På jagt efter min far. Edvotec S-49.

På jagt efter min far. Edvotec S-49. Skolekom eller Frederiksen er leverandører Dansk oversættelse Lektor Åse Uttenthal, Vordingborg Gymnasium og HF. Figurer fra Edvotecs vejledning. Oktober 2017, version 3. Kittet kan opbevares ved stuetemperatur, dog skal prøverne til påsætning opbevares ved 4 C. Indhold Baggrund... 2 Baggrundsmateriale fra importøren:... 2 Baggrundshistorie... 2 Metode... 4 Overblik over forsøgsopstillingen... 4 Støbning af gel og fremstilling af elektroforese buffer... 5 Støbning af gel... 5 Buffer... 6 Påsætning af prøver... 6 Gelelektroforese... 7 Tolkning af gelerne og arbejdsspørgsmål... 8 Noter til læreren.... 8 Gelen til venstre er fra Edvotec forlægget, gelen til højre er resultatet af en elevkørsel. Det bliver ikke helt så pænt som i vejledningen, men kan sagtens aflæses. Vær opmærksom på at prøverne diffunderer så snart der slukkes for strømmen, så de skal aflæses straks. På jagt efter min far, Edvotec S-49_ Uttenthal 1

Baggrund Baggrundsmateriale fra importøren: Kit S-49. Eleverne finder identiteten på 2 drenge, som blev adskilt fra deres forældre som små vha. DNA elektroforese. Mødrene identificeres vha. mitochondrie DNA og fædrene vha. kromosom DNA. DNA simuleres med farvestoffer. Eleverne lærer at støbe agarose geler samt hvordan de påsætter prøver og udfører elektroforesen. De lærer hvordan DNA adskilles efter størrelse under elektroforesen. De får set nogen helt basale begreber for løsning af identitet af mor og far i børnene. Det er en god mulighed for at øve pipettering samt påsætning af prøver i dummy-geler. Prøverne skal sættes på under bufferspejlet, og det er relativt vanskeligt at få prøven placeret korrekt uden luftbobler og overflow, så det er vigtigt at eleverne har prøvet pipettering før. Vær dog opmærksom på at dummy-gelerne flyder så man kan kun øve at ramme brøndene. Materialer Prøvemateriale til 10 grupper på gymnasieniveau, leveres med koncentreret buffer og gel opløsning. Apparaturkrav for at gennemføre øvelsen Vandret elektroforese apparat Elektroforese strømforsyning Mikropipetter med variabelt volumen inkl. spidser Vægt Mikroovn/kogeplade Almindelige laboratorieglasvarer Forsøgstid Ca. 45 min, heraf 20 min hvor gelen stivner. Derudover skal der beregnes ca 1 times elektroforese. Det er muligt at støbe gelen og gemme den et par dage i køleskab. Baggrundshistorie Historien bag de prøver der skal analyseres er denne: I et lille land, hærget af krig, blev to unge drenge adskilt fra deres forældre, som var blevet taget til fange af det onde regime. Drengene var fætre idet deres mødre var halv søskende med samme mor (se figur 1 herunder for et stamtræ). Det var tydeligt at se at de lignede hinanden, de var næsten lige gamle, kun 2 måneder var der mellem deres fødselsdage. Mange år senere blev det onde regime nedkæmpet og erstattet af en ny regering som løslod alle politiske fanger. De tidligere fanger blev ført tilbage til det område de oprindeligt kom fra og alle anklager imod dem blev frafaldet. På jagt efter min far, Edvotec S-49_ Uttenthal 2

Figur 1 Stamtræ over de to fætre og deres forældre. I denne tid havde de to drenge opholdt sig sammen hos en militær officer, der ikke selv havde børn, han havde adopteret drengene og anså dem for sine sønner. Både officeren og hans hustru blev slået ihjel under den opstand der knuste militærdiktaturet. De to drenge blev derfor anbragt på et børnehjem i en kort periode. Da drengene fyldte 18 år forlod de børnehjemmet og begyndte straks at lede efter deres biologiske forældre. Fætrene kontaktede en række af de ældre fra landsbyen. De ældste fortalte dem at efter deres biologiske forældre var blevet løsladt fra fængslet blev en af fædrene myrdet af en sympatisør med det faldne regime. Den anden biologiske far led af alvorligt hukommelsestab. To kvinder, der blev betragtet som de biologiske mødre opholdt sig i et rehabiliteringscenter med ca 200 andre kvinder. Da drengene ankom til rehabiliteringscenteret stod det klart at patienterne ikke havde fået den nødvendige medicinske behandling. På baggrund af alder og udseende var det muligt at udvælge 10 kvinder, der var mulige mødre til de 2 drenge. Da drengene var fætre og deres mødre var halvsøstre blev den første analyse baseret på DNA fra mitokondrierne (mitokondrie DNA screening). Mitokondrie DNA nedarves kun med moderen, fordi det er moderens ægcelle der danner grundlag for fosteret. Det var derfor forventet at mitokondrie DNAet ville være ens for de to drenge. Analyse af mitokondrie DNA er en billigere analyse end at undersøge kromosomalt DNA og resultatet foreligger hurtigere. Det viste sig at 2 af kvinderne fra hjemmet havde identisk kromosomalt DNA, og at dette også var identisk med mitokondrie DNA fra de 2 drenge. For at finde de korrekte fædre til de to drenge blev der udført en kromosom DNA identitets test (fingerprinting test) på de 2 drenge og mødrene og den far der stadig var i live. DNA identiteten af et barn er en blanding af elementerne (de synlige DNA bånd på gelen) fra begge forældrene. DNA billedet fra den ene dreng passede til den ene potentielle mor samt den far der var i live. Kromosomalt DNA er til stede i cellekernen på alle levende celler, det er det genetiske materiale som bestemmer over syntesen af alle proteiner i cellen. DNA i cellekernen består af lige meget DNA fra hver af individets forældre, idet hvert kromosom par består af et kromosom fra far og et fra mor. I pattedyr er det kun exons der koder for protein, resten af DNA et er ikke-kodende (introns). Under udviklingen af mrna til proteinsyntesen bliver introns klippet ud af RNA strengen. DNA strukturen i introns kan anvendes til at studere forskellen mellem individer og disse bruges til analyse af slægtsskab. Mitokondrie DNA nedarves alene fra moren, ægcellen indeholder et stort antal kromosomer mens sædcellen kun har ganske få kromosomer. Det befrugtede æg indeholder derfor flest mitokondrier fra moren, og er derfor kun egnet til at vurdere hvem der er mor til individet. På jagt efter min far, Edvotec S-49_ Uttenthal 3

Metode Inden du starter forsøget skal du læse og forstå hele beskrivelsen. Skriv en hypotese for resultatet. Overblik over forsøgsopstillingen 1. Bland delene til gelen, og kog gelen i mikrobølgeovn. 2. Støb en gel i støbeformen og lad den køle af. 3. Fremstil elektroforesebufferen. 4. Tag kam og gummiklodser af gelen og læg den i elektroforesekarret, den skal blive liggende i sin plastic form. 5. Hæld elektroforesebuffer over gelen, så begge de to render, hvor elektroderne sidder, er fyldt med buffer. Derudover skal gelen være helt dækket af buffer. 6. Sæt prøverne på gelen. 7. Læg låg på elektroforesekarret. 8. Sæt strøm til bufferen, som så går igennem gelen. 9. Hold øje med gelen mens den kører, den skal køre i ca 1 time. 10. Afbryd strømmen inden prøverne kører ud af gelen. 11. Aflæs resultatet straks strømmen er slukket. På jagt efter min far, Edvotec S-49_ Uttenthal 4

Støbning af gel og fremstilling af elektroforese buffer Støbning af gel Materiale: Erlenmeyer kolbe, 250 ml Målebæger 50-100 ml Mikropipette 1 ml Finvægt og vejebåde Form til at støbe gelen i (der er 2 forskellige størrelser, vi bruger en 7x7 cm form) Mikroovn og handske, der kan tåle varme. Termometer op til 100 grader. Ionbyttet vand TAE buffer koncentrat (ligger i pakken) Agarose (ligger i pakken) DNA elektroforesen udføres i 0,8% UltraSpec-Agarose TM i TAE buffer, alle delene leveres med kittet. Gelen fremstilles i en 250 ml Erlenmeyer kolbe, den fremstilles af agarose, koncentreret buffer og ionbyttet vand efter nedenstående skema. Gel størrelse [cm] Agarose [g] Buffer 50x [ml] Ionbyttet vand [ml] Total volume [ml] 7 x 7 (de små) 0,24 0,6 29,4 30 7 x 15 (de store) 0,48 1,2 58,8 60 Vej agar nøjagtigt af på en fin vægt i en vejebåd, hæld i kolben. Tilsæt buffer ved hjælp af pipette. Afmål ionbyttet vand i et måleglas og tilsæt. Swirl kolben rundt et par gange for at fordele agaren og sæt den i mikroovn med fuld effekt i 30 sec. Derefter swirvles kolben igen (brug handsker) nu skal kolben stå i mikroovn ved fuld effekt og hver gang den koger stoppes og swirles igen. Når indholdet er klart uden partikler i stilles den på bordet til afkøling. Nu samles elektroforeseformen, der sættes gummiklodser på begge ender og der hænges en kam på holderen så der kommer brønde i gelen. Sørg for at formen står på et lige bord så gelen bliver jævn i tykkelsen. Når formen er samlet hældes den ca 55ºC varme gel i, undgå luftbobler, lad stå i 20 min mens den stivner. Når kammen fjernes er der 6 brønde spor se tegning her for nummerering. 1 2 3 4 5 6 På jagt efter min far, Edvotec S-49_ Uttenthal 5

Buffer Materialer: 1 liter Blue cap flaske Måleglas til 20-50 ml evt stampipette til at måle buffer af. Ionbyttet vand Koncentreret TAE buffer (ligger i pakken). Vi arbejder med elektroforesekar, der kan tage 3x2 små geler eller 3 af de lange geler i én kørsel. For at fylde karret skal der bruges lidt mere end 1 liter elektroforesebuffer (TAE buffer). Det er også muligt at bruge mindre kar der kun kan tage 1x2 geler. Bufferen fremstilles ud fra en medsendt 50xopløsning. Lav opløsningen i Blue Cap flasker med skruelåg, skriv TAE buffer og fremstillingsdato på flasken. Brug stampipetter eller små måleglas til at måle den koncentrerede buffer af, fyld op til f.eks 1 liter på Blue Cap flasken. Efter elektroforese kan bufferen hældes tilbage på flasken, stilles i køleskab og bruges igen. 50x conc buffer [ml] Ionbyttet vand [ml] Total mængde 20 980 1000 ml (1 liter) 6 294 300 ml Påsætning af prøver Når gelen er stivnet fjernes kammen forsigtigt uden at lave ridser i gelen. Fjern også forsigtigt de to gummiklodser, der kan lirkes af. Lad gelen blive i sin plexiglas form og sæt den i elektroforesekarret. Læg mærke til at der er nogen hakker i karret der passer med formen. DNAet vil køre mod + (den røde elektrode) derfor skal karret ligge så brøndene i gelen ligger længst væk fra den røde elektrode. Hæld buffer i karret. DNA prøverne sættes på gelen efter den er anbragt i elektroforesekarret og gelen er dækket med elektroforese buffer. Det vil sige at du skal sætte prøverne på under bufferen. Der skal påsættes 6 prøver på gelen, brug de 6 første brønde til prøverne. Hvis du kommer til at sjaske for meget ved siden af kan du springe en brønd over. Men husk endelig at notere det i din journal. Inden I begynder at tage af prøverne skal hele strippen centrifugeres for at få prøvematerialet væk fra toppen. Prøverne sættes på med en 10-100 µl pipette. Sæt 30 µl prøve på fra hver, prøverne er mærkede med farve, så de er lette at se. HUSK: du skal sætte pipetten på 20 µl, sætte en ren pipettespids på (sørg for at den sidder ordentligt fast), trykke knappen ned til der er modstand. Tryk pipettespidsen igennem sølvpapiret og sug de 20 µl op ved meget forsigtigt at slippe knappen. Hold pipetten lodret og overfør straks, med rolig hånd, prøven til gelen ved at støtte pipettehånden på elektroforese-karret, forsigtigt sætte spidsen ned i brønden og trykke stemplet ned til der er modstand. Hvis du trykker for hårdt kommer der luftbobler og så spilder prøven ud af brønden. Hold tommelfingeren nede til du har pipettespidsen oppe af karret igen, ellers suger du prøven med op. Pipettespidsen skiftes mellem hver prøve. På jagt efter min far, Edvotec S-49_ Uttenthal 6

Prøverne påsættes efter dette skema Spor nr Mærket med Prøve 1 A Størrelsesmarkør* 2 B Mor 1 3 C Mor 2 4 D Dreng 1 5 E Dreng 2 6 F Far *Størrelsesmarkøren har flg prøver 450, 800, 1500, 3500 baser. Den bruges til at vurdere hvor mange baser der er i de DNA stykker der bliver kørt på gelen i de andre brønde. Størrelses markøren (eller Ladder/Stige) påsættes på samme måde som de ukendte prøver. Når alle 6 prøver er sat på sættes låget på elektroforesekarret og de to stik sættes i strømforsyningen (HUSK at prøverne kører mod + (rød)). Gelelektroforese Sæt strømforsyningen på, check igen at dine prøver vandrer imod den røde pol. Skru strømkilden op til 100 Volt. Vent i 1 minut så du kan se at prøverne begynder at vandre ud af gelen, og at de vandrer ud mod det lange stykke. Hvis du har kvajet dig og prøverne går den gale vej kan du slukke for strømmen og sætte låget rigtigt på og starte strømmen igen. Vær også lige opmærksom på at gelen ikke bliver for varm under kørslen (man kan måle karrets temperatur på undersiden, det må ikke føles ret meget varmere end omgivelserne). Følg prøvernes kørsel, når de første farvede bånd er ca 1 cm fra kanten af gelen skal strømmen afbrydes. Det tager 30-50 minutter, men hold lidt øje med kørslen, prøverne kan køre ud af gelen hvis der ikke slukkes for strømmen. Afbryd strømmen og tag gelerne op af karret (de kan godt være gået lidt løse af holderen), så vær forsigtig. Sæt karret på en hvid baggrund, tag et billede og aflæs hvor båndene ligger. På jagt efter min far, Edvotec S-49_ Uttenthal 7

Tolkning af gelerne og arbejdsspørgsmål Beskriv forskellen på kromosomalt DNA og mitokondrie DNA, hvor kommer de fra og hvorfor er de forskellige. Hvad er ifølge historien grunden til at der undersøges mitokondrie DNA for at udvælge de 2 kvinder der kan være mødre til drengene? Hvordan er DNA fra mitokondrier dannet? I det forsøg I har udført analyseres kromosomalt DNA på 5 personer, forklar hvordan DNA fra kromosomer er dannet. Hvad er eksperimentets variable? Hvor er kontrollen i eksperimentet? Hvorfor skal der være en markør? Spor A? Hvilken størrelse har de forskellige fraktioner af DNA? Det bliver angivet i antal baser pr bånd. Hvem er mor til dreng 1? Hvem er mor til dreng 2? Er den overlevende far i familie med nogen af drengene? Noter til læreren. Baggrundshistorien er noget rodet, man kan evt fjerne hele historien om mitokondrie DNA, det vil lette forståelsen at man kun snakker kromosomalt DNA., der er det vi analyserer. Det er en god idé at øve sig forinden med de gummigeler der passer i karret. Brug et tungt, farvet reagens til at sætte på dummy-gelerne. Alternativt kan man støbe nogen geler med en masse kamme i, disse kan også bruges til at øve prøvepåsætning under væske. Kogning i mikrobølgeovn skal være meget overvåget, ellers kommer der stødkogning og gelen koger over. Stå og følg processen mens der mikrobølges. Centrifugér hele strippen før den udleveres, så er materialet i bunden af rørene. Læreren kan gøre det på forhånd og sætte prøverne i stativ. Der sker hurtig diffusion af prøven når der ikke er strøm på systemet. Derfor skal de ikke stå ret længe efter påsætning inden kørsel, og ikke for længe efter kørsel inden aflæsning. Materiale rester, pipettespidser og geler er uden risiko. Hvis man lader gelen ligge uden væske over vil den tørre ind til en ganske tynd chip, det er illustrativt at vise hvor lidt agar der skal til får at få en stærk gelstruktur. Se den engelske udgave for lærer tolkning af gelen. På jagt efter min far, Edvotec S-49_ Uttenthal 8