OM S ANVENDELSEN AF OG ERFARINGER MED NATURLIG NEDBRYDNING Civilingeniør, projektchef Ernst Lassen, Oliebranchens Miljøpulje

Indholdsfortegnelse Side FELTUNDERSØGELSE AF DEN NATURLIGE PCE OG TCA NED- 1 12 BRYDNING I MORÆNELER VED EN TIDLIGERE KEMIKALIE- FORDELINGSCENTRAL Ph.d.-studerende Ida Damgaard, DTU Miljø Projektforsker Jacob Bælum, GEUS Professor Carsten Suhr Jacobsen, GEUS Civilingeniør enriette Kerrn-Jespersen, Region ovedstaden Fagleder Carsten Bagge Jensen, Region ovedstaden Lektor Charlotte Scheutz, DTU Miljø Professor Poul L. Bjerg, DTU Miljø Lektor Mette Broholm, DTU Miljø OM S ANVENDELSEN AF OG ERFARINGER MED NATURLIG 13 20 NEDBRYDNING Civilingeniør, projektchef Ernst Lassen, Oliebranchens Miljøpulje BESTEMMELSE AF AKTIVITETEN AF SPECIFIKKE MIKRO- 21 30 BIELLE PENOXYSYRE-PESTICID NEDBRYDERE Projektforsker Jacob Bælum, GEUS Adjunkt Mette auberg Nicolaisen, Det Biovidenskabelige Fakultet, KU-LIFE Professor Jan Sørensen, Det Biovidenskabelige Fakultet, KU-LIFE Professor Carsten Suhr Jacobsen, GEUS, og Det Biovidenskabelige Fakultet, KU-LIFE MIKROBIEL DECLORERING AF TCE 31 38 MOLEKYLÆRE TEKNIKKER TIL BESTEMMELSE AF TILSTEDEVÆRELSE OG AKTIVITET AF SPECIFIKKE NEDBRYDERE Professor Carsten Suhr Jacobsen, GEUS Projektforsker Jacob Bælum, GEUS Lektor Charlotte Scheutz, DTU Miljø Lektor Mette Broholm, DTU Miljø ØFDE 42, POTENTIALE FOR BIOLOGISK NEDBRYDNING 39 46 Ph.d. Morten Bondgaard, Region Midtjylland

BIODEGRADATION OF MTBE AND BTEXS IN FULL-SCALE 47 56 REACTORS TO PPB LEVELS AFTER INOCULATION WIT A MTBE DEGRADING CULTURE Professor Erik Arvin, DTU Environment Res. Assoc., Ph.D. Kevin Waul, DTU Environment Director, M.Sc. Rasmus Krag, Jord Miljø A/S M.Sc. Charlotte Juhl Søgaard, Jord Miljø A/S Associate Professor Jeppe Lund Nielsen, Section of Biotechnology, Aalborg University VURDERING AF OPRENSNINGSGRAD VED FULDSKALA IN-SITU 57 68 SRD AF TCE-FORURENING I MORÆNELER Lektor Mette M. Broholm, DTU Miljø Ph.d.-studerende Camilla Christiansen, DTU Miljø Professor Poul L.Bjerg, DTU Miljø Civilingeniør aus Westergaard, Orbicon Leif ansen Civilingeniør, ph.d. Mette Christophersen, Region Syddanmark Biolog Jan Petersen, Region Syddanmark MODELLING IN-SITU ENANCED REDUCTIVE DECLORINATION 69 78 AT SORTEBROVEJ - WAT CAN WE LEARN IN TERMS OF EFFICIENCY AND TIMEFRAME? Ph.D.-student Julie Chambon, DTU Environment Research Assistant Gabriele Manoli, DTU Environment Associate Professor Mette Broholm, DTU Environment Ph.D.-student Camilla Christiansen, DTU nvironment M.Sc. Eng., Ph.D. Mette Christophersen, Region of Southern Denmark Professor Poul L. Bjerg, DTU Environment

FELTUNDERSØGELSE AF DEN NATURLIGE PCE OG TCA NEDBRYDNING I MORÆNELER VED EN TIDLIGERE KEMIKALIEFORDELINGSCENTRAL Ph.d.-studerende Ida Damgaard, DTU Miljø Projektforsker Jacob Bælum, GEUS Professor Carsten Suhr Jacobsen, GEUS Civilingeniør enriette Kerrn-Jespersen, Region ovedstaden Fagleder Carsten Bagge Jensen, Region ovedstaden Lektor Charlotte Scheutz, DTU Miljø Professor Poul L. Bjerg, DTU Miljø Lektor Mette Broholm, DTU Miljø Naturlig og stimuleret biologisk nedbrydning - processer og mikrobiologi Møde 21. april 2010 Schæffergården

RESUMÉ Ved oprensning med stimuleret anaerob deklorering på morænelers lokaliteter er det svært at opnå god kontakt mellem de reaktive stoffer og forureningen med de klorerede opløsningsmidler. I Danmark har aktive oprensninger på lav permeable lokaliteter kun være i gang i 4-5 år og ud fra vandprøveresultater ser metoden lovende ud. Det vides dog ikke om nedbrydningen kun finder sted i/omkring sprækker og sandslirer/linser eller, om der udvikles en nedbrydningszone i en større del af lermatricen. I dette projekt er den naturlige nedbrydning af klorerede ethener og ethaner undersøgt på en morænelerslokalitet med formålet at opnå bedre kendskab til processerne, der driver den anaerobe deklorering, samt at få en forståelse for, hvor nedbrydningen efter længere tid (30 år) finder sted. Foreløbige resultater viser tegn på, at der sker eller er sket naturlig nedbrydning i lermatricen. BAGGRUND Klorerede ethener samt nogle ethaner kan nedbrydes ved anaerob deklorering til ethen eller ethan. Den fuldstændige nedbrydning finder kun sted, hvis de rette bakterier er til stede under relativt reducerede forhold. Nedbrydningen forløber som en sekventiel nedbrydning, hvor hydrogen ombyttes med et klor atom. Det er derfor også nødvendigt, at en elektrondonor er til stede, for at nedbrydningen finder sted. Stimuleret anaerob deklorering er de seneste år blevet en anvendt afværgemetode på både sandede og lerede lokaliteter forurenet med klorerede opløsningsmidler /1/. På lavpermeable lokaliteter sætter den lave permeabilitet af sedimentet dog visse begrænsninger i forhold til at opnå god kontakt mellem de reaktive stoffer og forureningen. Der findes flere afprøvede metoder på markedet, der forsøger at forbedre denne kontakt /2;3/. I en erfaringsopsamling af oprensning med anaerob deklorering i moræneler blev det dog slået fast, at stimuleret anaerob deklorering ud fra målte vandprøvekoncentrationer ser lovende ud i moræneler, dog påpeges det, at der mangler dokumentation for, hvor nedbrydningen finder sted. Finder nedbrydningen kun sted i sprækker og sandslirer/linser eller dannes der en reaktion zone i lermatricen, som det blev fundet på en lokalitet /4;5;6/, hvor der endvidere sker nedbrydning af de klorerede opløsningsmidler? Denne viden er nødvendig for at lave en realistisk vurdering af tidshorisonten for en oprensning med anaerob deklorering i moræneler /7/. FORMÅL For på sigt at opnå kendskab til tidshorisonten for en oprensning med stimuleret anaerob deklorering i moræneler er det nødvendigt at opnå en bedre procesforståelse. I dette studie er der lavet undersøgelser på en lokalitet, hvor en forurening med klorerede ethener og ethaner har været til stede i mere end 30 år. På lokaliteten findes der to hotspot-områder: det ene er domineret af nedbrydningsprodukter, hvilket indikerer at der naturligt sker nedbrydning, og det andet er domineret af moderstofferne PCE og 1,1,1-TCA. Forholdene, der driver den naturlige nedbrydning i det ene område og ikke i det andet, er derfor undersøgt, for at opnå en bedre viden om, hvad der driver den anaerobe deklorering. Det er endvidere undersøgt, om den naturlige nedbrydning kun finder sted i sprækker og højpermeable indslag som sandslirer/linser, eller om nedbrydningen også finder sted i lermatricen. Undersøgelserne er lavet i forbindelse med et større forskningsprojekt REMTEC (www.remtec.dk), hvor der blandt andet fokuseres på oprensning af lavpermeable aflejringer med anaerob deklorering.

ANAEROB DEKLORERING Klorerede ethener og ethaner kan ved reduktiv deklorering nedbrydes under anaerobe forhold ved at et kloratom fraspaltes og erstattes med et hydrogenatom. Nedbrydningen sker sekventielt, og kan under de rette forhold finde sted indtil et ikke-kloreret stof er tilbage (ethen og/eller ethan). alorespirerende bakterier står for nedbrydningen. Bakterierne bruger de klorerede stoffer som elektronacceptor og hydrogen som elektrondonor. Der findes flere typer halorespirerende bakterier, der kan deklorere PCE/TCE til 1,2-cis-DCE. Dehalococcoides er kendt for at stå for den videre nedbrydning fra 1,2-cis-DCE til VC og ethen. trans-1,2-dce C C C PCE C TCE 2 2 C C cis-1,2-dce C C 2 C VC C 2 Ethen C C 1,1-DCE C C 1,1,1-TCA 1,1-DCA CA Ethane 2 2 2 C C C C C C Biotisk Biotisk Biotisk C C 1,1-DCE C C 2 Biotisk C VC C 2 Biotisk Ethen C C Figur 1: Anaerob reduktiv deklorering af PCE og 1,1,1-TCA (figur fra /8/). FELTLOKALITET Den tidligere industrigrund i Vadsby (Vadsbyvej 16A, 2640 edehusene) blev i 2005 kortlagt som forurenet som følge af opbevaring og fordeling af kemikalier (blandt andet klorerede opløsningsmidler) (1973-76) og maskinværkstedsaktiviteter (1986-1993). I dag benyttes lokaliteten til landbrug og som parkeringsplads. En oversigt af lokaliteten kan ses i Figur 3.

Oxideret moræneler Reduceret moræneler Morænesand Smeltevandssand/silt Kalk Sprække Sten Kalk Figur 2: Geologisk tværsnit på lokaliteten (V-Ø) (figur fra /3/). Der er i forbindelse med afprøvning af injektionsmetoder på lokaliteten udført flere udgravninger, hvor en detaljeret geologisk karakterisering er lavet ( Figur 2) /2;3/. Ved undersøgelserne blev det fundet, at der på lokaliteten findes to morænelersenheder indtil ca. 16 m.u.t. Redoxgrænsen er fundet i ca. 4 m.u.t. Den oxiderede zone er præget af mange makroporer (vertikale og horisontale sprækker, rod og ormehuller). Flere glacial-tektoniske sprækker er endvidere identificeret. Disse forventes at have en større dybde end udgravningen dækkede dvs. mere end 4,5 m. De to morænelersenheder er i nogen områder adskilt af et smeltevandssandlag i ca. 8-9 m.u.t.. Morænelersenhederne er underlejret af et smeltevandssand/siltlag (mægtighed på op til 4 m), der udgør det sekundære grundvandsmagasin. erunder findes endnu et morænelerslag efterfulgt af kalken, hvor det primære magasin findes. Der er flere steder fundet direkte kontakt mellem det sekundære og primære magasin. Gennem 30 år har forureningen spredt sig i moræneleret. Formentligt er forureningen først spredt ved sprækketransport og derefter ved diffusion ind i lermatricen. Den horisontale og vertikale forureningsfordeling er undersøgt ved flere undersøgelsesrunder /9;10;11/. Spredningen er undersøgt ud fra jordprøver, vandprøver og Membrane Interface Probe (MIP) sonderinger. Den forventede forureningsfordeling kan ses i Figur 3.

N BDTU12 BDTU10 BDTU11 10000-20000 g/m 3 1000-10000 100-1000 0-100 Lade 0 2 4 6 DTU12 DTU10 10 M 20 M 30 M DTU11 2 4 6 8 10 Moræneler med sprækker Redox zone Moræneler med få sprækker 12 14 16 18 10.000-20.000 g/m 3 1000-10.000 100-1000 0-100 Dybder hvor der er udtaget kerneprøver Filtersætning Smeltevandssand/siltlag Moræneler Figur 3: Den horisontale (top) og vertikale (bund) forureningsfordeling af klorerede ethener og ethaner på Vadsbyvej (figurerne er modificeret fra /10/). På det horisontale og vertikale snit er der vist, hvor der er lavet MIP sonderinger og udtaget kerneprøver (BDTU10, BDTU11 og BDTU12). Den primære del af forureningen med klorerede opløsningsmidler er fundet i to områder under redoxgrænsen. Det ene område består overvejende af nedbrydningsprodukter (1,2-cis- DCE og 1,1-DCA), hvilket indikerer, at der naturligt sker nedbrydning af både klorerede ethener og ethaner. Dette kan skyldes, at der i samme område er spildt vandopløselige opløsningsmidler (isopropanol) og kulbrinter, som kan agerer som elektrondonorer i nedbrydningsprocessen. I det andet område er moderstofferne PCE og 1,1,1-TCA de primære forureningsstoffer, hvilket tyder på at den ikke sker naturlig omsætning af forureningsstofferne i større omfang. Der er endvidere målt klorerede opløsningsmidler i det underliggende grundvandsmagasin, hvorfor den forurenede lokalitet potentielt udgør en risiko for grundvands- og derved også drikkevandskvaliteten i området (Københavns Energis kildeplads Brokilde) /2;12/.

STRATEGI FOR FELTUNDERSØGELSER For at undersøge, hvor og under hvilke forhold nedbrydningen finder sted, er der udtaget kerner til diskretiseret prøvetagning fra de to hot spot på Vadsbyvej. For at udtage kernerne i dybder, hvor der forventes at foregå nedbrydning, er den vertikale forureningsfordeling undersøgt ved MIP sonderinger. For ca. hver 0,5 m er der udtaget en delprøve, der blev analyseret på en felt GC. erved opnåede vi kendskab til fordeling mellem moder- og nedbrydningsstoffer, og vi kunne derudfra udvælge interessante dybder til kerneprøvetagningen. Ud fra felt GC målingerne blev det endvidere besluttet, i hvilke dybder, der skulle filtersættes til vandprøvetagning. FELTUNDERSØGELSER Der blev lavet MIP sonderinger 3 steder på lokaliteten ( Figur 3): 2 i det hotspot, hvor der forventes at ske nedbrydning (BDTU10 og BDTU12) og 1 i det hot spot domineret af moderstoffer (BDTU11). MIP sonderingerne blev lavet fra terræn til ca. 12 m.u.t. På baggrund af MIP sonderingerne og felt GC målingerne blev dybderne til kerneprøvetagning udvalgt (de udvalgte dybder er vist i Figur 3). Der blev overvejende udvalgt dybder, hvor der forventedes at foregå nedbrydning. Enkelte dybder, hvor der ikke forventedes at foregå nedbrydning, blev endvidere udvalgt for at opnå kendskab til forholdene, hvor der ikke naturligt forekommer nedbrydning. Der blev udtaget 20 kerner i A-rør med en længde på 0,5 m. Kernerne blev lukket til med en prop i hver ende og derefter pakket ind i Rilsanposer. Kernerne blev opbevaret ved 10 C indtil prøvetagningen. KERNEPRØVETAGNING Kernerne blev presset ud af A-rørerene direkte ind i en Rilsanpose for at mindske fordampning. Derefter blev der lavet en detaljeret geologisk beskrivelse. Ud fra tilstedeværelsen af sprækker og sandslirer/linser blev prøvetagningsstrategien for hver enkelt kerne lavet. Når der blev identificeret en sprække eller sandslire/linse, blev der tæt på sprækken/sandsliren taget prøver for hver 0,5 cm. Prøvetagningsafstanden blev gradvist øget med afstanden til indslaget. Der blev udtaget prøver til analyse for parametrene beskrevet i Tabel 1. Koncentrationen af de klorerede opløsningsmidler blev analyseret straks efter prøvetagningen. Ud fra resultaterne blev områder, hvor sammensætningen af klorerede opløsningsmidler indikerede naturlig nedbrydning, udvalgt til videre analyse af de resterende parametre.

Tabel 1: Oversigt over analyseparametre ( *endnu ikke analyseret). Klorerede opløsningsmidler (Koncentrationer og Isotop fraktioner*) Redox parameter* Fedes syrer* Mikrobielle parameter* Geologiske parameters - PCE, TCE, 1,1-DCE, 1,2cis- DCE, 1,2trans-DCE, VC - Nitrat - Sulfat - Sulfid - Laktat - Acetat - Mikrobielle nedbrydere baseret på Dhc and Dhb 16S rrna genes (DNA) - Funktionelle gener: vcra, bvca, and tcea gener (DNA) - Aktivitet, baseret på Dhc and Dhb 16S rrna (RNA) - TOC* - Porøsitet - 1,1,1-TCA, 1,1-DCA, CA - Ethene og ethane - Jern speciering - Metan - Propionat - Myre syre - Specifik funktionel aktivitet baseret på vcra, bvca and tcea mrna - Karakterisering af det mikrobielle samfund - Densitet - Vandindhold FORELØBIGE RESUTATER På nuværende tidspunkt er der analyseret for klorerede opløsningsmidler og mikrobielle nedbrydere baseret på Dehalococcoides 16S rrna i kernerne fra Vadsbyvej. Der er ikke fundet Dehalococcoides over detektionsgrænsen (10 3 celler/l) i nogle af jordprøverne. De specifikke nedbrydere er dog fundet i vandprøver fra begge kildeområder (BDTU11 var der 5,8. 10 4 celler/l og i B2 var der 3,8. 10 8 celler/l). Det er uklart, om grunden til at nedbryderne ikke findes i lermatricen er, at de er til stede men i antal under detektionsgrænsen. vis dette er tilfældet, kan det have en sammenhæng med, at der sker en langsom nedbrydning af de klorerede opløsningsmidler på lokaliteten som følge af den diffusionsstyrede kontakt. I det følgende er præsenteret et udvalg af resultaterne af de målte koncentrationer af de klorerede opløsningsmidler. I Figur 4 ses den molære sammensætning af de klorerede ethener og ethaner målt i kernerne fra BDTU10 fra 7 til 12 m.u.t. Det ses, at nedbrydningsprodukterne 1,2-cis-DCE og 1,1-DCA er de dominerende stoffer ned gennem profilet. Der sker et fald i den målte koncentration af 1,1,1-TCA fra 7 til 7.3 m.u.t. Samtidig med faldet sker der en stigning i 1,1-DCA koncentrationen, hvilket kan indikere, at der sker nedbrydning af 1,1,1-TCA til 1,1-DCA. Eftersom der ikke er identificeret sprækker eller sandslirer i denne dybde, forventes nedbrydningen at finde sted i lermatricen. Der er identificeret en sprække i 8,6 m.u.t. samt to sandslirer i henholdsvis 11 og 11,5 m.u.t. Det ses, at der ved sprækken og sandslirerne sker ændringer i sammensætningen af de klorerede ethener. Ved sprækken i 8,6 m.u.t. falder 1,2-cis-DCE koncentrationen. Eftersom der ikke er målt VC eller ethen, kan det tyde på at 1,2-cis-DCE diffunderer fra matricen tilbage i

sprækken. Ved sandsliren i 11 m.u.t. ses der inde i matricen et skift mellem TCE til VC. Dette kan indikere, at TCE nedbrydes til VC. vis der sker nedbrydning til VC, er det nødvendigt, at der er Dehalococcoides til stede. vis de er til stede her må de være til stede under detektionsgrænsen. Ved sandslirer i 11,5 m.u.t. følger stofferne det samme mønster, hvorfor der ikke forventes at ske nedbrydning her. I kernerne fra BDTU12 blev der målt væsentlig højere koncentrationer af klorerede ethener (fra 1000 µmol/kg i 5,5 m.u.t op til 3000 µmol/kg i 8 m.u.t.) end i BDTU10 ( Figur 4). Koncentrationen af de klorerede ethaner er indtil ca. 7 m.u.t. lavere end i BDTU10, hvorefter koncentrationen stiger til ca. samme niveau. Fra 6-6,8 m.u.t. ses et skift fra at 1,2- cis-dce er dominerede til at TCE bliver dominerende (Figur 5). µmol/kg µmol/kg 7,0 0 200 400 600 7,0 0 100 200 300 400 500 600 Blød ler 7,5 8,0 7,5 8,0 8,5 8,5 Moræneler Smeltevandssand Depth (m.b.s.) 9,0 9,5 10,0 10,5 11,0 PCE TCE cis DCE VC Ethene Depth (m.b.s.) 9,0 9,5 10,0 10,5 11,0 1,1,1 TCA 1,1 DCE 1,1 DCA CA Ethane 11,5 11,5 12,0 12,0 Figur 4: Den molære sammensætning af klorerede ethener og ethaner i BDTU10 fra 7-10 m.u.t. Til venstre ses den geologiske sammensætning af de udtagne kerner. De stiplede kasser illustrerer de udvalgte dybder til yderligere analyser.

6,0 6,1 6,2 µmol/kg 0 500 1000 1500 PCE TCE cis DCE VC Ethene µmol/kg 0 20 40 60 80 6,0 1,1,1 TCA 1,1 DCE 6,1 1,1 DCA CA Ethane 6,2 Depth (m.b.s.) 6,3 6,4 Depth (m.b.s.) 6,3 6,4 6,5 6,5 6,6 6,6 Moræneler 6,7 6,7 6,8 6,8 Figur 5: Den molære sammensætning af klorerede ethener og ethaner fra 6-6,8 m.u.t. Til venstre ses den geologiske sammensætning af kernerne. Skiftet, fra at 1,2-cis-DCE er dominerende til at TCE bliver dominerende, sker hen over to sprækker. Skiftet kan skyldes, at der sker nedbrydning af TCE hen over den øverste sprække og at nedbrydningen aftager med dybden. Da der er flere halorespirerende bakterier, der kan foretage denne nedbrydning, behøver der ikke nødvendigvis at være Dehalococcoides tilstede. FORELØBIGE KONKLUSIONER Undersøgelserne viste at MIP sammen med en felt GC er en god metode til at finde den vertikale fordeling af klorerede opløsningsmidler og deres nedbrydningsprodukter. I de analyserede kerner er der fundet flere områder, hvor, der ud fra resultaterne for de klorerede ethener og ethaner, er indikation på naturlig nedbrydning ved anaerob deklorering i lermatricen. Der er fundet dybder, hvor der er indikation på at 1,1,1-TCA, PCE, TCE og 1,2-cis-DCE nedbrydes. Eftersom der flere steder er målt lave koncentrationer af ethen, forventes det, at der på lokaliteten nogle steder sker fuldstændig nedbrydning af chlorerede ethener. De steder, hvor der forventes at ske naturlig nedbrydning, er overvejende i lermatricen. Det bør dog bemærkes, at disse vurderinger kun er lavet ud fra de målte koncentrationer af klorerede ethener og ethaner, dvs der stadig ikke er noget kendskab til om forholdene i lermatricen (redox forhold og tilstedeværelsen af elektron donor) er gunstige for at nedbrydningen finder sted. VIDERE UNDERSØGELSER For at dokumentere om nedbrydningen finder sted er det stadig nødvendigt at opnå kendskab til redoxforholdene og tilstedeværelsen af elektrondonor i kernerne. En anden metode,

der endvidere forsøges benyttet til dokumentation af nedbrydningen, er at kigge på isotopfraktioneringen af de klorerede ethener og ethaner. I den forbindelse er det en udfordring, om det er muligt at se forskel på nedbrydning og diffusion. TAKSIGELSE Vi vil gerne sige tak til Orbicon for godt samarbejde under planlægningen og udførslen af feltarbejdet. Vi vil også gerne takke gæste PhD-studerende Massimo Marchesi og Cong Lu samt teknikkerne ved DTU Miljø Mona Refstrup og Jens Schaarup Sørensen for deres store indsats under prøvetagningen og analysearbejde. Undersøgelserne er finansieret af det Strategiske Forskningsråd som en del af REMTEC, Innovative REMediation and assessment TEChnologies for contaminated soil and groundwater. N REFERENCER /1/ Damgaard, I., Chambon, J., Christiansen, C. M., Lemming, G., Broholm, M. M., Binning, P. J. og Bjerg, P. L., 2008. Erfaringsopsamling for reduktiv deklorering som afværgeteknologi i moræneler. Delrapport I. Miljøstyrelsen. /2/ Christiansen,C.M., Riis,C., Christensen,S.B., Broholm,M.M., Christensen,A.G., Klint,K.E.S., Wood,J.S.A., Bauer-Gottwein,P. og Bjerg,P.L., 2008. Characterization and quantification of pneumatic fracturing effects at a clay till site. Environmental Science & Technology, 42(2): 570-576. /3/ Damgaard, I., Broholm, M. M., Christiansen, C., Kessler, T., Klint, K. E., Nilsson, B., og Bjerg, P. L., 2009. Sammenligning og dokumentation af hydraulisk frakturering og direkte injektion med GeoProbe på Vadsbyvej, edehusene. DTU Miljø og Region ovedstaden, www.sara.env.dtu.dk. /4/ Bjerg, P. L., Broholm, M. M., Scheutz, C., Weeth, E. B., Jørgensen, T., Jacobsen, C. S., Durant, N., Cox, E., Rasmussen, P., og Christophersen, M., 2007. Challenges in remediation of low permeability sediments by enhanced reductive dechlorination of chlorinated solvents. Proc. 6th International Groundwater Quality Conference held in Fremantle, Western Australia, GQ07: Securing Groundwater Quality in Urban and Industrial Environments. /5/ Jørgensen, T.., Nissen, L., Nielsen, L., Weeth, E. B., Scheutz, C., Broholm, M. M., Bjerg, P. L., Durant, N., Cox, E., Christophersen, M., og Rasmussen, P., 2007. Oprensning af klorerede opløsningsmidler i moræneler med stimuleret reduktiv deklorering - Pilotforsøg - Rugårdsvej 234-238, Odense. Region Syddanmark. /6/ Broholm, M. M., Scheutz, C., Begtrup, E., Bjerg, P. L., Jacobsen, C. S., Jorgensen, T., Nielsen, L. og Rasmussen, P., 2006. Remediation of chlorinated solvents in clay till: Importance of diffusion, in Danish. /7/ Chambon,J.C., Broholm,M.M., Binning,P.J. og Bjerg,P.L., 2010. Modeling multicomponent transport and enhanced anaerobic dechlorination processes in a single fracture-clay matrix system. Journal of Contaminant ydrology, 112(1-4): 77-90. /8/ Bjerg, P. L., ansen, M.., Christiansen, C., Scheutz, C. og Broholm, M. M., 2006. Anaerob deklorering og oprensning af lavpermeable aflejringer. Københavns Amt.

/9/ Tuxen, N., Westergaard, C. og Pedersen, O. F., 2008. Afværgeprogram, Vasbyvej 16 A, Taastrup. Region ovedstaden. /10/ Tuxen, N., Andersen, K. og Pedersen, O. F., 2009. Tillæg til skitseprojekt, Vadsbyvej 16 A, Taastrup. Region ovedstaden. /11/ Kjærsgaard, P. og Tuxen, N., 2007. Vasbyvej 16A - supplerende undersøgelser. Region ovedstaden. /12/ Riis, C., Christensen, A. G., Bjerg, P. L., Christensen, S. B., Broholm, M. M., og Scheutz, C., 2006. Pneumatisk Frakturering - Dokumentation af pilotforsøg, Vadsbyvej 16A, edehusene. Københavns Amt.

OM S ANVENDELSE AF OG ERFARINGER MED NATURLIG NEDBRYDNING Civilingeniør Ernst V.. Lassen, Oliebranchens Miljøpulje Naturlig og stimuleret biologisk nedbrydning - processer og mikrobiologi Møde 21. april 2010 Schæffergården

RESUME Naturlig nedbrydning har haft afgørende betydning på OM s forskellige projekter. Fra gamle benzinsalgssteder, som er ophørt omkring 2. verdenskrig, til moderne servicestationer som først er ophørt i drift i nyere tid. OM udviklede primo 2000 en protokol for nedbrydningen af kulbrinterne i grundvand. Protokollen har, efter indledende skepsis hos myndighederne, med succes været anvendt i forbindelse med grundvandsforureninger og overvågning af samme på en lang række OM sager. Naturlig nedbrydning af kulbrinterne har formentligt haft afgørende indflydelse på, at en meget stor del af de OM tilmeldte benzinsalgssteder har kunnet løses til en ganske rimelig gennemsnitspris. Erfaringsopsamlingen på villaolietanksagerne har vist, at selv helt frisk spild af gasolie gennemsnitligt ikke har udbredt sig mere en 13 m i grundvandets strømningsretning. BAGGRUND For over 10 år siden afholdt ATV et møde tilsvarende dette med titlen Naturlig nedbrydning - en ny oprensningsteknik? her på Schæffergården. Undertegnede var inviteret og holdt et indlæg med titlen Er naturlig nedbrydning et alternativ til andre afværgeteknikker? Ti år er lang tid i vores verden - stor var derfor spændingen, da jeg åbnede filen med indlægge. vad havde jeg skrevet og sagt? Indlæggets kvalitet kan man altid diskutere, men jeg havde besvaret spørgsmålet med et klart og rungende Ja, selvfølgelig. I bakspejlets ulideligt klare lys er jeg rigtig glad for dette svar! I 1998 var Miljøstyrelsens vejledning nr. 6 Oprydning på forurenede lokaliteter kommet på gaden. ATV havde afholdt Naturel Attenuation for Remediation of Contaminated Sites - a Short Course, hvor Todd. Wiedenmeier m.fl., fortalte om tankegangen og erfaringerne fra USA. Konceptuelt drejede det sig om massebalancebetragtninger, hvor det centrale er en vurdering og kvantificering af nedbrydningen på basis af den observerede omsætning af de forskellige redoxparametre (jern, mangan, nitrat, sulfat m.fl.), som indgår i de processer, hvor olie- og benzinstoffer nedbrydes i grundvandet. Weidenmeiers protokol, som den kom til at hedde i folkemunde, havde på daværende tidspunkt fundet udbredt anvendelse på olie- og benzinspild i USA. I virkeligheden var der jo ikke noget særligt nyt i de bagvedliggende principper for nedbrydningen. Det var de samme mekanismer, som man på DTU i forbindelse med Lossepladsprojektet i 1980 erne havde beskrevet i forbindelse med indgående undersøgelser på både Vejen og Grindsted Losseplader i komplekse perkolatfaner. Stærk inspireret af Weidenmeier s arbejde, Lossepladsprojektet fra DTU, og fordi vi i OM fandt, at den nye vejledning fra Miljøstyrelsen med fordel kunne suppleres med en til danske forhold tilpasset metode, udarbejdede vi i 2000/01/02 en dansk OM protokol for naturlig nedbrydning af olie- og benzinforureninger i grundvandet. OM s protokol har siden 2002 dannet udgangspunktet for mange af de projekter, som OM har igangsat, og hvor metoden har været naturlig nedbrydning af olie- og benzinstoffer i grundvandet. Protokollen omfatter ikke MTBE, fordi MTBE s nedbrydningsforhold på daværende tidspunkt ikke var tilbundsgående undersøgt. I de senere år, i takt med beskrivelsen

af MTBE s nedbrydningsforhold, har moniteringsprogrammerne, når det har været nødvendigt, også omfattet MTBE uden, at det har været nødvendigt at ændre de bagvedliggende principper i protokollen. OM S ANVENDELSE AF NATURLIG NEDBRYDNING PÅ OM-I PROJEKTER Lidt overordnet kan man inddele OM s primære projekter (OM I) i 4 grupper efter undersøgelse- og afværgeomkostninger. Dette er gjort i tabel 1 nedenfor. Tabel 1. Inddeling af samtlige OM I - projekter til og med 2009 i omkostningskategorier. Grupper Kategori kr. Antal Stk. Antal % Omkostninger mio. kr. Gennemsnit t. kr. 1 <200.000 7.189 78 376 52 2 <1.000.000 1.611 18 702 436 3 <5.000.000 353 4 616 1.746 4 >5.000.000 12 1 114 9.496 Ialt 9165 100 1.808 197 Gruppe 1. Undersøgelser 78 % af sagerne er afsluttet med undersøgelser og i enkelte tilfælde meget små afværger (f.eks. et tanktjek i Områder med Særlige Drikkevandsinteresser (OSD-områder). Langt den overvejende del af disse sager har været anlæg af DDPA-typen* med manuelt betjente pumper, som var monteret ovenpå tanken. Tankene, som typisk var 2,5 m 3, indeholdt udelukkende benzin. Typen var i anvendelse før og i en rum tid efter 2. verdenskrig, indtil motorpumperne, større tanke og diesel blev introduceret på benzinsalgsstederne. Gennemsnitsprisen på denne type opgaver er i størrelsesordenen 52.000 kr. Med andre ord er langt hovedparten blevet afsluttet efter undersøgelse. Alle, som er stødt på DDPA anlæg, ved, at der var tale om håndværksmæssig kvalitet og det er formentligt ikke forkert at antage, at spild p.g.a. fejl på anlægget har været mindre forekommende end på senere anlægstyper. Selvfølgeligt er der blevet spildt på denne type anlæg, der i reglen lå på ubefæstet areal, fordi tilladelsen til salg af benzin p.g.a. brand- og eksplosionsfare var betinget af, at benzinspild kunne vaskes ned i jorden. Naturlig nedbrydning af benzinspild har helt givet været en afgørende faktor for, at 78 % sagerne som hovedregel har kunnet lukkes efter undersøgelser, der har vist, at grunden var forureningsfri. * DDPA Det Dansk Petroleums Aktieselskab men her brugt som en beskrivelse af pumpe- og tanktypen.

Gruppe 2. Undersøgelser, risikovurderinger og mindre afværger Den næststørste gruppe sager (18 %) er blevet gennemført til en gennemsnitspris på 436.000,- kr. Denne type anlæg er for hovedpartens vedkommende anlæg med motorpumper, flere tanke med flere produkttyper, olieudskillere og andre punktkilder. Der er stor variation i hvilke type anlæg, der er tale om her, men man kan forestille sig et mindre benzinsalgsanlæg/tankstation bygget i 1950- eller 1960 erne De primære årsager til de større udgifter på denne type sager er flere. Først og fremmest er der blevet konstateret forurening i flere hot-spots, tankgrave, olieudskillere standerøer mm. Ofte også i mindre udstrækning i sekundære magasiner og/eller mindre ikke udbredte magasiner. OM har pr. kulance indvilliget i at grave tanke og underjordiske installationer op, også selvom en risikovurdering måske ikke begrundede det. Årsagen var, at ejendommen var beliggende i et OSD-område. Der er ikke konstateret forurening i det primære magasin. På denne type anlæg har fjernelse af hot-spot i umættet zone betydet, at den naturlige nedbrydning af vandforureningen i de sekundære magasiner er blevet kraftigt fremmet, p.g.a. iltningen mm., efter de underjordiske installationer er blevet erstattet af ny indbygget grus. Fænomenet er næsten uden undtagelse altid blevet påvist i filtersatte boringer ved monitering efter den egentlige afværge, hvor hot-spot er blevet fjernet. Gruppe 3. Store undersøgelser og afværger med efterfølgende monitering Gruppe 3, som udgør 4 % af OM s projekter, udgør en kompleks blanding af sager. Der kan være tale om store graveprojekter, in-situ projekter, grundvandsmoniterings projekter i dybtliggende magasiner og eller en kombination af dem alle. Man kan typisk forestille sig en stor tankstation fra 1960 erne og senere med mange store tanke og andre underjordiske installationer. Efter afværgen i umættet zone, står man i nogle tilfælde tilbage med en mindre restforurening i umættet zone, som det af geotekniske årsager ikke har været muligt at fjerne. Der er ligeledes en udbredt forurening i mættet zone (de sekundære magasiner). Måske er de primære magasiner ligeledes kontaminerede. Effekten af hot-spot fjernelse vil selvfølgelig have en gunstig effekt på forureningen i mættet zone. Effekten af den restforurening, man af praktiske årsager måtte efterlade, kan dog ikke vurderes. I denne situation kan det være nødvendigt med et set up efter OM s protokol, hvor restforureningen i mættet zone skal moniteres, således, at det tidsmæssige perspektiv kan blive belyst. Dette gøres ved monitering af kulbrinterne og de redoxparametre, som indgår i nedbrydningen af kulbrinterne. erved får man mulighed for at udtale sig om fanens stabilitet altså om den udvider sig, eller, som det næsten altid er tilfældet, når man har fjernet hot-spot, at den skrumper. Gruppe 4. Mega-sager 1 af OM s sager, nærmere bestemt 12 sager, har kostet over 5 mio. kr. Gennemsnitsprisen er jf. tabel 1. i størrelsesordenen 9,5 mio. kr. Der er tale om helt ekstraordinære sager på store anlæg. Det ekstraordinære kan være helt specielle forureningshændelser eller langvarige driftsperioder med defekte underjordiske installationer. Et eksempel kunne være en trykprøvning af en tank med produkt ved fire gange det tryk, som tanken var projekteret til.

ændelsen forårsagede et spild på 20 m 3 benzin på én gang. Ejendommen var i forvejen ganske forurenet med både benzin og diesel. Andre sager er kommet op i det røde område p.g.a. uforholdsmæssigt meget forurenet jord, som måtte køres væk fra ejendommene. Selvom vi fra diverse undersøgelser ved, at der sker en biologisk omsætning i umættet zone, er den meget langsommere, end den vi ser i mættet zone. Dette har ofte betydet, at meget store mængder jord skulle køres væk. Rekorden på en OM sag er 15.500 tons jord. Sådan en sag bliver i sagens natur, alene i jordrensning, meget dyr. På alle mega-sagerne har der været et efterspil på grundvandssiden, som regel i større målestok end på de store sager. vis forureningshændelsen skyldes et spild, som har stået på gennem længere tid, vil udbredelsen være større end ellers. På mega-sagerne har vi i enkelte tilfælde været ude for fanelængder i sekundære magasiner på i størrelsesordenen 100 m. MTBE er i regelen det stof, der har bevæget sig længst, mens de klassiske kulbrinter har udbredt sig i noget mindre målestok. OM S ANVENDELSE AF NATURLIG NEDBRYDNING PÅ OM-II PROJEKTER For sammenligningens skyld er nedenstående tabel 2 lavet. Tabellen omfatter de såkaldte OM-II projekter (261 stk.). Der er tale om nyere tankstationer, som blev tilmeldt af oliebranchen, og som var eller kunne have været i drift op frem 2005. Altså en anden, mindre og nyere population af sager med gennemsnitligt flere potentielle forureningskilder. Tabel 2. Inddeling af samtlige OM II - projekter til og med 2009 i omkostningskategorier. Grupper Kategori kr. Antal Stk. Antal % Omkostninger mio. kr. Gennemsnit t. kr. 1 <200.000 21 8 2,2 103 2 <1.000.000 169 65 89,2 528 3 <5.000.000 68 26 118,8 1,747 4 >5.000.000 3 1 20,4 6.783 Ialt 261 100 230,5 883 En statistiker vil sikkert slå syv kors foran sig, hvis man sammenligner to så forskellige talmæssige populationer. Jeg vover alligevel det ene øje og påstår, at naturlig nedbrydning og tiden har givet en hjælpende hånd til den markant lavere gennemsnitspris på OM-I sagerne. Det er indlysende, at de to populationer, udover antallet, også på andre måder er forskellige. vor OM-I indeholder et stort antal benzinsalgsanlæg, indeholder OM-II næsten udelukkende, hvad man kan betegne som benzinstationer. Gennemsnitsprisen er, målt som et samlet hele, markant højere. Der ses også en klar forskydning væk fra det store antal små projekter til langt flere projekter i middelkategorien. Alene at tilskrive dette Naturlig nedbrydning ville nok være temmelig tendentiøst, men over-

ordnet betragtet er det nok ikke urimeligt at antage, at naturlig nedbrydning har haft en afgørende finger med i spillet i henseende til den lavere gennemsnitspris for OM-I sagerne. ERFARINGSOPSAMLING PÅ UDBREDELSE AF FORURENINGSFANER I GRUNDVAND PÅ VILLATANKSAGER I forbindelse med forsikringsordningen for villatanksager er naturlig nedbrydning også blevet anvendt i forbindelse med opfølgningen på forsikringsordningen og evalueringen af ordningen. Parallelt med udarbejdelsen af vejledning fra Miljøstyrelsen nr. 2 fra 2009 Undersøgelser og oprensning af forureninger fra villaolietanke blev der sideløbende iværksat 2 erfaringsopsamlinger: 1. Erfaringsopsamling på poreluftkoncentrationer på villatanksager (Miljøprojekt 1310, 2009), og 2. Erfaringsopsamling på udbredelse af forureningsfaner i grundvand på villatanksager. (Miljøprojekt 1309, 2009) De to projekter er finansieret af Miljøstyrelsens teknologiudviklingsprogram for jord- og grundvandsforureninger og Oliebranchens Miljøpulje. Fyringsgasolie har de samme fysisk kemiske egenskaber som dieselolie. OM s protokol for naturlig nedbrydning har primært fundet anvendelse benzin- og MTBE forureninger og kun sjældent på gasolieforureninger, fordi disse kun sjældent har været et problem. Selvom opsamlingen vedrørende poreluftkoncentrationer også peger på, at naturlig nedbrydning og afdampning spiller en betydende rolle i forbindelse med de reducerede poreluftkoncentrationer, relativt hurtigt efter spild af fyringsolie, lægges fokus i dette indlæg på den sidste af de to nemlig forureningsfaner i grundvand på villatanksager. Erfaringsopsamlingen bygger på data fra 14 af de største og mest veldokumenterede sager. Sagerne er fremkommet ved en screening af 1436 i OM s database for villatanksager. Erfaringsopsamlingen har bl.a. vist: Den typiske forureningsfane i grundvandet (indhold>9µg/l) er 13 meter. Den maksimalt konstaterede fane er 48 m De længste faner ses typisk i starten af forureningshændelsen og efterfølgende stabiliseres/reduceres fanelængden væsentligt over tid Sammenligningen mellem de opmålte fanelængder og de tilsvarende faner beregnet v.h.a. JAGG viser, at risikovurdering overestimere udbredelsen af forureningen. Observationen gælder BTEX erne såvel som totalindholdet af kulbrinter. Resultatet indikerer, at fysiske- såvel som biologiske processer har stor indflydelse på fanelængden.

Erfaringsopsamlingen har udover en hel række parametre også set på redoxforhold på de undersøgte sager - i den forbindelse er nedenstående figur 1 fremkommet. Figuren viser, at der er betydelig biologisk aktivitet i fanen (indhold>9µg/). Iltkoncentrationen er reduceret med 75 %, mens nitrat og sulfatkoncentrationerne er reduceret med 50 % i fanerne. Fig. 1 Relativ middelværdi og standardafvigelse for normerede koncentrationer af ilt, nitrat og sulfat, opstrøms, i og nedenstrømsfanen. KONKLUSION Som det kan læses af ovenstående, har naturlig nedbrydning af kulbrinterne direkte og indirekte haft afgørende indflydelse på OM s opgave(r). Naturlig nedbrydning har på den ene eller anden måde haft betydende indflydelse på, at 78% af OM sager har kunnet løses til en gennemsnitspris på i størrelsesordenen kr. 52.000. Langt hovedparten af disse sager er gamle sager på mindre DDPA anlæg, hvor benzinsalget er lukket omkring 2. verdenskrig. Undersøgelser har vist, at en evt. forurening ikke har kunnet genfindes. I en mere direkte sammenhæng har OM s protokol for naturlig nedbrydning i grundvandet været anvendt med succes, efter afværge overfor hot-spot forurening, til at eftervise, at evt. kulbrintefaner i terrænnære magasiner er stabile eller skrumpende. Endelig har erfaringsopsamlingen på villatanksagerne vist, at naturlig nedbrydning har en afgørende indflydelse på, at selv frisk fyringsoliespild kun har en meget lokal udbredelse.

BESTEMMELSE AF AKTIVITETEN AF SPECIFIKKE MIKROBIELLE PENOXYSYRE-PESTICID NEDBRYDERE Projektforsker Jacob Bælum, GEUS Adjunkt Mette aubjerg Nicolaisen, Det Biovidenskabelige Fakultet, KU-LIFE Professor Jan Sørensen, Det Biovidenskabelige Fakultet, KU-LIFE Professor Carsten Suhr Jacobsen, GEUS, og Det Biovidenskabelige Fakultet KU-LIFE Naturlig og stimuleret biologisk nedbrydning - processer og mikrobiologi Møde 21. april 2010 Schæffergården

RESUME Vi har gennemført et studie hvor vi har undersøgt sammenhængen mellem udtrykkelsen af det funktionelle gen tfda, der er involveret i det første nedbrydningsstep af phenoxysyre herbiciderne 2,4-D og MCPA. Genudtrykkelsen blev målt over tid i et mikrokosmos studie med naturlig jord tilsat de to herbicider i en koncentration på 20 mg/kg jord. Mineraliseringen af de to herbicider fulgte vi ved hjælp af radiorespirometri. Vi fandt at der var god sammenhæng mellem mineraliseringsraten og indholdet af tfda mrna, hvilket indikerer at mrna fra specifikke funktionelle gener må betegnes som ideelle biomarkører for påvisning af igangværende mikrobielle processer i miljøprøver. INTRODUKTION Direkte måling af specifik aktivitet af mikroorganismer har i mange år været en udfordring for forskerne. En del metoder, såsom CO 2 målinger og radioaktiv thymidin inkorporering, har været brugt som indirekte mål for den overordnede mikrobielle aktivitet, men en biomarkør der kan afsløre om en specifik mikroorganisme i et større samfund er aktiv på et givent tidspunkt, har været mere problematisk at udvikle (1). Inden for de sidste par år har der været stor fokus på at udnytte messengerrna (mrna) som biomarkør for netop specifikke mikrobielle processer (2, 3). mrna er et molekyle der dannes hver gang en organisme udfører en proces og er derfor ideelt til dette formål. Der er dog visse praktiske problemer ved at arbejde med mrna, som jeg vil vende tilbage til efter en kort introduktion til hvad mrna i det hele taget er. En celles genom består af DNA og er den samlede betegnelse for alle de gener cellen bærer rundt på. En celles genom kan betragtes som dens værktøjskasse, hvori de enkelte gener fungerer som et udtryk for hvilke processer cellen potentielt kan udføre. Når cellen føler trang til at udføre en proces, det kunne være produktion af et enzym der kan nedbryde et fremmedstof, hiver den det relevante gen op ad værktøjskassen, aflæser koden i DNA et og udfra den dannes en kopi i form af mrna (Fig. 1). Når mrna et er blevet dannet, og der dannes typisk mange fra det samme gen, bliver det ført over cellemembranen fra cellens kerne til cytoplasmaet, hvor ribosomerne opfanger mrna, aflæser koden i molekylet og danner et protein eller et enzym. Fig. 1: Simplificeret skitse over mekanismen for udtrykkelse af et gen i en celle. Efterfølgende løsriver mrna sig igen og kan potentielt genbruges af ribosomet igen og være skabelon for dannelsen af endnu et protein eller enzym. Denne mekanisme kan både være

en fordel og en ulempe for cellen, for på den ene side behøver den ikke danne så mange mrna for at få dannet tilstrækkeligt protein eller enzym, men på den anden side er der så også en god chance for at få dannet for meget, hvilket ikke er en god forretning for cellen. Derfor findes der altid et højt niveau af RNaser i cytoplasmaet, hvilket gør nedbrydningen af mrna går meget hurtigt. Det er ikke unormalt at se halveringstider på under et minut. Denne hurtige nedbrydning gør så også, at mrna generelt er et meget ustabilt molekyle at arbejde med, hvilket er grunden til at det først er inden for de sidste par år man har haft held med at ekstrahere mrna fra miljøprøver og lave analyser på det (4). I dette studie har vi undersøgt niveauet af mrna der er dannet ud fra det funktionelle gen tfda, under nedbrydningen af phenoxysyre herbiciderne 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4- D) og 4-chloro-2-methylphenoxyacetic acid (MCPA) i jord. tfda genet koder for dannelsen af et enzym der katalyserer det første nedbrydningsstep af 2,4-D og MCPA (Fig. 2)(5). Nedbrydningen foregår typisk i specifikke bakterier som har et helt sæt af gener man ved er involveret i nedbrydningen. Niveauet af tfda mrna under forskellige stadier af nedbrydningen ønsker vi at bruge til at undersøge om man kan korrelere niveauet af specifikt mrna i den enkelte celle til raten hvormed substratet (i dette tilfælde 2,4-D og MCPA) forsvinder. C 2 COO O Me α-kg Succinate O 2 CO 2 O Me Fig. 2: Første nedbrydningsstep af MCPA hvor ether bindingen brydes og en phenol dannes. Enzymet TfdA katalyserer denne reaction. TfdA Fe 2+ MCPA MCP MATERIALER OG METODER Forsøgsopstilling Forsøget blev udført som batch forsøg, hvor 20 g jord (Sjællans Odde, DK) blev anbragt i en lufttæt glasflaske. 20 mg/kg jord af de to respektive stoffer (2,4-D og MCPA) blev tilsat, og jordens vandindhold indstillet til 80 % af vandholdningskapaciteten. En lille del af det tilsatte 2,4-D og MCPA var 14 C-mærket i ringstrukturen. og inden i flasken blev en NaO fælde til opsamling af 14 CO 2 placeret. Igennem en periode på ~25 dage for 2,4-D forsøget og 35 dage for MCPA forsøget blev NaO fælden udskiftet og talt på scintilationstæller med passende mellemrum. Endvidere blev der taget 0,5 g jordprøver ud til senere ekstraktion af nuklein syrer. Efter de ~25 dage for 2,4-D forsøget og 35 dage for MCPA forsøget tilsatte vi endnu en portion af det respektive herbicid, og nedbrydningen blev fulgt endnu engang ved udskiftning af NaO fælderne og udtag af jordprøver til ekstraktion af nuklein syrer. Ekstraktion af nuklein syrer De 0,5 g jordprøver der blev taget ud fra flaskerne blev straks frosset i flydende kvælstof for at sikre en hurtig indfrysning og en tilstrækkeligt lav temperatur til, at alt mikrobiel aktivitet var

ophørt. Den efterfølgende ekstraktion af nuklein syrer blev udført med en metode, der tidligere er beskrevet (Nicolaisen et al., Bælum et al.). Kvantitativ real time PCR Efter omdannelse af mrna til det komplementære DNA (cdna) blev der kørt kvantitativ real time PCR med tfda genet som mål. Denne metode er også beskrevet andetsteds (Bælum et al., Bælum et al.). Databehandling Mineralisering af 2,4-D og MCPA blev fittet til de to 3/2-ordens modeller, der er udviklet af Brunner og Focht (1984), der tager højde for henholdsvis vækst og ikke vækst af microorganismer under nedbrydningsprocessen. Endvidere blev forholdet mellem tfda mrna/tfda gener plottet imod raten for mineraliseringen. Mineraliseringsraten fandt vi ved at differentiere det 3/2 ordens udtryk, der bedst beskrev mineraliseringen.

Fig.3: 2,4-D/MCPA mineralisering, tfda gen udtrykkelse, og tfda gen kvantificering. Kumulative mineraliseringsdata for 2,4-D og MCPA er vist i a og e, respektivt. I b og f er antallet af tfda mrna vist hen over perioden for 2,4-D og MCPA mineraliseringen, i c og g er antallet af tfda gener vist og i d og h er forholdet mellem tfda mrna og tfda DNA vist.

Resultater Mineralisering af 2,4-D og MCPA blev målt som frigivet 14 CO 2 over tid. Mineraliseringen af 2,4-D gik lidt hurtigere end MCPA (Fig. 3a+3e). Vi observerede 60% mineralisering af 2,4-D indenfor 20 dage, mens der gik omkring 25 dage for MCPA. Mineraliseringforløbet for begge stoffer var tydeligt sigmoidt for den første tilsætning af herbicid, men for den anden tilsætning forløbet var mere relateret til 1.-ordens kinetik. Et sigmoidt kurveforløb ses typisk i systemer, hvor vækst af mikroorganismer er involveret, i modsætning til 1.-ordens kinetik hvor vækst typisk ikke er involveret. Denne teori blev da også bekræftet ved fitning af data til vores to modeller, hvor første tilsætning klart fittede bedst til modellen, der tog højde for eksponentiel vækst, mens anden tilførelse af herbicid fittede bedst til modellen, der ikke tog højde for vækst. Kvantificering af tfda mrna molekyler blev udført på passende tidspunkter igennem hele mineraliseringsprocessen (Fig. 3b+3f). Det var helt tydeligt, at der, når mineralisering gik hurtigst, var det højeste indhold af mrna, mens der ret hurtigt efter nedsat mineraliseringsrate blev observeret mindre mængde mrna. Det maksimale antal mrna, vi detekterede, var 2 10 4 og 1 10 5 mrna g -1 jord for hver af de to tilsætninger af 2,4-D, mens for MCPA det var 1 10 5 og 2,5 10 5 mrna g -1 jord, altså en lille smule højere for MCPA end for 2,4-D. Fig. 4: Forholdet mellem mineraliseringsraten og jordens indhold af tfda mrna er vist i a og c, mens forholdet mellem mineraliseringsraten og jordens indhold af tfda gener er vist i b og d.

Antallet af genkopier (baseret på cellernes DNA) i jordprøverne blev også kvantificeret, og det var tydeligt, at vækst af organismer med tfda genet forekom under mineraliseringen af 2,4-D og MCPA. Det er værd at notere sig, at vækstraten var klart højere under den første tilsætning af herbicid sammenlignet med den anden. Under mineraliseringen af den første tilsætning så vi en ~1000 forøgelse af antallet af genkopier i forhold til anden tilsætning, hvor der kun var en ~3-4 forøgelse. Denne information kan bruges til at forklare de to mineraliseringskinetikker, hvor den første fittede bedst til en model, der inkluderer eksponentiel vækst, mens anden tilsætning fittede bedst til en model, der ikke eller kun i ringe grad inkluderer vækst. Endvidere var det tydeligt, at indholdet af DNA ikke på samme måde som mrna forsvandt, når mineraliseringsraten gik ned. Ved at finde forholdet mellem tfda mrna og tfda DNA får man et mere realistisk billede af genudtrykkelsen i den enkelte celle. På disse grafer (Fig. 3d+3h) ser man da også at når man ser bort fra væksten i tfda gener, har man lige stor udtrykkelse af gener for de to tilsætninger. Endvidere er det tydeligt at se opreguleringen af genudtrykkelsen samtidig med forøgelsen i mineraliseringsraten, både ved første og anden tilsætning af herbicid. Den maksimale genudtrykkelse kommer op på ca. 0,03 mrna molekyler pr. tfda gen. En forholdsvis tydelig korrelation fremkom ved at plotte antallet af tfda mrna overfor mineraliseringsraten (Fig. 4a+4c), mens der ingen korrelation var imellem tfda DNA og mineraliseringsraten (Fig. 4b+4d). DISKUSSION I dette studie har vi undersøgt muligheden for at bruge mrna fra det funktionelle gen tfda, der er centralt under nedbrydningen af phenoxysyre herbiciderne 2,4-D og MCPA, som biomarkør for en aktivt forløbende proces. Det er klart, at vi i dette studie ligeledes bruger radiorespirometri til at påvise en igangværende mineraliseringsproces, men det er ikke alle stoffer man har adgang til radioaktivt mærket, og endvidere er det ikke muligt at bruge denne teknik til påvisning af aktivitet i felten. Resultaterne, der er beskrevet ovenfor, viser, at det er muligt at studere en specifik mikrobiel proces ud fra ekstraheret mrna. Vi fandt en relativt god sammenhæng mellem mineraliseringsraten og tilstedeværelsen af mrna. Grunden til at denne korrelation ikke fremstår helt perfekt, er, at reguleringen af genudtrykkelsen sjældent er så simpel, at den blot følger raten. Genudtrykkelsen vil ideelt set aftage et stykke tid, før raten går ned, fordi cellen føler, at koncentrationen af stof er på vej ned, og der derfor snart ikke er brug for mere enzym. Det enzym, cellen allerede indeholder, vil dog stadig kunne udføre processen, og derfor kan man godt have en relativt høj mineraliseringsrate hen imod slutningen af processen uden at finde det store indhold af mrna. Der er ingen tvivl om, at mrna baseret detektion har en stor fremtid indenfor mikrobiel økologi og indenfor påvisning af aktive processer in-situ. Der er stor interesse fra den kommercielle verden for at få adgang til analyser for påvisning af aktive processer, f.eks i forbindelse med forureningssager, hvor man ønsker svar på, om en mikrobiel medieret nedbrydning er i gang. Men også inden for påvisning af ændringer i funktionaliteten af mikrobielle samfund ligger der et potentiale for anvendelse af mrna baserede analyser. Det vil være muligt at bruge udtrykkelsen af gener, der er centrale for vigtige processer i f.eks en jord, til at bestemme påvirkningen af det mikrobielle miljø fra et pesticid. Derved vil man kunne få et hurtigt svar på, hvor meget pesticid man vil kunne udbringe uden at forstyrre jordens generelle omsætning. Det er klart, at teknikken til brugen af mrna som biomarkør er i sin spæde opstart, og at der kræves en del arbejde, før vi kan bruge den til problemstillinger som vurde-

ring af sundheden af mikrobielle miljøer, men studier, som det der er beskrevet heri, er helt klart en påvisning af, at det er muligt, og at det blot er et spørgsmål om tid, før disse analyser er implementeret. KONKLUSION I det nærværende arbejde har vi påvist, at det er muligt at ekstrahere mrna fra en naturlig jordprøve og bruge det som biomarkør for at nedbrydning af stofferne 2,4-D og MCPA foregår. Vi fandt en god sammenhæng mellem den kvantitative tilstedeværelse af tfda mrna og mineraliseringsraten for 2,4-D og MCPA. REFERENCE LIST 1. Saleh-Lakha, S., M. Miller, R. G. Campbell, K. Schneider, P. Elahimanesh, M. M. art, and J. T. Trevors. 2005. Microbial gene expression in soil: methods, applications and challenges. J. Microbiol. Meth. 63:1-19. 2. Bælum, J., M.. Nicolaisen, W. E. olben, B. W. Strobel, J. Sorensen, and C. S. Jacobsen. 2008. Direct analysis of tfda gene expression by indigenous bacteria in phenoxy acid amended agricultural soil. ISME J. 2:677-687. 3. Nicolaisen, M.., J. Baelum, C. S. Jacobsen, and J. Sorensen. 2008. Transcription dynamics of the functional tfda gene during MCPA herbicide degradation by Cupriavidus necator AEO106 (pro101) in agricultural soil. Environ. Microbiol. 10:571-579. 4. Andersson, A. F., M. Lundgren, S. Eriksson, M. Rosenlund, R. Bernander, and P. Nilsson. 2006. Global analysis of mrna stability in the archaeon Sulfolobus. Genome Biology 7. 5. Fukumori, F. and R. P. ausinger. 1993. Purification and characterization of 2,4- dichlorophenoxyacetate α-ketoglutarate dioxygenase. J. Biol. Chem. 268:24311-24317.

MIKROBIEL DECLORERING AF TCE - MOLEKYLÆRE TEKNIKKER TIL BESTEMMELSE AF TILSTEDEVÆRELSE OG AKTIVITET AF SPECIFIKKE NEDBRYDERE Professor Carsten Suhr Jacobsen, GEUS Projektforsker Jacob Bælum, GEUS Lektor Charlotte Scheutz, DTU Miljø Lektor Mette Broholm, DTU Miljø Naturlig og stimuleret biologisk nedbrydning - processer og mikrobiologi Møde 21. april 2010 Schæffergården

BAGGRUND Klorerede opløsningsmidler udgør en markant trussel for grundvandet i mange områder i Danmark. En af de mulige løsninger på problemet er biologisk oprensning, der baseres på visse bakteriers evne til at trække vejret på klor den såkaldte halorespiration. Denne proces vil normalt kunne etableres i en forurenet grundvandsakvifer ved at tilføre så store mængder af letnedbrydeligt kulstof, så ilten og nitraten opbruges af andre bakterier, og derefter er det blandt andet halorespirerende bakterier, der tager over og vokser på kulstoffet, samtidig med at kloren bliver fjernet fra stoffer som TCE og PCE. Forskellige stoffer kan dannes som slut- og mellemprodukter, og det er klart, at dannelse af det meget toksiske vinykklorid (VC) er en uheldig situation (se figur1). Det er ikke alle de halorespirerende bakterier, der kan foretage alle processer, og mange af disse kommer ikke videre end til dannelse af stoffet cis-dce og andre er ikke i stand til at fjerne det sidste kloratom, så VC ophobes. 1,1-DCE 2 2 2 2 PCE TCE cis -DCE VC vcra, bvca ethene FIGUR 1 trans-dce Figur 1 Nedbrydningen af TCE/PCE over cisdce til VC og endelig til ethen. De funktionelle gener for nedbrydning fra VC til ethene er angivet til vcra og bvca. Forskellige firmaer sælger blandingskulturer af bakterier, der er vist at kunne foretage en fuldstændig nedbrydning af PCE/TCE til ethen et eksempel er kulturen KB1 fra det Canadiske firma SIREM, der har været anvendt i forskellige danske feltskalaforsøg. Et andet eksempel er ollandske Bioear, der sælger et lignende produkt. Før beslutning om det er nødvendigt at tilsætte bakteriekultur samt under et forsøg med reduktiv deklorering (med eller uden tilsat bakteriekultur) kan man ønske at kende antallet af specifikke bakterier, der er i stand til at foretage halorespirering. Når en behandling af en grundvandsakvifer er igangsat er det endvidere vigtigt at vide om bakterierne laver noget udfører de processen så problemstofferne forsvinder? Problemet i en naturlig forurening er, at stofferne måske nedbrydes, men fordi grundvandet også bevæger sig - eller fordi stofferne konstant frigøres - kan man ikke med sikkerhed se det på kemiske data.

Både SIREM og Bioear tilbyder analyser for disse specifikke bakterier. Da der kan være oplagte grunde til ikke at få udført analyser for tilstedeværelse af deklorerende bakterier af de firmaer, der samtidig tilbyder at sælge egnede bakteriekulturer, besluttede GEUS for nogle år siden at tilbyde interesserede kunder at udføre disse analyser på kommerciel basis. Det er ikke GEUS mission at drive analyselaboratorium for mikrobiologiske og miljøkemiske målinger, men da der stadig ikke findes kommercielle akkrediterede laboratorier, der tilbyder analyserne, gør vi det stadigt. BESTEMMELSE AF ANTALLET AF DEKLORERENDE BAKTERIER I FORURENEDE AKVIFERER En bakteriegruppe, som oftest findes på lokaliteter, hvor der sker halorespiration, er Dehalococcoides sp. (endrickson et al. 2002). Denne gruppe af bakterier har det til fælles, at de er kokker (runde bakterier), og at de er i stand til at fjerne halogener. En anden ting, der desværre er velkendt for denne gruppe af bakterier, er, at de er vanskelige at dyrke i laboratoriet, med meget lange inkuberingstider til følge. Det har derfor været meget oplagt at udvikle direkte DNA baserede teknikker til tælling af disse bakterier i grundvands- eller sedimentprøver. Dette sker med udgangspunkt i den meget konserverede gensekvens der findes næsten ens i alle bakterier, og som sikrer, at bakterien kan danne ribosomer nemlig 16SrRNA generne (se figur 2). I figuren kan man se, at generne nogle steder sidder sammen og andre steder buler ud. Der, hvor generne sidder sammen, er sekvenserne meget konserverede og findes i alle bakterier, mens generne i områderne, hvor de buler ud, kan variere/mutere, uden at det betyder noget for dannelsen af ribosomerne. Ved at kigge på de variable regioner har man efterhånden fundet ud af, hvilke DNA sekvenser, der er specifikke for Dehalococcoides sp., samt hvilke der er specifikke for andre anaerobe bakterier, der kan være vigtige i anaerobe sedimenter, f. eks. Dehalobacter sp. (Grostern and Edwards 2006). 16S rrna genet kan bruges til at bestemme både de specifikke bakterier (her Dehallococcoides sp. og Dehalobacter sp.) men også det totale antal af bakterier. Fordelen ved at kvantificere det totale antal bakterier sammen med de specifikke bakterier ved Real-Time PCR er, at det også er den teknik, der bruges til de specifikke bakterier. Man kan også simpelt måle den totale mængde DNA ekstraheret og antage, at alt DNA stammer fra bakterier.

Figur 2 En tegning af16srrna genet der er målet for både total bakterie tællinger, samt tællinger af Dehalococcoides sp. samt Dehalobacter sp. Vi kan sammenfatte de typer af DNA baserede analyser, som normalt tilbydes, i nedenstående tabel: Tabel 1. Typer af DNA baserede PCR analyser af relevans i forbindelse med projekter med reduktiv deklorering ANALYSE (kort) target reference Dehalococcoides sp. Dhc 16S-baseret endrickson et al. (2002) Dehalobacter sp Dhb 16S-baseret Grostern & Edwards (2006) Total bakterier Tot16S 16S baseret Vinylklorid reductase vcra Funktionelt gen olmes et al. (2006) Vinylklorid reduktase bvca Funktionelt gen olmes et al. (2006) vad skal man så måle efter 16S gener eller funktionelle gener? Ideen med at måle for vinylklorid reduktase er, at man så sikre sig, at der findes bakterier med et potentiel for at foretage det sidste trin af dekloreringen. erved undgås teoretisk en ophobning af vinylklorid i akviferen. I praksis følges Dhc målinger og vcra målinger oftest hinanden.

En test af renheden af det DNA, der analyseres på, er en god ide. vis DNA et ikke er rent, kan det betyde, at PCR-polymerasen ikke fungerer optimalt med skæve målinger til følge. Mange stoffer kan co-oprenses med DNA fra miljøprøver. Selv om det mest forventes at være udbredt i humus rige jorde, er det vist, at også prøver fra et dybtliggende lag kan indeholde forureningskomponenter, der kan føre til falske negative prøver (Lindberg et al 2007). DNA ekstraktion fra især lerede underjorde eller partikel indeholdende grundvand kræver ofte, at prøven behandles med en forbindelse, der coater bindingssteder for de phosphorrige molekyler, som DNA (eller RNA) udgøres af. På GEUS har vi oplevet, at brug af en specifik agens til at coate disse reaktive jordpartikler før DNA ekstraktion betød en næsten 10.000 ganges stigning i kvantificeringen af Dhc gener. Med andre ord - der kan være en del forskelle på, hvordan laboratorierne udfører analyserne, så det må anbefales, at der arbejdes for en samlet forbedring af protokoller. VIS DE ER DER, FINDER DU DEM MED DNA TEKNIK, MEN DET ER IKKE SIKKERT, AT DE LAVER NOGET. Ligesom der er masser af eksempler på bakterier i overjord, der kan trække vejret både med brug af ilt og med brug af nitrat (f.eks. Pseudomonas fluorescens), kan man forestille sig, at der blandt de bakterier, der findes i grundvandssedimenter forurenet med klorerede opløsningsmidler, findes nogle, der har muligheden for at trække vejret på flere forskellige måder (Lee et al 2009) hvis man f.eks. har pumpet et stort inoculum af KB1 ned i grundvandssedimentet, og der stadig kan findes nitrat vil man sagtens kunne finde masser af vcra og bvca gener, uden at der sker nogen deklorering genernes DNA er simpelthen ikke omsat til enzymer endnu fordi det ikke kan betale sig for bakteriesamfundet bredt set at anvende halorespiration. Det er blandt andet derfor, at det er normalt, at man ikke kun måler for antallet af gener i prøven men også måler for, om ændringerne kan ses i klorerede forbindelser samt nedbrydningsprodukter. Dette er dog en meget vanskelig proces i felten hvor man ikke har mulighed for at skærme måleområdet af. Typisk vil forurenet grundvand kunne sive ind i et ellers renset område og dermed sløre, hvor godt det går med den reduktive deklorering. MÅLING AF AKTIVITET AF VINYLKLORID REDUKTASE DIREKTE På GEUS har vi nogle år arbejdet med at kombinere den mere kvalitative beskrivelse af genekspression direkte i jord (Jacobsen & olben 2007) med universelle og robuste kvantitative metoder til at måle aktivitet af funktionelle gener i jord (Bælum et al 2008). Ved at forsøge at kvantificerer direkte på mrna af funktionelle gener ønsker man at fastholde et øjebliksbilledet af det mrna, der var i en vandprøve i det øjeblik den er pumpet op. I praksis har det betydet at vi har medbragt vacuum til filtrering af vandprøver og flydende kvælstof i felten for at kunne hurtigfryse filteret. I de seneste resultater i projektet REMTEC har vi vist, at det er muligt at måle et højt niveau af transkripter af de funktionelle gener vcra og bvca samtidig med, at der sker nedbrydning af vinylklorid. Dette støtter de ellers ret få undersøgelser, der har brugt denne approach (Lee et al 2006) til at vise, at den deklorerende proces løber.

µmol bottle -1 30 25 20 15 10 5 0 1e+6 Bottle 25-27 mrna vs DNA cis-dce VC Ethene vcra genes vcra genes ml -1 1e+5 vcra mrna/vcra genes 1e+4 10 1 0,1 vcra mrna vs. vcra genes Figur 3. Data 0,01 fra batchforsøg med tæt prøvetagning for DNA og mrna kvantificering. Bemærk at dannelse og bortskaffelse af 0vinylklorid 100 200 (øverste 300 figur) 400 sker 500samtidigt 600 med at vinylklorid reduktase generne når deres maksimale aktivitet. Time, days I flere uafhængige forsøg ser det ud til, at de halorespirerende bakterier udtrykker mange kopier af vcra generne, når de er aktive. Dette er en fordel, da mange kopier gør detektionen mere følsom. Det ser ud til, at disse foreløbige resultater tegner så lovende, at vi i løbet af kort tid vil kunne tilbyde mrna kvantificering på kommerciel basis. KONKLUSION Der er en række muligheder for at lave gode og meningsfulde kvantitative målinger af deklorerende bakterier i miljøprøver. Det er muligt at måle aktivitet af vinylklorid reduktase gener ved at ekstrahere og kvantificere mrna direkte fra jord- og vandprøver.

REFERENCER Bælum, J., Nicolaisen, M.., olben, W.E., Strobel, B.W., Sørensen, J. and Jacobsen C.S. (2008.)Direct analysis of tfda gene expression by indigenous bacteria in phenoxy acid amended agricultural soil. Nature Publishing Group, The ISME Journal 2:677-687. Grostern, A. and E.A. Edwards (2006) Growth of Dehalobacter and Dehalococcoides spp. during Degradation of Chlorinated Ethanes. Appl Envir Microbiol. 72: 428 436 endrickson, E.R., Payne, J.A., Young, R.M. Starr, M.G., Perry, M.P., Fahnestock, S., Ellis, D.E. and Ebersole, R.C. (2002) Molecular Analysis of Dehalococcoides 16S Ribosomal DNA from Chloroethene-Contaminated Sites throughout North America and Europe Appl. Envir. Microbiol. 68: 485-495. olmes, V.F., J.Z. e, P.K.. Lee, and L. Varez-Cohen. 2006. Discrimination of multiple Dehalococcoides strains in a trichloroethene enrichment by quantification of their reductive dehalogenase genes. Appl. Environ. Microbiol. 72:5877-5883. Jacobsen, C.S. and olben, W.E. (2007) Quantification of mrna in Salmonella sp. seeded soil and chicken manure using magnetic capture hybridization RT-PCR. Journal of Microbiological Methods 69:315-321. Lee, P.K.., D.R. Johnson, V.F. olmes, J.Z. e, and L. varez-cohen. 2006. Reductive dehalogenase gene expression as a biomarker for physiological activity of Dehalococcoides spp. Appl. Environ. Microbiol. 72:6161-6168. Lee, P.K.., e, J., Zinder, S.., and Alvarez-Cohen, L. (2009) Evidence for Nitrogen Fixation by "Dehalococcoides ethenogenes" Strain 195 Appl. Envir. Microbiol., 75: 7551-7555. Lindberg, E., Albrechtsen,.J., and Jacobsen, C.S. (2007) Inhibition of real-time PCR in DNA extracts from aquifer sediment. Geomicrobiology Journal 24:343-352. Miljøprojekt nr. 1148, 2007 Teknologiudviklingsprogrammet for jord- og grundvandsforurening Pilotprojekt med stimuleret in situ reduktiv deklorering ovedrapport http://www2.mst.dk/common/udgivramme/frame.asp?http://www2.mst.dk/udgiv/publikationer/2 007/978-87-7052-366-0/html/helepubl.htm

ØFDE 42, POTENTIALE FOR BIOLOGISK NEDBRYDNING Ph.d. Morten Bondgaard, Region Midtjylland Naturlig og stimuleret biologisk nedbrydning - processer og mikrobiologi Møde 21. april 2010 Schæffergården

RESUMÉ Undersøgelser har vist, at der foregår en naturlig, ikke-stimuleret biologisk nedbrydning af forureningskomponenterne i det tidligere kemikaliedepot ved øfde 42. Undersøgelser viser også, at in situ basisk hydrolyse med høj sandsynlighed vil slå de fleste eller alle bakterier i sedimentet ihjel. Derfor vil det være nødvendigt at pode sedimentet med egnede bakterier for at få sat den biologiske nedbrydning i gang (bioaugmentation) efter en basisk hydrolyse. Ventileringsforsøg har vist, at det vil være muligt at skabe aerobe forhold i formationen med henblik på at stimulere biologisk nedbrydning in situ. Der er endnu ikke identificeret et egnet podemateriale til podning af sedimentet efter ludbehandlingen. INDLEDNING OG BAGGRUND øfde 42 er en stærkforurenet lokalitet beliggende ved Vesterhavet på arboøre Tange. I 1950 erne og 1960 erne blev store mængder pesticider og andre forureningskomponenter deponeret på grunden. En del af forureningen ved øfde 42 blev fjernet ved bortgravning i 1971 i forbindelse med kystsikringsarbejde og i 1981 i forbindelse med miljøforbedringer langs kysten. I 2000 indikerede lugtgener, at disse bortgravninger var utilstrækkelige, og at den tilbageværende forurening var væsentlig. En grundig kortlægning af forureningen i perioden 2001-2006 viste, at et område på ca. to hektar (20.000 m2) stadig var kraftigt forurenet med ca. 100 forskellige stoffer, herunder estimeret 170 tons parathion. På den baggrund besluttede Ringkjøbing Amt og Miljøstyrelsen at udføre en oprensning af kemikaliedepotet, med det formål at standse påvirkning af havmiljøet I 2006 blev det forurenede område på ca. to hektar indkapslet med en stålspuns til en dybde på 14 meter og området blev overdækket med en plastmembran. ermed blev forureningsspredningen til havet midlertidigt standset, mens en permanent løsning kunne identificeres og afprøves. Teknologi screening valg af metode Miljøstyrelsen og Ringkjøbing Amt vurderede, at der var behov for en teknologi screening for at vælge den rette afværgeteknologi. ovedargumenterne for at igangsætte teknologi screeningen var at: forureningen er svært tilgængelig (immobil) der er tale om et stort areal med en vanskelig forurening, dvs. der er ingen oplagte standardløsninger. kendte afværge teknologier er lovende, men effektivitet og omkostninger er usikre. måske findes der innovative løsninger. der er behov for at finde den rette bæredygtige metode. I 2006 udførte Ringkjøbing Amt og Miljøstyrelsen en systematisk evaluering af seks forskellige afværgeteknologier for forureningen ved øfde 42. De valgte seks forskellige teknologier blev evalueret af rådgivende ingeniørfirmaer og Universiteter. En oversigt over de undersøgte teknologier ses i tabellen nedenfor.

Teknologi Effektivitet Tid Anslået pris Biologisk nedbrydning Mellem Lang Lav Basisk hydrolyse Mellem Mellem Lav Kemisk oxidation Mellem Mellem Mellem Nul-valent jern Mellem Mellem Mellem Termisk oprensning øj Lav øj Afgravning øj Lav øj Tabel 1. Oversigt over de afprøvede afværgeteknologier. På basis af teknologi screeningen udvalgte Miljøstyrelsen og Ringkjøbing Amt metoderne in situ basisk hydrolyse og in situ biologisk nedbrydning til videre undersøgelser. Udvælgelseskriterierne kan opsummeres som: ovedkriterier: Omkostninger Effektivitet vs. target level Tid Risici Andre kriterier: Miljømæssig cost-benefit analyse Bidrag til global opvarmining/co 2 udledning Politiske hensyn/overvejelser I perioden 2007-2009 er basisk hydrolyse og biologisk nedbrydning blevet afprøvet ved undersøgelser i laboratorium og ved feltforsøg. Den forventede tidsplan for oprensning ved øfde 42 er sammenfattet i Tabel 2 Fase Aktivitet 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020-> 1 Etablering af spuns (holdbarhed>15 år) 2 Basisk-hydrolyse (preliminære lab- og feltforsøg) 2 Bioaugmentation (preliminære laboratorietest - DI) 2 Ph.D.-projekt - biologisk nedbrydning (Århus Uni) 3 Basisk hydrolyse (effektivitetsdokumentation - pilot scale) 4 Basisk hydrolyse (fuldskala - oprensning) 4 Bioaugmentation (udvikling af teknologi) 5 Bioaugmentation (efterpolering - fuldskala) Tabel 2: Forventet tidsplan for oprensningen ved øfde 42 Det er planen, at afværgen skal udføres som et treatment train startende med in situ basisk hydrolyse efterfulgt af in situ biologisk nedbrydning. Basisk hydrolyse er kort fortalt en in situ metode, hvor natronlud tilføres grundvandsmagasinet med henblik på at hydrolysere parathion og andre organophosphor pesticider til vandop-

løselige stoffer med lav toksicitet, der efterfølgende kan fjernes ved afværgepumpning eller nedbrydes biologisk på et vandbehandlingsanlæg. Størstedelen af forureningen ved øfde 42 forventes fjernet ved hjælp af den basiske hydrolyse kombineret med pump-and-treat af grundvandet. Det er planen at bioaugmentering skal anvendes til efterpolering, som en langtidsforanstaltning til langsom fjernelse af eventuelle hydrolyseproduktrester og mindre mængder aktivstoffer, som efterlades i sedimentet efter ludbehandlingen. I denne artikel omtales udelukkende de præliminære undersøgelser, der indtil nu er udført med henblik på at vurdere, om der er potentiale for at anvende in situ biologisk nedbrydning efter ludbehandling af sedimentet. PRÆLIMINÆRE FORSØG MED BIOLOGISK NEDBRYDNING I den indledende fase af projektet har DI (aus Jørgensen og Anke Oberender) og DGE Group (Søren Dyreborg og aus Kirkegaard) på vegne af Region Midtjylland og Miljøstyrelsen gennemført en række undersøgelser, der skulle lede hen imod en nuanceret vurdering af egnetheden af biologisk nedbrydning in situ til efterpolering af forureningen ved øfde 42. Undersøgelserne har omhandlet følgende: a) Ludbehandlingens (ps) indflydelse på den naturlige mikrobielle aktivitet i sedimentet. b) Forsøg med biologisk nedbrydning efter ludbehandling i søjleforsøg. Målet har været at simulere basisk hydrolyse og efterfølgende undersøge om biologisk nedbrydning kan stimuleres. c) Forsøg med ventilering (flerfase ekstraktion - air-sparging - vakuum-test) til undersøgelse af mulighederne for tilførsel af ilt til den mættede og umættede zone for at skabe bedre iltforhold i formationen for at øge den biologiske nedbrydning Parallelt med DI s arbejde har en Ph.D-studerende fra Biologisk Institut, Århus Universitet, arbejdet med isolering, identifikation og karakterisering af bakterier fra øfde 42, der har potentiale for nedbrydning forureningen i depotet. RESULTATER a) Ludbehandlingens (p s) indflydelse på mikrobiel aktivitet. Forsøgene er udført som batchforsøg med sedimentopslæmninger. Kimtalsundersøgelser fra ubehandlet sediment viser, at der findes højt indhold af bakterier i sedimentet fra øfde 42. Som forventet viser resultaterne, at en p hævning i sedimentet til p 10-11 har en kraftig negativ effekt på koncentrationen af bakterier i sedimentopslæmningerne. Undersøgelserne viser også, at ikke alle bakterier inaktiveres ved en behandling af sedimentet med p 10 efterfulgt af neutralisering. Jo højere p er jo større er risikoen for at alle bakterier slås ud. Kimtalsbestemmelserne blev understøttet af resultater af respirationsundersøgelser på sedimentsuspensionerne før, under og efter (neutralisering) ludbehandling.

De bakterier, der overlevede høje p stigninger, var i alle tilfælde samme art. Den blev fænotypisk bestemt til Pseudomonas flourescens. b) Forsøg med biologisk nedbrydning efter ludbehandling i søjleforsøg DI har gennemført en række søjleforsøg og nedbrydningsforsøg til simulering af oprensningen ved øfde 42. Den bakterielle vækst er observeret før, under og efter ludbehandlingen. Resultaterne viser, at der efter ludbehandling og den efterfølgende neutralisering er gode forhold for bakterier, der tilsættes sedimentet, da sedimentet er mindre toksisk, og både konkurrenter og bakteriernes naturlige fjender er reduceret til et lavt niveau. I en række forsøg blev ludbehandlet (og neutraliseret) sediment podet med podevæske indeholdende bakterier fra Cheminovas renseanlæg. Med det valgte podemateriale var det ikke været muligt at påvise en biologisk nedbrydning af restforureningen i sedimentet. c) Ventilering (air-sparging - flerfase ekstraktion - vakuum-test) Det vil kræve store mængder ilt for at stimulere en biologisk nedbrydning af en eventuel restforurening i depotet efter basisk hydrolyse. Tilsætning af ilt kan ske ved tilsætning af atmosfærisk luft, enten ved airsparging eller bioventilering eller en kombination af de to. To scenarier blev undersøgt af DGE Group: 1) Fjernelse af grundvand således at der skabes umættede forhold, hvorved en kraftig gennemventilering vil kunne sikre aerobe forhold i jorden (+ stripning af flygtige forbindelser) 2) Tilsætning af ilt til grundvandet (mættede zone) via air-sparging / bio-sparging med en tilhørende vakuumekstraktion i den umættede zone. Fjernelse af grundvand (scenarie 1) blev undersøgt ved en flerfase ekstraktionstest. Testene viste, at det var muligt at fjerne store mængder vand fra formationen ved anvendelse af vakuum. Tilsætning af ilt til grundvandet (scenarie 2) blev undersøgt med en traditionel air-sparging test. Air-sparging testene viste, at metoden kan anvendes til at tilsætte atmosfærisk luft (og dermed ilt) til grundvandet på lokaliteten. Samtidig viste undersøgelserne, at der vil ske en afstripning af flygtige forureningskomponenter. Alternerende drift vil som supplement til iltningen af grundvandet også medføre, at store vandmængder vil blive flyttet rundt i grundvandsmagasinet og medføre en kraftig omrøring. Dette vil i teorien kunne stimulere udvaskning af stoffer fra svært tilgængelige områder og stimulere biologisk nedbrydning Mulighederne for at fjerne luft fra den umættede zone blev undersøgt ved en vakuumekstraktionstest. Resultaterne af testene viste, at der er store virkningsradier i den umættede zone ved relativt lave anvendte difference vakuum. Det vurderes, at det vil være muligt at fjerne store mængder luft fra formationen. vis det besluttes at anvende air-sparging til iltning af grundvandet, vil det være muligt at fjerne den injicerede luft i den umættede zone ved hjælp af vakuumekstraktion.

d) Isolering, identifikation og karakterisering af bakterier fra øfde 42 Marie Bank Nielsen er ca. halvvejs i sit Ph.D-studie. Foreløbig er det lykkedes hende at isolere to bakterier der kan nedbryde para-nitrofenol, et nedbrydningsprodukt af parathion. Især den ene af disse bakterier er blevet karakteriseret, og nedbrydningen af para-nitrofenol er blevet undersøgt under forskellige betingelser med fokus på nedbrydning ved højt p. Evnen til at nedbryde para-nitrofenol ved høje p værdier (p 9-10) kan eventuelt minimere behovet for neutralisering efter den basiske hydrolyse. Fokus for hendes projekt er fremadrettet at undersøge, hvilke andre bakterier der er til stede ved øfden 42. DISKUSION De præliminære undersøgelser viser, at ludbehandlingen vil slå de fleste eller alle bakterier i sedimentet ihjel. Derfor vil det være nødvendigt at pode sedimentet med egnede bakterier for at få sat nedbrydningen i gang (bioaugmentation). Ventileringsforsøgene har vist, at det vil være muligt at skabe aerobe forhold i formationen med henblik på at stimulere biologisk nedbrydning in situ. Der kræves dog pilot-skala feltforsøg for at bestemme design parametrene i forhold til fuld-skala oprensning. Der er ikke i øjeblikket identificeret et egnet podemateriale til podning af sedimentet efter ludbehandlingen. Udvælgelsen af egnede bakterier er et afgørende trin i oprensning ved bioaugmentation. Der er stadig usikkert, om der kan frembringes podemateriale af en kvalitet og mængde, der gør, at man med fordel kan anvende bioaugmentation som en afværgeteknologi på øfde 42. Undersøgelserne ved øfde 42 har dog vist, at der foregår naturlig, ikkestimuleret biologisk nedbrydning. Nogle af de ubesvarede spørgsmål og overvejelser i forbindelse bioaugmentation er vist herunder. Krav til bakterierne/podematerialet: Skal kunne spredes/distribueres i sedimentet (være mobil) Skal kunne overleve og være aktive (nedbryde forurening) Skal kunne opformeres i stor mængde Skal kunne nedbryde de væsentligste restforureninger (parathion, PNF, EP2-syre, e- sulfotep og e-amino-parathion) Skal helst kunne måles, så man kan afgøre om de overlever og er aktive. Kilder til og udvælgelse af bakterier / podemateriale: En bred vifte af bakterier skal vælges (forskellige stoffer, forskellige nedbrydningsveje) Isolering af bakterier fra vand og sediment på øfde 42 Selektiv opformering og isolering efter nedbrydningsegenskaber og efter mobilitet i sedimentet. Karakterisering af bakterierne (morfologisk, fænotypisk og genetisk) Bakterier der er vidt udbredt, har rette nedbrydningsegenskaber, har højt potentiale for transport og bibeholder sine nedbrydningsegenskaber efter opformering udvælges.

KONKLUSION OG PERSPEKTIVERING Udviklingsarbejdet omkring afværgemetoderne ved øfde 42 er finansieret af Region Midtjylland og Miljøstyrelsen og udført i et samarbejde mellem firmaerne DGE Group, DI og Alectia. Århus Universitet og Cheminova har bidraget til arbejdet. Metodeudviklingen har taget udgangspunkt i en helt ny teknologi in situ basisk hydrolyse, hvor de forurenende stoffer nedbrydes i jorden, hvorefter restprodukter opløst i vand pumpes op og fjernes i et overjordisk renseanlæg. In situ biologisk nedbrydning skal til slut sikre at eventuel restforurening efterladt i høfdedepotet nedbrydes over tid. Resultaterne af udviklingsprojekterne er i januar 2009 afrapporteret i et udkast til skitseprojekt for fuldskalaoprensning af forureningen på øfde 42. Laboratorieforsøg og pilotskala feltforsøg har dokumenteret at basisk hydrolyse i kombination med biologisk nedbrydning med stor sandsynlighed vil være en anvendelig og omkostningseffektiv metode til fjernelse af forurening i høfdedepotet. De indledende undersøgelser efterlader dog en række ubesvarede spørgsmål med hensyn til metodens effektivitet ved fuldskalaimplementering. Der kan nævnes to primære uafklarede forhold: 1) vor effektiv er in situ basisk hydrolyse reelt? Er det muligt at opnå tilstrækkelig kontakt mellem den basiske væske og de svært tilgængelige forurenende stoffer i depotet, og hvor meget forurening kan vi forvente at fjerne ved metoden? 2) Kan der efter den basiske hydrolyse skabes forhold i høfdedepotet, og udvikles bakterier, der muliggør in situ biologisk oprensning til fjernelse af restforurening. Det er Region Midtjylland og Miljøstyrelsens vurdering, at effektiviteten af in situ basisk hydrolyse (pkt 1) skal dokumenteres i pilotforsøg, der simulerer fuld-skalaoprensning, inden projektgruppen arbejder videre på udviklingen af in situ biologisk nedbrydning (pkt 2). Der planlægges at lave pilotforsøg med in situ basisk hydrolyse i perioden 2010-2013.

BIODEGRADATION OF MTBE AND BTEXS IN FULL-SCALE REACTORS DOWN TO PPB LEVELS AFTER INOCULATION WIT A MTBE DEGRADING CULTURE Professor Erik Arvin, DTU Environment Res. Assoc. PhD Christopher Kevin Waul, DTU Environment Director M.Sc. Rasmus Krag, Jord Miljø A/S M.Sc. Charlotte Juhl Søegaard, Jord Miljø A/S Associate Professor Jeppe Lund Nielsen, Section of Biotechnology, Aalborg University Naturlig og stimuleret biologisk nedbrydning - processer og mikrobiologi Møde 21. april 2010 Schæffergården

ABSTRACT The biodegradation of MTBE (methyl tert-butyl ether) and BTEX (benzene, toluene, ethylbenzene and xylenes) at a gasoline polluted site have been investigated. The purpose of the work was to ascertain whether it was possible to inoculate a full scale biofilm reactor from a 10 L lab scale biofilm reactor and to achieve the same high removal efficiency as in the lab scale reactor (>99%). Molecular DGGE analysis (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) is being used to study differences in microbial populations in the treatment train. In summary, the up-scaling has been very successful because very efficient MTBE removal has been achieved in terms of overall MTBE removal (>99%) and effluent MTBE concentration (1-3 µg/l). BTEX removal was also very efficient (>99.9%) and effluent concentrations were < 0.01 µg/l. INTRODUCTION AND AIMS MTBE (methyl tert-butyl ether) is still used as a gasoline additive in some parts of the world. Even in places where its use has been disallowed, old contaminated sites still exist and have created groundwater contamination (Barceló, 2007). Biodegradation of MTBE and BTEX (benzene, toluene, ethylbenzene and xylenes) using full-scale reactors were investigated at a gasoline polluted site. The polluted aquifer is located 8 m below ground, inside a populated area in Farum, Denmark. The reactors were designed based on the results of our previous laboratory and modeling studies (Waul et al, 2008 a, b). The goal of the work was to investigate whether it is possible to inoculate a full scale biofilm reactor from a 10 L lab scale biofilm reactor and to achieve the same high removal efficiency as in the lab reactor (>99%). Furthermore, the aim was to use both mathematical modeling and Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) analysis to further study the degradation of MTBE and BTEXs with a view to optimize the operation and determine the origin of the MTBE degrading organisms. MATERIALS AND METODS Three serial biofilm reactors (BF1 BF3, Fig. 1-3) were constructed on-site with a volume of 3 m 3 each and an inlet average pumping rate of 1.7 m 3 /hr (down flow). The temperature in the plant is 10-11ºC. The carrier material in BF 1 and 2 is Exponet (BioBlok 300, 300 m 2 /m 3 ) and the carrier material in BF3 is Filtralite (4-8 mm). Approximately 140 L of MTBE degrading cultures attached to Filtralite carrier material was used to inoculate the top layer of BF3 in order to initiate the biodegradation of MTBE. The inoculum was grown up in a bench-scale reactor with ca. 100 L Filtralite (4-8 mm) operated with 90% feed recycle, an inlet concentration of 1 mg/l, and a constantly increasing inlet flow rate adjusted upwards as soon as MTBE was depleted in its effluent. This high recycle reactor was operated for about 2 months and inoculated using biomass taken from our previously reported 10 L laboratory reactors. Based on modeling studies (AQUASIM, Waul et al. 2008b) it was expected that in the initial start-up phase MTBE removal would mainly occur in BF3. Therefore, only, BF3 was chosen to spike the limited available quantity of inoculum. Due to the competition between the slower growing MTBE degraders, BTEX degraders would be expected to dominate in BF1 and BF2. Tracer and modeling studies using AQUASIM have shown that the flow regime in BF3 is plug flow.

Figure 1. Schematics of the MTBE treatment plant with biofilters BF1-BF3. Figure 2. Containers with biofilters. Oil separator on top.

Figure 3. Oil separator (left) and biofilters (right). RESULTS AND DISCUSSION Figure 4 shows the removal of MTBE in BF1 BF3 as well as the inlet groundwater concentration. It appears that MTBE removal started within 1 month after inoculating BF3 with the MTBE degrading biomass. After 9 months inoculation, MTBE reduced from 60-80 µg/l to 1-3 µg/l in BF3. Surprisingly, within the same time after inoculating BF3, MTBE removal in BF1 and BF2 was also observed. After 7 months, the MTBE concentration was reduced from 1200 to 400 µg/l in BF1 and further reduced to 82 µg/l in BF2 s outlet. The near complete removal of MTBE in BF3 corresponds well to start-up time for MTBE degradation predicted by our model assuming a small inoculation of the reactor at time zero.

10000 1000 MTBE (ug/l) 100 10 1 GW BF1 BF2 BF3 0 100 200 300 400 500 Time (day) Figure 4. The concentration of MTBE (µg/l) in the groundwater (GW), and the outlets of the biofilters (BF1 BF3). The vertical broken line at time equals 140 day shows when BF3 was inoculated. Concentrations are shown on a log scale vs. time of reactor operation. It is still an open question how the degradation of MTBE in BF1 and BF2 may have started. Our modeling shows that 4-5 months will be required to fully start-up the MTBE degradation in the reactors (Waul et al, 2008b); it is, therefore, likely that it may have started due to crosscontamination from BF3 and/or natural inoculation from the inlet flow. The concentrations of the MTBE metabolites tert-butyl alcohol (TBA) and tert-butyl formate (TBF) were also measured. TBF was below the detection limit 0.5 µg/l in all samples and TBA was also below the same detection limit when the effluent MTBE concentration got below 220 µg/l from BF3. The BTEX removal is shown in Figure 5. BTEX removal started after less than 1 month of startup. Concentrations reduced from over 2500 to 200-300 µg/l in BF1 and down to < 0.01 in BF3 (not shown). This fast start-up and complete degradation corresponds well to the model results.

10000 1000 BTEXs (ug/l) 100 10 1 GW OS BF1 BF2 0 100 200 300 400 500 Time (day) Figure 5. The concentration of BTEXs (µg/l) in the groundwater (GW), oil separator (OS), and the outlets of the biofilters (BF1 BF2). The vertical broken line at time equals 140 day shows when BF3 (not shown) was inoculated. BTEXs in the effluent from BF3 was < 0.01 µg/l. Concentrations are shown on a log scale vs. time of reactor operation. Potential MTBE degraders in the various biofilter compartments were investigated by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) patterns of PCR-amplified 16S rrna gene fragments. None of the DGGE bands were present in all MTBE degrading compartments. 29 bands found in MTBE-degrading compartments were cut out and sequenced. The bacterial community consisted of several bacterial genera with the majority being members of the phyla Bacteroidetes, Proteobacteria, and Nitrospirae. Among the dominating genera were Terrimonas which were very closely related (>99% identity) to the sequences found in a clone library from the sample used to inoculate batch systems that preceded the 10 L lab biofilter several years earlier (Liu et al., 2009). Two uncultured organisms had 98-99% 16S rrna gene sequences similarity to the genus Methylibium to which the well characterized MTBE degrader Methylibium petroleiphilum PM1 also belong (Bruns et al. 2001). owever, MTBE degradation was also present in compartments without members belonging to the genera Terrimonas or Methylibium indicating that more organisms are involved in the degradation. The remaining uncultured microorganisms identified showed less than 97% 16S rrna gene sequence similarity with any of the hitherto described MTBE degraders. Further proof of the active MTBE degraders and quantification

hereof will be investigated by application of microautoradiography in combination with fluorescence in situ hybridization (MAR-FIS). The very efficient removal of MTBE and BTEX observed in the full scale biofilters BF1-BF3 confirm the results obtained from our previous lab scale biofilter studies (Waul et al, 2008 a, b) and some other biofilter studies (Waul, Arvin and Schmidt, 2007). From our data (Figure 4) it is possible to determine rate constants for comparison with our existing data on MTBE degradation. From the physical set-up it can de derived that the actual hydraulic residence time (based on pore volume) is appr. 1.2 hours in BF1 and BF2 and 0.85 hours in BF3. From the removal data from the last three measurements according to Figure 4 (16/9/2009, 17/11/2009 and 13/1/2010) and the measured flows, it can be calculated that the average volumetric first order rate constant, k 1,v from BF1 and BF2 is 1.7 h -1 (1.4-2.1 h -1 ) and the average value for BF3 is 4.4 h -1 (4.2-4.5 h -1 ). Part of the difference in rate constants between BF3 compared with BF1 and 2, i.e. a ratio of 4.4/1.7 = 2.6, can be explained by the much bigger specific surface area of Filtralite compared to Exponet, probably by a factor of 2 or more. The higher rate constant for the Filtralite reactor BF3 may also partly be explained by the bigger pore velocity, probably leading to less resistance to mass transfer in the hydraulic boundary layer around the Filtralite particles and/or the presence of multiple types of MTBE degraders with different affinities toward MTBE. It is obvious that there is a need for much better understanding of the reaction kinetics in the reactors applied. The k 1,v values of 1.7-4.4 h -1 calculated above corroborate very well with the k 1,v values that can be estimated from the biofilters in the Grubbemoelle water works in the city of Svendborg, Denmark, where MTBE is being removed (Kjær Nielsen et al., 2002). Based on the data in this report, k 1,v values are 1.2-4.4 h -1. The biofilm carrier material in the Grubbemoelle water works is anthracite (30 cm layer, 2.5-4 mm) on top of a quartz sand layer (90 cm, 0.8-1.2 mm). Waul et al. (2008b) derived kinetic data based on Monod kinetics. From this, and assuming a MTBE degrading culture of 100 g COD/m 3 reactor volume (estimated from modelling results), the first order rate constant k 1,v is 2.5 h -1. In summary, the order of magnitude of the k 1,v values determined is the same. There is a big operational benefit from having MTBE degradation in all three biofilm reactors BF1-BF3. This ensures constant and very low effluent concentrations of MTBE and BTEX even at fluctuating inlet concentrations and fluctuating flows. CONCLUSIONS AND OUTLOOK The up-scaling has been successful because very efficient MTBE removal has been achieved in terms of overall MTBE removal (>99%) and low effluent MTBE concentrations (1-3 µg/l). BTEX removal is more than 99.9% and the effluent total BTEX concentration is < 0.01 µg/l. In addition to high treatment performance, the full scale plant has been working with high process stability.

The concentrations of the MTBE metabolites TBA and TBF are below the detection limit 0.5 µg/l. Kinetic analysis of the performance of reactors BF1-BF3 has shown that the volumetric first order degradation rate constant for MTBE, k 1,v, is 1.7-4.4 h -1. The variability is probably due to differences in specific surface area of the carrier materials used, differences in pore velocity, and/or the presence of multiple types of MTBE degraders with different affinities toward MTBE. The bacterial community in the three biofilters contains members of the phyla Bacteroidetes, Proteobacteria, and Nitrospirae. owever, more work is needed to fully characterize the microbial consortia, in particular the microorganisms that are responsible for the MTBE removal. Due to the efficient MTBE and BTEX removal obtained, the effluent from the treatment plant complies with the Danish drinking water requirements with respect to MTBE and BTEX. ACKNOWLEDGMENT Ulrich Gosewinkel Karlson from the National Environmental Research Institute University of Aarhus, Roskilde, Denmark, provided a mixed MTBE degrading culture from a MTBE contaminated site for inoculation of the batch cultures that preceded the 10 L lab biofilter that was used for up-scaling. REFERENCES Barceló, D. (Ed.). 2007. Fuel oxygenates. The andbook of Environmental Chemistry. Springer Verlag. Bruns M.A., J.R. anson, J. Mefford, and K.M. Scow. 2001. Isolate PM1 populations are dominant and novel methyl tert-butyl ether-degrading bacterial in compost biofilter enrichments. Environ Microbiol. 3(3): 220-225. Liu,, J. Yan, Q. Wang, U. Gosewinkel Karlson, G. Zou, Z. Yuan. 2009. Biodegradation of Methyl tert-butyl Ether by Enriched Bacterial Culture. Curr. Microbiol. 59:30-34. Nielsen, K.N., A.G. Tully, -J. Albrechtsen,. Mosbæk and E. Arvin. 2002. Removal of MTBE in Danish water works (In Danish). Danish EPA (Miljøstyrelsen/Miljøministeriet). Report Nr. 17. Waul, C.K., E. Arvin, and J. E. Schmidt. 2008a. Model description and kinetic parameter analysis of MTBE biodegradation in a packed bed reactor. Water Research. 42(12): 3122 3134. Waul, C.K., E. Arvin, and J. E. Schmidt. 2008b. Modeling the competitive effect of ammonium oxidizers and heterotrophs on the degradation of MTBE in a packed bed reactor. Water Research. 42(12): 3098 3108. Waul, C.K., E. Arvin, and J.E.Schmidt. 2007. Microbial degradation of MTBE in reactors. In: D. Barceló (Ed.) Fuel oxygenates. The andbook of Environmental Chemistry. Springer Verlag.

VURDERING AF OPRENSNINGSGRAD VED FULDSKALA IN-SITU SRD AF TCE-FORURENING I MORÆNELER Lektor Mette M. Broholm, DTU Miljø Ph.d.-studerende Camilla Christiansen, DTU Miljø Professor Poul L. Bjerg, DTU Miljø Civilingeniør aus Westergaard, Orbicon Leif ansen Civilingeniør, ph.d., Mette Christophersen, Region Syddanmark Biolog Jan Petersen, Region Syddanmark Naturlig og stimuleret biologisk nedbrydning - processer og mikrobiologi Møde 21. april 2010 Schæffergården

RESUMÈ Ved en fuldskala oprensning af TCE fourening i moræneler ved stimuleret reduktiv dechlorering (SRD) er donor og bakteriekultur tilført naturlige sandslirer/vandførende indslag i moræneleren. Moniteringen på vandprøver giver indtryk af hurtigt fremadskridende nedbrydning af de chlorerede ethener i hele behandlingsområdet. Analyse af lermatrix viser derimod en langsom diffusionsstyret omsætning i behandlingsområdet. Moniteringen på vandprøver fra filtersatte boringer afspejler udviklingen i sandslirer/reaktionszoner og giver et forskønnet billede af udviklingen. Selvom man er opmærksom på diffusionsbegrænsningen og den langsommere oprensning i matrix, er det særdeles vanskelligt at vurdere udviklingen i matrix og dermed tidsperspektivet for oprensningen uden analyse af jordprøver fra matrix. INDLEDNING Ved udførelse af in-situ afværge ved biologiske og kemiske teknikker i moræneler moniteres oprensningen typisk på vandprøver fra filtersatte boringer. Kun i udviklings/teknologiprojekter med fokus på diffusionsbegrænsninger er foretaget prøvetagning af intakte jordprøver fra lermatrix i væsentligt omfang (f.eks. Dalumvej ved kemisk oxidation /1/, Rugårdsvej /2/ og Sortebrovej /3/ ved stimuleret reduktiv dechlorering). I dette indlæg sættes fokus på den manglende overensstemmelse mellem vurdering af oprensningsgrad baseret alene på monitering af vandprøver henholdsvis baseret på prøvetagning af jord repræsenterende lermatrix med udgangspunkt i in-situ afværgen ved stimuleret reduktiv dechlorering (SRD) på Sortebrovej, som er iværksat for omtrent 4 år siden. Formål Formålet med moniteringen på Sortebrovej er at vurdere effektiviteten af afværgen. I dette indlæg fokuseres på sammenhængen (eller mangelen på samme) mellem resultater af monitering på grundvand fra filtersatte boringer i behandlingsområdet henholdsvis jordprøver fra kerneboringer i behandlingsområdet udtaget efter knap 2 år. LOKALITET, GEOLOGI OG FORURENINGSUDBREDELSE På lokaliteten Sortebrovej 26, Tommerup, har været maskinværksted siden 1886. I perioden 1951-1966 er sket en løbende udbygning af virksomheden og bl.a. etableret konstruktionshal med sprøjteværksted. Konstruktionshallen brændte i 1979 og blev derefter genopført. Affedtning og maling af større produktioner er formodentlig foretaget udendørs. Affedtningsaktiviteterne har ført til omfattende forurening med TCE øst for konstruktionshallen, jf. figur 1. Geologien på lokaliteten består af skiftende lag af moræneler og sand /3/, De enkelte geologiske enheder er kort beskrevet i boks 1. ovedparten af forureningen på Sortebrovej træffes i moræneler i 10-25 (primært 15-20) m u.t. (enhed 3), jf. figur 2.1.

1 2 3 5 4 6 7 1 3 6 5 2 4 Figur 2.1: TCE forurening øst for konstruktionshallen ved maskinværkstedet på Sortebrovej 26, Tommerup, fra /3/. Talangivelse på tværsnit angiver geologisk enhed, jf. boks 1. Boks 1 Geologi Den geologiske lagserie under fyldlaget og indenfor ca. 50 m u.t. består af 7 enheder (se fig 2.1 tværsnit): Enhed 1 (kote +64 til +50) er domineret af moræneler med talrige indslag af sandlinser/slirer. Enheden tolkes afsat som flow till i et dødislandskab. Enhed 2 (Kote +55 til +49) udgøres af et mere eller mindre sammenhængende sandlag med en mægtighed på få cm til over 2 meter, som synes at strække sig igennem det meste af området. Sandlaget er delvist umættet, idet vandspejl træffes i enheden, hvor denne optræder nærmest terræn. Enhed 3 (Kote +55 til +38) består af en 10-14 meter tyk morænebænk (ca 9-26 m u.t.) der strækker sig igennem hele området. Bænken består af homogen massiv moræneler med en del sandslirer. Enheden tolkes afsat som en basal till under et ældre isfremstød. Der er ikke tegn på systematiske horisontale sprækker udfra de kerner, der er udtaget i enheden, men der optræder mange horisontale sandslirer. Enhed 4 består af endnu et mere eller mindre sammenhængende sandlag. Enhed 5 består af moræneler. Enhed 6 består af et sammenhængende sandmagasin, som udgør det primære magasin i området. Enhed 7 består af moræneler.

Forureningen forventes at være blevet spredt mere eller mindre fuldstændigt ned gennem og ud i moræneleren (enhed 3) via hhv. vertikale og horisontale sprækker samt horisontale sandslirer og efterfølgende diffunderet ind i matrix. Den beskedne forureningspåvirkning i den øvre moræneler (enhed 1) formodes at skyldes, at forureningen overvejende er spredt via veritikale sprækker gennem denne, og at der er sket en betydelig fordampning af TCE fra denne som følge af stedvis/periodevis umættede forhold i enheden. AFVÆRGE VED SRD I 2006 blev en fuldskala oprensning ved SRD projekteret og iværksat på lokaliteten /4, 5/. Målet er: at oprense jord- og vandforureningen i 10-20 m u.t. over et areal på ca. 2100 m 2 (geologisk enhed 3) og at skabe en bufferzone mod yderligere forureningsnedsivning i et sandlag i ca. 25 m u.t. (geologisk enhed 4) Ved in-situ stimuleret reduktiv dechlorering (SRD) stimuleres nedbrydningen af chlorerede opløsningsmidler, her TCE, til ethen, jf. figur 3.1. Stimuleringen foretages ved in-situ tilsætning af et substrat, som sikrer optimale redoxforhold og tilgængelig donor, samt evt. en bakteriekultur indeholdende specifikke nedbrydere (Dehalococcoides), som sikrer, at der kan ske komplet nedbrydning af TCE til ethen. trans-1,2-dce C C TCE 2 2 C C cis-1,2-dce C C 2 VC C C 2 Ethen C C 1,1-DCE C C Figur 3.1: Nedbrydning af TCE ved reduktiv dechlorering. Der blev etableret et injektionsboringsnet på 39 nye boringer (med 2-3 filterniveauer i hver) samt 8 eksisterende boringer med filtre fra ca. 10-30 m u.t. i det ønskede behandlingsområde, se Figur 3.2. Bakteriekulturen KB1 og substratet EOS (emulsion af soyabønneolie) blev injiceret i 70 filtre i dybdeintervallet 10-20 m u.t., 3 filtre herover og 13 filtre herunder (i 20-30 m u.t.). Boringerne filtersat i moræler-enheder er fortrinsvis filtersat, hvor der optræder naturlige vandførende sandslirer i moræneleren, for at sikre injektion af en tilstrækkelig mængde substrat og bakteriekultur. Bakteriekulturen er tilsat pulsvis til substratet under injektionen.

Kerneboring 368 og 369, ca. placering 368 369 Figur 3.2: Afværge ved SRD af TCE forurening på Sortebrovej 26, Tommerup. Placering af injektionsboringer for donor og kultur samt moniteringsboringer og kerneboringer. MONITERING Moniteringen på Sortebrovej lokaliteten omfatter bl.a.: Udtagelse og analyse af vandprøver fra 8-12 filtersatte boringer i behandlingsområdet 3 gange årligt Udtagelse af kernemateriale fra moræneler i 2 boringer i 2 dybder på hver ca. 1.5 m efter knap 2 år og ca. 4 år Detaljeret delprøvetagning og analyse af kernemateriale for vurdering af effekten i matrix

Monitering på vandprøver Ved en løbende monitering på grundvand fra moniteringsboringer i behandlingsområdet kontrolleres det, om behandlingen har den tilsigtede effekt på forureningen, og om der opretholdes optimale forhold for den reduktive deklorering. Moniteringen skal endvidere danne grundlag for en vurdering af behovet for en eventuel reinjektion af substrat. Moniteringen har omfattet måling af redoxpotentialet i samtlige injektionsboringer og analyse af vandprøver udtaget fra 8 moniteringsboringer, der er filtersat i sekundært grundvand 15-18 m u. t. i behandlingsområdet. De 8 moniteringsboringer, B210, B211.2, B223.2, B224, B225.1, B307.2, B308.1 og B309.2, er tidligere undersøgelsesboringer, hvori der ikke er foretaget injektion af substrat og bakteriekultur. Behandlingsområdet og moniteringsboringernes beliggenhed fremgår af figur 3.2. Der er moniteret 3 gange om året siden iværksættelsen af afværgen i efteråret 2006. Følgende parametre har været omfattet af moniteringen: Feltparametre o Ilt, redoxpotentiale, p og ledningsevne o Lugt og gasdannelse Redoxparametre o Jern(II), sulfat, sulfid og methan Fede syrer og NVOC o Mælkesyre, propionsyre, eddikesyre, myresyre og NVOC Klorerede opløsningsmidler og nedbrydningsprodukter o Klorerede opløsningsmidler o Nedbrydningsprodukter af TCE incl. ethen Specifikke nedbrydere Til kontrol af at der ikke sker en utilsigtet spredning af problemstoffer (substrat, klorerede opløsningsmidler og bakterier) uden for behandlingsområdet, er der endvidere moniteret i boringer, der er filtersat i sekundært grundvand og i primært grundvand. Resultaterne af denne monitering er ikke videre omtalt i denne artikkel, idet det falder udenfor artiklens fokusområde. Vandprøverne er udtaget af Orbicon og analyseret ved akkrediteret analyselaboratorie. Analyser for specifikke nedbrydere er foretaget af GEUS. Udtagelse af lerkerner Data fra lermatrix er af afgørende betydning for vurdering af tidsperspektiv og massefjernelse ved oprensningstiltag på forurenede morænelerslokaliteter. På Sortebrovej var fordelingen af chlorerede opløsningsmidler og nedbrydningsprodukter i lermatrix set i forhold til de sandslirer/linser i moræneleren, som substratet er injiceret i, og

som der moniteres på ved grundvandsanalyser, ikke kendt. Ved etableringen af 2 nye moniteringsboringer i behandlingsområdet i 2008 er der derfor udtaget kerneprøver (A-rør) fra de 2 nye boringer over den del af dybden, som der i 2006 er injiceret over (6 kerner for hver boring). Disse kerner er blevet opskåret og beskrevet, og for udvalgte kerner med synligt indlejrede sandslirer/-linser er delprøvetaget til et detaljeret profil for chlorerede opløsningsmidler og nedbrydningsprodukter (incl. ethen og ethan), anioner, fede syrer og specifikke bakterier. Disse profiler tjener som baseline for udviklingen i lermatrix samt for sammenligning med traditionelle analyser af jordprøver. De 2 nye boringer er navngivet B368 og B369. Boringerne er udført som 8 forede snegleboringer af Glibstrup A/S til 20 m u.t. og blev tilstræbt placeret på linien mellem B347 og B223, i hhv. 1,5 m s afstand og 4 m s afstand fra B347, jf. figur 4.1. Figur 4.1: Placering af kerneboringerne 368 og 369. Dybdeinterval for kerneprøvetagning samt observationer af sandslirer i moræneler-aflejringen og af donor i filtrene i området for kerneprøvetagning. Efter ca. 4 år (sommer/efterår 2010) vil der blive udført 2 boringer nær de ovennævnte med udtagelse af jordprøver og kerneprøver over det samme dybdeinterval som denne gang. Delprøvetagning og analyser af lerkerner De udtagne kerner er presset ud af A-rørene, beskrevet og prøvetaget i laboratoriet. Procedurer og metoder udviklet til brug ved delprøvetagningen af kerner til detaljerede profiler på

Rugårdsvej i 2006 blev re-evalueret og fundet anvendelige /2/. Kernerne blev delprøvetaget til analyser for anioner, fede syrer, chlorerede opløsningsmidler, nedbrydningsprodukter (incl. ethen og ethan), samt specifikke nedbrydere. Prøvetagningsintervaller og typer er givet i tabel 4.1 for kerner med observeret sandslire. I kerner, hvor der ikke blev observeret sandslire blev udtaget prøver med større interval. Tabel 4.1: Prøvetagningssteder og analyseparametre i kerner med synlig sandslire. Afstand fra sandslire TCE & nedbrydningsprodukter Anioner Fede syrer Dehalococcoides 0 X X X X 0,25 X X 0,5 X X X X 0,75 X X 1 X X X X 1,5 X X X X 2 X X X X 3 X X X 4 X X X 5 X X X X 6 X X X 8 X X X 10 X X X X 12 X X X 15 X X X 20 X X X 25 X X X 30 X X X 35 X X X 40 X X X 45 X X X 50 X X X Max. total 33 29 13 33 RESULTATER OG DISKUSSION Resultaterne af moniteringen på grundvand viser omsætning af TCE til cis-dce, VC og ethen, fig 5.1, med dechloreringsgrader mellem 40% og 75% efter 2 år, figur 5.2. Moniteringen giver indtryk af hurtigt fremadskridende nedbrydning af de chlorerede ethener i hele behandlingsområdet.

Figur 5.1: Monitering på vandprøver fra B223 i behandlingsområdet. Nedbrydning af TCE via cis-dce og VC til ethen. Fuldskala in-situ oprensning blev iværksat dag 0. Figur 5.2: Monitering på vandprøver fra 8 moniteringsboringer i behandlingsområdet. Udvikling i dechloreringsgrad over tid. Fuldskala in-situ oprensning blev iværksat dag 0. Resultatet af den detaljerede prøvetagning og analyse af lermatrix viser, at forureningen i størstedelen af matrix fortsat består af TCE og i sandslirer og våde partier i leren overvejende består af cis-dce, figur 5.3. Kun i 2 tætliggende sandslirer og den umiddelbart tilstødende matrix ses et betydeligt indhold af VC og ethen, figur 5.4, og deraf følgende dechloreringsgrad højere end ca. 33% efter 2 år.