1 Biologi-forsøg: Populationsbiologi/evolution Konkurrence mellem to bakteriearter Forsøget undersøger, hvordan en ydre miljøfaktor (temperatur) påvirker konkurrencen mellem to forskellige arter. I dette tilfælde undersøges konkurrencen mellem to bakteriearter: Escherichia coli (E.coli)og Serratia marcescens. Forsøget præsenterer samtidig elementær bakteriologisk metodik: Dyrkning i vækstmedie, udstrygning på agarplader og metode til bestemmelse af bakterietal. Figur 1.E.coli (tv) og S. marcescens (th) Materialer Bakterier (E.coli, Serratia marcescens) 1 stk 1,5-2 L Erlenmeyerkolbe 6 stk Bluecap 250 ml Materialer til LB og agar Sterile petriskåle Sterile podenåle Aluminiumsfolie 4 magnetomrørere med magneter Automatpipetter til 100 µl og 1-5 ml Drigalskispatler Spritlamper + alkohol Vandfaste tuscher 5 reagensglas e.l. i stativ (til fortyndingsrække) Fremgangsmåde (beskrivelsen er tilpasset forsøg ved 4 forskellige temperaturer. Kan evt. forberedes af læreren) a. Forberedelse af forsøget 1. Fremstil 1000 ml LB (se vejledning i figur 2, side 2) 2. Hæld 100 ml af LB-mediet i hver af 6 Bluecap-flasker (250 ml). Læg en magnet (til omrøring seener på magnetomrører). Tildæk toppen med aluminiumsfolie. 3. Til den resterende del af LB-mediet (400 ml) tilsættes 8 g agar. Denne del bruges til fremstilling af agarplader (ca. 16 stk) 4. Det hele autoklaveres. 5. Når agarblandingen er passende afkølet, hældes den i sterile petriskåle. Pladerne stilles i bunke med bunden opad, når agaren er størknet. Stil dem til afkøling og tørring et døgnstid ved stuetemp.
2 Biologi-forsøg: Populationsbiologi/evolution Figur 2. Fremstilling af LB og agarplader 6. Når LB en er under ca. 30 grader C skal bakterierne podes til vækst. Fra pladen med E.coli udtages med steril podenål bakterier til podning i en af Bluecap flaskerne. Tilsvarende udtages bakterier fra pladen med Serratia i en anden Bluecap-flasker (OBS. Bakterierne skal altså i hver sin flaske). Husk at mærke flaskerne. 7. De podede flasker (tildækket med aluminiumsfolie) sættes til vækst et døgns tid ved 37 grader C i varmeskab. Brug de to magnetomrørere, der kører på batteri. Moderat omrøring (begyndende hvirvel i midten af opløsningen). Efter et døgns tid er bakteriekulturerne udvoksede og klar til at blive brugt i forsøget. b. Afvikling af forsøget Forsøget undersøger, hvordan konkurrencen mellem de to bakteriearter forløber ved forskellige temperaturer. Det kunne f.eks være i køleskab (5-8 C), stuetemperatur (ca. 20 C), 37 C og 50 C. Forsøget kan nemt udvides til flere temperaturer, hvis forberedelserne af flasker og plader tilpasses. Eleverne deles i 4 grupper, som hver for ansvaret for en af de 4 temperaturer. 8. Mærk de 4 Bluecapflasker med 100 ml LB med den temperatur, de skal stå ved. 9. Til hver flaske tilsættes med automatpipette 100 µl af den udvoksede Serratia-kultur og 100 µl af den udvoksede Coli-kultur. 10 Kolberne (tildækket med aluminiumsfolie) sættes til vækst ca. 1 døgn ved den aktuelle temperatur og med magnetomrøring.
3 Biologi-forsøg: Populationsbiologi/evolution c. Måling af resultatet Når bakterierne vokser vil der være konkurrence mellem de to arter og efter et døgn kan det måles, hvad resultatet af denne konkurrence blev. Det gøres ved at udstryge en prøve af kulturen på en agarplade og tælle, hvor mange der er af hver slags. I en ufortyndet prøve vil der være så mange bakterier, at det er umuligt at tælle dem på en agarplade. Derfor laver man en såkaldt fortyndingsrække for at nå frem til en koncentration, hvor antallet kan tælles. Fortyndingsrækken laves efter følgende princip: 1:100.000 Figur 3. Fremstilling af fortyndingsrække Som fortyndingsvæske bruges vand fra hanen. Vandet og reagensglas bør være autoklaverede, men i de fleste tilfælde kan man godt undlade det, fordi bakterietallet i postevand og vaskede reagensglas er minimalt i forhold til det antal bakterier, der indgår i forsøget. 11. Fyld 5 reagensglas med 9 ml vand og mærk dem som vist på figuren med fortyndingsrækken: 1:10, 1:100 osv. 12. Udtag med automatpipette 1 ml fra bakteriekulturen og fyld den i den første fortynding (1:10). Sæt en prop i glasset og bland grundigt ved at ryste og vende op/ned. Det er vigtigt, at prøven til næste fortyndig udtages ret hurtigt efter omrystningen, for når glasset er i ro, synker bakterierne mod bunden 13. Udtag straks herefter 1 ml af blandingen og tilsæt til det næste fortyndingsglas, som rystes og blandes grundigt. 14. Proceduren gentages til det sidste glas (1:100.000) har modtaget 1 ml fra næstsidste glas. 15. Gør agarplader klar ved med vandfast tusch at skrive følgende på bunden af agarpladen: Gruppenavn, forsøgstemperatur og fortynding. Hvis der mangler agarplader, overspringes udstrygning af fortyndingen 1:10 ( og evt 1:100)
4 Biologi-forsøg: Populationsbiologi/evolution Fra fortyndingsglassene skal der nu udtages en prøve, der udstryges på en agarplade. 15. Ryst glasset og udtag straks 100 µl prøve, der afsættes midt på agarpladen. 16. Bakterierne fordeles på pladen med steril drigalskispatel (læreren demonstrerer, hvordan det gøres, se figur 4 ) Figur 4. Desinfektion af drigalskispatel (tv) og udstrygning af bakterieprøve (th) 17. Pladerne sættes til vækst ved stuetemperatur (!) i ca. 1 døgn. Bakterierne skal vokse, så kolonierne bliver tydelige og mulige at tælle ved den største og evt den næststørste fortyndingsgrad Resultatbehandling a. På baggrund af forsøgsresultaterne udregnes koncentrationen af de to bakteriearter (antal pr. ml i den ufortyndede kultur). b. Resultaterne fra de 4 gruppers forsøg samles og resultaterne præsenteres hensigtsmæssigt i et søjlediagram. Diskussion a. Analyser resultaterne. b. Diskuter, hvordan forsøget illustrerer forhold, der har betydning i evolutionen. c. Forklar biologisk, hvorfor temperaturen kan have betydning for, hvordan de to arter bakterier klarer sig ved forskellige temperaturer. d. Diskuter, om forsøget kan bruges til at forudsige mulige konsekvenser af global opvarmning. e. I forsøget indgår ikke kontrolforsøg. Forklar, hvordan kontrolforsøget skal laves. VRA-05-2014
5 Biologi-forsøg: Populationsbiologi/evolution Til lærerens orientering (bør ikke udleveres til eleverne, da det fjerner spændingen om udfaldet, som formodentlig også vil variere en del fra gang til gang). Nedenstående billeder er udstrygninger af 2 gange 1:2000 fortyndinger lavet som 2 gange 1 µl i 2 ml vand (lavet i Eppendorf-rør). Det skulle give en samlet fortynding på 1: 4.000.000, så måske skal der en 6. fortynding med i fortyndingsrækken (det mangler en afprøvning). OBS. Ingen billeder fra 50 grader forsøget, for den temperatur slog alle bakterier ihjel og gav helt blanke plader Hvis dette pilotforsøg holder, hvad det lover, ser det ud til, at der sker et voldsomt skift i konkurrencevilkårene fra 20 til 40-50 grader. Derfor kan det være interessant at lægge flere temperaturer ind i dette interval Figur 5. Resultat af konkurrencen ved 37 C
6 Biologi-forsøg: Populationsbiologi/evolution Figur 6. Resultat af konkurrencen ved stuetemperatur
7 Biologi-forsøg: Populationsbiologi/evolution Figur 7. Resultat af konkurrencen ved køleskabstemperatur Steril teknik. Når man tager låget af en agarplade er der stærkt forøget risiko for at få uønskede bakterier på pladen. Det skal undgås på følgende måde: Tag ikke låget af, før du er ved, hvad der skal ske og er klar til at udføre det Berør ikke de arbejdsredskaber, der skal arbejde med bakterierne, feks pipettespidser og drigalskispatler. Tag dem først frem, når de skal bruges og læg dem ikke fra dig på bordet. Læg ikke låget fra dig med indersiden opad Arbejd hurtigt. Tal ikke unødvendigt i nærheden af pladen og lad være med at ånde i nærheden af pladen Sæt straks låget på, når du er færdig med at udføre din opgave