Øvelsesvejledning til Almen Mikrobiologi

2. år Blok 1 Øvelsesvejledning til Almen Mikrobiologi Lars H. Hansen, Bo Jensen, Anders Priemé, Sten Struwe, Søren J. Sørensen Afdeling for Mikrobiologi Biologisk Institut Københavns Universitet 2007

Indholdsfortegnelse INDHOLDSFORTEGNELSE OVERSIGT OVER ØVELSER OG KOLLOKVIER... 4 GENERELLE SIKKERHEDSREGLER FOR DE STUDERENDES LABORATORIEARBEJDE... 5 Første gang du er i et nyt laboratorium...5 Inden du begynder på et arbejde...5 Under laboratoriearbejdet...6 Efter endt laboratoriearbejde...6 Uheld ved laboratoriearbejde...7 Generelle kommentarer...7 1. INTRODUKTION... 8 1.1. Substratfremstilling...8 1.2. Inkubering og opbevaring af kulturer...8 1.3. Steriliseringsmetoder...9 Tørsterilisering...10 Autoklavering...10 Dampsterilisering...10 Flambering og glødning...11 Sterilfiltrering...11 1.4. Basale teknikker...12 Podning...12 Podning med podenål...12 Podning med pipette...12 Podning med sprøjte...13 Fortyndinger...13 Fraktioneret udstrygning...13 Tælling af mikroorganismer...14 Pladespredning på agar...14 Indstøbning i agar...15 Tælling i tællekammer...16 2. VÆKST AF MIKROORGANISMER... 17 2.1 Vækst i væskekultur...17 Øvelse 1: Vækstkurve...17 2.2 Vækst på overflade...19 2

Indholdsfortegnelse Øvelse 2: Radiær udbredelse...19 Selektive medier:...19 Atamons indvirkning på svampevækst (Geotrichum candidum):...20 Øvelse 3: Bakterie-kimtal i hakket oksekød...22 Øvelse 4: Indvirkning af bakteriehæmmende behandlinger af hakket oksekød...23 3. IDENTIFIKATION AF MIKROORGANISMER... 25 Øvelse 5: Identifikation af bakterier...25 Gram-farvning...27 Katalase...28 Cytochrom c oxidase...29 Oxidativ eller fermenterende glukoseomsætning...29 API identifikations kits...33 Identifikation af mikrosvampe...33 Skimmelsvampe...34 Gærsvampe...35 Mugsvampe...35 Fremstilling af præparater af skimmelsvampe...35 Øvelse 6: Identifikation af mikrosvampe...36 4. KVANTITATIVE BESKRIVELSER AF BAKTERIEPOPULATIONER I SPILDEVAND... 37 Brug af indikatorbakterier...38 Decimal fortyndingsrække af spildevandet til alle øvelserne fra 7 til 12...39 Øvelse 7: Antal koloniformende enheder (CFU)...39 Øvelse 8: Bestemmelse af totalt bakterietal...40 Øvelse 9: Påvisning af Clostridium perfringens (C. welchii)...41 Øvelse 10: Påvisning af fækale enterokokker...43 Øvelse 11: Kvantitativ bestemmelse af coliforme bakterier...44 Øvelse 12: Antibiotikaresistente bakterier i spildevand...48 Isolering af antibiotikaresistente bakterier fra spildevand...48 Forekomst af multiresistens...50 SUBSTRATOPSKRIFTER... 52 3

Oversigt over øvelser og kollokvier OVERSIGT OVER ØVELSER OG KOLLOKVIER Se særskilt dokument: "Øvelsesoversigt 2007" 4

Generelle sikkerhedsregler Generelle sikkerhedsregler for de studerendes laboratoriearbejde Første gang du er i et nyt laboratorium Orienter dig om, hvor sikkerhedsudstyr findes, og hvordan det anvendes. Orienter dig om, hvilke flugtveje der er, og hvor de fører hen. Inden du begynder på et arbejde Overtøj må ikke medbringes i laboratorierne. Er det nødvendigt at medbringe tasker, skal de placeres, så de ikke generer nogen. Der skal altid bæres kittel ved alt laboratoriearbejde. Kitlen bruges ikke blot for at skåne dit almindelige tøj, men også for at beskytte dig mod skadelige stoffer. Kitlen skal være knappet foran og bør vaskes ofte, samt når man har mistanke om, at der er kommet sundhedsskadelige stoffer på. Du bør ikke gå til frokost i kittel. Du skal bære briller ved alt farligt laboratoriearbejde, helst laboratoriesikkerhedsbriller. Anden ansigtsbeskyttelse kan være påkrævet. Handsker bør kun bruges ved arbejde med ætsende/sundhedsskadelige/smittefarlige stoffer. Handskerne tages af ved endt arbejde og bør kun bruges så kort tid som muligt. Hvis der spildes på handskerne kasseres disse straks. Hvis du har langt hår: bind det op, så det ikke kan komme i roterende maskiner eller antændes af en åben flamme, f.eks. en bunsenbrænder (langt løsthængende hår er også uhensigtsmæssigt ved biologisk laboratoriearbejde). 5

Generelle sikkerhedsregler Sørg for at få en ordentlig instruktion i brug af apparatur, inden du begynder på arbejdet (læs øvelsesvejledningen grundigt). Under laboratoriearbejdet Du må ikke løbe/jage hverken i laboratoriet eller på gangene ved laboratoriet. Mange ulykker kan undgås, hvis man tager det lidt med ro. Al indtagelse af mad eller drikke samt tobaksrygning er forbudt i laboratoriet. Slik i lommerne er således også uacceptabelt. Arbejde hvor farlige flygtige stoffer kan dannes eller forekommer skal foregå i stinkskab; der skal altid arbejdes med mindst mulig lugeåbning under hensyntagen til det arbejde, der skal udføres. Det er især fordelagtigt, at lugekanten er under ansigtshøjde, hvilket også beskytter mod stænk. Ved afpipettering skal der anvendes gummibold eller anden forsvarlig sugeanordning. Hæld aldrig kemikalier tilbage i beholderen. Tages kemikalier ud af stinkskabene, skal de opbevares i lukkede beholdere, f.eks. tilproppede reagensglas. Kemikalierester skal, hvad enten det er små eller store mængder, opsamles efter de gældende forskrifter, der er ophængt i lokalet. Kemikalieaffald må normalt ikke hældes i vasken, da afløbene i stinkskabene såvel som fra andre vaske i laboratoriet er direkte forbundet med det almindelige kloaksystem. Efter endt laboratoriearbejde Vis omtanke ved rengøring af glasapparatur; kan eventuelt foregå i stinkskabene med sprit og vand for at undgå farlige dampe og lugtgener. Den enkelte skal sørge for forsvarlig oprydning og rengøring af arbejdspladsen, før laboratoriet forlades (kemikaliespild m.v. tørres op). Før laboratoriet forlades, bør man vaske hænder, og kitlen skal tages af. 6

Generelle sikkerhedsregler Uheld ved laboratoriearbejde Ved uheld tilkaldes hjælp så hurtigt som muligt. Brug din sunde fornuft. Uheld, uanset størrelse og omfang, skal anmeldes (specielle blanketter) til det pågældende instituts sikkerhedsgruppe. Blanketter udleveres hos øvelsesvejlederen. Generelle kommentarer Vis samme hensyn over for andre, som du selv ønsker at blive genstand for. Stinkskabe er primært beregnet til at bortskaffe luftforurening ved processer, der foregår inde i skabene - selv om de også medvirker til den generelle fornyelse af laboratorieluften. 7

Introduktion 1. INTRODUKTION 1.1. Substratfremstilling Et næringsmedium til mikroorganismer skal indeholde alle de stoffer, mikroorganismerne kræver for at kunne vokse. Foruden vand skal mediet indeholde uorganiske mineralsalte, suppleret med kulstof-, energi- og kvælstofkilde samt eventuelle vækststoffer. De fleste mikroorganismer man dyrker med henblik på økologiske eller kliniske undersøgelser, er heterotrofe og er i stand til at vokse på sammensatte (komplekse) substrater. Der tilsættes som regel kødekstrakt, gærekstrakt, pepton (oligo- og polypeptider), jordekstrakt eller vitaminopløsning. Ved substratfremstillingen blandes ingredienserne, og ph indstilles på den ønskede værdi, lettest med et ph-meter. ph justeres med 0,1 M NaOH eller 0,1 M HCl. Mængden, der skal tilsættes, kan beregnes ved først at indstille på 10 ml af substratet, eller justering foretages ved direkte tildrypning til mediet under omrøring og kontinuert ph-måling. De fleste substrater autoklaveres ved 121 C i 20 minutter og kan, hvis de er tilstrækkeligt beskyttede mod fordampning og kontaminering, opbevares lang tid eventuelt i køleskab. Substrater, der stivnes med agar, skal køles til ca. 45 C inden ophældning i sterile plast-petriskåle. Rørglas med agarsubstrat kan efter autoklavering anbringes skråt for at give en stor agaroverflade (skråstivning). 1.2. Inkubering og opbevaring af kulturer Inkubering af kulturer sker i thermostat indstillet på den ønskede temperatur. Inkubationstiden er afhængig af mikroorganismens væksthastighed og formålet med forsøget. Ved inkubering af petriskåle ved temperaturer over 25 C skal disse anbringes med bunden opad, og hvis inkubationen er langvarig, i plastikposer for ikke at tørre ud. 8

Introduktion Langtidsopbevaring af bakterie- og svampekulturer kan ske ved lav temperatur (ca. 4 C), bedst på rørglas, overhældt med steril paraffinolie. Andre langtidsopbevaringsmetoder er frysetørring, frysning i flydende kvælstof eller opbevaring i 20% glycerol ved -80 C. 1.3. Steriliseringsmetoder Et effektivt drab af mikroorganismer er paradoksalt nok en forudsætning for et vellykket arbejde med renkulturer af mikroorganismer. I stedet for "drab" og "udryddelse" anvendes det mindre dramatiske "sterilisation", hvorved forstås en proces, hvor et givet materiale befris for levende mikroorganismer eller deres hvilestadier. Når et sterilt materiale eller et medie podet med definerede kulturer inficeres af andre mikroorganismer, siger man, at det er blevet kontamineret. Begreberne "desinficeret", "aseptisk" og "infektion" anvendes hovedsageligt i forbindelse med medicin og hygiejne. Mikroorganismer varierer stærkt i deres følsomhed overfor forskellige sterilisationsmetoder. Udover artsforskelle har faktorer såsom vandindhold, mediets ph, alderen af cellerne og tilstedeværelsen af sporer betydning for følsomheden. Den decimale reduktionstid (D 10 ) nødvendig for at reducere en given mikrobiel population 90% under givne omstændigheder anvendes hyppigt som mål for effektiviteten af en behandling (se tabel). Sporer fra Decimal reduktionstid (D 10 ) i sekunder ved våd varme 105 120 130 140 150 160 Bacillus cereus 12,1 4,2 2,6 1,3 1,0 0,7 Bacillus subtilis 27,8 4,5 3,1 2,1 1,1 0,5 Bacillus stearothermophilus 2857 38,6 8,8 3,9 2,4 1,4 Sterilisation kan opnås ved tør varme, våd varme, filtrering, kemiske metoder eller bestråling. 9

Introduktion Tørsterilisering Alle tørre glasvarer (pipetter, kolber, etc.) steriliseres i en varmeovn ved 160 C i 2-3 timer. Den lange opholdstid er nødvendig for at sikre, at alle bakteriesporer er dræbt. Til mikrobiologisk brug er det nødvendigt, at sætte en lille tot vandskyende vat i enden af pipetterne. De steriliseres enten indpakket i brunt papir, glas- eller metalrør. Kolber forsynes med vat i mundingen og overbindes med papir eller staniol. Autoklavering De fleste medier og substrater kan tåle autoklavering ved et overtryk på 1 atm., dvs. 121 C i 20 minutter. Autoklavering finder sted i en autoklave, der kan være tilsluttet enten gas eller elektricitet. Der skal være destilleret vand i bunden af autoklaven, og det er vigtigt, at dampen har drevet al atmosfærisk luft ud, inden autoklaveringen begynder, fordi der ellers ikke opnås en tilstrækkelig høj temperatur. Medier og substrater autoklaveres som regel i rørglas, kolber eller infusionsflasker, der er forsynet med vandskyende vat overbundet med papir eller løstsiddende skruelåg. Hvis substratet er tilsat agar, må kolben højst være 3/4 fyldt, da substratet ellers stødkoger (koger over). Autoklavering kan også benyttes til at sterilisere glasvarer og instrumenter samt til at sterilisere kontamineret materiale før opvask. Sukkerholdige substrater skal autoklaveres ved temperaturer under 110 C for at hindre karamellisering, evt. tilsættes sukker sterilt efter autoklavering. Dampsterilisering Hvis mediet eller substratet ikke kan tåle mere end 100 C, kan der foretages en dampsterilisation i autoklaven (åben ventil) i 90 minutter, eller hvis absolut sterilisation er påkrævet gentages processen 3 dage i træk i 30 minutter (kochning). Dette skulle sikre, at alle bakteriesporer er spiret og dernæst dræbt. 10

Introduktion Flambering og glødning Podenåle og andre metalinstrumenter, der kan tåle høje temperaturer, skal glødes i en bunsenbrænder inden brug. Skalpeller, spatler o.a., der ikke kan tåle at blive glødet, skal dyppes i alkohol (96%) og flamberes. Sterilfiltrering Membranfiltrering benyttes til sterilisering af væsker, men også til opsamling af bakterier i vand- og jordprøver med henblik på tælling, især hvis antallet af kim er ringe, og en koncentrering er nødvendig. Et membranfilter er en tynd polymér-membran, der fås med porestørrelser fra 0,025 μm til 15 μm, og de mest anvendte typer er af celluloseacetat og cellulosenitrat fra Sartorius, Millipore og Gelman. Filterholderen og sugeflasken skal være steriliserede inden brugen (autoklaveret i indpakket stand). Det sterile filter anbringes, tragten monteres ovenpå, og suget tilsluttes. Prøven hældes i, suges igennem filtret, og der skylles efter med vand (eller PBS-opløsning). 11

Basale teknikker 1.4. Basale teknikker Podning Podning af bakterier og svampe foretages almindeligvis med podenål, pipette eller sprøjte. Podning med podenål Stregkultur: Podenålen køles efter udglødning i randen af agaren eller i en flydende kultur. Med en glødet podenål (med øje eller vinkelbøjet) ridses forsigtigt i overfladen af agar i en skål eller skråstivnet agar i et rør. Stikkultur: Med en glødet podenål (lige) podes i et rør med agar fra toppen til bunden. Podenål kan også benyttes til at overføre podemateriale til både faste og flydende substrater. Podning med pipette Pipetter benyttes til overførsel af mikroorganismer fra flydende medier eller vandprøver til faste substrater eller medier. Hvis mængden, der skal overføres, blot er nogle dråber eller et ubestemt kvantum, benyttes finpipetter. Til afmåling af bestemte mængder, f.eks. ved fortynding og pladespredning, anvendes graduerede stangpipetter eller finpipetter. Fuldpipetter kan anvendes (1-50 ml), hvis man ikke har brug for graduering. Podning skal foregå i så sterile omgivelser som muligt, helst i poderum eller sterilbænk. Mundinger på rør og kolber flamberes i en gasflamme, efter at vatproppen er taget af. Glasvarerne holdes med den ene hånd, mens vatproppen tages ud og holdes med den anden hånds lillefinger, således at podenål eller pipette kan bruges af de frie fingre. Før påsætning af proppen flamberes mundingen af glasset igen. 12

Basale teknikker Podning med sprøjte Anaerobe bakteriekulturer, er som oftest ekstremt følsomme overfor ilt, podes mest hensigtsmæssigt med sterile éngangssprøjter forsynet med en tynd kanyle. Før podningen gasses sprøjten omhyggeligt med steril kvælstof for at sikre anaerobitet. Fortyndinger Det vil som regel være nødvendigt at fortynde den vandprøve eller jordsuspension, der skal undersøges for mikroorganismer, inden podning foretages. Dette foregår ved, at der laves en serie decimale fortyndinger efter følgende procedure: Fortyndingerne udføres med sterile 1 ml pipetter og pipetteskift eller med finpipetter og skift af pipettespids, og blanding af prøven for hver fortynding. Som fortyndingsmedium benyttes PBS-opløsning. Fraktioneret udstrygning Denne teknik benyttes, når man ønsker en separation af mikroorganismerne i en blandet prøve eller forskellige stammer i en renkultur. Udstrygningen foretages med en podenål på en agaroverflade, der skal være helt tør. Dette opnås ved at tørre skålen uden låg i en sterilbænk. Først podes nær kanten af skålen, dernæst steriliseres podenålen i en flamme, køles, og der udstryges fra podematerialet. Således fortsættes 13

Basale teknikker flere gange skålen rundt, som ovenstående tegning angiver. Der skulle derved blive mulighed for at opnå enkeltliggende kolonier, hvorfra der kan isoleres videre. Tælling af mikroorganismer Pladespredning på agar Pladespredningsmetoden kan benyttes til svampe- og bakterietællinger. Det er en indirekte metode, hvor man tæller de "kim", der kan vokse frem til kolonier på det benyttede substrat. Inden pladespredningen skal der normalt laves decimale fortyndinger af prøven. Fra passende fortyndinger af udgangsmaterialet afpipetteres 0,1 ml på skåle med substrat. Dråben spredes på agaroverfladen med en drigalskispatel. Skålene inkuberes ved ønsket temperatur, indtil kolonierne er vokset frem. Optælling foregår nemmest på bagsiden af skålene ved at markere hver talt koloni med en speedmarker. Tælles svampekolonier, må der højst være 25; tælles bakterier må der højst være 50-200 kolonier på hver skål. Hvis en svampe- eller bakteriekoloni dækker mere end en fjerdedel af skålen, skal denne kasseres. Antal CFU (colony forming units) pr. g eller ml prøve beregnes ved at gange antallet af kolonier på skålene med 14

Basale teknikker fortyndingen og yderligere x 10, da der kun er spredt 0,1 ml på hver plade. Indstøbning i agar Indstøbningsmetoden benyttes hovedsageligt til bakterie-tællinger. På en pladespredningsskål kan kolonierne undertiden være svære at adskille ved tælling. Endvidere kan mange mikroorganismers selvbevægelighed medføre, at kolonier breder sig hurtigt over en fugtig agaroverflade. En bedre adskillelse opnås derfor ofte ved at indstøbe prøven i agar. Substratet autoklaveres i rør med 20 ml i hver og nedkøles i vandbad til 45-50 C inden podningen. Fra decimale fortyndinger podes 0,1 ml i rør af 15

Basale teknikker hver fortynding. Rørene rulles mellem hænderne, og indholdet hældes i skåle med et tyndt lag agar i bunden. Blanding kan også ske ved, at 0,1-1 ml af fortyndingerne afpipetteres i bunden af tomme skåle eller skåle med et tyndt lag agar, og det smeltede, nedkølede substrat hældes over. Dernæst roteres pladerne for at sikre fuldstændig opblanding. Optælling som ved pladespredning. Tælling i tællekammer Der findes forskellige typer tællekamre. Alle har imidlertid det til fælles, at de har et kvadratnet indridset i glasset. Længden af siderne i dette net og dybden af kammeret er kendt. Inden brugen skal tællekammeret renses i alkohol og tørres. En dråbe af den suspension, der skal undersøges, anbringes på kvadratnettet og dækglasset lægges på eller klemmes fast afhængigt af typen. Under mikroskop tælles 10 tilfældige felter. Tællingen gentages med en ny dråbe efter at tællekammeret er renset. Middeltallet pr. kvadrat udregnes (celler på selve linierne tælles kun på de to af siderne). Følgende er et regneeksempel med en bestemt type cellekammer: Hvert lille felt har et areal på 0,0025 mm 2. Dybden i kammeret er 0,1 mm. Hvis man antager, at hvert lille kvadrat i gennemsnit indeholder 8 celler, dvs. 8 celler i et volumen på 0,0025 mm 2 x 0,1 mm. (1 ml udgør 1000 mm 3 ). Pr. ml suspension findes: 1000 x 8/0,00025 = 3,2 x 10 7 celler /ml 16

2. Vækst af mikroorganismer 2. VÆKST AF MIKROORGANISMER Øvelserne skal vise, hvorledes mikroorganismer vokser i væskekultur og på overflader. Forskelle på vækst af encellede og flercellede mikroorganismer belyses og de generelle vækstbegreber gennemgås. 2.1 Vækst i væskekultur Øvelse 1: Vækstkurve Vækst i væskekulturer kan for de fleste mikroorganismer simpelt måles ved at følge stigningen i populationens optiske densitet (O.D.) ved en given bølgelængde. Formålet med øvelsen er at bestemme den specifikke væksthastighed af en mikroorganisme, der vokser under omrøring i en kolbe, samt at iagttage de forskellige vækstfaser i denne dyrkning. Fremgangsmåde Som testorganisme anvendes bakterien Pseudomonas putida (uwc 1), og væksten måles ved optisk densitet (O.D.) på et spektrofotometer. Vandbadene er indstillet til forskellige temperaturer. Vælg et vandbad til hele øvelsen og noter temperaturen. En Erlenmeyerkolbe med sterilt vækstmedium podes fra forkulturer med steril pipette (1 ml). Kolben mærkes med holdnummer. Podetidspunktet 17

2. Vækst af mikroorganismer noteres, kolben omrøres, og der udtages en prøve (1 ml) med steril pipette. Kolben anbringes straks i det valgte rystevandbad, og prøven overføres til en kuvette. Prøvens O.D. aflæses umiddelbart i spektrofotometer ved 450 nm overfor vand (alle hold) samt overfor en af følgende bølgelængder 350, 550 eller 650 nm (husk at bruge de samme to bølgelængder hver gang samt i begge tilfælde at nulstille overfor vand). Efter 15 minutter udtages den næste prøve, som aflæses i spektrofotometer. Derefter udtages prøverne hvert 15 minut på samme måde. I rapporten afsættes O.D. som funktion af tiden på semilogaritmisk papir (husk at notere bølgelængderne). Bakterie: Pseudomonas putida (uwc 1), OD 450 nm Valgfri bølgelængde OD nm 18

2. Vækst af mikroorganismer 2.2 Vækst på overflade Øvelse 2: Radiær udbredelse Formålet med denne øvelse er at demonstrere, hvorledes bakterier og skimmelsvampe vokser på et fast substrat med/uden antibiotika (både nystatin eller penicillin+ streptomycin) samt at teste effekten af svampehæmningsmidlet atamon i forskellige koncentrationer og ved forskellig ph. Den anvendte metodik bruges ofte til biologisk bestemmelse af visse stoffers koncentration. Fremgangsmåde Selektive medier: Der anvendes en svamp Geotrichum candidum og en bakterie Pseudomonas putida. Arbejdet foregår så sterilt som muligt. Pladerne (hhv. svampe og bakterie) podes vha. en podenål. Lågene på petriskålene må kun lettes lidt, ikke fjernes helt, når der podes; podenålen glødes inden og mellem hver podning. Hvert hold poder 2 kontrolplader (uden hæmmer), en for hver af de to mikroorganismer, samt 4 plader, en af henholdsvis nystatin og penicillin+streptomycin for hver organisme. Podningen foregår ved med podenålen at afsætte en lille "prik" midt i petriskålene. Skålene inkuberes ved 30 º C. Den følgende laboratoriedag måles diameteren af hver koloni med en lineal. 19

2. Vækst af mikroorganismer Sammenligning af vækst på plader: Skimmelsvamp: Geotrichum candidum... Tid (i timer) Kr Radius af koloni (μm) kontrol + nystatin +penicillin+streptomycin Bakterie: Pseudomonas putida Tid (i timer) Kr Radius af koloni (μm) kontrol +nystatin +penicillin+streptomycin Koloniens radiære væksthastighed (Kr) er defineret som: Kr = ΔR/ΔT hvor ΔR er ændringen i koloniens radius i tidsrummet ΔT. Beregn den radiære væksthastighed i μm/time for kontrollerne. Bakteriekoloni... μm/time Svampekoloni... μm/time Atamons indvirkning på svampevækst (Geotrichum candidum): Arbejdet foregår så sterilt som muligt. Pladerne med atamon podes vha. en podenål. Lågene på petriskålene må kun lettes lidt, ikke fjernes helt, når der podes; podenålen glødes inden og mellem hver podning. Podning foregår ved med podenålen at afsætte en lille prik midt i petriskålene. 20

2. Vækst af mikroorganismer Der podes 6 plader, en af hver af følgende atamon-koncentrationer: 0%, 0.05%, 0.1%, 0,2%, 0.4%, 0.8% (vægt/volumen) og med ukendt koncentration. ph i disse plader er indstillet til 5,5. Ved atamonkoncentrationerne 0 og 0,05% skal der endvidere podes plader med ph 4,5 og med ph 6,5. Alle skålene inkuberes ved 30 C. De følgende laboratoriedage måles diameteren af hver koloni med en lineal. Idet forsøget skal foregå ved konstant temperatur, må pladerne ikke anbringes på laboratoriebordet i længere tid. Atamon konc. kontrol 0.05% 0.1% 0.2% 0.4% 0.8% ukendt Måledag 1 koloniradius (μm) Måledag 2 koloniradius (μm) Atamon konc. kontrol 0.05% 0.1% 0.2% 0.4% 0.8% ukendt Kr (μm/time) Måledag 1 Måledag 2 ph 4.5 ph 6.5 atamon atamon med(0.05%) uden med(0.05%) uden radiær væksthastighed PH i plader 4.5 med 4.5 uden 5.5 med 5.5 uden 6.5 med 6.5 uden Kr (μm/ time) Atamon koncentration i den ukendte plade:.% 21

2. Vækst af mikroorganismer 2.3 Bestemmelse af bakterie-kimtal i hakket oksekød Formålet med denne øvelse er at introducere sterile arbejdsteknikker samt at undersøge udviklingen i bakterieantallet i hakket oksekød opbevaret ved køleskabstemperatur og stuetemperatur. Øvelse 3: Bakterie-kimtal i hakket oksekød Protokollen til bestemmelse af bakterieantallet i hakket oksekød følger principperne i Dansk Standard for bestemmelse af kimtal i hakket oksekød. Ved forsøgets start er 500 g hakket oksekød blevet blandet ved at ælte kødet grundigt i to minutter. Kødet deles i to halvdele, som pakkes i plastikfolie. Den ene halvdel placeres i køleskab ved 4 C, mens den anden halvdel placeres ved stuetemperatur. Umiddelbart før øvelsens start har lærerstaben udtaget en prøve fra det opbevarede kød og har homogeniseret 10 g hakket oksekød i 100 ml PBS i 10 minutter på rystebord ved maksimal hasighed. Hvert småhold får udleveret en homogeniseret portion hakket oksekød, som har været opbevaret i enten 0, 1, 2 eller 4 dage ved en af de to temperaturer og laver en fortyndingsrække i PBS: Dag 0: til 10-5 Dag 1, 2 og 4: til 10-7 Husk at den udleverede prøve repræsenterer en 10-1 fortynding! Fra følgende fortyndinger: Dag 0: 10-4 til 10-5 Dag 1, 2 og 4: 10-6 til 10-7 pladespredes 0,1 ml på en petriskål med Plate Count Agar (PCA) med cycloheximid (cycloheximid hæmmer svampevækst). Lav tre replikater af hver pladespredning. Podematerialet fordeles med en steril Drigalski spatel. 22

2. Vækst af mikroorganismer Pladerne mærkes med tusch på låget og stilles til inkubation ved 25 C i to døgn inden tælling af kolonier (Dansk Standard foreskriver fem døgns inkubation, men det harmonerer ikke med dette øvelsesforløb, så vi nøjes med inkubation i to døgn vores erfaring er, at stort set alle CFU er synlige efter to døgn). Ved afslutningen af det praktiske arbejde, og når I forlader laboratoriet skal I altid vaske hænder. Brug sæbe og vask grundigt. Husk at vaske håndleddene. Test af effekten af håndvask: Hver person inddeler en petriskål med Plate Count Agar i fire lige store dele med en tusch: Område 1) Afsæt et enkelt aftryk med højre tommelfinger INDEN håndvask. Område 2) Afsæt et enkelt aftryk med højre tommelfinger EFTER håndvask, men INDEN tørring i håndklæde. Område 3) Afsæt et enkelt aftryk med højre tommelfinger EFTER tørring i håndklæde. Område 4) Afsæt et enkelt aftryk med højre tommelfinger EFTER vask med 70% etanol og afdampning af denne, men INDEN tørring i håndklæde. Pladen mærkes med navn og holdnummer med tusch på låget og stilles til inkubation ved 25 C i to døgn inden tælling af kolonier. Øvelse 4: Indvirkning af bakteriehæmmende behandlinger af hakket oksekød Til denne øvelse benytter samtlige småhold hakket oksekød opbevaret ved 4 C i fire døgn. 23

2. Vækst af mikroorganismer 10 g hakket oksekød i 100 ml PBS, A) autoklaveres i 20 minutter; B) pasteuriseres under omrøring, så kødet opnår 71 C i 15 sek; eller C) koges i 2 minutter. Hver gruppe får udleveret en af ovenstående prøver og laver følgende fortyndingsrække ud fra den udleverede prøve ( som er10-1 ): A) Autoklavering: til 10-1 (anvendes ufortyndet) B) Pasteurisering: til 10-2 (fortyndes 10 gange) C) Kogning: til 10-2 (fortyndes ti gange) hvorfra der pladespredes 0,1 ml på en petriskål med PCA med cycloheximid. Lav en plade af hver fortynding. Podematerialet fordeles med en steril Drigalski spatel. Pladerne mærkes med tusch på låget og stilles til inkubation ved 25 C i to døgn inden tælling af kolonier. Test af steril teknik Hvert småhold får udleveret en prøve med sterilt vand og laver fortyndingsrække til 10-4 i PBS. Der pladespredes 0,1 ml af 10-4 fortyndingen på en petriskål med PCA med cycloheximid (der laves kun en plade). Efter 7 dage checkes for vækst på pladen. 24

3. Identifikation af mikroorganismer 3. IDENTIFIKATION AF MIKROORGANISMER Øvelse 5: Identifikation af bakterier Der er mange grunde til at beskæftige sig med identifikation af bakterier f.eks. i klinikken, i levnedsmiddelkontrol, i vandhygiejne og i økologiske undersøgelser. I de fleste forsøg på identifikation indsnævrer man overvejelserne til kun at omfatte et begrænset udvalg af samtlige forekommende bakterier, og praksis viser, at det til mange formål er tilstrækkeligt. Hvis man derimod begynder helt forfra med en ukendt bakterie (svarende til brug af identifikationsnøgler for andre organismer) er begyndelsen på identifikationsprocessen vanskelig. Der findes mange måder at indlede en identifikation på, og på grund af den store praktiske interesse er der også udviklet flere kommercielle identifikationssystemer f.eks. API systemet (www.biomerieux.com) og BIOLOG (www.biolog.com). Disse identifikationssystemer bygger på bakteriernes fysiologiske egenskaber, og enten skal bakterierne vokse i substraterne og omsætte dem, eller også skal allerede dannede enzymer reagere med substraterne. Mange af de benyttede substrater er stærkt selektive og tillader kun visse bakteriers vækst. Dette princip benyttes især til påvisning af bestemte bakterier i blandede prøver (se 1.3 & 1.4). Udover bakteriernes forskellige fysiologiske egenskaber benyttes også enkelte morfologiske karakterer til at "adskille" bakterier. I det nedenfor beskrevne enkle system, der bygger på Cowan et al. (1993) Cowan & Steel s Manual for the Identification of Medical Bacteria, indgår celleform, sporedannelse og bevægelighed således som overordnede kriterier sammen med cellens omsætning af glucose og vækst under aerobe og anaerobe forhold. Hvis man ikke kan identificere en bakterie, kan man mod behørig betaling få den identificeret hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (www.dsmz.de), som har stor ekspertise i bakterieidentifikation og besidder det nødvendige appatur. 25

3. Identifikation af mikroorganismer Isolering og rendyrkning Det er meget vigtigt, at de bakterieisolater, man vil identificere, er rene og altså ikke blandinger af forskellige bakteriestammer. Det kan være svært at sikre sig dette, men gentagen udstrygning på forskellige substrater med efterfølgende opformering fra enkeltkolonier er en nødvendig sikkerhedsforanstaltning. Den mest benyttede metode til at isolere bakterier fra blandede prøver er brug af agarsubstrater med forskellige kulstofkilder - og inkubering under aerobe forhold. Allerede herved har man afskåret sig fra at isolere en række bakterier, hvoraf mange er hyppigt forekommende og vigtige i naturen. De anaerobe og fototrofe bakterier er udelukkede, de kemolithoautotrofe vokser ikke, og selv heterotrofe bakterier med lav væksthastighed vokser ikke frem på de sædvanlige medier. Det vil derfor kun være et udvalg af hurtigtvoksende, heterotrofe bakterier der normalt isoleres, og det er disse bakterier, der bliver lagt vægt på i det følgende. Primær karakterisering Til den primære karakterisering af bakterier med henblik på identifikation benyttes følgende egenskaber i Cowan et al. s skemaer: Cellemorfologi: Gramfarvningsreaktion Celleform og arrangement Bevægelighed Sporedannelse Fysiologi: Katalase Cytochrom-oxidase Oxidation-fermentation 26

3. Identifikation af mikroorganismer Med disse oplysninger er det muligt at identificere en lang række almindelige bakterier til gruppe eller slægt efter de indledende skemaer for Gram-positive og Gram-negative bakterier. I denne øvelse skal hvert småhold identificere to ukendte isolater på grundlag af ovennævnte morfologiske og fysiologiske karakteristika. Bakteriekulturerne udleveres på agarplader mærket med en kode. Første trin i identifikationsprocessen er at fremstille friske præparater til vurdering af bakteriernes eventuelle bevægelighed og sporedannelse. Gram-farvning og testene til bestemmelse af fysiologiske egenskaber udføres som beskrevet i de efterfølgende afsnit. Resultaterne indføres i skemaet, hvorefter det skulle være muligt at bestemme de to ukendte isolaters slægt. Gram-farvning Gram-farvning er den klassiske indledende test, som benyttes til inddeling af bakterier i to hovedgrupper af vidt forskellig fysiologisk karakter. Cellevæggen hos Gram-positive bakterier består af flere murein-lag, og det formodes, at der under farvningen sker en dehydrering, så farvekomplekset bindes i cellevæggen. De Gram-negative bakterier indeholder derimod kun ét murein-lag, men en stor del lipider. Under farvningen opløses lipiderne i alkohol, cellevæggen bliver porøs og farvekomplekset udvaskes. For tydeligere at kunne se de nu farveløse Gram-negative celler, foretages til sidst en farvning med en kontrastfarve - erythrosin. Ved undersøgelse i mikroskopet vil de Gram-positive bakterier være mørkviolette (blå), mens de Gram-negative bakterier på grund af kontrastfarvningen er lys pink (rød). Gram-reaktionen kan ændres med cellens fysiologiske tilstand. Kun unge bakteriekulturer bør derfor benyttes til Gram-farvning. Metoden kræver en vis standardisering, det er derfor vigtigt at overholde tidsangivelserne. 27

3. Identifikation af mikroorganismer Fremgangsmåde 1. En dråbe frisk bakteriekultur udstryges på et affedtet objektglas (sørg for at udstryge nok bakterier på glasset). Objektglasset mærkes med blyant, idet den senere affarvning i etanol fjerner tusch. 2. Objektglasset lufttørres under lampe og flammefikseres. Objektglasset skal være helt tørt inden flammefikseringen. 3. Objektglasset nedsænkes i krystalviolet-opløsning (opl. 1) i 1 min. 4. Præparatet skylles herefter med vand i 3-4 sekunder. 5. Præparatet henstår i jodopløsningen (opl. 2) i 1 min. 6. Affarvning med 96% etanol (opl. 3) (der skylles med flere hold, indtil der ikke fjernes mere farve). 7. Afskylning med vand. 8. Kontrastfarvning med erythrosin-opløsning i 2 min. (opl. 4). 9. Præparatet skylles i vand, afdryppes og tørres. Det er herefter klar til mikroskopering. Gram-præparaterne undersøges i mikroskop og både celleform og resultatet af Gram-farvningsreaktionen noteres. Katalase Katalase er et enzym, der dannes af obligat aerobe og fakultativt anaerobe bakterier, mens det ikke dannes af mikroaerofile og obligat anaerobe bakterier. Katalase omsætter brintoverilte (H 2 O 2 ), der dannes ved flavoproteiners elektronoverførsel til O 2, til H 2 O og O 2. Mikroaerofile bakterier har i stedet en peroxidase, der oxiderer organiske forbindelser med H 2 O 2. Blandt aerobt voksende bakterier er mælkesyrebakterierne den eneste katalase-negative gruppe. Som eksempler kan nævnes: K+ : Micrococcus, Staphylococcus, Propionibacterium, enterobakterier, Bacillus. K- : Mælkesyrebakterier (f.eks. Streptococcus), Clostridium. 28

3. Identifikation af mikroorganismer Fremgangsmåde Katalase-testen udføres ved direkte på kolonier på agarpladen at tilsætte en dråbe 3% H 2 O 2 -opløsning. Ved positiv reaktion ses luftudvikling (O 2 ) i form af bobler eller skum. Selv svage bobler registreres som positiv reaktion. Cytochrom c oxidase Alle obligat aerobe og fakultativt anaerobe bakterier er i besiddelse af cytochrom-oxidaser og -reduktaser. Visse af disse bakterier har cytochrom c oxidase, som også er i stand til at oxidere den kunstige elektrondonor N,N,N,N-tetramethyl-p-phenylen-diamin-dihydrochlorid, der ved oxidation skifter fra farveløs til blå. Da de fleste aerobe Gram-positive bakterier mangler cytochrom c oxidase, har testen kun praktisk betydning ved identifikation af aerobe Gram-negative bakterier. Som eksempler kan nævnes: O+ : Pseudomonas, Aeromonas, Acetobacter, Vibrio. O- : Enterobakterier, f.eks. Escherichia coli. Fremgangsmåde Med en podenål udstryges en koloni på en strip med N,N,N,N-tetramethylp-phenyl-diamin-dihydrochlorid. Ved positiv reaktion ses en blåfarvning i løbet af 10 sek. Sværtning efter 30 sekunder eller mere regnes for negativ reaktion. Oxidativ eller fermenterende glukoseomsætning Bakteriernes kulhydratomsætning foregår enten respiratorisk (aerobt) eller fermenterende (anaerobt). Denne forskel kan undersøges ved at pode bakterien i Hugh & Leifsons medium, hvor glukose (i høj koncentration) er kulstofkilden. Peptonindholdet skal derimod være lavt for at modvirke, at basiske produkter (NH3) fra peptonnedbrydningen neutraliserer den 29

3. Identifikation af mikroorganismer dannede syre fra kulhydratnedbrydningen (specielt den svage syredannelse ved den oxidative omsætning). Substratet er halvflydende (0,3% agar) med det formål at undgå væskestrømninger, hvorved den oxidativt dannede svage syre, der produceres øverst i glasset, ikke opblandes i det øvrige substrat og neutraliseres. Bakterier, der viser fermentativ nedbrydning af glukose, er enten obligat eller fakultativt anaerobe. Bakterier, der ikke kan nedbryde glukose, kan eventuelt udnytte substratets pepton og derfor alligevel vokse i substratet uden at danne syre. Testen er af mindre betydning for Gram-positive bakterier (kun Micrococcus, Nocardia og nogle Bacillus-arter er rent oxidative), men er vigtig ved identifikationen af Gram-negative bakterier, idet alle enterobakterier (vigtige slægter som Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Erwina, Serratia, Yersinia, Vibrio og Aeromonas) nedbryder glukose fermentativt. Blandt de Gram-negative bakterier er Pseudomonas den vigtigste oxidative slægt. Fremgangsmåde Til undersøgelsen anvendes to rør med H & L medium, der begge podes som stikkultur. Det ene rør påhældes 1/2-1 cm tykt lag smeltet vaseline (for at holde kulturen anaerob). Kulturerne inkuberes ved 37 C. Aflæsning efter 24-96 timer. NB: H & L medium vil være podede inden øvelserne, så disse blot skal aflæses. Ved aflæsning undersøges dels for bakteriel vækst, dels for farvereaktion med indikatorfarve i mediet (se nedenstående skema), hvor gul indikerer aktivitet. 30

3. Identifikation af mikroorganismer Tilsmeltede rør Åbne rør Aerob vækst - + Anaerob vækst + - Fakultativ anaerob vækst + + Fermentativ nedbrydning, F gul gul eller grøn Oxidativ nedbrydning, O grøn gul Ingen nedbrydning grøn grøn eller blå Identifikation af vigtige Gram-positive slægter (Skemaer frit efter Cowan et al. (1993)) Form Bevæge Aerob Anaerob Kat Ox Sy OF lighed vækst vækst Micrococcus Kugler - + - + - (+) O Staphylococcus Kugler - + + + - + F Streptococcus Kugler - + + - - + F Leuconostoc Kugler - - + - - + F Corynebacterium Stave - + + + - (+) (F) Lactobacillus Stave - + + - - + F Bacillus Stave m. (+) + (+) + (+) (+) O/F sporer Clostridium Stave m. (+) - + - - (+) F sporer Nocardia Stave - + - + - + O Kat, Katalase test; Ox, Cytochrom c oxidase; Sy, Syredannelse fra glukose; OF, Oxidation - Fermentation 31

3. Identifikation af mikroorganismer Identifikation af vigtige Gram-negative slægter Form Bevægelighed Aerob Anaerob Kat Ox Sy OF vækst vækst Neisseria Kugler - + - + + + O Acinetobacter K/S - + - + - + O Bacteroides Stave - - + (-) - (+) F Alcaligenes Stave (+) + - + +/- - - Flavobacterium Stave - + - + + + O Pseudomonas Stave + + (-) + + (+) O Vibrio Stave + + + + + + O/F krumme Serratia* Stave (+) + + + - + F Campylobacter Stave + ** - (+) + - - *) gælder også andre Enterobakterier; **) i 5% O 2 Samlede resultater for bakterie-identifikation Nr Form Gram Endosporer Bevægelighed Aerob vækst Anaerob vækst Kat Ox Sy OF Slægt Sekundær karakterisering De primære tests identificerer højst den ukendte bakterie til slægt. Det er derfor ofte nødvendigt at benytte sekundære tests til yderligere identifikation. Valget af sekundære tests er forskellige fra gruppe til gruppe. Tabel 24.3 i Brock Biology of Microorganisms giver en oversigt over en række vigtige diagnostiske tests for klinisk vigtige bakteriegrupper. Udover de klassiske undersøgelser for vækst på specifikke medier og enzym-assays anvendes idag en række molekylære teknikker til yderligere identifikation af bakterieisolater. Disse metoder omfatter en række typninger baseret på restriktionsenzym-analyse af plasmid- og kromosomalt DNA. Sekventering af DNA kodende for 16S RNA er den mest anvendte metode til fylogenetiske studier, mens reaktioner med specifikke antistoffer er meget anvendt inden for klinisk mikrobiologisk identifikation. 32

3. Identifikation af mikroorganismer Api identifikations kits Der findes en række testkits til identifikation af bakterieisolater. API systemet er et eksempel på et sådant system. Testkittet består at en række brønde der indeholder specifikke vækstmedier og nogle enkelte enzymsubstrater. Brøndene podes med en bekteriesuspension og efter en vis inkubationstid (24-48 timer, afhængig af hvilket system man anvender) kan testene aflæses. Aflæsningen af API testkit omsættes til en talkode. Bakteriens navn fås ved opslag af talkoden i APIs identifikationskatalog. Identifikation af mikrosvampe Mikrosvampe omfatter skimmelsvampe (Fungi Imperfecti eller Deuteromycetes), mugsvampe (Murorales) og gærsvampe (Ascomyceter). Svampe findes vidt udbredt i naturen og har en vigtig økologisk rolle som nedbrydere af organisk materiale, især komplekse molekyler som lignin. Forskellige slægter er i stand til at producere enzymer til omsætning i naturen af plantekomponenter som f. eks. stivelse, pektin, cellulose og lignin. Visse mikrosvampe kan producere antibiotika, hvorfor mikrosvampe har stor industriel interesse. Andre svampe udskiller toksiske metabolitter, der kan gøre foder og levnedsmidler giftige for dyr og mennesker. Skimmelsvampe finder man også i stigende grad i fugtplagede boliger, hvor de er årsag til det såkaldte "sick building syndrome". Både i økologiske studier og ved kommercielle screeninger er identifikation af isolerede svampe en nødvendighed. Isolering af mikrosvampe er traditionelt foregået ved pladespredning. På pladerne vil kolonier vokse frem ved spiring af de spredte konidier. For at få et indblik i om der også findes levedygtige hyfer i undersøgelsesmaterialet, kan jordvaskemetoden benyttes. Vaskede jordpartikler (mineralkorn, organiske rester) placeres på agarplader, hvorefter levende hyfer kan vokse frem til kolonier. Ved begge metoder er det nødvendigt at 33

3. Identifikation af mikroorganismer rendyrke de enkelte isolater for at få renkulturer af de forskellige svampe inden en identifikation. Skimmelsvampe Identifikation af mikrosvampe er helt afhængig af genkendelsen af morfologiske strukturer. Makroskopisk iagttages koloniernes form, struktur, farve, sporulering og luftmyceliedannelse. Dette sker på standardmedier for visse slægters vedkommende (f.eks. Penicillium, Aspergillus og Fusarium), men i øvrigt på et komplekst medium, f.eks. V-8 agar. Mikroskopisk benyttes en lang række karakterer som adskillelsesgrundlag mellem slægter og mellem arter. Dette gælder f.eks. konidiernes størrelse, form, pigmentering, overfladestruktur og opdeling i celler. Konidierne kan dannes ved simpel septering af en hyfe, hvor enkeltcellerne kan fungere som konidier, eller konidierne dannes på kondiebærere ved knopskyding eller fra phialider eller annelider. Konidierne sidder enkeltvis, i kæder eller i hoveder, hvor mange konidier er holdt sammen af slim. Konidiebærerne kan være placeret direkte på hyferne eller være samlet mange sammen i koremier eller pyknider. Terminologi til bestemmelse af skimmelsvampe Pyknide: oftest kugleformet beholder til konidier, apikal åbning. Koremier: mange kondiebærere samlet i en stilk. Perithecier: oftest kugleformet beholder til ascosporer. Basipetal: kædedannelse, den yngste konidie dannes ved basis. Acropetal: kædedannelse, den yngste konidie dannes i toppen, dvs. at hver ny konidie dannes oven på den forrige. Thallisk: kædedannelse, hyferne fragmenteres og der dannes arthrosporer. Blastosporer: konidier dannes som knopskydning på konidiofor eller hyfe. Phialide: celler hvorfra konidier dannes i basipetale kæder eller slimhoveder, ofte flaskeformede celler, runde-ovale konidier. Kolarette: en krave øverst på en phialide. 34

3. Identifikation af mikroorganismer Annelider: celler hvorfra konidier dannes i basipetale kæder, mens den øverste del af konidioforen vokser med ringdannelse til følge. Konidier med lige afskåret basis. Gærsvampe Mugsvampe Gærsvampe er encellede og identificeres dels på grundlag af deres morfologi og dels ved hjælp af fysiologiske tests ligesom bakterier med hovedvægten på forgæring af kulhydrater. Vegetativt deler de sig ved knopskydning, og de har kønnet formering ved dannelse af ascosporer. Mugsvampe identificeres på grundlag af luftmyceliets vækst på agar, dets farve, højde, sporangie- og zygosporedannelse. Mikroskopisk benyttes sporangiesporernes størrelse, form, farve, overfladestruktur, sporangiestørrelse og form samt zygosporekarakteristika. Terminologi til bestemmelse af mugsvampe Sporangier: er oftest kugleformede. De vegetative sporer dannes i sporangier og frigives, når ydervæggen brister. Kolumella: er en central, steril del af sporangiet. Apofyse: er en opsvulmning lige under sporangiet. Zygospore: kønnet spore, oftest tykvæggede og piggede. Fremstilling af præparater af skimmelsvampe Dækglaskulturer Denne metode er velegnet til fremstilling af mikroskopiske præparater af skimmelsvampe. Hyferne klæbes eller adhæderes til et dækglas, og konidiedannelsen kan følges ved mikroskopering. Ved fremstilling af et væskepræparat fra en koloni på en agarplade går konidieopbygningen let i stykker. I en petriskål med agar udskæres sterilt fire agarblokke med et propbor (en skalpel eller en flad podenål kan også benyttes). Dernæst løftes disse blokke op på agarfladen med en steril podenål. Hver blok podes med 35

3. Identifikation af mikroorganismer svampen, der skal undersøges, og et flamberet (og dernæst afkølet) dækglas lægges ovenpå hver blok. Mellem blokkene kan der fremstilles en stregkultur. Inkubationen sker ved passende temperatur, indtil svampen er vokset frem. Ved mikroskopering anbringes dækglasset med kultursiden nedad i en dråbe vand eller et svampefarvestof (f.eks. cotton-blue). Stregkulturen i petriskålen iagttages ved direkte mikroskopering med 10 objektiv. Tapepræparat Præparater til mikroskopering kan også fremstilles ved at fange hyfer med konidier på et stykke tape. Herefter afsættes en dråbe cotton-blue, på et objektglas, og tapen klæbes til glasset med kultursiden nedad i dråben. Gemmepræparat Dækglasset anbringes i et urglas med Farmers fikseringsvæske i 5 min. Dernæst dyppes det i 96% alkohol og lægges med den bevoksede side opad på et stykke filtrerpapir. Når alkoholen er fordampet, anbringes dækglasset på et objektglas i en dråbe lactophenol tilsat cotton-blue. Efter en uges forløb lakkes dækglassets rand til med neglelak. Øvelse 6: Identifikation af mikrosvampe Fremgangsmåde Hvert småhold skal identificere de udleverede præparater af mikrosvampe ved hjælp af de udleverede identifikationspapirer. Derudover skal hvert småhold undersøge mikrosvampe opvokset på forskellige fødevarer eller agarplader. 36

4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand 4. KVANTITATIVE BESKRIVELSER AF BAKTERIEPOPULATIONER I SPILDEVAND Vi har valgt at bruge spildevand som prøvemateriale i denne øvelse. Dels er bakterieindholdet i spildevand forholdsvis højt, og dels kan en sådan undersøgelse relateres til en række sundhedsmæssige problemstillinger. Et af hovedformålene med denne øvelse er at demonstrere nogle forskellige metoder til at bestemme antallet af bakterier i en prøve. Dette gøres dels ved en direkte tælling i mikroskop og dels ved tælling af kolonier på generelle vækstmedier. Endvidere anslås antallet statistisk på baggrund af positiv farvereaktion i en række flydende vækstmedier. Et andet hovedformål er at undersøge forekomst af forskellige fækale indikatororganismer i hhv. renset og urenset (råt) spildevand. Dette gælder bl.a. de coliforme bakterier, fækale enterococcer og Clostridium perfringens. En eller flere af disse bakterier benyttes normalt som indikatorbakterier i vand. Endelig undersøges udbredelsen af antibiotika resistens blandt coliforme bakterier. Dette belyses dels ved at bestemme antallet af tetracyklin- og ampicillin-resistente bakterier, dels ved en analyse for forekomsten af multiresistens. Dansk Standard har lavet en række procedurer for mikrobiologiske vandundersøgelser. Disse forskrifter bruges af alle offentlige kontrolmyndigheder. De fleste af procedurerne i denne øvelse er tilpasset Dansk Standards forskrifter. Spildevand og i mindre omfang ferskvand og havvand indeholder en række bakterier, som normalt optræder i tarmen på pattedyr. På grund af fækal forurening af vandmiljøet spredes disse bakterier i spildevandet og derfra videre til recipientmiljøet. Visse sygdomsfremkaldende bakterier (patogener) spredes også ofte ved en fækal forurening. Fækalt forurenet drikke- og/eller badevand udgør derfor en potentiel sundhedsfare. For at karakterisere vands hygiejniske tilstand undersøges almindeligvis antallet af en eller flere normalt forekommende tarmbakterier. En direkte 37

4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand bestemmelse af indholdet af patogene bakterier er i dag mulig for de fleste organismers vedkommende. De kan dog ikke danne baggrund for den rutinemæssige undersøgelse af vandkvaliteten, idet de patogene bakterier kun optræder sporadisk og ofte i et lille antal. Desuden er disse analyser dyre og besværlige. Man vælger derfor ofte at teste for tilstedeværelsen af en eller flere indikatororganismer. Brug af indikatorbakterier Det er alment accepteret at følgende punkter skal være opfyldt i rimeligt omfang, hvis en bakterie skal kunne bruges som indikatororganisme: 1. Den skal være til stede, når de patogene organismer er der. 2. Den skal på den anden side kun optræde, når der er sandsynlighed for, at de patogene også er der. 3. Den skal være til stede i meget større antal end patogenerne. 4. Den skal være mere resistent overfor en desinfektion end patogenerne. 5. Den skal være hurtigt voksende på et relativt simpelt medie. 6. Den skal indgå i simple og karakteristiske reaktioner, som med lethed identificerer gruppen eller arten. 7. Den skal være tilfældigt fordelt i den udtagne prøve. 8. Dens vækst skal kunne ske uafhængigt af andre organismer (der skal ikke kunne optræde en hæmning af indikatoren). Sammenfattende kan man fastslå, at der ikke eksisterer nogen bakterier, som kan betegnes som perfekte indikatorer under alle forhold. Således har flere undersøgelser vist, at det er muligt at finde patogener på steder, hvor det ikke var muligt at påvise forekomst af indikatororganismer som f.eks. coliforme bakterier. Normalt vil tilstedeværelse af indikatorbakterier kunne bruges til at indicere forekomsten af en fækal forurening, mens man ikke vil kunne slutte omvendt, at manglen på samme angiver omgivelsernes renhed. 38

4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand Decimal fortyndingsrække af spildevandet til alle øvelserne fra 7 til 12 Af vandprøven laves decimale fortyndinger i PBS-opløsning. Pipettespids skiftes, og røret whirles grundigt mellem hver fortyndning. Der laves følgende fortyndinger: Renset spildevand 10 0-10 -5 Urenset spildevand 10-1 - 10-7 NB! Hvert hold arbejder enten med renset eller råt spildevand. Øvelse 7: Antal koloniformende enheder (CFU) Formålet med denne øvelse er, at bestemme det totale antal aerobe heterotrofe bakterier i spildevandet før og efter rensning. Man vil, ud fra disse tal, få et indtryk af hvor meget bakterietallet falder ved rensning af 39

4. Bakteriologisk undersøgelse af spildevand spildevand. Selv om fjernelse af det bakterielle indhold i spildevandet ikke indgår som en selvstændig del af spildevandsrensningen i rensningsanlæg, vil totaltallet af bakterier i spildevandet falde drastisk under rensningsprocessen. Dette skyldes først og fremmest at bakterierne overvejende er knyttet til partikulært organisk materiale i spildevandet, og et af hovedformålene med spildevandsrensningen er netop at fjerne det organiske materiale. Til kvantificering af det totale antal bakterier i spildevand benyttes et komplekst medium, Plate Count Agar (PCA), som en lang række af de almindelige bakterier kan vokse på. 0,1 ml fra hver fortynding pladespredes på PCA-plader. Renset spildevand 10 0-10 -3 Urenset spildevand 10-2 - 10-5 Alle plader inkuberes med bunden opad ved stuetemperatur i mindst 48 timer. Efter inkubation ved stuetemperatur tælles antallet af kolonier på pladerne. Antal CFU (colony forming units) pr. plade omregnes til CFU pr. ml prøve. Fortyndinger med mellem 50 og 200 kolonier pr. plade tælles. Øvelse 8: Bestemmelse af totalt bakterietal En stor del af de naturligt forekommende bakterier vil ikke danne kolonier på en agarplade. Det kan skyldes at de fysisk/kemiske forhold eller næringsforholdene på vækstmediet ikke tillader vækst af disse bakterier. En indlysende måde at komme uden om dette problem er at tælle bakterierne direkte i prøven. Direkte tælling af bakterier er imidlertid ikke så simpelt som det kunne lyde, og tælling foregår derfor på et udleveret billede. For det første må tællingerne foregå i mikroskop. For det andet skal bakterierne fikseres så de ikke bevæger sig under tællingen. For det tredie 40