»Quorum sensing«-hæmmere: en ny måde at bekæmpe bakterielle infektioner på

»Quorum sensing«-hæmmere: en ny måde at bekæmpe bakterielle infektioner på Det er essentielt at forstå infektiøse processer. Ud fra denne viden kan der udvikles en ny generation af antibakterielle midler. Midlernes virkning baseres ikke på væksthæmning, men på at ramme essentielle punkter i selve infektionsprocessen Af Michael Givskov og Thomas Bovbjerg Rasmussen, ph.d.-studerende, Center for Mikrobielle Interaktioner, BioCentrum-DTU Mikroorganismers aktivitet har en altafgørende indflydelse på vores liv. WHO nævner infektionssygdomme som»verdens største dræber«af børn og yngre voksne med mere end 13 mio. pr. år. Ud over infektioner med dødelig udgang er mikroorganismer involveret i et stort antal kroniske lidelser hos mennesker, dyr og planter. Desuden forårsager mikroorganismer store problemer i industrielle anlæg, og de er den væsentligste årsag til forrådnelse af fødevarer. En ekspertgruppe under USA s National Academy of Science skønner, at ca. 25% af de fødevarer, der produceres globalt, går tabt pga. mikrobiel aktivitet. Omvendt er mikroorganismer af kolossal betydning i klodens stofomsætning, og mennesker og dyr har deres egen mikroflora, der hjælper med at fordøje næringsstoffer. Mikroorganismer bruges desuden ved produktion af enzymer og forskellige typer farmaka i den bioteknologiske industri. Menneskets forhold til mikrober er ambivalent. Vi har forsøgt at bekæmpe uønskede mikroorganismer og at udnytte gavnlige egenskaber hos andre mikrober. I dag bruges der store mængder antibiotika, desinfektionsmidler og konserveringsstoffer til at kontrollere skadelige mikroorganismer. Midlernes effektivitet beror på giftige eller vækstbegrænsende virkninger. Det er netop vigtigt at begrænse antallet af mikroorganismer. For enkelte typer bakterier (som f.eks.»hamburgerbakterien«escherichia coli O157) kan ganske få bakterieceller forårsage en livstruende infektion. Men for de fleste typer skal der være høje cellekoncentrationer (mere end 1 mio. pr. gram), før de er i stand til at forårsage sygdom, eller før deres påvirkning af fødevarer kan lugtes og smages. celler, der uafhængigt af hinanden udfører en række kemiske reaktioner, er kun er en lille del af sandheden. Mikroorganismer vil så vidt muligt sætte sig og vokse på overflader, hvor de danner kooperative populationer, der kan bestå af flere forskellige bakteriearter. Næringsstoffer koncentreres ofte ved sådanne faseovergange mellem f.eks. vand og faste overflader. Herved danner efterfølgende vækst hurtigt tykke lag mikroorganismer, der indlejrer sig i en matrix af slimstoffer (exopolysaccharider som f.eks alginat). Denne form for begroning kaldes biofilm. Bakteriepopulationer, der optræder Traditionelle antibiotika og resistensudvikling Ulempen ved traditionelle antibiotika er, at den væksthæmmende effekt på længere sigt bevirker, at man fremavler bakterielle varianter, der udviser øget tolerance og i sidste ende resistens over for antibiotika. Ud over dette bevirker resistens mod ét antibiotika ofte resistens mod en større mængde af forskellige typer antibiotika (multiresistens). Inden for primærproduktionen (landbrug, planteavl og opdræt af fisk) anvendes store mængder antibiotika, og der er også her dokumenteret resistensudvikling hos de sygdomsfremkaldende bakterier. Den voldsomme vækst af multiresistente bakterier har givet en global frygt for, at menneskeheden i løbet af det 21. århundrede vil træde ind i en»post-antibiotika«æra med stærkt reduceret mulighed for at bekæmpe bakterielle infektioner. Bakterielle biofilm Sammenhængen mellem antallet af bakterier og deres vækst og stofskifte er central for vurderingen af deres betydning i miljøet, i fødevarer, som sygdomsfremkaldende organismer og for udnyttelse af deres egenskaber i produktionsøjemed. Den klassiske opfattelse, at bakterier eksisterer som individuelle Figur 1. A Eksempler på biofilmdannelse i naturen. Biofilm i de varme kilder i Yellowstone (grønne bakteriemåtter). B Bakteriel biofilm som den fremtræder under laser konfocal-mikroskopet. Biofilmen gror fra den underliggende overflade (substratum) ud i den omgivende væske. Der dannes kanaler mellem paddehattestrukturerne, der består af tusindvis af bakterieceller. 32

som biofilm, er generelt mere modstandsdygtige over for påvirkninger fra det ydre miljø, hvorfor de er vanskeligere at komme til livs end frit levende bakterier. Biofilm kan frembringe smukke scenarier i naturen, hvor de bedst kendte uden tvivl findes i Yellowstone National Park, Wyoming i USA (figur 1). Biofilm giver store problemer på skibssider, hvor den danner det fundament, hvorpå højere organismer fasthæfter sig. Det udvikler sig ofte til et tykt, nærmest trådformet tæppe kaldet bio-fouling. Fænomenet kendes specielt fra ruser og muslinger. Den kommercielle skibsfart benytter giftige, tungmetalbaserede bundmalinger, der er med til at holde biofilmdannelsen på et minimum, men desværre også har en nærmest uoprettelig effekt på miljøet. Biofilmdannelse bevirker desuden blokering af varmevekslere i industrielle anlæg, forurening af fødevarer fra procesudstyret og overførsel af bakterier til mennesker gennem implantater. National Institute of Health, USA, skønner, at biofilmdannende bakterier er involveret i 60% af alle kroniske infektioner. Bakterielle kommunikationssystemer Biofilmbakterier er resistente mod de højest anvendelige doseringer, og man må se i øjnene, at traditionelle antibiotika ikke kan kurere biofilmbaserede infektioner [1,2]. Biofilmdannelse er en overlevelsesstrategi i fjendtlige omgivelser, hvor frie bakterier elimineres af de hvide blodlegemer. Men kan man ramme biofilmdannelsen? I de senere år er det blevet klart, at mange bakteriearter benytter kemisk baserede kommunikationssystemer til at koordinere deres angreb på mennesker, dyr og planter. Koordinering er en medvirkende årsag til, at bakterier kan overvinde de højere organismers forsvarssystemer og dermed sikre en - fra deres synspunkt - succesrig infektion. Disse kommunikationssystemer tillader bl.a. bakterier at registrere deres antal (deraf navnet»quorum sensing«-systemer) og først producere de, for infektionen nødvendige, sygdomsfremkaldende komponenter (virulensfaktorer) når de er»mange nok«. Det har vist sig, at mere end 30 forskellige bakteriearter besidder sådanne»quorum sensing«-systemer, der fungerer vha. hormonlignende signalstoffer [3]. Sådanne systemer spiller en stor rolle under den begyndende infektionsproces. Værtsorganismens immunsystem reagerer på selv små mængder virulensfaktorer. Derfor kan rationalet for en angrebsstrategi være, at så længe der kun er få bakterier til stede, vil værtens immunsystem nemmere kunne slå infektionen ned. Strategien, at bakteriepopulationen venter med at producere virulensfaktorer, til den har nået en vis størrelse, bevirker, at værtens forsvar lettere kan overrumples. Naturen producerer kommunikationshæmmere I 1996 publiceredes i samarbejde med Staffan Kjellebergs team på University of New South Wales i Sydney, Australien, det første eksempel på, at en bakteriepopulations evne til at danne biofilm styres af den gruppe signalmolekyler, som regulerer virulensfaktorer hos mange sygdomsfremkaldende bakterier [4] (figur 2, side 34). Blandt Gram-negative bakterier er det et udbredt fænomen, at»quorum sensing«-systemer benytter N- acylhomoserinlaktoner (AHL) som signaler. AHL-molekylerne består af en ringformet lakton samt en acylsidekæde (af varierende længde) med et eller to substituerede iltatomer. I 1998 dokumenterede en amerikansk og en engelsk forskergruppe, at P. aeruginosas evne til at danne tætte biofilm styres på samme måde. Biofilmdannelse forekommer dog i de fleste tilfælde som kolonisering af overflader i naturen. Overfladekolonisering sker kun, hvis der er mange bakterieceller til stede. Gennem f.eks.»quorum sensing«-kontrolleret produktion af overfladeaktive stoffer kan bakteriernes bevægelse på overflader lettes. Ligeledes kan forrådnelse af fødevarer ikke karaktet 33

Figur 2. A Bakterielle AHL-signalmolekyler fra Pseudomonas aeruginosa. B Algeplanten Delisea pulchra producerer en kollektion af AHL-signalhæmmere (halogenerede furanoner). riseres som et angreb på en vært. Det er dog en situation, hvor en vis mængde bakterieceller skal være til stede for at forårsage nedbrydningen, der ofte vil ske i skarp konkurrence mellem forskellige bakteriegrupper. En bakteriepopulation, der kan koordinere og opregulere sin indsats, f.eks. gennem produktion af nedbrydningsenzymer, har derfor en stor fordel. AHL-baserede kommunikationssystemer findes ikke kun hos bakterier, der inficerer mennesker, men også hos en lang række bakterier, der kan give infektion hos planter (Agrobacterium tumefaciens, Erwinia carotovora) og fisk (Vibrio anguillarum, Aeromonas salmonicida). I samarbejde med Lone Grams forskerteam på Fødevareministeriets Forsøgslaboratorium, DTU, har vi som de første dokumenteret, at bakterier, der vokser på fødevarer, producerer de samme AHL-signalstoffer, som anvendes af sygdomsfremkaldende og biofilmdannende bakterier [5]. Kommunikationssystemer som drug targets En mere sofistikeret bekæmpelse af bakterier kan derfor i fremtiden ske gennem brug af stoffer, der ikke er antibiotika, men som hindrer bakteriers evne til at virke i flok. Forskningsprojektet fokuserer derfor på effektiv blokering af kommunikation mellem bakterier, og naturen bruges som skabelon. Biofilmdannelse på overfladen af marine organismer hæmmer disses vækst, og netop her finder man højere organismer, der har udviklet kemisk baserede anti-fouling- eller anti-biofilmsystemer. I samarbejde med Staffan Kjellebergs forskerteam fra University of New South Wales er det vist, at den australske rødalge Delisea pulchra producerer en række stoffer, der kan regulere biofilmdannelse. Det gøres ved at blokere for bakteriekommunikation og dermed undertrykke mange uønskede bakterielle aktiviteter [4]. At der ikke er tale om giftstoffer, ses af at planterne ikke er sterile. Bakterier og organismer findes på overfladen, men kun i begrænsede områder, hvor de ikke danner biofilm. Da de nævnte stoffer ikke påvirker bakteriernes almindelige vækst, vil sådanne kommunikationshæmmere ikke fremprovokere resistens der vil ikke være noget selektionstryk. Sådanne naturligt forekommende stoffer undersøges bl.a. mhp. bakteriebekæmpelse, der er baseret på specifik blokering af bakteriel kommunikation og dermed den adfærd, der bevirker infektion, begroning eller forrådnelse. En modelorganisme er P. aeruginosa, der bl.a. inficerer lungerne hos patienter med cystisk fibrose. Bakterien producerer forskellige enzymer, der angriber lungevævet og komponenter af immunsystemet. Produktion af et tykt slimlag bestående af alginat muliggør dannelse af en tyk bakteriel biofilm, der beskytter de koloniserende bakterier mod immunsystemets reaktioner og øger tolerancen mod antibiotika. Etablering af biofilm og produktion af vævsnedbrydende virulensfaktorer styres af og koordineres i bakteriepopulationen vha.»quorum sensing«-kommunikationssystemer. Det er den ultimative modstander, hvad angår kroniske infektionssygdomme. Modelsystemer At bakteriel kommunikation spiller en vigtig rolle under infektionsprocessen er direkte demonstreret vha. dyremodeller og sofistikerede molekylærbiologiske systemer. Men det har også betydet, at vi har bevæget os hele vejen fra marin biologi, over kemi, via mikrobiologi for endelig at udføre forsøg i dyremodeller i samarbejde med Niels Høibys forskerteam på Rigshospitalet. Vores nuværende forskerteam består af organisk kemikere (John Nielsens gruppe på Institut for Kemi, KVL), mikrobiologer, molekylær biologer (Michael Givskovs og Søren Molins grupper på BioCentrum-DTU), fødevaremikrobiologer, der håndterer fiskemodelforsøg (Lone Grams gruppe Figur 3. A Eksempel på en bakteriel AHL-monitor. AHL-signalmolekyler inducerer dannelsen af det grønt fluorescerende GFP. Tilstedeværelse af signalhæmmere som f.eks de halogenerede furanoner blokerer kommunikationssystemet og cellerne danner ikke GFP. AHL-monitorcellerne er desuden udstyret med det røde fluorescerende protein RFP, så vi kan følge dem under konfocalmikroskopet. B. Vores eksperimentelle system til at studere biofilm (flowkammeret), der lige passer ind under konfocal-mikroskopet. I de tre små kamre dannes biofilmene på glasfladen. C Sådan ser det ud i laser konfocal-mikroskopet ovenfra. Til venstre ser man tydeligt, at cellerne kommunikerer (grønne celler), til højre, hvor der behandles med halogenerede furanoner, er der derimod lukket godt ned for kommunikationen (næsten alle celler er mørke). D Set fra siden ser man tydeligt den karakteristiske paddehattestruktur i den udviklede biofilm (til venstre), hvorimod furanonbehandling (til højre) har reduceret tykkelsen betydeligt. 34

Figur 4. Musemodel til at studere hæmning af bakteriel kommunikation in vivo. Den ene lunge på en række mus inficeres med monitorbakterier, og den følgende dag får musene injektioner med AHL-signalhæmmere (i dette tilfælde halogenerede furanoner). Tynde snit af musenes lunger undersøges herefter under konfocal-mikroskopet. Øverst til højre ser man tydeligt, at cellerne kommunikerer (grønne celler), i midten til højre er der behandlet med en hæmmer (0.5mg/g kropsvægt), der kun inhiberer delvist, hvorimod nederst til højre har behandlingen været tilstrækkelig (2 mg/g kropsvægt) til at lukke helt ned for cellekommunikationen (næsten alle celler er mørke). Igen benyttes RFP-markøren til at finde bakteriecellerne i lungesnittene. Den sidste dosering benyttes til en ny runde museforsøg, der er en decideret behandling, hvor effektiviteten testes. på Fødevareministeriets Forsøgslaboratorium, DTU) og endelig folk med medicinsk baggrund, der kan håndtere musemodelforsøg (Niels Høibys gruppe på Rigshospitalet). Lad det være BIOTEKNOLOGI sagt med det samme, naturstofferne isoleret fra den australske alge er ikke tilstrækkelig virkningsfulde mod P. aeruginosa. Derfor er et større organisk kemisk modifikationsarbejde af molekylstrukturer (foregår i Sydney og på KVL) gået i gang. For at bedømme effekt af nye syntetiske molekyler er det nødvendigt med velfungerende testsystemer (screeningssystemer). Vores team på DTU har udviklet en kollektion af»grønne quorum-sensorer«. Vha. genmanipulation er der koblet»quorum sensing«-systemer til et modificeret vandmandsprotein kaldet GFP [6]. Det fluorescerende protein gør bakteriecellerne grønne, og man kan følge bakteriel kommunikation (grønne celler) og hæmning af kommunikation (mørke celler) [7]. Systemet er så velfungerende, at det kan følges i eksperimentelle biofilmsystemer (figur 3) og helt ind i musemodellen (figur 4). Der arbejdes efter følgende princip: en gruppe stoffer testes i indledende undersøgelser, de mest lovende udvælges og testes videre i biofilmmodelsystemet. Vha. laser confocal-mikroskopi kan man se direkte igennem biofilmstrukturer og vha. computere kan genereres et 3- dimensionalt billede af biofilmen. Det giver et godt billede af, hvor effektivt de udvalgte stoffer gennemtrænger biofilmen (de traditionelle antibiotika gennemtrænger ikke effektivt biofilmstrukturer). Lovende stoffer modificeres atter. Hensigten er at gøre dem endnu mere effektive som»quorum sensing«- inhibitorer. De bedste går endnu engang gennem biofilmmodellen. Når et stof effektivt hæmmer quorum sensing i mere end 95% af biofilmens celler og opløser biofilmen, går det videre til dyremodellen. Der bruges meget tid på biofilmmodellen, idet der er en god overensstemmelse med dyremodellen. Først testes det, om stoffet kan føres rundt i musen t NYHED Nu er det igen muligt at købe readere, vaskere og multidrops til konkurrencedygtige priser hos Laboratory, Automation & Technology A/S og ikke kun til pippeteringsautomater og robotter. Priser fra 31.500 inkl. software Priser fra 27.500 inkl. software Laboratory, Automation & Technology A/S Valhøjvej 18 2500 Valby Danmark CVR nr: 20 85 39 05 VAT no: DK20853905 www.lat-int.com E-mail: info@lat-int.com Danmark Tlf: +45 7023 7740 Tlf: Fax:+45 7023 7741 Sverige +46 (0)503 13989 +46 (0)409 70740 +46 (0)403 05810 35

via blodbanen, trænge ind i lungevævet og hæmme bakterielle kommunikationssystemer. Dagen før er det inficeret en lunge i en række mus med»grønne quorum-sensorer«. Herefter undersøges det, om»vi kan slukke det grønne lys i monitorbakterierne«. I den endelige test inficeres en række mus med P. aeruginosa bakterier og derefter udføres en 3 til 5 dages behandling af dyrene med typisk tre daglige injektioner med kommunikationshæmmer. Lovende resultater viser, at»quorum sensing«-inhibitorer effektivt kan kurere P. aeruginosa lungeinfektioner. Gode perspektiver Håbet er, at en profylaktisk behandling i fremtiden vil kunne forhindre den kroniske infektion i at bryde ud i CF-patienter. Vi mener, at en sådan behandling kan hjælpe til at reducere den bakterielle biofilm i lungerne og dermed øge patienternes velbefindende og overlevelsesmuligheder. Desværre er kvaliteten af de fundne stoffer endnu ikke god nok. Molekylerne er for reaktive. Den grundvidenskabelige del af projektet skal sikre, at disse stoffer ikke har ubehagelige bivirkninger (såsom mutagene egenskaber eller bakteriel resistens). Nye eksperimentelle redskaber Der er opsat en række krav til den nye generation af de nyudviklede screeningssystemer. Målet er at udvikle stoffer, der kun rammer bakteriers kommunikationssystemer. Screeningssystemet skal frasortere stoffer uden virkning og fravælge stoffer, der er mutagene, giftige eller på anden måde interfererer med mikroorganismernes vækst. Ved screening af et stort antal stoffer er det bedst at bruge et positivt screeningssystem, dvs. man får en (tydelig) indikation, når der er et»hit«. Det kan f.eks. være en markant farvedannelse ved tilstedeværelsen af en kommunikationshæmmer i screeningsassayet. Vha. genmanipulation er der skabt en række bakteriestammer, der kun kan vokse, hvis der er en»quorum sensing«-hæmmer i bakteriernes vækstmedie. Når de gensplejsede mikroorganismer vokser, danner nogle af dem en grøn farve, hvor andre udsender lys (bioluminescens). Disse bakterier kaldes»quorum sensing inhibitor selectorer«. Ved screening indstøbes en»quorum sensing inhibitor selector«i agar, dernæst tilsættes teststof eller stofblanding til en brønd lavet i mediet (figur 5). Prøven begynder hurtigt at diffundere ud i den porøse matrix i mediet, hvorved der opstår en koncentrationsgradient med højest koncentration ved brønden. Stort set alle stoffer er giftige, hvis en levende organisme udsættes for dem i tilstrækkelig høje koncentrationer. En time efter prøvetilsætning ( koncentrationsgradienten har haft tid til at opstå) inkuberes selectorbakterierne ved en passende temperatur. Dagen efter vil tilstedeværelsen af en»quorum sensing«-hæmmer kunne ses ved en blå eller lysende ring omkring brønden. Afstanden fra brønden til ringen indikerer, om nogle af stofferne har toksiske egenskaber. Der testes ofte komplekse stofblandinger, som f.eks. planteeller svampeekstrakter, der typisk indeholder et eller flere giftige stoffer. Til at adskille giftige ingredienser fra potentielle kommunikationsinhibitorer kan bruges en chromatografisk plade forud for indsøbningen i gelmatricen. Viser det sig, at en stofblanding indeholder en potentiel inhibitor, sendes den til vores samarbejdspartnere. Her opdeles stofferne i mindre fraktioner, som vi får tilbage og tester igen. Processen fortsætter til der kun er et (eller evt. få) stoffer i fraktionerne. En del af de nyudviklede screeningssystemer er simple at bruge, hvilket gør dem velegnede til feltarbejde. Dermed bliver det muligt at teste stoffer, der er ustabile. I den tid der går, fra man tager en prøve, til man er tilbage i laboratoriet og kan begynde testen, risikerer man at miste potentielle kommunikationshæmmere. Den første generation af signalinhibitorer, isoleret fra den australske alge, Delisea pulchra er netop ustabile molekyler. Det er ikke svært at forestille sig, hvad der sker med ustabile molekyler på en rejse fra Australien til Danmark. Vi ønsker ikke at finde stoffer, der virker på bakteriers vækst. Sådanne stoffer vil fremprovokere resistens og vil kun være virksomme en i en begrænset periode. Pga. manglende selektionstryk hos kommunikationshæmmerne anser vi det for usandsynligt, at der kan opstå resistens mod en»quorum sensing«-inhibitor. Dog er vi opmærksomme på muligheden og er ved at undersøge, om det er muligt at blive resistent over for signalinhibitorerne. E-mail-adresse: Michael Givskov: immg@pop.dtu.dk Figur 5. Diffusionsassay for»quorum sensing«-hæmmere. Prøven påsættes i den sorte ring (brønden), og de aktive stoffer diffunderer ud (i pilenes retning), så der opstår en koncentrationsgradient. Næste dag vil tilstedeværelsen af en»quorum sensing«-hæmmer kunne ses ved en blå ring omkring brønden, det er bakterier, der vokser og producerer et blåt farvestof. Referencer 1. Koch,C. & Høiby,N. (1993).Pathogenesis of cystic fibrosis. Lancet 341, 1065-1069 2. Costerton,J.W., Stewart,P.S. & Greenberg,E.P. (1999).Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science 284, 1318-1322 3. Eberl, L. (1999). N-acyl homoserinelactone-mediated gene regulation in gram-negative bacteria. Syst Appl Microbiol 22, 493-506. 4. Givskov, M., de Nys, R., Manefield, M., Gram, L., Maximilien, R., Eberl, L., Molin, S., Steinberg, P. D., and Kjelleberg, S. (1996). Eukaryotic interference with homoserine lactone-mediated prokaryotic signalling. J Bacteriol 178, 6618-6622. 5. Gram, L., Ravn, L, Rasch, M., Bruhna, J.B., Christensen, A. B., and Givskov, M (2002) Food spoilage interactions between food spoilage bacteria. International Journal of Food Microbiology 78: 79-97. 6. Wu, H., Song, Z., Henzer, M., Andersen, J. B, Heidorn, A., Mathee, K., Moser, C., Molin, S., Høiby, N., and Givskov, M. (2000). Detection of N-acyl-homoserine lactones in lung tissues of mice infected with Pseudomonas aeruginosa. Microbiol 146: 2481-2493 7. Hentzer, M., K. Riedel, T. B. Rasmussen, A. Heydorn, J. B. Andersen, M. R. Parsek, S. Rice, L. Eberl, S. Molin, S., Høiby, N., Kjelleberg, and M. Givskov (2002). Interference with Pseudomonas aeruginosa quorum sensing by a halogenated furanone compound. Microbiol 148:87-102. 36