemet ikke kan tilskrives nogen af ovennævnte årsager, eller hvis den foreslåede korrigerende handling ikke løser problemet, kontakt vores tekniske service for yderligere assistance.
Appendiks 1 Cytology FISH Accessory Kit, kode nr. K 5499 Specifikationer for fluorescensmikroskop Dako anbefaler følgende udstyr til anvendelse sammen med Cytology FISH Accessory Kit, hvis der anvendes Dako FISH-prober: 1. Mikroskoptype Epifluorescensmikroskop. 2. Lampe 100 watt kviksølvlampe (hold regnskab med brændetiden). 3. Objektiver Til screening af vævet kan der anvendes 10X fluorescens tør- eller 16X fluorescensolieimmersionsobjektiver. Til kraftig forstørrelse og scoring af signaler anbefales det kun at anvende fluorescensolieimmersionsobjektiver, f.eks. 100X. 4. Filtre Filtre er individuelt designet til specifikke fluorokromer og skal vælges ifølge dette. Dako anbefaler anvendelse af et specifikt DAPI-filter i kombination med et højkvalitets Texas Red/FITC dobbeltfilter ved anvendelse af Dako FISH-DNA-prober. DAPI-filter, f.eks. Chroma filter # 31000. Texas Red/FITC dobbeltfilter, f.eks. Chroma filter # 51006. Texas Red og FITC enkeltfiltre kan anvendes til bekræftelse. Fluorokrom Excitationsbølgelængde Emissionsbølgelængde FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filtre er specifikke for hver enkelt mikroskoptype, og anvendelse af korrekte filtre er kritisk for fortolkningen. Kontakt Deres mikroskopleverandør eller Deres Dako repræsentant, hvis De ønsker detaljeret information. 5. Olie Ikke-fluorescerende olie. Forholdsregler Forskellige fluorokromer kræver forskelligt udstyr og skal vælges under hensyn til dette. Til Dako FISH-prober anbefales en 50 watt kviksølvlampe ikke, rhodaminfiltre kan ikke anvendes, og ej heller anbefales anvendelse af tripelfiltre. Et uoptimeret mikroskop kan give problemer ved aflæsning af fluorescenssignaler. Det er vigtigt, at lyskilden ikke er udløbet, og at den er korrekt justeret og fokuseret. Brugerne bør sætte sig ind i og følge anbefalingerne fra kviksølvlampens producent. Mikroskopet bør vedligeholdes og kviksølvlampen justeres inden fortolkning af resultater. Det bør tilstræbes at eksponere prøven mod så lidt af excitationslyset som muligt for at minimere falmning af fluorescensen. Vi anbefaler, at De diskuterer opsætningen af Deres mikroskop med producenten, eller læser litteraturen, inden De påbegynder in situ fluorescenshybridiseringen.
Producent: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Tel. +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95 Symbolforklaringer Katalognummer Temperaturbegrænsninger Lotnummer Medicinsk anordning til in vitro diagnostik Se brugsvejledningen Holdes væk fra direkte sollys (se under opbevaring) Indeholder tilstrækkeligt til <n> tests Anvendes senest Producent GHS-farepiktogram (se afsnittet om forholdsregler) GHS-farepiktogram (se afsnittet om forholdsregler) GHS-farepiktogram (se afsnittet om forholdsregler) GHS-farepiktogram (se afsnittet om forholdsregler)