Analyse af proteiner Øvelsesvejledning

Størrelse: px

Starte visningen fra side:

Download "Analyse af proteiner Øvelsesvejledning"

Patrick Dideriksen
10 år siden
Visninger:

1 Center for Undervisningsmidler, afdeling København Analyse af proteiner Øvelsesvejledning Formål At separere og analysere proteiner i almindelige fødevarer ved brug af gelelektroforese. Teori Alle dele af denne burger indeholder proteiner. Det gør alle celler i din krop også. Proteiner udgør omtrent en femtedel af din kropsvægt. De fungerer som enzymer, der får kemiske reaktioner til at forløbe hurtigere, som hormoner og neurotransmittere. Nogle proteiner fungerer som antistoffer, der beskytter mod infektioner. Andre proteiner reparerer kropsvæv og holder dig sund. Proteiner består af lange kæder af aminosyrer. Der er 20 forskellige aminosyrer, der kan kædes sammen på mange forskellige måder ligesom bogstaver kan kædes sammen til mange forskellige ord. Rækkefølgen af aminosyrer i forskellige kæder får kæderne til at folde sig og krølle sig sammen på forskellige måder. Det er den rumlige opbygning af proteinerne, der gør at proteinerne har så mange forskellige funktioner. Proteiner kan adskilles efter størrelse med elektroforese. Det gøres ved at lade proteinerne bevæge sig gennem en porøs gel. Proteinerne placeres i den ene ende af gelen, hvorefter Side 1 af 6

De fungerer som enzymer, der får kemiske reaktioner til at forløbe hurtigere, som hormoner og neurotransmittere. Nogle proteiner fungerer som antistoffer, der beskytter mod infektioner.

2 en elektrisk spænding får dem til at bevæge sig gennem gelen. Efter elektroforesen farves og vaskes gelen, hvorefter de forskellige proteiner ses som blå bånd. Hvert bånd udgøres af millioner af proteinmolekyler med omtrent samme størrelse. Denne metode kan bruges til at sammenligne proteiner i fx forskellige fisk, i frø, i biologiske vaskemidler eller i morgenmadsprodukter. Apparatur og kemikalier Fødevareprøver TB-buffer Agarosegel 3% Laemmli-buffer Colloidal Coomassie Blue + salt Engangssprøjte med engangspipettespids Prøverør med låg Flydeholder til prøverør Saks Elektrosekammer 6-benet kam Carbonfiber Strømforsyning og ledninger Side 2 af 6

Denne metode kan bruges til at sammenligne proteiner i fx forskellige fisk, i frø, i biologiske vaskemidler eller i morgenmadsprodukter.

3 Fremgangsmåde De fleste fødevarer (fx fisk og ost) kan bruges uden at der skal gøres noget forarbejde. Hvis du bruger frø, skal de først males til fint pulver. Når du har forberedt fødevare-prøven, skal du gøre følgende: 1. Kom dine proteinprøver i rene prøverør. Prøvestørrelsen skal svare til et halvt riskorn. 2. Tilsæt 0,5 ml Laemmli-buffer til hvert rør 3. Luk rørene og mærk dem på låget. 4. Bland rørenes indhold ved at knipse forsigtigt på rørenes sider gange. Herved opløses nogle af proteinerne i farven 5. Lad rørene stå opret i 5 min. så faste stykker synker til bunds. Kogning Det følgende trin kan springes over, men det kan give bedre resultater. Ved opvarmning ændres proteinerne således at de folder sig ud og bliver til lange kæder. Alle proteinerne ender med at have samme form, så derfor vil de efterfølgende bevæge sig igennem gelen efter størrelse i stedet for efter hvordan de er foldet. 1. Sæt prøverørene i holderen, der kan flyde, og placér dem i et kogende vandbad i ca. 3 min. 2. Tag rørene op og sæt dem på is indtil de skal bruges i næste trin Forberedelse af gelen 1. Klip to stykker carbonfiber. De skal måle 22 mm x 42 mm. Disse skal være elektroderne i hver ende af elektrolysekammeret. Tjek at de passer og læg dem til side. 2. Placér en seks-benet kam i den ene ende af gelkammeret, så den flade side vender den vej, der står på figuren. Side 3 af 6

Tilsæt 0,5 ml Laemmli-buffer til hvert rør 3. Luk rørene og mærk dem på låget. 4. Bland rørenes indhold ved at knipse forsigtigt på rørenes sider 15-20 gange.

4 3. Hæld lidt over 10 ml smeltet gel i kammeret, så det fylder midten og flyder under og mellem kammens ben. Hvis du spilder gel i enderne af kammeret, kan du fjerne det, når det er størknet. 4. Lad kammeret stå i min. mens gelen størkner. Når den er størknet, vil den være lidt mælket. Påføring af prøverne 1. Hæld lidt mere end 10 ml TB-buffer ned i gelkammeret. Væsken skal dække gelens overflade og flyde ned i områderne i hver ende af kammeret, således at væskestanden er ca. 2 mm over gelen. 2. Tag meget forsigtigt kammen op af gelen 3. Marker på kammerets yderside hvilken prøve du vil påføre i hvilken brønd 4. Udtag lidt væske fra et af prøverørene (ca. 5 mm i spidsen af pipetten er nok). Sørg for at du ikke får noget bundfald med! 5. Overfør prøven til en af brøndene i gelen ved at holde pipetten over brønden, men under væskeoverfladen se figuren. 6. Gentag med de andre prøver. Side 4 af 6

Væsken skal dække gelens overflade og flyde ned i områderne i hver ende af kammeret, således at væskestanden er ca. 2 mm over gelen. 2. Tag meget forsigtigt kammen op af gelen 3.

5 Kørsel af gelen 1. Placér en elektrode i hver ende af tanken som vist nedenfor. Tilslut elektroderne til en strømforsyning. Spændingen må max. være 36 V. 2. Sørg for at der er kontakt mellem bufferopløsningen og elektroderne. Tilsæt lidt mere TB-buffer hvis det er nødvendigt. Du kan se bobler ved den negative elektrode, hvis det er som det skal være. Side 5 af 6

Sørg for at der er kontakt mellem bufferopløsningen og elektroderne.

6 3. Læg den 6-benede kam over gelkammeret som låg. Lad gelen køre i nogle timer. Den røde pil på figuren viser hvilken vej proteinerne bevæger sig. 4. Afbryd strømmen når Laemmli-bufferens blå farve er tæt på gelens ende. 5. Rens krokodillenæbene i vandhanevand og tør dem grundigt ellers ruster de. Farvning af proteinerne 1. Fjern elektroderne og smid dem væk 2. Lad gelen være i kammeret. Skyl den med demineraliseret vand. Hæld derefter demineraliseret vand i tanken og lad det stå i ca. ½ time. Skift vand og gentag. 3. Ryst farveflasken grundigt. Hæld ca. 12 ml farve på gelen. Læg igen kammen over og lad det stå natten over. Den blå farve vil så binde sig til proteinerne. 4. Hæld bufferen væk og rens overfladen af gelen grundigt med demineraliseret vand. 5. Hæld demineraliseret vand i kammeret og lad det stå i 4-6 timer. Skift vandet efter 2-3 timer. 6. Nu kan båndene på gelen studeres. De forskellige bånd er forskellige proteiner eller fragmenter af proteiner. Det bedste resultat kan ses efter timer. Side 6 af 6

Fjern elektroderne og smid dem væk 2. Lad gelen være i kammeret. Skyl den med demineraliseret vand. Hæld derefter demineraliseret vand i tanken og lad det stå i ca. ½ time. Skift vand og gentag. 3.

Relaterede dokumenter

Formål At analysere for myosin i muskelvæv fra fisk ved brug af western blotting

Center for Undervisningsmidler, afdeling København Western blotting Øvelsesvejledning Formål At analysere for myosin i muskelvæv fra fisk ved brug af western blotting Teori Proteomik er studiet af celleproteiners