Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse

Transkript

1 Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse Kode K udgave Til brug sammen med automatiske Dako instrumenter til immunfarvning. Sættet indeholder reagenser til 500 analyser. ( ) P04097DK_01_K / p. 1/8

2 Indhold Side Tilsigtet anvendelse... 3 Resumé og forklaring... 3 Reagenser... 4 A. Medfølgende materialer... 4 B. Nødvendige materialer, der ikke medfølger... 4 Forholdsregler... 5 Opbevaring... 5 Klargøring af reagens... 5 Indsamling og klargøring af prøver... 6 Procedure... 6 Kvalitetskontrol... 7 Fortolkning af resultater... 7 Symbolforklaring... 8 ( ) P04097DK_01_K / p. 2/8

3 Tilsigtet anvendelse Anvendes til in vitro diagnostik. Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, er beregnet til anvendelse ved immunhistokemi sammen med automatiske Dako instrumenter til immunfarvning. Sættet er baseret på LSAB-metoden (labeled streptavidin-biotin) og anvendes i en tretrins procedure. Det første trin er inkubation af vævet med et optimalt fortyndet, primært, kanin- eller murint antistof, andet trin er inkubation med Dako REAL Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2), og tredje trin er inkubation med Dako REAL Streptavidin Peroxidase (HRP). Reaktionen visualiseres med Dako REAL DAB+ kromogen, som også følger med sættet. For at sikre en korrekt farvning tilrådes det at bruge sættet sammen med andre anbefalede reagenser angivet i afsnittet Nødvendige materialer, der ikke medfølger. Resumé og forklaring Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, er udviklet med henblik på at frembringe en optimal farvning på automatiske Dako instrumenter til immunfarvning ved anvendelse af de skabeloner/protokoller, der anbefales i denne indlægsseddel. Inden farvningen skal nogle rutinemæssigt fikserede, paraffinindstøbte vævssnit udsættes for varmeinduceret epitop-retrieval (HIER) med anvendelse af den target retrieval-opløsning, som er angivet i indlægssedlen til det primære antistof. Visse primære antistoffer kræver enzymforbehandling af vævet i stedet for HIER for at opnå en optimal farvning. Bemærk venligst, at Dako REAL Proteinase K, kode S2019, er udviklet til anvendelse i kombination med HIER for at gøre det nemmere at behandle flere objektglas ad gangen. Endogen peroxidase skal blokeres med Dako REAL Peroxidase-Blocking Solution, kode S2023, eller Dako Dual Endogenous Enzyme Block, kode S2003. På grund af en effektiv vaskeprocedure og stabiliserende proteiner i Dako reagenserne er yderligere blokeringstrin med henblik på at reducere uspecifik baggrundsfarvning ikke påkrævet. Det tilrådes at anvende en Dako vaskebuffer, som er specifik for hvert enkelt Dako instrument. Sættet indeholder ikke primære antistoffer. Vi anbefaler brug af Dako N-Series Ready-to-Use Primary Antibodies eller Dako koncentrerede, primære antistoffer. Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse er baseret på en indirekte streptavidin-biotin metode, der har vist sig at give øget sensitivitet sammenlignet med analoge metoder. Sættets biotinylerede sekundære antistofreagens reagerer lige meget med kanin- og murine immunglobuliner, og derfor er det kun nødvendigt med ét sekundært reagens for primære kanin- eller murine antistoffer. Det sekundære antistofreagens er blevet mærket optimalt med biotin ved hjælp af en 7-atoms afstandsarm. Dette gør det muligt for hvert biotinyleret antistofmolekyle at reagere med adskillige peroxidase-konjugerede streptavidinmolekyler og derved øge sensitiviteten af detektionssystemet. Sættets peroxidase-konjugerede streptavidin er fremstillet af streptavidin, der er isoleret fra Streptomyces avidinii, og højrenset peberrodsperoxidase. Konjugeringen udføres ved hjælp af en forfinet to-trins glutaraldehyd-metode. Fordi streptavidins isoelektriske punkt er næsten neutralt, undgås uspecifikke ioniske interaktioner med præparatkomponenter. Det biotinylerede sekundære antistofreagens og det peroxidase-konjugerede streptavidin leveres brugsklart i dråbeflasker og skal hældes i egnede instrumentbeholdere inden anvendelse. Substratsystemet består af to komponenter: DAB+ Chromogen, en koncentreret diaminobenzidinopløsning (DAB), og HRP Substrate Buffer indeholdende hydrogenperoxid. Inden anvendelse skal DAB+ Chromogen fortyndes i HRP Substrate Buffer. Substratsystemet danner et tydeligt brunt slutprodukt på stedet for målantigenet. Dako REAL Hematoxylin, kode S2020, eller Hematoxylin for the Dako Autostainer, kode S3301, anbefales til kontrastfarvning, idet disse produkter danner en klar blå kernefarvning. De farvede vævssnit kan monteres med vandbaseret eller organisk opløsningsmiddelbaseret monteringsmedium. ( ) P04097DK_01_K / p. 3/8

4 Reagenser A. Medfølgende materialer Flaske A Dako REAL Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2) 100 ml, brugsklar Biotinylerede ged-anti-mus og anti-kanin immunglobuliner. I bufferopløsning, der indeholder stabiliserende protein og natriumazid. Farven på dette reagens kan variere fra stærk gul til farveløs, uden at det har nogen indflydelse på sættets ydeevne. Flaske B Flaske C Flaske D Dako REAL Streptavidin Peroxidase (HRP) 100 ml, brugsklar Streptavidin konjugeret til peberrodsperoxidase. I bufferopløsning, der indeholder stabiliserende protein og konserveringsmiddel. Dako REAL DAB+ Chromogen 5 ml, 50x koncentreret 3,3'-diaminobenzidin-tetrahydrochlorid i organisk opløsningsmiddel. Farven på dette reagens kan variere fra stærk violet til farveløs, uden at det har nogen indflydelse på sættets ydeevne. Dako REAL HRP Substrate Buffer 250 ml, brugsklar Bufferet opløsning indeholdende hydrogenperoxid og konserveringsmiddel. B. Nødvendige materialer, der ikke medfølger Automatiske Dako instrumenter til immunfarvning Dako vaskebuffer, som er specifik for det enkelte instrument Dako REAL Peroxidase-Blocking Solution, kode S2023, eller Dual Endogenous Enzyme Block, kode S2003 Dako REAL Proteinase K, kode S2019, fortyndet i Dako REAL Proteinase K Diluent, kode S2032, eller Proteinase K (Ready-to-Use), kode S3020 (om nødvendigt) Dako N-Series Ready-to-Use Primary Antibodies eller koncentrerede, primære kanin- eller murine antistoffer fra Dako N-Series Ready-to-Use Rabbit or Mouse Universal Negative Control eller egnet negativ kontrolreagens til det primære antistof Dako REAL Antibody Diluent, kode S2022 (til fortynding af koncentrerede antistoffer) Dako REAL Hematoxylin, kode S2020 eller Hematoxylin for the Dako Autostainer, kode S3301 Target retrieval-opløsning. Se indlægssedlen til det primære antistof Dako REAL Incubation Container, kode S2030 (valgfri) Dako REAL Slide Holder, kode S2029 (valgfri) Dako instrumentredskaber Objektglas Generelle laboratoriereagenser til fjernelse af voks på paraffinindstøbte vævssnit ( ) P04097DK_01_K / p. 4/8

5 Monteringsmedium (vandigt eller organisk opløsningsmiddelbaseret) og dækglas Forholdsregler 1. Må kun anvendes af uddannet personale. 2. Flaske A, Dako REAL Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2), indeholder materiale, der stammer fra pattedyr. Som med alle produkter, der er afledt ud fra biologiske kilder, bør der iagttages korrekte håndteringsprocedurer. 3. Flaske A, Dako REAL Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2), indeholder natriumazid (NaN 3 ), et kemisk stof, der er yderst giftigt i ren form. Selvom koncentrationen i produktet ikke er klassificeret som farlig, kan natriumazid reagere med bly og kobber og danne meget eksplosive ophobninger af metalazider. Efter bortskaffelse skylles med rigelige mængder vand for at hindre ophobning af metalazid i afløb. 4. Flaske C, Dako REAL DAB+ Chromogen og substratarbejdsopløsningen (CHROM) må ikke udsættes for kraftigt lys. 5. Flaske C, Dako REAL DAB+ Chromogen, indeholder 5-<10% biphenyl-3,3',4,4'- tetrayltetraammonium tetrahydrochlorid og er mærket: H350 H341 P201 P280 Farlig P308 + P313 P405 P501 Kan fremkalde kræft. Mistænkt for at forårsage genetiske defekter. Indhent særlige anvisninger før brug. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Brug særligt arbejdstøj. VED eksponering eller mistanke om eksponering: Søg lægehjælp. Opbevares under lås. Indholdet og beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regler. Som hovedregel gælder det, at personer under 18 år ikke må arbejde med dette produkt. Brugerne skal omhyggeligt vejledes i korrekt arbejdsprocedure, produktets farlige egenskaber og de nødvendige sikkerhedsforanstaltninger. Se yderligere oplysninger i sikkerhedsdatabladet (SDS). 6. Brug egnet personligt beskyttelsesudstyr for at undgå kontakt med øjne og hud. 7. Ubrugt opløsning skal bortskaffes i henhold til lokal og national lovgivning. Opbevaring Opbevares ved 2 8 C. Må ikke anvendes efter udløbsdatoen, som er trykt på sættet. Sættets komponenter må ikke skiftes ud med komponenter fra andre partier. Hvis reagenser opbevares under andre betingelser end de specificerede, skal betingelserne verificeres af brugeren. Den klargjorte substratarbejdsopløsning (CHROM) skal opbevares ved 2 8 C og anvendes inden for 5 dage. Kontakt vores tekniske service, hvis der observeres uventet farvning, som ikke kan forklares med variationer i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et problem med produktet. Klargøring af reagens Substratarbejdsopløsning (CHROM) Substratarbejdsopløsningen, der indeholder DAB, (CHROM) klargøres ved at blande 20 µl DAB+ Chromogen (flaske C) grundigt med 1 ml HRP Substrate Buffer (flaske D). Klargør kun den mængde, der kræves til det antal objektglas, som skal farves. CHROM skal anvendes inden for 5 dage (opbevares mørkt ved 2 8 C). ( ) P04097DK_01_K / p. 5/8

6 Se vejledningen, der medfølger de enkelte reagenser, vedrørende klargøring af reagenser, der ikke er indeholdt i sættet. Indsamling og klargøring af prøver Rutinemæssigt fikserede, paraffinindstøbte vævssnit og frysesnit kan anvendes. Der kan anvendes flere forskellige fiksativer til bevaring af præparaterne. Præparaterne må ikke fikseres i neutral bufferet formalin i mere end 24 timer og helst i kortere tid. Den optimale tykkelse for paraffinindstøbte snit er ca. 4 µm. Den optimale tykkelse for frysesnit er 4 6 µm. Præparaterne skal monteres på objektglas. Snittene skal monteres på objektglassene så fladt og med så få folder som muligt. For mange folder vil påvirke farvningsresultaterne. BEMÆRK: Objektglassene skal have en bredde, der passer til Dako instrumentet. Se brugervejledningen til de enkelte Dako instrumenter vedr. en definition af brugbare objektglas. Paraffinsnit skal monteres fra et forvarmet vandbad med destilleret eller deioniseret vand. Vandbadet må ikke indeholde additiver (f.eks. gelatine, poly-l-lysin osv.). Snittene skal tørres inden opvarmning, generelt ved en temperatur, der ikke overstiger 60 C, i mindst 60 minutter (f.eks. natten over). Det er vigtigt at fjerne vandet under snittene inden ovntørringen for at sikre, at snittene hæfter godt på objektglassene. Procedure Automatiske Dako instrumenter til immunfarvning anvender teknikker, der er baseret på forskellige principper, for at opnå et optimalt farvningsresultat. Inden der køres protokoller på det automatiske Dako instrument til immunfarvning, skal brugervejledningen til det anvendte Dako instrument læses grundigt igennem. Efter afparaffinering og hydrering til buffer (vand) skal de fleste vævssnit gennemgå HIER. Det tilrådes at standardisere HIER for at sikre reproducerbar epitop-retrieval. For at standardisere behandlingen tilrådes det at fylde objektglasholderen helt med objektglas, også selvom der kun er væv på ét objektglas; dette sikrer den samme opvarmning af snit i hver kørsel. Efter epitop-retrieval skal objektglassene forblive i bufferen i mindst 20 minutter ved stuetemperatur. Det automatiske Dako instrument til immunfarvning kan klargøres til farvningen under denne afkøling. Nogle få epitoper tåler ikke HIER. Se indlægssedlen til hvert enkelt Dako primært antistof vedr. vejledning til forbehandling. Inkubation med primært antistof Dako N-series, Ready-to-Use Primary Antibodies kan anvendes sammen med Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, på formalinfikserede, paraffinindstøbte snit. Indlægssedlen i det koncentrerede, primære antistof indeholder en fortyndingsvejledning til Dako koncentrerede, primære antistoffer og en vejledning til anvendelse af proteinase K forbehandling i forbindelse med Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, anvendt på formalinfikserede, paraffinindstøbte snit. De koncentrerede, primære antistoffer skal fortyndes i Dako REAL Antibody Diluent, kode S2022. Objektglassene indsættes i et Dako instrument og farves ved anvendelse af den dertil beregnede skabelon/protokol for Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+ Rabbit/Mouse, kode K5001. Hvis skabelonen/protokollen ikke findes på dit Dako instrument, bedes du kontakte vores tekniske serviceafdeling. Inden Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, første gang anvendes på Dako Autostainer, skal de reagenser og tider, som er angivet i tabel 1, føjes til instrumentets reagensliste. Tabel 1. Nødvendige tilføjelser til reagenslisten og optimale inkubationstider Reagens Kode Forslag til kort navn Skabelontrin Inkubationstid ( ) P04097DK_01_K / p. 6/8

7 Dako REAL Peroxidase-Blocking Solution eller Dual Endogenous Enzyme Block Dako REAL Proteinase K Solution eller Dako Proteinase K S2023 eller S2003 S S2032 HP Block End. Enz. Block 5 minutter Pro K Forbehandling 10 minutter under antistof S2030 Primære antistoffer Individuel - Antistof 10* 25 minutter Dako REAL Detection System Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2) Dako REAL Detection System, Streptavidin Peroxidase (HRP) K5001 K5001LIN Sekundært reagens 15 minutter K5001 K5001HRP Tertiært reagens 15 minutter Dako REAL Detection System (DAB+) K5001 K5001DAB Substrat 3 minutter (2 gange) Dako REAL Hematoxylin S2020 Ekstra 1 2 minutter eller - Dako Hematoxylin for the Dako Autostainer S minutter Blueing Buffer (= Autostainer buffer) S Ekstra 5 minutter * N-Series Ready-to-Use Primary Antibodies Ved andre Dako instrumenter er reagensnavnene og inkubationstiderne forprogrammeret i skabelonerne/protokollerne. Kvalitetskontrol Hver farvekørsel skal omfatte et kendt positivt kontrolpræparat for at sikre en korrekt ydeevne af alle de anvendte reagenser. Hvis det positive kontrolpræparat ikke udviser en positiv farvning, skal mærkningen af prøvepræparaterne betragtes som ugyldige. Der skal anvendes et negativt kontrolreagens sammen med hvert præparat for at identificere en eventuel uspecifik farvning. Hvis uspecifik farvning ikke kan adskilles tydeligt fra den specifikke farvning, skal mærkningen af prøvepræparatet betragtes som ugyldig. Negative Control for N-Series Rabbit Primary Antibodies, kode N1699, eller Negative Control for N-Series Mouse Primary Antibodies, kode N1698, anbefales som negativ kontrolreagens. Fortolkning af resultater Substratarbejdsopløsningen, der indeholder diaminobenzidin, (CHROM) danner en brun farve på stedet for målantigenet, som genkendes af det primære antistof. Den brune farve skal kunne ses på det positive kontrolpræparat på det forventede sted for målantigenet. Hvis der er uspecifik farvning, vil dette kunne ses som en diffus, brun farvning på de objektglas, der er behandlet med det negative kontrolreagens. Kernerne farves blå med hæmatoxylin-kontrastfarven. ( ) P04097DK_01_K / p. 7/8

8 Symbolforklaring Katalognummer Temperaturbegrænsning Anvendes senest Medicinsk udstyr til in vitro diagnostik Indeholder til <n> analyser Producent Se brugsanvisningen Lotnummer GHS-piktogram (se afsnittet med forholdsregler) Produceret af: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danmark Tlf Fax ( ) P04097DK_01_K / p. 8/8