SMITTESPORING MED MIKROBIOLOGISKE METODER nye muligheder med fuldgenom-sekvensering

Transkript

1 SMITTESPORING MED MIKROBIOLOGISKE METODER nye muligheder med fuldgenom-sekvensering Eva Møller Nielsen cand.brom., PhD Sektionsleder, Fødevarebårne Infektioner Afdeling for Mikrobiologi og Infektionskontrol Statens Serum Institut

2 Registrerede tilfælde Campylobacter Salmonella Shigella ssp VTEC Listeria 0 2

3 Hvordan ved vi hvad patienten er syg af? Patienten får diarré, feber, Går til egen læge eller bliver indlagt Afføringsprøve indsendes til laboratorium og prøven analyseres Positivt resultat (fx dyrkning) Patienten registreres som et tilfælde, fx med Salmonella-infektion, i SSI s database 3

4 Hvad skal det nationale smitteberedskab kunne? Overblik over situationen i hele landet - Løbende følge udviklingen i smittede med mave-tarminfektioner ændringer i typer/virulens/antibiotikaresistens over tid Påvise og undersøge udbrud Smittekilder ændringer over tid - Smittekilderegnskab til interventioner i fødevaresikkerheden Samarbejde med fødevaremyndigheder mm International kommunikation - Data til den europæiske overvågning (ECDC) - Fødevarebårne udbrud der krydser grænser udveksling af epi-/mikrobiologiske data 4

5 Hvordan gør vi i dag? Løbende registrering af episoder - laboratorie-verificerede cases (KMA er) Modtagelse af tilhørende isolater fra KMA er (visse patogener) Løbende typning af isolater Analyse af data - igangværende udbrud? Udbrudsundersøgelser 5

6 6

7 Mikrobiologisk sammenhæng? Er flere patienter smittet med samme bakterie? - Fælles smittekilde, udbrud? Kan bakterien findes i en mulig smittekilde? Mulig smittekilde Bakterien isoleres Patient Patient 2 7

8 Typning Anvendelse af markører, som danner undergrupper af en bakterieart ( typer ) Viser epidemiologiske sammenhænge - bør kunne genkende isolater fra et udbrud og adskille fra ikke-relaterede bakterieisolater Vi typer bl.a. for at påvise udbrud, afgrænse udbrud, smittesporing Sammenholdes med andre epidemiologiske data Multi-locus variable number of tandem repeats (MLVA) Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) 8

9 E. coli O57 tilfælde udbrud? 9

10 E. coli O57 undertyper (PFGE, DNA-fingeraftryk) 0

11 Salmonella Typhimurium (MLVA-typer ) jan feb mar apr maj jun jul aug sep okt nov dec jan feb mar apr maj jun jul aug sep okt nov dec jan feb mar apr maj jun jul aug sep okt nov dec jan feb mar apr maj jun jul aug sep okt FUD nr

12 Udbrudsopklaring Formålet med opklaringsarbejdet er at: identificere og fjerne kilden til sygdomsudbruddet forhindre, at flere bliver syge af den aktuelle kilde forebygge gentagelse 2

13 Antal tilfælde med invasiv listeriosis

14 Overvågning med PFGE Anne Kvistholm Jensen

15 Udbrud 2009: 8 cases indenfor en uge Sous-vide kød, utilstrækkeligt tilberedt Catering til ældre Inkubationstid 2-27 dage 2 døde Identical PFGE pattern (3 entries) PFGE_AscI PFGE_AscI

16 Pulsed-field gel elektroforese (PFGE) gel Standard Standard Standard Reference Standard

17 MLVA Multi-locus variable number of tandem repeats analysis Bakteriegenom med 5 VNTR-områder (= VNTR loci): 6, 9 or 33 bp repeat units, e.g. GCAAGG MLVA-profil: Metode: PCR efterfulgt af fragment-analyse ved kapillær-elektroforese

18 Whole genome sequencing (WGS) Principles of next generation short read sequencing: 8

19 Fremtidens metoder er baseret på WGS Sparer tid og penge ved at gå væk fra hierarkisk typning og forskellige reagenser/metoder til hver organisme Mix af lab-teknikker serotypning, antibiogram, PCR, PFGE, MLVA, sekventering WGS Bioinformatiske analyser til forskellige formål Backward comparability for visse karakteristika 9

20 Listeria overvågningen fremtiden er begyndt Før september 203: - Alle isolater fra patienter types (PFGE; batch med 3-5 cases) - Interview ved mistanke om udbrud - Fødevareisolater fra offentlig kontrol gemmes Forbedret overvågning 203-4: September 203: patient-isolater genom-sekventeres ugentlig Januar 204: løbende opfølgning på alle patienter (inkl interview) Juni 204: FVST s isolater sendes til genomsekventering på SSI - 205: genomsekvensering på DTU 20

21 MLST Whole-genome-sequencing OG ST + SNP? (WGS), SNPs, MLST MLST approx 3500 basepairs WGS MLST + SNP analysis selekterede regioner MLST: 3500 bp = 0.3% of the genome - Sammenligning af isolater Pat Pat 2 Pat 3 Pat 4 Pat SNP: 2.8 mio bp = 98% of the genome

22 Workflow rutine overvågning QC MiSeq data QC MLST MLST nomenklatur 6 7 Cluster? QC SNP analyse Cluster? ssi-snp-pipeline på github.com/phwgs Udbrudsundersøgelser 22

23 Sekvenstyper (7-locus MLST) August 203 Real-time WGS of human isolates

24 Listeriosis in 203 and 204 (May) MLST tree, all isolates (n=64): MLST ST- isolates (n=2): Date Patient A 204 Jan 203 Marts 203 Juli 204 Marts 203 Jan 203 Jan Patient A Cluster Cluster Cluster Cluster 203 April 203 April 203 Aug 203 Sept 203 Juni ST SNPs 4 patients 9 weeks SNP 204 Jan

25 Listeria udbrud 25

26 Udbrud sommer 204 (4 cases, 4 i 203; 7 døde) July 7: 5 cases from 204 in outbreak July 6: matching food isolate August 203 Real-time WGS of human isolates

27 WGS forbinder patienter med rullepølse Hele bakteriens DNA-kode bestemmes: - 2,8 millioner baser/ bogstaver Bakterier fra rullepølse og patienter i udbruddet er helt ens WGS viser med stor sikkerhed sammenhæng mellem Listeria fra patienter og fra Jørn A. Det kan bekræftes at mange patienter har spist rullepølse 27

28 Opklaring af udbruddet Fødevareisolater typet på SSI og sammenlignet direkte - pilotprojekt med start juni 204 Identiske Listeria isolater fundet hos patienter og i rullepølse fra april 204 Spisevaner og Jørn A s distribution støttede hypotese om link til rullepølse Flere cases kan være smittet på plejehjem eller på sygehus - De fleste hospitaler har fået leveret produkter fra Jørn A Rullepølser 2 Havde været meget svært at udpege smittekilde via interviews - cases havde spist meget forskelligt pålæg og handlet mange forskellige steder 6 Human Jørn A 2.led virksomhed 6 28

29 Clustre af listeria-infektioner Samme farve = samme klon (fuldgenom-sekvenser ens) 29

30 Fremtidens smitteberedskab med nye teknikker Gode muligheder for brug af bedre teknikker, fx genom-sekventering - Også til Salmonella, E. coli, Campylobacter,. Kræver omlægning/investering i lab og bioinformatik (forskning) Brug for vidensopbygning og erfaring med udbrud og opsporing Trussel: manglende isolater fra patienter, fødevarer og primærproduktionen Fortsat vigtigt med samarbejde på tværs af sektorer og mellem mikrobiologer og epidemiologer 30

31 Salmonella Stanley outbreak in Europe 202

32 Tak for opmærksomheden! Fødevarebårne infektioner, SSI: Jonas T. Larsson Kristoffer Kiil Anne Kvistholm Jensen Mia Torpdahl Søren Persson Pernille Gymoese Eva Litrup Flemming Scheutz Katrine Joensen Marianne Kjeldsen