Appendix 1: Udregning af mængde cellesuspention til udsåning. Faktor mellem total antal celler og antal celler der ønskes udsås:

Transkript

1 Appendix Appendix 1: Udregning af mængde cellesuspention til udsåning Fortyndingsfaktor: Efter trypsinering og centrifugering af celler fra cellestokken, opblandes cellerne i 1 ml medie. For at lave en 1:20-fortynding af cellesuspentionen resuspenderes 50 µl cellesuspention i 1 ml medie. Celletælling af det totale antal celler; x: antal talte celler i tællekamre antal talte tællekamre fortyndingsfaktor tællefaktor = x celler ml Cellemængde, der ønskes udsås; y: Antal celler der ønskes pr cm = antal cm= brønd el. flaske = y celler brønd el. flaske Faktor mellem total antal celler og antal celler der ønskes udsås: x y = faktor Volumen af celler til udsåning fra 1 ml cellesuspention; z: 1000 ul faktor = z ul brønd el. flaske

2 Appendix 2: Viabilitetstest Ved EGF-stimulering af U87MG opstod der tvivl om hvorvidt cellerne døde, hvorfor der blev udført en viabilitetstest af de EGF-stimulerede celler og af cellerne i kontrolbrøndene. Til viabilitetstesten anvendes tryptan blå som optages af døde celler. Fra 1 ml cellesuspension overføres 15 µl til et eppendorfrør, hvori der blandes 15 µl tryptan blå. I tællekammer tælles levende(ufarvede) og døde(farvede) celler. Celletælling af antal celler; x: antal talte celler i tællekamre antal talte tællekamre fortyndingsfaktor tællefaktor = x celler ml Viable celler, v %: antal levende celler 100 total antal celler = v % EGF-stmulerede celler: Total antal celler: Levende celler: Viable celler: C IJ = celler/ml = celler/ml =LM.MMM NCM.MMM 100 = 78,4 % Kontrol-celler: Total antal celler: Levende celler: Viable celler: RMI L= = celler/ml = celler/ml UM.MMM I=I.MMM 100 = 87,6 % et var altså ikke på grund af at U87MG-cellerne døde ved EGF-stimulering, at de ikke dannede monolag. Proceduren blev forsøgt optimeret ved at anvende T25-flasker i stedet for en 6- brøndsplade til EGF-stimulering og kontrol af U87MG-celler. 2

3 Appendix 3: RT-PCR testkørsler I testkørslerne søges optimering af cna-template input og hvilket housekeeping gen der anvendes, hvorfor det kun er disse parametre der justeres på. e resterende komponenter i RT-PCR amplificeringen ændres der ikke på. Første testkørsel: Test af cna-template input og housekeeping gen - cna-template input: 1 ng (4 µl med en koncentration på 0,25 ng/µl) - Housekeeping gen: YWHAZ Testkørslen udføres på U87MG-cNA med enkeltbestemmelse med negativ kontrol. Resultat: Et moderat signal kom ved Cx43-amplificeringen og mange primerdimere ved cna-template, hvorfor et større cna-template input testes. Med YWHAZ-genet opstod der en del smear i gelen, hvorfor housekeeping genet GAPH testes. Anden testkørsel: Test af cna-template input og housekeeping gen - cna-template input: 1,5 ng (6 µl med en koncentration på 0,25 ng/µl) - Housekeeping gen: GAPH Testkørslen udføres på U87MG-cNA med dobbeltbestemmelse og negativ kontrol. 3

4 Resultat: Svagt til moderat signal kom ved Cx43-amplificeringen og fortsat mange primerdimere ved cna-template, hvorfor et større cna-template input testes. Med GAPH-genet opstod næsten ingen smear i gelen, hvorfor dette housekeeping gen anvendes fremover. Tredje testkørsel: Test af cna-template input - cna-template input: 2 ng (4 µl med en koncentration på 0,50 ng/µl) Testkørslen udføres på U87MG-cNA med dobbeltbestemmelse og negativ kontrol. Resultat: Ved denne testkørsel skete der den fejl, at ethidium bromid ikke blev tilsat gelen, hvorfor der stort set ikke ses noget signal. Men fordi 2 ng input er et stort input anvendes dette input til RT-PCR på U87MG og C16 cna i rapporten. 4

5 Appendix 4: EGF-stimulering og Immunfluorescensfarvning 1. Celler udsås I en 24-brøndsplade med en densitet på 5000 celler/cm 2 og lader vokse til ca. 60 % konfluens. 2. Forbered 7 ml vækstmedie tilsat 5,6 µl EGF(koncentration på 20 ng/ml) 3. Når cellekulturen har opnået den ønskede konfluens udskiftes mediet i 3 brønde med mediet indeholdende EGF. NOTE: skift også medie i kontrolbrønde. 4. Inkubér kulturerne i 48 timer ved 37 C og 5 % CO Efter inkubering vaskes cellerne med 500 µl PBS pr. brønd. 6. Cellerne fikseres i 400 µl 4 % formaldehyd pr brønd i 20 min ved stuetemperatur. 7. Vask cellerne med 500 µl PBS pr. brønd. 8. Tilføj 500 µl/brønd blokering og permeabiliseringsopløsning(pbs + 5% BSA + 0,5% SA) og inkubér i 60 min ved stuetemperatur på vippebord. 9. Cellerne vaskes to gange med 500 µl PBS + 0,5% BSA pr. brønd. 10. Inkuber cellerne med 150 µl primær antistof og 50 µl PBS + 0,5 % BSA pr. brønd natten over ved 4 C på vippebord. NOTE: Husk kontrolbrøndene. 11. Sug antistof-opløsningen fra og opbevar ved 4 C. 12. Vask cellerne 3 gange med 500 µl PBS + 0,5% BSA pr. brønd. 13. For at minimere lyseksponering til den sekundære antistof slukkes lyset og gardiner rulles for vinduerne. 14. Inkuber cellerne med 150 µl sekundært antistof og 50 µl PBS + 0,5 % BSA pr. brønd i to timer pakket ind i stanniol ved stuetemperatur på vippebord. NOTE: Husk kontrolbrøndene og ekstra kontrolbrønd som ikke er inkuberet med det primære antistof 15. Sug antistof-opløsningen fra og opbevar ved 4 C. NOTE: pak opløsningen ind i stanniol da det sekundære antistof er lysfølsomt. 16. Vask cellerne 3 gange med 500 µl PBS + 0,5% BSA pr. brønd. 17. Til kernefarvning Inkuberes cellerne med 200 µl/brønd Hoechst i 30 min ved stuetemperatur på vippebord. 18. Vask cellerne to gange med 500 µl PBS + 0,5% BSA pr. brønd. 19. Til sidst opbevares cellerne i 500 µl PBS + 0,5% BSA pr. brønd. 5

6 Appendix 5: ot Blot Til oprensning af proteiner anvendes cellestokke i T175-flasker. 1. Mediet suges fra og cellestokkene vaskes en gang med PBS 2. Cellerne behandles med 1 ml lyseringsbuffer(ripa, radioimmunoprecipitation assay buffer) tilsat proteinase-inhibitor. Cellestokkeflaskerne placeres på is og inkuberer i 20 min. 3. Cellesuspentionerne overflyttes til plastrør som centrifugeres ved 12000g i 10 min, hvilket faseopdeler suspentionerne. Cellerester og lipider bunderfælder og proteinerne befinder sig i supernatanten som pipeteres over i nyt rør. Kan opbevares ved -18 C til senere analyse. Fremgangsmåde til dotblot efter Abcam generelle dot blot procedure ( den 2/5-16) Reagents TBS: 20 mm Tris-HCl 150 mm NaCl ph 7.5 TBS-T: 0.05% Tween 20 in TBS BSA/TBS-T: 1% BSA in TBS-T Nitrocellulose membrane (BIO-RA) Fremgangsmåde 1. På nitrocellulosemembranen påtegnes et gitter ved at tegne streger med en blyant for at angive hvor dråberne skal sættes. 2. er pipeteres 1,5 µl prøve på nitrocellulosemembranen i det påtegnede gitter. Prøvematerialet påføres langsomt for at minimere det område hvor prøvematerialet penetrerer membranen. 3. Lad membranen tørre helt. 4. Til blokering af baggrundsstøj inkuberes membranen i 3 ml TBS-T buffer tilsat 5 % BSA i en time på vippebord ved stuetemperatur tildækket med stanniol for at beskytte mod lys. 5. Membranen vaskes 3 gange i 10 sekunder med BSA/TBS-T buffer. 6. Membranen inkuberes med 1 ml primært antistof(koncentration 1:1000) µl TBS-T buffer tilsat 1 % BSA i 1 time på vippebord ved stuetemperatur tildækket med stanniol for at beskytte mod lys. 7. Antistofopløsningen suges fra og opbevares ved 4 C. 8. Membranen vaskes 3 gange i 10 sekunder med BSA/TBS-T buffer. 9. Membranen inkuberes med 1 ml sekundært antistof(koncentration 1:1000) µl TBS-T buffer tilsat 1 % BSA i 1 time på vippebord ved stuetemperatur tildækket med stanniol for at beskytte mod lys. 10. Antistofopløsningen suges fra og opbevares ved 4 C. 11. Membranen vaskes 3 gange i 10 sekunder med BSA/TBS-T buffer. 12. Herefter belyses nitrocellulærmembranen ved 800nm i 30 sekunder. 6