Udvikling og validering af ELISA test til bestemmelse af Newcastle Disease antistoffer i serum og æg

Transkript

1 Udvikling og validering af ELISA test til bestemmelse af Newcastle Disease antistoffer i serum og æg Rapport over forsøg finansieret af Fjerkræafgiftsfonden i projektåret 2007/2008 Forfattere: Lis Olesen, og Joan Klausen

2 ELISA TEST TIL PÅVISNING AF ANTISTOFFER MOD NEWCASTLE DISEASE I SERUM OG ÆG Deltagere Dyrlæge Lis Olesen, Dansk Landbrugsrådgivning, Landscentret Fjerkræ, Fjerkræklinikken. Sektionsleder Joan Klausen, Veterinærinstituttet, DTU. Laborant Henriette Vorsholt, Veterinærinstituttet, DTU. Baggrund Formålet med projektet har været at udvikle en ELISA test til påvisning af antistoffer mod Newcastle Disease (ND) i forbindelse med kontrol af vaccination mod ND. Kontrol af vaccination mod ND er hidtil foregået ved en hæmagglutinations inhibitions test (HI) på blodprøver fra vaccinerede høns. Hensigten har derfor været at finde en sammenhæng mellem måling af antistoffer ved HI test og måling af antistoffer ved den nyudviklede ELISA test. Desuden var det hensigten at finde en sammenhæng mellem antistoffer målt ved ELISA på blodprøver og antistoffer målt ved ELISA i æggeblommer. For nuværende måles antistoffer mod ND ved 23 ugers alderen på blodprøver. Ved at lade antistofmålingerne foregå på æggeblommer kan de æg, der alligevel indsendes til undersøgelse for antistoffer for Salmonella ved ugers alderen hos konsumægsflokke, samtidig testes for antistoffer mod ND. Herved spares såvel arbejdskraft for landmanden samtidig med, at stress hos hønsene reduceres ved at kunne erstatte blodprøveudtagning med indsamling af æg. Forsøgsplan Der blev indsat 55 hønniker i enkeltbure hos en ægproducent. Heraf var 45 ( numrene 11-55) vaccineret efter det lovpligtige Newcastle Disease vaccinationsprogram: To gange med en levende vaccine via grov spray (Nobilis ND C2) ved 3 og 9 uger og herefter med en inaktiveret ND vaccine ved flytning til æglæggerstalden. Hønnikerne blev vaccineret af dyrlæge Lis Olesen. Injektions-vaccination blev foretaget i låret med vaccinen Nobilis RT- IB multi- ND G. Fem hønniker (Hønenumre 1-5) er vaccineret alene to gange med en levende vaccine (ND C2), og fem hønniker (hønenumre 6-10) er importeret fra Sverige og er helt uvaccinerede. Disse blev inden indsætning i burene testet negative for såvel Salmonella som for ND. Hønerne blev placeret i nummererede enkeltbure i enden af en række hos en burproducent. Inden indsamling af æg på prøveudtagningsdagene blev ægbåndet adskilt af papskiver, så man undgik, at et æg fra én forsøgshøne kunne bevæge sig væk fra det pågældende bur. Æggene blev indsamlet og nummereret, inden ægbåndet startede med at køre. Der blev samtidig taget blodprøver af de pågældende høns. Disse blev straks sendt til Veterinærinstituttet i København. Æggene blev kørt til Danæg i Christiansfeld og transporteret med de æg, der alligevel skulle undersøges for Salmonella på Veterinærinstituttet i København. 2

3 ELISA TEST TIL PÅVISNING AF ANTISTOFFER MOD NEWCASTLE DISEASE I SERUM OG ÆG Den første prøveudtagning på blod og æg er foretaget i uge 51, 2007, altså da hønsene var 23 uger gamle. Herefter er der hver 9. uge udtaget blod og æg i alt fem gange, indtil et tilstrækkeligt grundlag er fundet til at udvikle en ELISA test på blod og æg. Den beskrevne forsøgsplan blev fulgt, bortset fra at det sidst i indsamlingsperioden blev besluttet at vaccinere fem høns med halvdelen af normaldosis. De fem høns var en del af de negative høns, der var primede med vaccinen (hønenumre 1-5), og som var forblevet negative for antistoffer mod ND i perioden. Dette forsøg blev foretaget, da alle de indsamlede prøver fra vaccinerede høns gennem hele indsamlingsperioden viste meget høje antistofniveauer i ELISA og i HI testen, og der var brug for en sammenligning af lave antistofniveauer i HI testen og i ELISA testen til beregning af et cut-off i ELISA testen. Der blev udtaget blodprøver og indsamlet æg fra de fem høns efter en, to og tre uger. Selve vaccinationen, med 0,25 ml Nobilis RT- IB multi- ND- G, blev foretaget den 3. juni Prøveudtagningerne af blod og æg blev foretaget én uge efter vaccinationen samt i de næste to uger. Værdierne efter én uge var dog allerede så høje, at fastsættelse af en cut-off værdi på grundlag af vaccination af disse høns ikke var mulig. Resultaterne af målingerne ved henholdsvis HI test og ELISA ses i tabel 3. Den sidste ordinære prøveudtagning er udført i uge 35. Hønerne er aflivede og forsøget afsluttet. Laboratoriemetoder HI test HI test foretages på udtitrerede serum prøver, hvortil en kendt mængde virus antigen tilsættes, Efterfølgende tilsættes 1 % hønseerytrocyter, og resultaterne aflæses visuelt som en titer. ELISA ELISA testen blev udviklet med henblik på at kunne teste både serumprøver og prøver fra æggeblomme. ELISA plader coates med et oprenset virus antigen og serum eller æggeblomme tilsættes i fortyndingerne 1:1.600 og 1: Der tilsættes et konjugeret sekundært antistof, og der fremkaldes efterfølgende ved en farveudvikling. ELISA pladerne aflæses spektofotometrisk. Resultaterne af de enkelte prøver beregnes som en procent af en kendt positiv og negativ kontrol, og resultaterne vises som OD % (optical density %). Resultater Der blev indsamlet blod og æg hver 9. uge, i alt fem gange. I enkelte tilfælde blev der udtaget en blodprøve, uden der samtidig blev indsamlet et æg fra den pågældende høne. Dette skyldes, at der på udtagningstidspunktet endnu ikke var æg fra den pågældende høne. En enkelt høne (nr. 29) afgik ved døden to uger efter forsøgets start. Ud fra en række forsøg med både serum og æggeblomme i forskellige fortyndinger blev det bestemt, at alle prøverne til ELISA skulle testes i to fortyndinger, henholdsvis i 1:1.600 og i 1:

4 ELISA TEST TIL PÅVISNING AF ANTISTOFFER MOD NEWCASTLE DISEASE I SERUM OG ÆG Da HI testen ikke er anvendelig på æggeblommer, blev kun serumprøver testet i HI test. Tabel 1 viser resultaterne fra de 55 forsøgshøns i forsøgsperioden med fem prøveudtagningsdatoer og et interval på ni uger mellem prøveudtagningerne med test af serum og æggeblomme testet i de to valgte fortyndinger ved ELISA og resultaterne fra de samme serumprøver testet ved HI test. Prøve 1-5 er fra høns primede med vaccinen, mens prøve 6-10 er prøver fra ikke-vaccinerede høns. Prøverne er fra høns vaccineret efter det lovpligtige vaccinationsprogram. Serum og æggeblomme fra hønerne 6-10, der ikke var vaccinerede, eller havde kontakt med høns vaccineret med en levende vaccine, var negative og forblev negative i hele forsøgsperioden både ved ELISA og ved HI test. Prøverne 1-5 er fra høner, der var primet med levende vaccine, og som den 3. juni 2008 er vaccineret med halv dosis af en inaktiveret ND vaccine. Dette ses på såvel HI værdier som på ELISA værdierne fra 25. juni og 26. august i tabellen. Separate værdier for disse høns ses i tabel 3. Allerede ved første prøvning viste de vaccinerede høns meget høje antistofniveauer. Dette var gældende for både serumprøver og prøver fra æg testet i ELISA og for serumprøver testet ved HI test. Hen over test perioden sås et fald i antistofniveauet ved HI test, mens antistofniveauet ved ELISA generelt holdt sig højt gennem hele perioden. Forsøget viste også, at der ikke er et fuldstændigt sammenfald mellem resultaterne fra ELISA og fra HI testen, således at høje antistofniveauer i ELISA ikke direkte er lig med høje antistofniveauer i HI testen. De høje antistofværdier for ELISA på serumprøver og æggeblommer igennem hele forsøgsperioden gjorde ikke muligt at lave en sammenligning mellem lave værdier i HI testen og lave værdier i ELISA. Antistofværdierne forbliver højest i æggeblommerne, mens der dog ses et svagt fald i serumprøverne. Derfor blev det efterfølgende bestemt, at de fem primede høns (høne nr. 1-5) blev vaccinerede med halv dosis inaktiveret ND vaccine (Nobilis RT-IBmulti-ND G), og blod og æg blev udtaget efter en, to og tre uger. Tabel 1 viser, at der en uge efter vaccinationen med den lave dosis vaccine kunne måles et lavt indhold af antistoffer ved ELISA i serumprøverne. Ved HI test ses et lidt højere antistofsvar. I prøver fra æggeblommer var det ikke muligt at måle antistoffer efter den første uge. Efter 14 dage ses et højt indhold af antistoffer ved både ELISA og HI test på serumprøverne. I æggeblommer blev der fundet et middelhøjt indhold af antistoffer. Tre uger efter vaccinationen blev der fundet et højt indhold af antistoffer i både serum og æggeblommer testet ved ELISA og serum ved HI test. For yderligere at sammenligne lave værdier mellem ELISA og HI testen blev der udvalgt fem sæt af serumprøver, indsendt til den almindelige vaccinations kontrol for ND. Tabel 2 viser resultater fra serum fra fire tilfældige flokke: A, B, C og D, der er indsendt til vaccinationskontrol til Veterinærinstituttet, ved fra hver besætning i leveuge 23 at indsende 30 blodprøver. Antistofværdierne i både ELISA og HI testen af disse prøver viser en del lavere 4

5 ELISA TEST TIL PÅVISNING AF ANTISTOFFER MOD NEWCASTLE DISEASE I SERUM OG ÆG værdier end i det udførte vaccinations forsøg. Forsøget viste dog også, at lave antistofværdier i ELISA ikke er klart sammenfaldende med lave antistofværdier i HI testen. Fremtid Da udviklingen af antistoffer i serum og æggeblomme umiddelbart ser ud til at følges nogenlunde ad, bør fokus måske rettes mod sammenhængen mellem antistoffer i serum ved HI test og serum ved ELISA. Et forslag ville være at teste alle rutineprøver i både HI test og ELISA over en periode for at få et større grundlag til at fastlægge en cut-off værdi. En cut-off værdi kan ikke fastlægges på enkelte dyr, men kunne muligvis fastlægges for alle indsendte blodprøver fra samme flok, evt. med en gennemsnitsværdi (OD %) for den samlede indsendelse sammen med en nedre grænseværdi for enkelte prøver. Alternativt eller i sammenhæng med ovenstående kunne der også vaccineres ti høns med 1/10 dosis vaccine og derefter følge udviklingen af antistoffer efter en uge, med ugentlige indsamlinger af både blodprøver og æg i op til ti uger. Det vil yderligere give et godt beregningsgrundlag for sammenhængen mellem lave antistof værdier for de to test, og et bredere grundlag for fastlæggelse af en cut-off værdi for test på æggeblommer. Konklusion Der er udviklet en ELISA, der er i stand til at detektere antistoffer mod ND i både blodprøver og i æggeblommer. ELISA testen viser en god specificitet; Alle negative høns forblev negative gennem hele testperioden, og hos de vaccinerede høns kunne der gennem hele testperioden detekteres antistoffer mod ND. Der ses en høj grad af sammenhæng mellem udviklingen af antistoffer i blodprøver og udviklingen af antistoffer i æg. Dog ses en forsinkelse i måling af antistofferne i æggeblomme i forhold til i blodprøverne, men antistofferne i begge materialer holder sig højt gennem hele forsøgsperioden. Desværre har det høje antistofniveau gennem næsten hele forsøgsperioden gjort det svært at finde en sammenhæng mellem lave antistofmålinger ved HI test og ved ELISA, hvilket vil være nødvendigt, hvis HI testen skal erstattes med ELISA. I øjeblikket foretages der, på initiativ af Veterinærinstituttet, sortering og frysning af blodprøver, indsendt til normal vaccinationskontrol, der ikke opfylder lovens krav om en titer på over 64 eller med titer under 16 eller mellem 16 og 64. Prøverne testes via HI og via ELISA. Dette sker for at kunne finde en gyldig cut-off værdi, der kan danne grundlag for at kunne benytte en ELI- SA test som alternativ til en HI test. Der vil i foråret 2010 blive ansøgt om midler til validering af testen. 5

6 Tabel 1. Resultater af forsøgshøns (1-55) indsat i enkeltbure. ELISA-test HI Titer Høne nr. sera 1:1600 sera 1:3200 æg 1:1600 æg 1:3200 Prøvedato 17/ / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / /

7 Tabel 2. Resultater af fire tilfældigt indsendte flokke til vaccinationskontrol. ELISA 1:1600 1:3200 Floknr./prøvenr. A B C D A B C D A B C D Hi-titer

8 Tabel 3. Resultater af målinger på seronegative forsøgshøns 1-5, vaccineret med halv dosis af en inaktiveret NDvaccine og testet efter én, to og tre uger. ELISA Høne nr. sera 1:1600 sera 1:3200 sera 1:8000 æg 1:1600 æg 1:3200 æg 1:8000 Prøvedato 11/ / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / HI Titer